Реферат на тему:
Химия нуклеиновых кислот
2009
Начнем с ДНК. Ее физические характеристики и «конструктивные» особенности были достаточно подробно описаны во введении. Настало время подробнее познакомиться с нуклеотидами, уточнить понятие «комплементарное», конкретно познакомиться со слабыми («водородными») связями, удерживающими две цепи ДНК друг подле друга, и строением самих цепей.
Путем ферментативного гидролиза гигантские молекулы ДНК удается полностью разбить на составляющие звенья и разделить их с помощью уже упомянутого метода хроматографии. Физико-химический анализ показал, что эти звенья («нуклеотиды») имеют в своем составе (подобно аминокислотам) одинаковые линейные элементы, которые собственно говоря, и выстраивают цепь, а также боковые ветви («нуклеиновые основания»), которыми они отличаются. Таковых оказалось, действительно всего четыре: два относительно меньших размеров —цитозин (Ц) и тимин (Т) и два более крупных — аденин (А) и гуанин (Г), и основание урацил (У), которое в РНК заменяет тимин.
Менее крупные молекулы (Ц, Т, У) являются производными молекулы пиримидина и потому называются пиримидиновыми основаниями. Две более крупных молекулы, — производные пурина, — именуются пуриновыми основаниями,
Все эти нуклеиновые основания содержат гетероциклы с сопряженными связями. Такие молекулы обладают ярко выраженной гидрофобностью и, кроме того, сильно поглощают ультрафиолетовый свет вблизи максимума поглощения при длине волны 260 тц. (По интенсивности УФ-поглощения можно количественно определять содержание ДНК или РНК в водном растворе.) Все эти молекулы плоские и содержат активные атомы и группы (N, NH, Nh4, О), способные образовывать водородные связи. Ковалентные связи всех нуклеиновых оснований с линейными частями звеньев ДНК и РНК осуществляются по NH-группам, окруженным пунктирами.
Теперь мы уже можем их назвать — это пары: А—Т и Г—Ц.
Заметим, что в паре Г—Ц три связи, а в А—Т только две. Мы вправе заключить, что первая пара связана прочнее. Анализ наружных («линейных») участков нуклеотидов ДНК подтвердил, что они содержат плоские молекулы сахара дезоксирибозы (у РНК — рибозы)
В пятичленных кольцах этих Сахаров находится по четыре атома углерода, пятый атом углерода расположен вне кольца. Следует обратить внимание на нумерацию углеродов от Г до 5' (штрихи при номерах роли не играют — они «пришли» из общепринятой химической номенклатуры). Обведенные пунктиром гидроксилы в обеих молекулах участвуют в образовании ковалентных связей с нуклеиновыми основаниями.
В линейную часть звена ДНК (и РНК) входит еще остаток ортофосфорной кислоты. На рис. 25 изображена в полном составе пара кодирующих звеньев ДНК. В изображении используются общепринятые упрощения: во всех свободных углах колец надо представить себе стоящие там атомы углерода, а на концах выходящих из этих углов черточек — атомы водорода. Еще раз обратите внимание на нумерацию углеродов в дезоксирибозах. Не случайно на рис. 25 правый нуклеотид (Т) изображен как бы «вниз головой» относительно левого нуклеотида (А). Как видно из рис. 26, такое относительное расположение имеет место во всех парах цепи ДНК. Оно диктуется необходимостью соответственного положения оснований (при котором сближены группы, образующие водородные связи) и сахаро-фосфатных связей между нуклеотидами каждой нити. Комплементарные нити ДНК оказываются противоположно направленными. Если, к примеру, мы примем за направление нити переход от 5'-углерода одной концевой молекулы дезоксирибозы, несущей фосфатную группу, к 3'-углероду другой концевой дезоксирибозы, несущей ОН-группу, то тем самым мы определим направление всей нити. Такое направление принято называть направлением от 5'-конца нити к ее 3'-концу или сокращению
На рис. эти направления для обеих нитей указаны стрелками. Они противоположны. Отсюда следует, что переходя от звена к звену в двунитевой ДНК (т. е. от одной пары связанных нуклеиновых оснований к следующей паре) мы неизбежно будем двигаться по одной нити в направлении 5'-3', а по второй в направлении 3'-5'. Это обстоятельство следует запомнить.
На рис. для простоты нуклеиновые основания были обозначены кружками. Рис. 2 изображает полную структуру двухзвенного фрагмента ДНК. Штриховка означает, что плоскости оснований перпендикулярны направлению параллельных сахаро-фосфатных цепочек.
Рис. 2
Сопоставив суммарные элементарные составы пар А—Т и Г— Ц легко подсчитать, что они почти одинаковы. Если же учесть, что усреднение элементарного состава всей молекулы ДНК происходит по более, чем миллиону пар, можно с еще большей уверенностью, чем для белков, утверждать, что элементарный состав всех ДНК одинаков. Он оказался совсем иным, чем у белков (см. выше), а именно: 33,1% С; 38,2% О; 15,7% N и 9,3% Р.
Подробно рассмотрев состав и структуру ДНК, можно для РНК ограничиться лишь краткими замечаниями. С учетом того, что замена тимина на урацил в составе РНК ведет к отличию всего в двух атомах водорода, а дезоксирибозы на рибозу — в одном атоме кислорода, можно утверждать, что элементарный состав РНК такой же, как у ДНК. Главное отличие в том, что большинство РНК — однонитевые молекулы. Им ведь нет нужды реплицироваться. (Впрочем, последнее замечание сегодня, в 2001 году, звучит не столь категорически, как даже год назад, ввиду совсем недавнего обнаружения возможности репликации РНК с помощью фермента «рйбозима».)
Давно известно, что на отдельных небольших участках нить РНК может спариваться сама на себя, благодаря разнесенным по ее длине комплементарным участкам. Такое образование двунитевых участков, по-видимому, важно для структурирования и функционирования больших (например, рибосомальных) молекул РНК и малых молекул тРНК.
Наконец, следует иметь в виду, что растворы РНК, благодаря гибкой однонитевой структуре ее молекул, обладают гораздо меньшей вязкостью, чем растворы ДНК. Еще, в отличие от ДНК, РНК можно расцепить до нуклеотидов обработкой слабым щелочным раствором. Способность к поглощению света в УФ-области у обоих типов молекул нуклеиновых кислот одинакова.
Механизм редупликации ДНК
Здесь целесообразно лишь вкратце повторить основные представления о фундаментальных жизненных процессах: редупликации ДНК, транскрипции ее с переносом наследственной информации на иРНК и механизме трансляции — синтезе белка, направляемом этой информацией.
Разумеется, по ходу дела мы сделаем некоторые уточнения и добавим ряд деталей к описаниям названных процессов.
Редупликацию ДНК (копирование «материнской» ДНК при делении клетки) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-уг-леродом дезоксирибозы. Следовательно к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении б'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-поли-мераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 тыс. дальтон, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизоме-разы». Он продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимера-за, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-поли-мераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему(«танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Каждому, кто пробовал просто раздвинуть концы двух скрученных в спираль веревок (противоположные концы которых закреплены) знает, что сначала это удается сделать легко, потом все труднее, а затем становится и невозможно. Это происходит потому, что концы веревок именно раздвигаются, а не раскручиваются. Остальная часть спирали при этом уплотняется, сохраняя прежнее число витков, что и создает напряжение, мешающее дальнейшему раздвижению концов. Достаточно теперь у вершины вилки перерезать одну веревку, как плотно скрученная ее часть начинает вращаться до тех пор, пока напряжение уплотнения витков не будет снято. Одновременно будет вращаться вокруг своей оси и не перерезанная ветвь раздвинутой веревки. Отрезанная ветвь, если она сохранила какое-то сцепление, хотя бы в одной точке, с другой ветвью, будет без напряжения вращаться вместе с нею...
Подобный описанному процесс, вероятно, осуществляется и в ходе репликации ДНК. Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК 'тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топо-изомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а ге-ликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-кон-цу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед. Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того
места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений. '
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме.
Конечно, все описанные механизмы были установлены для E.coli и подтверждены для других микроорганизмов. Имела ли смысл вся эта огромная работа, с точки зрения познания процессов передачи наследственной информации у высших организмов? Безусловно имела! Во-первых, исследователи не раз убеждались в том, что фундаментальные реакции на разных уровнях развития организмов протекают сходным образом. Во-вторых, ферменты, выделенные из бактерий, хорошо ведут in vitro редупликацию ДНК, полученных из любых источников, и потому представляют собой прекрасный инструмент для исследования этих ДНК.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: ос, Р, у, 5 и е. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза 5. ДНК-полимераза а отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза Р — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза у ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы с пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек (как — непонятно). Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы 5 служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований. Всем бы корректорам такую тщательность!
Литература:
Ахмеджанов М.Ю., Гуз С.Я., Архангельский В.В. Динамика содержания триглицеридов, общего холестерина и его фракций в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда и при санаторно-курортном лечении. // Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внутренних органов. — Ужгород, -1983. -С.52.
Баев В.П., Булах Е.П. Определение кетоновых тел в крови и тканях. // Лабораторное дело. -1974. -N 9. -С.545.
www.ronl.ru
Реферат на тему:
Химия нуклеиновых кислот
2009
Начнем с ДНК. Ее физические характеристики и «конструктивные» особенности были достаточно подробно описаны во введении. Настало время подробнее познакомиться с нуклеотидами, уточнить понятие «комплементарное», конкретно познакомиться со слабыми («водородными») связями, удерживающими две цепи ДНК друг подле друга, и строением самих цепей.
Путем ферментативного гидролиза гигантские молекулы ДНК удается полностью разбить на составляющие звенья и разделить их с помощью уже упомянутого метода хроматографии. Физико-химический анализ показал, что эти звенья («нуклеотиды») имеют в своем составе (подобно аминокислотам) одинаковые линейные элементы, которые собственно говоря, и выстраивают цепь, а также боковые ветви («нуклеиновые основания»), которыми они отличаются. Таковых оказалось, действительно всего четыре: два относительно меньших размеров —цитозин (Ц) и тимин (Т) и два более крупных — аденин (А) и гуанин (Г), и основание урацил (У), которое в РНК заменяет тимин.
