Реферат на тему:
Микроскопия (МКС) (лат. μΙκροσ — мелкий, маленький и σκοποσ — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, многофотонная микроскопия, рентгеновская микроскопия или рентгеновская лазерная микроскопия, отличающиеся использованием электромагнитных лучей с возможностью рассмотрения и получения изображений микроэлементов вещества в зависимости от разрешающей способности приборов (микроскопов).
До создания рентгеновских микроскопов работали с оптическими приборами, использующими лучи видимого света, так как и глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Соответственно, оптические микроскопы не могли иметь разрешения менее полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина волн 0,4—0,7 мкм, или 400—700 нм) c возможным максимальным увеличением в 2000 раз.[1]
Идея просвечивающего