Менее крупные молекулы (Ц, Т, У) являются производными молекулы пиримидина и потому называются пиримидиновыми основаниями. Две более крупных молекулы, — производные пурина, — именуются пуриновыми основаниями,
Все эти нуклеиновые основания содержат гетероциклы с сопряженными связями. Такие молекулы обладают ярко выраженной гидрофобностью и, кроме того, сильно поглощают ультрафиолетовый свет вблизи максимума поглощения при длине волны 260 тц. (По интенсивности УФ-поглощения можно количественно определять содержание ДНК или РНК в водном растворе.) Все эти молекулы плоские и содержат активные атомы и группы (N, NH, Nh4, О), способные образовывать водородные связи. Ковалентные связи всех нуклеиновых оснований с линейными частями звеньев ДНК и РНК осуществляются по NH-группам, окруженным пунктирами.
Теперь мы уже можем их назвать — это пары: А—Т и Г—Ц.
Заметим, что в паре Г—Ц три связи, а в А—Т только две. Мы вправе заключить, что первая пара связана прочнее. Анализ наружных («линейных») участков нуклеотидов ДНК подтвердил, что они содержат плоские молекулы сахара дезоксирибозы (у РНК — рибозы)
В пятичленных кольцах этих Сахаров находится по четыре атома углерода, пятый атом углерода расположен вне кольца. Следует обратить внимание на нумерацию углеродов от Г до 5' (штрихи при номерах роли не играют — они «пришли» из общепринятой химической номенклатуры). Обведенные пунктиром гидроксилы в обеих молекулах участвуют в образовании ковалентных связей с нуклеиновыми основаниями.
В линейную часть звена ДНК (и РНК) входит еще остаток ортофосфорной кислоты. На рис. 25 изображена в полном составе пара кодирующих звеньев ДНК. В изображении используются общепринятые упрощения: во всех свободных углах колец надо представить себе стоящие там атомы углерода, а на концах выходящих из этих углов черточек — атомы водорода. Еще раз обратите внимание на нумерацию углеродов в дезоксирибозах. Не случайно на рис. 25 правый нуклеотид (Т) изображен как бы «вниз головой» относительно левого нуклеотида (А). Как видно из рис. 26, такое относительное расположение имеет место во всех парах цепи ДНК. Оно диктуется необходимостью соответственного положения оснований (при котором сближены группы, образующие водородные связи) и сахаро-фосфатных связей между нуклеотидами каждой нити. Комплементарные нити ДНК оказываются противоположно направленными. Если, к примеру, мы примем за направление нити переход от 5'-углерода одной концевой молекулы дезоксирибозы, несущей фосфатную группу, к 3'-углероду другой концевой дезоксирибозы, несущей ОН-группу, то тем самым мы определим направление всей нити. Такое направление принято называть направлением от 5'-конца нити к ее 3'-концу или сокращению
На рис. эти направления для обеих нитей указаны стрелками. Они противоположны. Отсюда следует, что переходя от звена к звену в двунитевой ДНК (т. е. от одной пары связанных нуклеиновых оснований к следующей паре) мы неизбежно будем двигаться по одной нити в направлении 5'-3', а по второй в направлении 3'-5'. Это обстоятельство следует запомнить.
На рис. для простоты нуклеиновые основания были обозначены кружками. Рис. 2 изображает полную структуру двухзвенного фрагмента ДНК. Штриховка означает, что плоскости оснований перпендикулярны направлению параллельных сахаро-фосфатных цепочек.
Рис. 2
Сопоставив суммарные элементарные составы пар А—Т и Г— Ц легко подсчитать, что они почти одинаковы. Если же учесть, что усреднение элементарного состава всей молекулы ДНК происходит по более, чем миллиону пар, можно с еще большей уверенностью, чем для белков, утверждать, что элементарный состав всех ДНК одинаков. Он оказался совсем иным, чем у белков (см. выше), а именно: 33,1% С; 38,2% О; 15,7% N и 9,3% Р.
Подробно рассмотрев состав и структуру ДНК, можно для РНК ограничиться лишь краткими замечаниями. С учетом того, что замена тимина на урацил в составе РНК ведет к отличию всего в двух атомах водорода, а дезоксирибозы на рибозу — в одном атоме кислорода, можно утверждать, что элементарный состав РНК такой же, как у ДНК. Главное отличие в том, что большинство РНК — однонитевые молекулы. Им ведь нет нужды реплицироваться. (Впрочем, последнее замечание сегодня, в 2001 году, звучит не столь категорически, как даже год назад, ввиду совсем недавнего обнаружения возможности репликации РНК с помощью фермента «рйбозима».)
Давно известно, что на отдельных небольших участках нить РНК может спариваться сама на себя, благодаря разнесенным по ее длине комплементарным участкам. Такое образование двунитевых участков, по-видимому, важно для структурирования и функционирования больших (например, рибосомальных) молекул РНК и малых молекул тРНК.
Наконец, следует иметь в виду, что растворы РНК, благодаря гибкой однонитевой структуре ее молекул, обладают гораздо меньшей вязкостью, чем растворы ДНК. Еще, в отличие от ДНК, РНК можно расцепить до нуклеотидов обработкой слабым щелочным раствором. Способность к поглощению света в УФ-области у обоих типов молекул нуклеиновых кислот одинакова.
Механизм редупликации ДНК
Здесь целесообразно лишь вкратце повторить основные представления о фундаментальных жизненных процессах: редупликации ДНК, транскрипции ее с переносом наследственной информации на иРНК и механизме трансляции — синтезе белка, направляемом этой информацией.
Разумеется, по ходу дела мы сделаем некоторые уточнения и добавим ряд деталей к описаниям названных процессов.
Редупликацию ДНК (копирование «материнской» ДНК при делении клетки) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-уг-леродом дезоксирибозы. Следовательно к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении б'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-поли-мераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 тыс. дальтон, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизоме-разы». Он продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимера-за, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-поли-мераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему(«танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Каждому, кто пробовал просто раздвинуть концы двух скрученных в спираль веревок (противоположные концы которых закреплены) знает, что сначала это удается сделать легко, потом все труднее, а затем становится и невозможно. Это происходит потому, что концы веревок именно раздвигаются, а не раскручиваются. Остальная часть спирали при этом уплотняется, сохраняя прежнее число витков, что и создает напряжение, мешающее дальнейшему раздвижению концов. Достаточно теперь у вершины вилки перерезать одну веревку, как плотно скрученная ее часть начинает вращаться до тех пор, пока напряжение уплотнения витков не будет снято. Одновременно будет вращаться вокруг своей оси и не перерезанная ветвь раздвинутой веревки. Отрезанная ветвь, если она сохранила какое-то сцепление, хотя бы в одной точке, с другой ветвью, будет без напряжения вращаться вместе с нею...
Подобный описанному процесс, вероятно, осуществляется и в ходе репликации ДНК. Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК 'тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топо-изомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а ге-ликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-кон-цу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед. Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того
места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений. '
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме.
Конечно, все описанные механизмы были установлены для E.coli и подтверждены для других микроорганизмов. Имела ли смысл вся эта огромная работа, с точки зрения познания процессов передачи наследственной информации у высших организмов? Безусловно имела! Во-первых, исследователи не раз убеждались в том, что фундаментальные реакции на разных уровнях развития организмов протекают сходным образом. Во-вторых, ферменты, выделенные из бактерий, хорошо ведут in vitro редупликацию ДНК, полученных из любых источников, и потому представляют собой прекрасный инструмент для исследования этих ДНК.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: ос, Р, у, 5 и е. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза 5. ДНК-полимераза а отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза Р — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза у ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы с пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек (как — непонятно). Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы 5 служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований. Всем бы корректорам такую тщательность!
Литература:
Ахмеджанов М.Ю., Гуз С.Я., Архангельский В.В. Динамика содержания триглицеридов, общего холестерина и его фракций в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда и при санаторно-курортном лечении. // Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внутренних органов. — Ужгород, -1983. -С.52.
Баев В.П., Булах Е.П. Определение кетоновых тел в крови и тканях. // Лабораторное дело. -1974. -N 9. -С.545.
www.ronl.ru
Реферат на тему:
Химия нуклеиновых кислот
2009
Начнем с ДНК. Ее физические характеристики и «конструктивные» особенности были достаточно подробно описаны во введении. Настало время подробнее познакомиться с нуклеотидами, уточнить понятие «комплементарное», конкретно познакомиться со слабыми («водородными») связями, удерживающими две цепи ДНК друг подле друга, и строением самих цепей.
Путем ферментативного гидролиза гигантские молекулы ДНК удается полностью разбить на составляющие звенья и разделить их с помощью уже упомянутого метода хроматографии. Физико-химический анализ показал, что эти звенья («нуклеотиды») имеют в своем составе (подобно аминокислотам) одинаковые линейные элементы, которые собственно говоря, и выстраивают цепь, а также боковые ветви («нуклеиновые основания»), которыми они отличаются. Таковых оказалось, действительно всего четыре: два относительно меньших размеров —цитозин (Ц) и тимин (Т) и два более крупных — аденин (А) и гуанин (Г), и основание урацил (У), которое в РНК заменяет тимин.
Менее крупные молекулы (Ц, Т, У) являются производными молекулы пиримидина и потому называются пиримидиновыми основаниями. Две более крупных молекулы, — производные пурина, — именуются пуриновыми основаниями,
Все эти нуклеиновые основания содержат гетероциклы с сопряженными связями. Такие молекулы обладают ярко выраженной гидрофобностью и, кроме того, сильно поглощают ультрафиолетовый свет вблизи максимума поглощения при длине волны 260 тц. (По интенсивности УФ-поглощения можно количественно определять содержание ДНК или РНК в водном растворе.) Все эти молекулы плоские и содержат активные атомы и группы (N, NH, Nh4, О), способные образовывать водородные связи. Ковалентные связи всех нуклеиновых оснований с линейными частями звеньев ДНК и РНК осуществляются по NH-группам, окруженным пунктирами.
Теперь мы уже можем их назвать — это пары: А—Т и Г—Ц.
Заметим, что в паре Г—Ц три связи, а в А—Т только две. Мы вправе заключить, что первая пара связана прочнее. Анализ наружных («линейных») участков нуклеотидов ДНК подтвердил, что они содержат плоские молекулы сахара дезоксирибозы (у РНК — рибозы)
В пятичленных кольцах этих Сахаров находится по четыре атома углерода, пятый атом углерода расположен вне кольца. Следует обратить внимание на нумерацию углеродов от Г до 5' (штрихи при номерах роли не играют — они «пришли» из общепринятой химической номенклатуры). Обведенные пунктиром гидроксилы в обеих молекулах участвуют в образовании ковалентных связей с нуклеиновыми основаниями.
В линейную часть звена ДНК (и РНК) входит еще остаток ортофосфорной кислоты. На рис. 25 изображена в полном составе пара кодирующих звеньев ДНК. В изображении используются общепринятые упрощения: во всех свободных углах колец надо представить себе стоящие там атомы углерода, а на концах выходящих из этих углов черточек — атомы водорода. Еще раз обратите внимание на нумерацию углеродов в дезоксирибозах. Не случайно на рис. 25 правый нуклеотид (Т) изображен как бы «вниз головой» относительно левого нуклеотида (А). Как видно из рис. 26, такое относительное расположение имеет место во всех парах цепи ДНК. Оно диктуется необходимостью соответственного положения оснований (при котором сближены группы, образующие водородные связи) и сахаро-фосфатных связей между нуклеотидами каждой нити. Комплементарные нити ДНК оказываются противоположно направленными. Если, к примеру, мы примем за направление нити переход от 5'-углерода одной концевой молекулы дезоксирибозы, несущей фосфатную группу, к 3'-углероду другой концевой дезоксирибозы, несущей ОН-группу, то тем самым мы определим направление всей нити. Такое направление принято называть направлением от 5'-конца нити к ее 3'-концу или сокращению
На рис. эти направления для обеих нитей указаны стрелками. Они противоположны. Отсюда следует, что переходя от звена к звену в двунитевой ДНК (т. е. от одной пары связанных нуклеиновых оснований к следующей паре) мы неизбежно будем двигаться по одной нити в направлении 5'-3', а по второй в направлении 3'-5'. Это обстоятельство следует запомнить.
На рис. для простоты нуклеиновые основания были обозначены кружками. Рис. 2 изображает полную структуру двухзвенного фрагмента ДНК. Штриховка означает, что плоскости оснований перпендикулярны направлению параллельных сахаро-фосфатных цепочек.
Рис. 2
Сопоставив суммарные элементарные составы пар А—Т и Г— Ц легко подсчитать, что они почти одинаковы. Если же учесть, что усреднение элементарного состава всей молекулы ДНК происходит по более, чем миллиону пар, можно с еще большей уверенностью, чем для белков, утверждать, что элементарный состав всех ДНК одинаков. Он оказался совсем иным, чем у белков (см. выше), а именно: 33,1% С; 38,2% О; 15,7% N и 9,3% Р.
Подробно рассмотрев состав и структуру ДНК, можно для РНК ограничиться лишь краткими замечаниями. С учетом того, что замена тимина на урацил в составе РНК ведет к отличию всего в двух атомах водорода, а дезоксирибозы на рибозу — в одном атоме кислорода, можно утверждать, что элементарный состав РНК такой же, как у ДНК. Главное отличие в том, что большинство РНК — однонитевые молекулы. Им ведь нет нужды реплицироваться. (Впрочем, последнее замечание сегодня, в 2001 году, звучит не столь категорически, как даже год назад, ввиду совсем недавнего обнаружения возможности репликации РНК с помощью фермента «рйбозима».)
Давно известно, что на отдельных небольших участках нить РНК может спариваться сама на себя, благодаря разнесенным по ее длине комплементарным участкам. Такое образование двунитевых участков, по-видимому, важно для структурирования и функционирования больших (например, рибосомальных) молекул РНК и малых молекул тРНК.
Наконец, следует иметь в виду, что растворы РНК, благодаря гибкой однонитевой структуре ее молекул, обладают гораздо меньшей вязкостью, чем растворы ДНК. Еще, в отличие от ДНК, РНК можно расцепить до нуклеотидов обработкой слабым щелочным раствором. Способность к поглощению света в УФ-области у обоих типов молекул нуклеиновых кислот одинакова.
Механизм редупликации ДНК
Здесь целесообразно лишь вкратце повторить основные представления о фундаментальных жизненных процессах: редупликации ДНК, транскрипции ее с переносом наследственной информации на иРНК и механизме трансляции — синтезе белка, направляемом этой информацией.
Разумеется, по ходу дела мы сделаем некоторые уточнения и добавим ряд деталей к описаниям названных процессов.
Редупликацию ДНК (копирование «материнской» ДНК при делении клетки) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-уг-леродом дезоксирибозы. Следовательно к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении б'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-поли-мераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 тыс. дальтон, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизоме-разы». Он продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимера-за, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-поли-мераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему(«танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Каждому, кто пробовал просто раздвинуть концы двух скрученных в спираль веревок (противоположные концы которых закреплены) знает, что сначала это удается сделать легко, потом все труднее, а затем становится и невозможно. Это происходит потому, что концы веревок именно раздвигаются, а не раскручиваются. Остальная часть спирали при этом уплотняется, сохраняя прежнее число витков, что и создает напряжение, мешающее дальнейшему раздвижению концов. Достаточно теперь у вершины вилки перерезать одну веревку, как плотно скрученная ее часть начинает вращаться до тех пор, пока напряжение уплотнения витков не будет снято. Одновременно будет вращаться вокруг своей оси и не перерезанная ветвь раздвинутой веревки. Отрезанная ветвь, если она сохранила какое-то сцепление, хотя бы в одной точке, с другой ветвью, будет без напряжения вращаться вместе с нею...
Подобный описанному процесс, вероятно, осуществляется и в ходе репликации ДНК. Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК 'тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топо-изомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а ге-ликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-кон-цу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед. Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того
места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений. '
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме.
Конечно, все описанные механизмы были установлены для E.coli и подтверждены для других микроорганизмов. Имела ли смысл вся эта огромная работа, с точки зрения познания процессов передачи наследственной информации у высших организмов? Безусловно имела! Во-первых, исследователи не раз убеждались в том, что фундаментальные реакции на разных уровнях развития организмов протекают сходным образом. Во-вторых, ферменты, выделенные из бактерий, хорошо ведут in vitro редупликацию ДНК, полученных из любых источников, и потому представляют собой прекрасный инструмент для исследования этих ДНК.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: ос, Р, у, 5 и е. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза 5. ДНК-полимераза а отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза Р — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза у ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы с пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек (как — непонятно). Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы 5 служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований. Всем бы корректорам такую тщательность!
Литература:
Ахмеджанов М.Ю., Гуз С.Я., Архангельский В.В. Динамика содержания триглицеридов, общего холестерина и его фракций в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда и при санаторно-курортном лечении. // Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внутренних органов. — Ужгород, -1983. -С.52.
Баев В.П., Булах Е.П. Определение кетоновых тел в крови и тканях. // Лабораторное дело. -1974. -N 9. -С.545.
www.ronl.ru
Реферат на тему:
Химия нуклеиновых кислот
2009
Начнем с ДНК. Ее физические характеристики и «конструктивные» особенности были достаточно подробно описаны во введении. Настало время подробнее познакомиться с нуклеотидами, уточнить понятие «комплементарное», конкретно познакомиться со слабыми («водородными») связями, удерживающими две цепи ДНК друг подле друга, и строением самих цепей.
Путем ферментативного гидролиза гигантские молекулы ДНК удается полностью разбить на составляющие звенья и разделить их с помощью уже упомянутого метода хроматографии. Физико-химический анализ показал, что эти звенья («нуклеотиды») имеют в своем составе (подобно аминокислотам) одинаковые линейные элементы, которые собственно говоря, и выстраивают цепь, а также боковые ветви («нуклеиновые основания»), которыми они отличаются. Таковых оказалось, действительно всего четыре: два относительно меньших размеров —цитозин (Ц) и тимин (Т) и два более крупных — аденин (А) и гуанин (Г), и основание урацил (У), которое в РНК заменяет тимин.
Менее крупные молекулы (Ц, Т, У) являются производными молекулы пиримидина и потому называются пиримидиновыми основаниями. Две более крупных молекулы, — производные пурина, — именуются пуриновыми основаниями,
Все эти нуклеиновые основания содержат гетероциклы с сопряженными связями. Такие молекулы обладают ярко выраженной гидрофобностью и, кроме того, сильно поглощают ультрафиолетовый свет вблизи максимума поглощения при длине волны 260 тц. (По интенсивности УФ-поглощения можно количественно определять содержание ДНК или РНК в водном растворе.) Все эти молекулы плоские и содержат активные атомы и группы (N, NH, Nh4, О), способные образовывать водородные связи. Ковалентные связи всех нуклеиновых оснований с линейными частями звеньев ДНК и РНК осуществляются по NH-группам, окруженным пунктирами.
Теперь мы уже можем их назвать — это пары: А—Т и Г—Ц.
Заметим, что в паре Г—Ц три связи, а в А—Т только две. Мы вправе заключить, что первая пара связана прочнее. Анализ наружных («линейных») участков нуклеотидов ДНК подтвердил, что они содержат плоские молекулы сахара дезоксирибозы (у РНК — рибозы)
В пятичленных кольцах этих Сахаров находится по четыре атома углерода, пятый атом углерода расположен вне кольца. Следует обратить внимание на нумерацию углеродов от Г до 5' (штрихи при номерах роли не играют — они «пришли» из общепринятой химической номенклатуры). Обведенные пунктиром гидроксилы в обеих молекулах участвуют в образовании ковалентных связей с нуклеиновыми основаниями.
В линейную часть звена ДНК (и РНК) входит еще остаток ортофосфорной кислоты. На рис. 25 изображена в полном составе пара кодирующих звеньев ДНК. В изображении используются общепринятые упрощения: во всех свободных углах колец надо представить себе стоящие там атомы углерода, а на концах выходящих из этих углов черточек — атомы водорода. Еще раз обратите внимание на нумерацию углеродов в дезоксирибозах. Не случайно на рис. 25 правый нуклеотид (Т) изображен как бы «вниз головой» относительно левого нуклеотида (А). Как видно из рис. 26, такое относительное расположение имеет место во всех парах цепи ДНК. Оно диктуется необходимостью соответственного положения оснований (при котором сближены группы, образующие водородные связи) и сахаро-фосфатных связей между нуклеотидами каждой нити. Комплементарные нити ДНК оказываются противоположно направленными. Если, к примеру, мы примем за направление нити переход от 5'-углерода одной концевой молекулы дезоксирибозы, несущей фосфатную группу, к 3'-углероду другой концевой дезоксирибозы, несущей ОН-группу, то тем самым мы определим направление всей нити. Такое направление принято называть направлением от 5'-конца нити к ее 3'-концу или сокращению
На рис. эти направления для обеих нитей указаны стрелками. Они противоположны. Отсюда следует, что переходя от звена к звену в двунитевой ДНК (т. е. от одной пары связанных нуклеиновых оснований к следующей паре) мы неизбежно будем двигаться по одной нити в направлении 5'-3', а по второй в направлении 3'-5'. Это обстоятельство следует запомнить.
На рис. для простоты нуклеиновые основания были обозначены кружками. Рис. 2 изображает полную структуру двухзвенного фрагмента ДНК. Штриховка означает, что плоскости оснований перпендикулярны направлению параллельных сахаро-фосфатных цепочек.
Рис. 2
Сопоставив суммарные элементарные составы пар А—Т и Г— Ц легко подсчитать, что они почти одинаковы. Если же учесть, что усреднение элементарного состава всей молекулы ДНК происходит по более, чем миллиону пар, можно с еще большей уверенностью, чем для белков, утверждать, что элементарный состав всех ДНК одинаков. Он оказался совсем иным, чем у белков (см. выше), а именно: 33,1% С; 38,2% О; 15,7% N и 9,3% Р.
Подробно рассмотрев состав и структуру ДНК, можно для РНК ограничиться лишь краткими замечаниями. С учетом того, что замена тимина на урацил в составе РНК ведет к отличию всего в двух атомах водорода, а дезоксирибозы на рибозу — в одном атоме кислорода, можно утверждать, что элементарный состав РНК такой же, как у ДНК. Главное отличие в том, что большинство РНК — однонитевые молекулы. Им ведь нет нужды реплицироваться. (Впрочем, последнее замечание сегодня, в 2001 году, звучит не столь категорически, как даже год назад, ввиду совсем недавнего обнаружения возможности репликации РНК с помощью фермента «рйбозима».)
Давно известно, что на отдельных небольших участках нить РНК может спариваться сама на себя, благодаря разнесенным по ее длине комплементарным участкам. Такое образование двунитевых участков, по-видимому, важно для структурирования и функционирования больших (например, рибосомальных) молекул РНК и малых молекул тРНК.
Наконец, следует иметь в виду, что растворы РНК, благодаря гибкой однонитевой структуре ее молекул, обладают гораздо меньшей вязкостью, чем растворы ДНК. Еще, в отличие от ДНК, РНК можно расцепить до нуклеотидов обработкой слабым щелочным раствором. Способность к поглощению света в УФ-области у обоих типов молекул нуклеиновых кислот одинакова.
Механизм редупликации ДНК
Здесь целесообразно лишь вкратце повторить основные представления о фундаментальных жизненных процессах: редупликации ДНК, транскрипции ее с переносом наследственной информации на иРНК и механизме трансляции — синтезе белка, направляемом этой информацией.
Разумеется, по ходу дела мы сделаем некоторые уточнения и добавим ряд деталей к описаниям названных процессов.
Редупликацию ДНК (копирование «материнской» ДНК при делении клетки) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-уг-леродом дезоксирибозы. Следовательно к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении б'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-поли-мераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 тыс. дальтон, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизоме-разы». Он продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимера-за, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-поли-мераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему(«танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Каждому, кто пробовал просто раздвинуть концы двух скрученных в спираль веревок (противоположные концы которых закреплены) знает, что сначала это удается сделать легко, потом все труднее, а затем становится и невозможно. Это происходит потому, что концы веревок именно раздвигаются, а не раскручиваются. Остальная часть спирали при этом уплотняется, сохраняя прежнее число витков, что и создает напряжение, мешающее дальнейшему раздвижению концов. Достаточно теперь у вершины вилки перерезать одну веревку, как плотно скрученная ее часть начинает вращаться до тех пор, пока напряжение уплотнения витков не будет снято. Одновременно будет вращаться вокруг своей оси и не перерезанная ветвь раздвинутой веревки. Отрезанная ветвь, если она сохранила какое-то сцепление, хотя бы в одной точке, с другой ветвью, будет без напряжения вращаться вместе с нею...
Подобный описанному процесс, вероятно, осуществляется и в ходе репликации ДНК. Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК 'тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топо-изомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а ге-ликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-кон-цу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед. Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того
места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений. '
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме.
Конечно, все описанные механизмы были установлены для E.coli и подтверждены для других микроорганизмов. Имела ли смысл вся эта огромная работа, с точки зрения познания процессов передачи наследственной информации у высших организмов? Безусловно имела! Во-первых, исследователи не раз убеждались в том, что фундаментальные реакции на разных уровнях развития организмов протекают сходным образом. Во-вторых, ферменты, выделенные из бактерий, хорошо ведут in vitro редупликацию ДНК, полученных из любых источников, и потому представляют собой прекрасный инструмент для исследования этих ДНК.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: ос, Р, у, 5 и е. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза 5. ДНК-полимераза а отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза Р — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза у ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы с пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек (как — непонятно). Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы 5 служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований. Всем бы корректорам такую тщательность!
Литература:
Ахмеджанов М.Ю., Гуз С.Я., Архангельский В.В. Динамика содержания триглицеридов, общего холестерина и его фракций в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда и при санаторно-курортном лечении. // Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внутренних органов. — Ужгород, -1983. -С.52.
Баев В.П., Булах Е.П. Определение кетоновых тел в крови и тканях. // Лабораторное дело. -1974. -N 9. -С.545.
www.ronl.ru
Реферат на тему:
Химия нуклеиновых кислот
2009
Начнем с ДНК. Ее физические характеристики и «конструктивные» особенности были достаточно подробно описаны во введении. Настало время подробнее познакомиться с нуклеотидами, уточнить понятие «комплементарное», конкретно познакомиться со слабыми («водородными») связями, удерживающими две цепи ДНК друг подле друга, и строением самих цепей.
Путем ферментативного гидролиза гигантские молекулы ДНК удается полностью разбить на составляющие звенья и разделить их с помощью уже упомянутого метода хроматографии. Физико-химический анализ показал, что эти звенья («нуклеотиды») имеют в своем составе (подобно аминокислотам) одинаковые линейные элементы, которые собственно говоря, и выстраивают цепь, а также боковые ветви («нуклеиновые основания»), которыми они отличаются. Таковых оказалось, действительно всего четыре: два относительно меньших размеров —цитозин (Ц) и тимин (Т) и два более крупных — аденин (А) и гуанин (Г), и основание урацил (У), которое в РНК заменяет тимин.
Менее крупные молекулы (Ц, Т, У) являются производными молекулы пиримидина и потому называются пиримидиновыми основаниями. Две более крупных молекулы, — производные пурина, — именуются пуриновыми основаниями,
Все эти нуклеиновые основания содержат гетероциклы с сопряженными связями. Такие молекулы обладают ярко выраженной гидрофобностью и, кроме того, сильно поглощают ультрафиолетовый свет вблизи максимума поглощения при длине волны 260 тц. (По интенсивности УФ-поглощения можно количественно определять содержание ДНК или РНК в водном растворе.) Все эти молекулы плоские и содержат активные атомы и группы (N, NH, Nh4, О), способные образовывать водородные связи. Ковалентные связи всех нуклеиновых оснований с линейными частями звеньев ДНК и РНК осуществляются по NH-группам, окруженным пунктирами.
Теперь мы уже можем их назвать — это пары: А—Т и Г—Ц.
Заметим, что в паре Г—Ц три связи, а в А—Т только две. Мы вправе заключить, что первая пара связана прочнее. Анализ наружных («линейных») участков нуклеотидов ДНК подтвердил, что они содержат плоские молекулы сахара дезоксирибозы (у РНК — рибозы)
В пятичленных кольцах этих Сахаров находится по четыре атома углерода, пятый атом углерода расположен вне кольца. Следует обратить внимание на нумерацию углеродов от Г до 5' (штрихи при номерах роли не играют — они «пришли» из общепринятой химической номенклатуры). Обведенные пунктиром гидроксилы в обеих молекулах участвуют в образовании ковалентных связей с нуклеиновыми основаниями.
В линейную часть звена ДНК (и РНК) входит еще остаток ортофосфорной кислоты. На рис. 25 изображена в полном составе пара кодирующих звеньев ДНК. В изображении используются общепринятые упрощения: во всех свободных углах колец надо представить себе стоящие там атомы углерода, а на концах выходящих из этих углов черточек — атомы водорода. Еще раз обратите внимание на нумерацию углеродов в дезоксирибозах. Не случайно на рис. 25 правый нуклеотид (Т) изображен как бы «вниз головой» относительно левого нуклеотида (А). Как видно из рис. 26, такое относительное расположение имеет место во всех парах цепи ДНК. Оно диктуется необходимостью соответственного положения оснований (при котором сближены группы, образующие водородные связи) и сахаро-фосфатных связей между нуклеотидами каждой нити. Комплементарные нити ДНК оказываются противоположно направленными. Если, к примеру, мы примем за направление нити переход от 5'-углерода одной концевой молекулы дезоксирибозы, несущей фосфатную группу, к 3'-углероду другой концевой дезоксирибозы, несущей ОН-группу, то тем самым мы определим направление всей нити. Такое направление принято называть направлением от 5'-конца нити к ее 3'-концу или сокращению
На рис. эти направления для обеих нитей указаны стрелками. Они противоположны. Отсюда следует, что переходя от звена к звену в двунитевой ДНК (т. е. от одной пары связанных нуклеиновых оснований к следующей паре) мы неизбежно будем двигаться по одной нити в направлении 5'-3', а по второй в направлении 3'-5'. Это обстоятельство следует запомнить.
На рис. для простоты нуклеиновые основания были обозначены кружками. Рис. 2 изображает полную структуру двухзвенного фрагмента ДНК. Штриховка означает, что плоскости оснований перпендикулярны направлению параллельных сахаро-фосфатных цепочек.
Рис. 2
Сопоставив суммарные элементарные составы пар А—Т и Г— Ц легко подсчитать, что они почти одинаковы. Если же учесть, что усреднение элементарного состава всей молекулы ДНК происходит по более, чем миллиону пар, можно с еще большей уверенностью, чем для белков, утверждать, что элементарный состав всех ДНК одинаков. Он оказался совсем иным, чем у белков (см. выше), а именно: 33,1% С; 38,2% О; 15,7% N и 9,3% Р.
Подробно рассмотрев состав и структуру ДНК, можно для РНК ограничиться лишь краткими замечаниями. С учетом того, что замена тимина на урацил в составе РНК ведет к отличию всего в двух атомах водорода, а дезоксирибозы на рибозу — в одном атоме кислорода, можно утверждать, что элементарный состав РНК такой же, как у ДНК. Главное отличие в том, что большинство РНК — однонитевые молекулы. Им ведь нет нужды реплицироваться. (Впрочем, последнее замечание сегодня, в 2001 году, звучит не столь категорически, как даже год назад, ввиду совсем недавнего обнаружения возможности репликации РНК с помощью фермента «рйбозима».)
Давно известно, что на отдельных небольших участках нить РНК может спариваться сама на себя, благодаря разнесенным по ее длине комплементарным участкам. Такое образование двунитевых участков, по-видимому, важно для структурирования и функционирования больших (например, рибосомальных) молекул РНК и малых молекул тРНК.
Наконец, следует иметь в виду, что растворы РНК, благодаря гибкой однонитевой структуре ее молекул, обладают гораздо меньшей вязкостью, чем растворы ДНК. Еще, в отличие от ДНК, РНК можно расцепить до нуклеотидов обработкой слабым щелочным раствором. Способность к поглощению света в УФ-области у обоих типов молекул нуклеиновых кислот одинакова.
Механизм редупликации ДНК
Здесь целесообразно лишь вкратце повторить основные представления о фундаментальных жизненных процессах: редупликации ДНК, транскрипции ее с переносом наследственной информации на иРНК и механизме трансляции — синтезе белка, направляемом этой информацией.
Разумеется, по ходу дела мы сделаем некоторые уточнения и добавим ряд деталей к описаниям названных процессов.
Редупликацию ДНК (копирование «материнской» ДНК при делении клетки) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-уг-леродом дезоксирибозы. Следовательно к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении б'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-поли-мераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 тыс. дальтон, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизоме-разы». Он продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимера-за, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-поли-мераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему(«танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Каждому, кто пробовал просто раздвинуть концы двух скрученных в спираль веревок (противоположные концы которых закреплены) знает, что сначала это удается сделать легко, потом все труднее, а затем становится и невозможно. Это происходит потому, что концы веревок именно раздвигаются, а не раскручиваются. Остальная часть спирали при этом уплотняется, сохраняя прежнее число витков, что и создает напряжение, мешающее дальнейшему раздвижению концов. Достаточно теперь у вершины вилки перерезать одну веревку, как плотно скрученная ее часть начинает вращаться до тех пор, пока напряжение уплотнения витков не будет снято. Одновременно будет вращаться вокруг своей оси и не перерезанная ветвь раздвинутой веревки. Отрезанная ветвь, если она сохранила какое-то сцепление, хотя бы в одной точке, с другой ветвью, будет без напряжения вращаться вместе с нею...
Подобный описанному процесс, вероятно, осуществляется и в ходе репликации ДНК. Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК 'тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топо-изомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а ге-ликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-кон-цу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед. Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того
места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений. '
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме.
Конечно, все описанные механизмы были установлены для E.coli и подтверждены для других микроорганизмов. Имела ли смысл вся эта огромная работа, с точки зрения познания процессов передачи наследственной информации у высших организмов? Безусловно имела! Во-первых, исследователи не раз убеждались в том, что фундаментальные реакции на разных уровнях развития организмов протекают сходным образом. Во-вторых, ферменты, выделенные из бактерий, хорошо ведут in vitro редупликацию ДНК, полученных из любых источников, и потому представляют собой прекрасный инструмент для исследования этих ДНК.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: ос, Р, у, 5 и е. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза 5. ДНК-полимераза а отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза Р — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза у ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы с пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек (как — непонятно). Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы 5 служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований. Всем бы корректорам такую тщательность!
Литература:
Ахмеджанов М.Ю., Гуз С.Я., Архангельский В.В. Динамика содержания триглицеридов, общего холестерина и его фракций в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда и при санаторно-курортном лечении. // Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внутренних органов. — Ужгород, -1983. -С.52.
Баев В.П., Булах Е.П. Определение кетоновых тел в крови и тканях. // Лабораторное дело. -1974. -N 9. -С.545.
www.ronl.ru
Реферат на тему:
Химия нуклеиновых кислот
2009
Начнем с ДНК. Ее физические характеристики и «конструктивные» особенности были достаточно подробно описаны во введении. Настало время подробнее познакомиться с нуклеотидами, уточнить понятие «комплементарное», конкретно познакомиться со слабыми («водородными») связями, удерживающими две цепи ДНК друг подле друга, и строением самих цепей.
Путем ферментативного гидролиза гигантские молекулы ДНК удается полностью разбить на составляющие звенья и разделить их с помощью уже упомянутого метода хроматографии. Физико-химический анализ показал, что эти звенья («нуклеотиды») имеют в своем составе (подобно аминокислотам) одинаковые линейные элементы, которые собственно говоря, и выстраивают цепь, а также боковые ветви («нуклеиновые основания»), которыми они отличаются. Таковых оказалось, действительно всего четыре: два относительно меньших размеров —цитозин (Ц) и тимин (Т) и два более крупных — аденин (А) и гуанин (Г), и основание урацил (У), которое в РНК заменяет тимин.
Менее крупные молекулы (Ц, Т, У) являются производными молекулы пиримидина и потому называются пиримидиновыми основаниями. Две более крупных молекулы, — производные пурина, — именуются пуриновыми основаниями,
Все эти нуклеиновые основания содержат гетероциклы с сопряженными связями. Такие молекулы обладают ярко выраженной гидрофобностью и, кроме того, сильно поглощают ультрафиолетовый свет вблизи максимума поглощения при длине волны 260 тц. (По интенсивности УФ-поглощения можно количественно определять содержание ДНК или РНК в водном растворе.) Все эти молекулы плоские и содержат активные атомы и группы (N, NH, Nh4, О), способные образовывать водородные связи. Ковалентные связи всех нуклеиновых оснований с линейными частями звеньев ДНК и РНК осуществляются по NH-группам, окруженным пунктирами.
Теперь мы уже можем их назвать — это пары: А—Т и Г—Ц.
Заметим, что в паре Г—Ц три связи, а в А—Т только две. Мы вправе заключить, что первая пара связана прочнее. Анализ наружных («линейных») участков нуклеотидов ДНК подтвердил, что они содержат плоские молекулы сахара дезоксирибозы (у РНК — рибозы)
В пятичленных кольцах этих Сахаров находится по четыре атома углерода, пятый атом углерода расположен вне кольца. Следует обратить внимание на нумерацию углеродов от Г до 5' (штрихи при номерах роли не играют — они «пришли» из общепринятой химической номенклатуры). Обведенные пунктиром гидроксилы в обеих молекулах участвуют в образовании ковалентных связей с нуклеиновыми основаниями.
В линейную часть звена ДНК (и РНК) входит еще остаток ортофосфорной кислоты. На рис. 25 изображена в полном составе пара кодирующих звеньев ДНК. В изображении используются общепринятые упрощения: во всех свободных углах колец надо представить себе стоящие там атомы углерода, а на концах выходящих из этих углов черточек — атомы водорода. Еще раз обратите внимание на нумерацию углеродов в дезоксирибозах. Не случайно на рис. 25 правый нуклеотид (Т) изображен как бы «вниз головой» относительно левого нуклеотида (А). Как видно из рис. 26, такое относительное расположение имеет место во всех парах цепи ДНК. Оно диктуется необходимостью соответственного положения оснований (при котором сближены группы, образующие водородные связи) и сахаро-фосфатных связей между нуклеотидами каждой нити. Комплементарные нити ДНК оказываются противоположно направленными. Если, к примеру, мы примем за направление нити переход от 5'-углерода одной концевой молекулы дезоксирибозы, несущей фосфатную группу, к 3'-углероду другой концевой дезоксирибозы, несущей ОН-группу, то тем самым мы определим направление всей нити. Такое направление принято называть направлением от 5'-конца нити к ее 3'-концу или сокращению
На рис. эти направления для обеих нитей указаны стрелками. Они противоположны. Отсюда следует, что переходя от звена к звену в двунитевой ДНК (т. е. от одной пары связанных нуклеиновых оснований к следующей паре) мы неизбежно будем двигаться по одной нити в направлении 5'-3', а по второй в направлении 3'-5'. Это обстоятельство следует запомнить.
На рис. для простоты нуклеиновые основания были обозначены кружками. Рис. 2 изображает полную структуру двухзвенного фрагмента ДНК. Штриховка означает, что плоскости оснований перпендикулярны направлению параллельных сахаро-фосфатных цепочек.
Рис. 2
Сопоставив суммарные элементарные составы пар А—Т и Г— Ц легко подсчитать, что они почти одинаковы. Если же учесть, что усреднение элементарного состава всей молекулы ДНК происходит по более, чем миллиону пар, можно с еще большей уверенностью, чем для белков, утверждать, что элементарный состав всех ДНК одинаков. Он оказался совсем иным, чем у белков (см. выше), а именно: 33,1% С; 38,2% О; 15,7% N и 9,3% Р.
Подробно рассмотрев состав и структуру ДНК, можно для РНК ограничиться лишь краткими замечаниями. С учетом того, что замена тимина на урацил в составе РНК ведет к отличию всего в двух атомах водорода, а дезоксирибозы на рибозу — в одном атоме кислорода, можно утверждать, что элементарный состав РНК такой же, как у ДНК. Главное отличие в том, что большинство РНК — однонитевые молекулы. Им ведь нет нужды реплицироваться. (Впрочем, последнее замечание сегодня, в 2001 году, звучит не столь категорически, как даже год назад, ввиду совсем недавнего обнаружения возможности репликации РНК с помощью фермента «рйбозима».)
Давно известно, что на отдельных небольших участках нить РНК может спариваться сама на себя, благодаря разнесенным по ее длине комплементарным участкам. Такое образование двунитевых участков, по-видимому, важно для структурирования и функционирования больших (например, рибосомальных) молекул РНК и малых молекул тРНК.
Наконец, следует иметь в виду, что растворы РНК, благодаря гибкой однонитевой структуре ее молекул, обладают гораздо меньшей вязкостью, чем растворы ДНК. Еще, в отличие от ДНК, РНК можно расцепить до нуклеотидов обработкой слабым щелочным раствором. Способность к поглощению света в УФ-области у обоих типов молекул нуклеиновых кислот одинакова.
Механизм редупликации ДНК
Здесь целесообразно лишь вкратце повторить основные представления о фундаментальных жизненных процессах: редупликации ДНК, транскрипции ее с переносом наследственной информации на иРНК и механизме трансляции — синтезе белка, направляемом этой информацией.
Разумеется, по ходу дела мы сделаем некоторые уточнения и добавим ряд деталей к описаниям названных процессов.
Редупликацию ДНК (копирование «материнской» ДНК при делении клетки) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-уг-леродом дезоксирибозы. Следовательно к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении б'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-поли-мераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 тыс. дальтон, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизоме-разы». Он продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимера-за, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-поли-мераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему(«танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Каждому, кто пробовал просто раздвинуть концы двух скрученных в спираль веревок (противоположные концы которых закреплены) знает, что сначала это удается сделать легко, потом все труднее, а затем становится и невозможно. Это происходит потому, что концы веревок именно раздвигаются, а не раскручиваются. Остальная часть спирали при этом уплотняется, сохраняя прежнее число витков, что и создает напряжение, мешающее дальнейшему раздвижению концов. Достаточно теперь у вершины вилки перерезать одну веревку, как плотно скрученная ее часть начинает вращаться до тех пор, пока напряжение уплотнения витков не будет снято. Одновременно будет вращаться вокруг своей оси и не перерезанная ветвь раздвинутой веревки. Отрезанная ветвь, если она сохранила какое-то сцепление, хотя бы в одной точке, с другой ветвью, будет без напряжения вращаться вместе с нею...
Подобный описанному процесс, вероятно, осуществляется и в ходе репликации ДНК. Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК 'тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топо-изомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а ге-ликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-кон-цу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед. Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того
места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений. '
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме.
Конечно, все описанные механизмы были установлены для E.coli и подтверждены для других микроорганизмов. Имела ли смысл вся эта огромная работа, с точки зрения познания процессов передачи наследственной информации у высших организмов? Безусловно имела! Во-первых, исследователи не раз убеждались в том, что фундаментальные реакции на разных уровнях развития организмов протекают сходным образом. Во-вторых, ферменты, выделенные из бактерий, хорошо ведут in vitro редупликацию ДНК, полученных из любых источников, и потому представляют собой прекрасный инструмент для исследования этих ДНК.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: ос, Р, у, 5 и е. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза 5. ДНК-полимераза а отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза Р — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза у ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы с пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек (как — непонятно). Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы 5 служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований. Всем бы корректорам такую тщательность!
Литература:
Ахмеджанов М.Ю., Гуз С.Я., Архангельский В.В. Динамика содержания триглицеридов, общего холестерина и его фракций в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда и при санаторно-курортном лечении. // Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внутренних органов. — Ужгород, -1983. -С.52.
Баев В.П., Булах Е.П. Определение кетоновых тел в крови и тканях. // Лабораторное дело. -1974. -N 9. -С.545.
www.ronl.ru
Нуклеиновые кислоты, биополимеры, состоящие из остатков фосфорной кислоты, сахаров и азотистых оснований (пуринов и пиримидинов). Имеют фундаментальное биологическое значение, поскольку содержат в закодированном виде всю генетическую информацию любого живого организма, от человека до бактерий и вирусов, передаваемую от одного поколения другому.
Нуклеиновые кислоты были впервые выделены из клеток гноя человека и спермы лосося швейцарским врачом и биохимиком Ф.Мишером между 1869 и 1871. Впоследствии было установлено, что существует два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая (РНК) и дезоксирибонуклеиновая (ДНК), однако их функции долго оставались неизвестными.
В 1928 английский бактериолог Ф.Гриффит обнаружил, что убитые патогенные пневмококки могут изменять генетические свойства живых непатогенных пневмококков, превращая последние в патогенные. В 1945 микробиолог О.Эвери из Рокфеллеровского института в Нью-Йорке сделал важное открытие: он показал, что способность к генетической трансформации обусловлена переносом ДНК из одной клетки в другую, а следовательно, генетический материал представляет собой ДНК. В 1940–1950 Дж.Бидл и Э.Тейтум из Станфордского университета (шт. Калифорния) обнаружили, что синтез белков, в частности ферментов, контролируется специфическими генами. В 1942 Т.Касперсон в Швеции и Ж.Браше в Бельгии открыли, что нуклеиновых кислот особенно много в клетках, активно синтезирующих белки. Все эти данные наводили на мысль, что генетический материал – это нуклеиновая кислота и что она как-то участвует в синтезе белков. Однако в то время многие полагали, что молекулы нуклеиновых кислот, несмотря на их большую длину, имеют слишком простую периодически повторяющуюся структуру, чтобы нести достаточно информации и служить генетическим материалом. Но в конце 1940-х годов Э.Чаргафф в США и Дж.Уайатт в Канаде, используя метод распределительной хроматографии на бумаге, показали, что структура ДНК не столь проста и эта молекула может служить носителем генетической информации.
Структура ДНК была установлена в 1953 М.Уилкинсом, Дж.Уотсоном и Ф.Криком в Англии. Это фундаментальное открытие позволило понять, как происходит удвоение (репликация) нуклеиновых кислот. Вскоре после этого американские исследователи А.Даунс и Дж.Гамов предположили, что структура белков каким-то образом закодирована в нуклеиновых кислотах, а к 1965 эта гипотеза была подтверждена многими исследователями: Ф.Криком в Англии, М.Ниренбергом и С.Очоа в США, Х.Кораной в Индии. Все эти открытия, результат столетнего изучения нуклеиновых кислот, произвели подлинную революцию в биологии. Они позволили объяснить феномен жизни в рамках взаимодействия между атомами и молекулами.
Типы и распространение. Как мы уже говорили, есть два типа нуклеиновых кислот: ДНК и РНК. ДНК присутствует в ядрах всех растительных и животных клеток, где она находится в комплексе с белками и является составной частью хромосом. У особей каждого конкретного вида содержание ядерной ДНК обычно одинаково во всех клетках, кроме гамет (яйцеклеток и сперматозоидов), где ДНК вдвое меньше. Таким образом, количество клеточной ДНК видоспецифично. ДНК найдена и вне ядра: в митохондриях («энергетических станциях» клеток) и в хлоропластах (частицах, где в растительных клетках идет фотосинтез). Эти субклеточные частицы обладают некоторой генетической автономией.
Бактерии и цианобактерии (сине-зеленые водоросли) содержат вместо хромосом одну или две крупные молекулы ДНК, связанные с небольшим количеством белка, и часто – молекулы ДНК меньшего размера, называемые плазмидами. Плазмиды несут полезную генетическую информацию, например содержат гены устойчивости к антибиотикам, но для жизни самой клетки они несущественны.
Некоторое количество РНК присутствует в клеточном ядре, основная же ее масса находится в цитоплазме – жидком содержимом клетки. Бльшую ее часть составляет рибосомная РНК (рРНК). Рибосомы – это мельчайшие тельца, на которых идет синтез белка. Небольшое количество РНК представлено транспортной РНК (тРНК), которая также участвует в белковом синтезе. Однако оба этих класса РНК не несут информации о структуре белков – такая информация заключена в матричной, или информационной, РНК (мРНК), на долю которой приходится лишь небольшая часть суммарной клеточной РНК.
Генетический материал вирусов представлен либо ДНК, либо РНК, но никогда обеими одновременно.
Общие свойства
Молекулы нуклеиновых кислот содержат множество отрицательно заряженных фосфатных групп и образуют комплексы с ионами металлов; их калиевая и натриевая соли хорошо растворимы в воде. Концентрированные растворы нуклеиновых кислот очень вязкие и слегка опалесцируют, а в твердом виде эти вещества белые. Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолетовый свет, и это свойство лежит в основе определения их концентрации. С этим же свойством связан и мутагенный эффект ультрафиолетового света.
Длинные молекулы ДНК хрупки и легко ломаются, например при продавливании раствора через шприц. Поэтому работа с высокомолекулярными ДНК требует особой осторожности.
Химическая структура. Нуклеиновые кислоты это длинные цепочки, состоящие из четырех многократно повторяющихся единиц (нуклеотидов). Их структуру можно представить следующим образом:
Символ Ф обозначает фосфатную группу. Чередующиеся остатки сахара и фосфорной кислоты образуют сахарофосфатный остов молекулы, одинаковый у всех ДНК, а огромное их разнообразие обусловливается тем, что четыре азотистых основания могут располагаться вдоль цепи в самой разной последовательности.
Сахаром в нуклеиновых кислотах является пентоза; четыре из пяти ее углеродных атомов вместе с одним атомом кислорода образуют кольцо. Атомы углерода пентозы обозначают номерами от 1 до 5. В РНК сахар представлен рибозой, а в ДНК дезоксирибозой, содержащей на один атом кислорода меньше. Фрагменты полинуклеотидных цепей ДНК и РНК показаны на рисунке.
Поскольку фосфатные группы присоединены к сахару асимметрично, в положениях 3 и 5, молекула нуклеиновой кислоты имеет определенное направление. Сложноэфирные связи между мономерными единицами нуклеиновых кислот чувствительны к гидролитическому расщеплению (ферментативному или химическому), которое приводит к высвобождению отдельных компонентов в виде небольших молекул.
Азотистые основания – это плоские гетероциклические соединения. Они присоединены к пентозному кольцу по положению 1. Более крупные основания имеют два кольца и называются пуринами: это аденин (А) и гуанин (Г). Основания, меньшие по размерам, имеют одно кольцо и называются пиримидинами: это цитозин (Ц), тимин (Т) и урацил (У). В ДНК входят основания А, Г, Т и Ц, в РНК вместо Т присутствует У. Последний отличается от тимина тем, что у него отсутствует метильная группа (Ch4). Урацил встречается в ДНК некоторых вирусов, где он выполняет ту же функцию, что и тимин.
Трехмерная структура. Важной особенностью нуклеиновых кислот является регулярность пространственного расположения составляющих их атомов, установленная рентгеноструктурным методом. Молекула ДНК состоит из двух противоположно направленных цепей (иногда содержащих миллионы нуклеотидов), удерживаемых вместе водородными связями между основаниями:
Водородные связи, соединяющие основания противоположных цепей, относятся к категории слабых, но благодаря своей многочисленности в молекуле ДНК они прочно стабилизируют ее структуру. Однако если раствор ДНК нагреть примерно до 60 С, эти связи рвутся и цепи расходятся – происходит денатурация ДНК (плавление).
Обе цепи ДНК закручены по спирали относительно воображаемой оси, как будто они навиты на цилиндр. Эта структура называется двойной спиралью. На каждый виток спирали приходится десять пар оснований.
Правило комплементарности. Уотсон и Крик показали, что образование водородных связей и регулярной двойной спирали возможно только тогда, когда более крупное пуриновое основание аденин (А) в одной цепи имеет своим партнером в другой цепи меньшее по размерам пиримидиновое основание тимин (Т), а гуанин (Г) связан с цитозином (Ц). Эту закономерность можно представить следующим образом:
Соответствие АТ и ГЦ называют правилом комплементарности, а сами цепи комплементарными. Согласно этому правилу, содержание аденина в ДНК всегда равно содержанию тимина, а количество гуанина – количеству цитозина. Следует отметить, что две цепи ДНК, различаясь химически, несут одинаковую информацию, поскольку вследствие комплементарности одна цепь однозначно задает другую.
Структура РНК менее упорядочена. Обычно это одноцепочечная молекула, хотя РНК некоторых вирусов состоит из двух цепей. Но даже такая РНК более гибка, чем ДНК. Некоторые участки в молекуле РНК взаимно комплементарны и при изгибании цепи спариваются, образуя двухцепочечные структуры (шпильки). В первую очередь это относится к транспортным РНК (тРНК). Некоторые основания в тРНК подвергаются модификации уже после синтеза молекулы. Например, иногда происходит присоединение к ним метильных групп.
Функция нуклеиновых кислот
Одна из основных функций нуклеиновых кислот состоит в детерминации синтеза белков. Информация о структуре белков, закодированная в нуклеотидной последовательности ДНК, должна передаваться от одного поколения к другому, и поэтому необходимо ее безошибочное копирование, т.е. синтез точно такой же же молекулы ДНК (репликация).
Репликация и транскрипция. С химической точки зрения синтез нуклеиновой кислоты – это полимеризация, т.е. последовательное присоединение строительных блоков. Такими блоками служат нуклеозидтрифосфаты; реакцию можно представить следующим образом:
Энергия, необходимая для синтеза, высвобождается при отщеплении пирофосфата, а катализируют реакцию особые ферменты – ДНК-полимеразы.
В результате такого синтетического процесса мы получили бы полимер со случайной последовательностью оснований. Однако большинство полимераз работает только в присутствии уже существующей нуклеиновой кислоты –матрицы, диктующей, какой именно нуклеотид присоединится к концу цепи. Этот нуклеотид должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матрицы, так что новая цепь оказывается комплементарной исходной. Используя затем комплементарную цепь в качестве матрицы, мы получим точную копию оригинала.
ДНК состоит из двух взаимно комплементарных цепей. В ходе репликации они расходятся, и каждая из них служит матрицей для синтеза новой цепи:
Так образуются две новые двойные спирали с той же последовательностью оснований, что и у исходной ДНК. Иногда в процессе репликации происходит «сбой», и возникают мутации.
В результате транскрипции ДНК образуются клеточные РНК (мРНК, рРНК и тРНК):
Они комплементарны одной из цепей ДНК и являются копией другой цепи, за исключением того, что место тимина у них занимает урацил. Таким способом можно получить множество РНК-копий одной из цепей ДНК.
В нормальной клетке передача информации осуществляется только в направлении ДНК ДНК и ДНК РНК. Однако в клетках, инфицированных вирусом, возможны и другие процессы: РНК РНК и РНК ДНК. Генетический материал многих вирусов представлен молекулой РНК, обычно одноцепочечной. Проникнув в клетку-хозяина, эта РНК реплицируется с образованием комплементарной молекулы, на которой, в свою очередь, синтезируется множество копий исходной вирусной РНК:
Вирусная РНК может транскрибироваться ферментом обратной транскриптазой в ДНК, которая иногда включается в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Теперь эта ДНК несет вирусные гены, и после транскрипции в клетке может появиться вирусная РНК. Таким образом, спустя длительное время, в течение которого никакого вируса в клетке не обнаруживается, он снова в ней появится без повторного заражения. Вирусы, генетический материал которых включается в хромосому клетки-хозяина, часто являются причиной рака.
Трансляция нуклеиновых кислот в белки. Генетическая информация, закодированная в нуклеотидной последовательности ДНК, переводится не только на язык нуклеотидной последовательности РНК, но и на язык аминокислот – мономерных единиц белков.
Белковая молекула – это цепочка из аминокислот. Каждая аминокислота содержит кислую карбоксильную группу –COOH и оснвную аминогруппу
–Nh3. Карбоксильная группа одной аминокислоты связывается с аминогруппой другой, образуя амидную связь, и этот процесс продолжается, пока не образуется цепь, содержащая до 1000 аминокислот.
В белках присутствует 20 разных аминокислот, от последовательности которых зависят их природа и функции. Эта последовательность определяется нуклеотидной последовательностью соответствующего гена – участка ДНК, кодирующего данный белок. Однако сама ДНК не является матрицей при синтезе белка. Сначала она транскрибируется в ядре с образованием матричной РНК (мРНК), которая диффундирует в цитоплазму, и на ней как на матрице синтезируется белок. Процесс ускоряется благодаря тому, что на каждой молекуле мРНК может одновременно синтезироваться множество белковых молекул.
Репликация нуклеиновых кислот осуществляется благодаря образованию водородных связей между комплементарными основаниями исходной и дочерней цепей. Аминокислоты не образуют водородных связей с основаниями, так что прямое копирование матрицы невозможно. Они взаимодействуют с матрицей опосредованно, через «адапторные» нуклеиновые кислоты – небольшие молекулы транспортных РНК (тРНК), состоящие примерно из 80 оснований и способные связываться с мРНК.
Каждая тРНК содержит специфическую последовательность из трех оснований, антикодон, который комплементарен группе из трех оснований, кодону, в мРНК. Антикодоны взаимодействуют с кодонами по правилу комплементарности, примерно так же, как взаимодействуют две цепи ДНК. Таким образом, последовательность оснований в мРНК определяет порядок присоединения тРНК, несущих аминокислоты. Схематически перенос информации от ДНК к белку можно представить следующим образом:
Последовательность оснований в ДНК задает порядок следования аминокислот в белке, поскольку каждая аминокислота присоединяется специфическим ферментом только к определенным тРНК, а те, в свою очередь, – только к определенным кодонам в мРНК. Комплексы тРНК-аминокислота связываются с матрицей по одному в каждый данный момент времени. Ниже перечислены основные этапы белкового синтеза (см. также рисунок).
1. Ферменты, называемые аминоацил-тРНК-синтетазами, присоединяют аминокислоты к соответствующим тРНК. Таких ферментов 20, по одному для каждой аминокислоты.
2. Молекула мРНК присоединяется своим первым кодоном к небольшой частице, называемой рибосомой. Рибосомы состоят из примерно равных количеств рРНК и белка. Структура и функция рибосом весьма сложны, но главная их задача – облегчение взаимодействия мРНК и тРНК и ускорение полимеризации аминокислот, связанных с разными тРНК.
3. тРНК, нагруженная аминокислотой, связывается с соответствующим кодоном мРНК, которая, в свою очередь, контактирует с рибосомой. Образуется комплекс рибосома-мРНК-тРНК-аминокислота.
4. мРНК, подобно ленте на конвейере, продвигается по рибосоме на один кодон вперед.
5. Следующая тРНК, нагруженная аминокислотой, присоединяется ко второму кодону.
6. Первая и вторая аминокислоты связываются между собой.
7. Первая тРНК отсоединяется от комплекса, и теперь вторая тРНК несет две аминокислоты, связанные между собой.
8. мРНК снова продвигается на один кодон вперед, и все события повторяются, а растущая аминокислотная цепь удлиняется на одну аминокислоту. Процесс продолжается, пока не будет достигнут последний, «стоп»-кодон и последняя тРНК не отделится от готовой белковой цепи. В бактериальных клетках цепь из 100–200 аминокислот собирается за несколько секунд. В животных клетках этот процесс занимает около минуты.
Генетический код. Итак, каждая аминокислота в белке опосредованно детерминируется определенным кодоном (группой из 3 оснований) в мРНК и в конечном счете в ДНК. Поскольку в нуклеиновых кислотах имеется четыре вида оснований, число возможных кодонов составляет 444 = 64. Соответствие между кодонами и аминокислотами, которые они кодируют, называется генетическим или биологическим кодом. Это соответствие было установлено опытным путем: к разрушенным клеткам добавляли синтетические полинуклеотиды известного состава и смотрели, какие аминокислоты включаются в белки. Позднее появилась возможность прямо сравнить последовательности аминокислот в вирусных белках и оснований в вирусных нуклеиновых кислотах. Чрезвычайно интересно, что генетический код, за редкими исключениями, одинаков для всех организмов – от вирусов до человека. Одно из таких исключений составляют изменения в генетическом коде, используемом митохондриями. Митохондрии это небольшие автономные субклеточные частицы (органеллы), присутствующие во всех клетках, кроме бактерий и зрелых эритроцитов. Предполагают, что когда-то митохондрии были самостоятельными организмами; проникнув в клетки, они со временем стали их неотъемлемой частью, но сохранили некоторое количество собственной ДНК и синтезируют несколько митохондриальных белков.
| Аланин | Аргинин | Аспарагин | Аспарагиновая кислота | |
| ГЦУ | ЦГУ | ГАУ | ААУ | |
| ГЦЦ | ЦГЦ | ГАЦ | ААЦ | |
| ГЦА | ЦГА | |||
| ГЦГ | ЦГГ | |||
| АГА | ||||
| АГГ | ||||
| Валин | Гистидин | Глицин | Глутаминовая кислота | |
| ГУУ | ЦАУ | ГГУ | ЦАА | |
| ГУЦ | ЦАЦ | ГГЦ | ЦАГ | |
| ГУА | ГГА | |||
| ГУГ | ГГГ | |||
| Глутамин | Изолейцин | Лейцин | Лизин | |
| ГАА | АУУ | УУА | ААА | |
| ГАГ | АУЦ | УУГ | ААГ | |
| АУА | ЦУУ | |||
| ЦУЦ | ||||
| ЦУА | ||||
| ЦУГ | ||||
| Метионин | Пролин | Серин | Тирозин | |
| АУГ | ЦЦУ | АГУ | УАУ | |
| ЦЦЦ | АГЦ | УАЦ | ||
| ЦЦА | УЦА | |||
| ЦЦГ | УЦГ | |||
| УЦУ | ||||
| УЦЦ | ||||
| Треонин | Триптофан | Фенилаланин | Цистеин | Нет |
| АЦУ | УГГ | УУУ | УГУ | УАА |
| АЦЦ | УУЦ | УГЦ | УАГ | |
| АЦА | УГА | |||
| АЦГ | ||||
| ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СЛОВАРЬ: указаны аминокислоты, встречающиеся в белках, и соответствующие им кодоны в мРНК. «Буквы» в кодонах записаны в направлении 5' 3'. В этом же направлении идут транскрипции нуклеиновых кислот и синтез белка на матрице. «Нет» означает, что кодон не кодирует никаких аминокислот; такие кодоны называются «бессмысленными». Генетический словарь одинаков для всех живых организмов – от вирусов до человека. |
Вообще говоря, каждой аминокислоте соответствует более одного кодона. Большинство кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту, имеют два одинаковых первых основания, но в трех случаях (для лейцина, серина и аргинина) имеются два альтернативных набора первых дублетов в кодонах, соответствующих одной и той же аминокислоте. Природа основания в третьем положении не столь важна; одна и та же аминокислота глицин может кодироваться по-разному: ГГУ, ГГЦ, ГГА и ГГГ. Однако кодоны для двух разных аминокислот могут иметь два одинаковых первых основания, и тогда различие между ними будет определяться природой третьего основания – пурином или пиримидином. Так, гистидин кодируется триплетами ЦАУ и ЦАЦ, а глутамин ЦАА и ЦАГ. Три кодона, УАА, УАГ и УГА, не кодируют никаких аминокислот и называются «бессмысленными».
Одна молекула ДНК кодирует много белковых цепей. Каждый отрезок, кодирующий одну цепь, называют цистроном. Начало и конец цистрона, а также граница раздела между ними помечаются с помощью своего рода знаков химической пунктуации. По крайней мере у бактерий в начале цистрона находится метиониновый кодон АУГ. Логично предположить, что первой аминокислотой в белке всегда должен быть метионин, но часто несколько первых аминокислот отщепляются ферментативно после окончания синтеза белка. Конец белковой цепи помечается одним или несколькими «бессмысленными» кодонами.
У бактерий (прокариот) практически вся ДНК кодирует какие-либо белки или тРНК. Однако у высших форм (эукариот) значительная часть ДНК состоит из простых повторяющихся последовательностей и «молчащих» генов, которые не транскрибируются в РНК и поэтому не транслируются в белки. Кроме того, исходно синтезированная мРНК содержит участки, не детерминирующие никаких белковых последовательностей. Такие участки (интроны), расположенные между кодирующими участками (экзонами), перед началом синтеза белка удаляются специальными ферментами. Почему в ДНК существуют эти казалось бы бесполезные сегменты – неясно; возможно, они выполняют регуляторные функции.
У простейшей Tetrahymena РНК сама удаляет свои интроны и соединяет свободные концы цепей, действуя как фермент по отношению к себе самой. Это единственное известное исключение из правила, согласно которому нуклеиновые кислоты не обладают ферментативной активностью.
Транспортные РНК и супрессия. Смысл информации, содержащейся в ДНК, если переводить ее на язык аминокислот, определяется как самой ДНК, так и считывающим механизмом, т.е. зависит не только от того, какие кодоны есть в ДНК и в какой последовательности они расположены, но также и от того, какие именно аминокислоты (и к каким тРНК) присоединяют аминоацил-тРНК-синтетазы. Конечно, природа синтетаз и тРНК тоже определяется ДНК, и в этом смысле ДНК является первичным детерминантом белковой последовательности. Тем не менее суммарная детерминация представляет собой функцию всей системы, поскольку результат зависит от исходных компонентов. Если бы соответствие между тРНК и аминокислотами было другим, смысл кодонов тоже изменился бы.
Известно, что мутации в ДНК изменяют считывающий механизм и в результате меняют – пусть и незначительно – смысл кодонов. Так, в бактерии Escherichia coli глициновая тРНК обычно узнает в мРНК кодон ГГА; мутация в ДНК, с которой транскрибируется эта тРНК, изменяет антикодон глициновой тРНК таким образом, что теперь он узнает кодон АГА, соответствующий аргинину, и в белковой молекуле вместо аргинина появляется глицин. Это не обязательно имеет фатальные последствия, поскольку не все аргинины кодируются триплетом АГА и есть аргининовые тРНК, по-прежнему узнающие «свои» АГА. В результате измененными оказываются не все белковые молекулы. Иногда такие мутации, изменяющие антикодон, подавляют (супрессируют) мутации в кодоне. Например, если в результате мутации глициновый кодон ГГА превращается в АГА, он все же может прочитываться как глицин, если антикодон глициновой тРНК, в свою очередь, изменился так, что эта тРНК стала узнавать АГА. В этом случае вторая «ошибка» устраняет первую.
Мутации, приводящие к изменению антикодонов, могут иметь разные последствия, поскольку один и тот же кодон может узнаваться несколькими тРНК. Вообще говоря, узнавание осуществляется благодаря комплементарности оснований кодона и антикодона, однако одно из оснований кодона может модифицироваться таким образом, что антикодон будет узнавать даже неполностью комплементарный кодон. В результате одна и та же тРНК может взаимодействовать с несколькими разными кодонами, кодирующими одну и ту же аминокислоту. Этот феномен неполного соответствия кодона и антикодона был назван Ф.Криком «шатанием».
Регуляция активности генов. Для организма было бы катастрофой, если бы во всех его клетках одновременно работали все гены и синтезировались все закодированные ими белки. Бактерии, например, должны все время приспосабливаться к условиям среды, синтезируя нужные ферменты. Все клетки высших организмов имеют один и тот же набор генов, но, к счастью, клетки мозга не продуцируют пищеварительные ферменты, а в хрусталике глаза не синтезируются мышечные белки.
Активность гена характеризуется тем, транскрибируется ли он с образованием соответствующей мРНК. ДНК длинная молекула, и в определенных ее участках имеются последовательности, называемые промоторами, которые распознаются специфическим транскрибирующим ферментом полимеразой. В этих участках и только в них начинается транскрипция, продолжаясь до тех пор, пока не достигнет последовательности оснований, означающей конец считывания.
Существуют особые репрессорные белки, которые связываются с ДНК поблизости от промотора в участке, называемом оператором. Образовавшийся комплекс блокирует транскрипцию, и мРНК не синтезируется. Таким образом, репрессорные белки являются ингибиторами транскрипции. С другой стороны, существуют небольшие молекулы, которые образуют комплекс с репрессорами и снимают их блокирующее действие на транскрипцию. Иными словами, они ингибируют ингибиторы. Так, у бактерий в норме отсутствуют ферменты, катализирующие расщепление некоторых сахаров; однако если один из этих сахаров появляется в среде, он образует комплекс с репрессором, ингибирование снимается и запускается синтез соответствующего фермента. Ферменты, синтез которых индуцируется собственными субстратами, называются индуцибельными. В ряде случаев, наоборот, репрессорный белок не блокирует транскрипцию мРНК, если он не связан с определенной молекулой. У бактерий некоторые ферменты, участвующие в синтезе определенных аминокислот, образуются только в отсутствие этих аминокислот, т.е. бактерии производят данные ферменты лишь по мере надобности. Если добавить в среду соответствующую аминокислоту, она образует комплекс с репрессором и активирует его, а тем самым ингибирует транскрипцию соответствующих генов. Уже образовавшаяся мРНК вскоре расщепляется, и синтез ферментов останавливается. Такие ферменты являются отрицально индуцибельными.
Поскольку репрессорные белки сами кодируются генами, работа которых, в свою очередь, может регулироваться другими генами, а синтез малых молекул-индукторов и гормонов также в конечном счете регулируется генами, механизмы регуляции генной активности могут быть очень сложными.
Список литературы
Ичас М. Биологический код. М., 1971
Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов, М., 1978
Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М., 1987
www.ronl.ru
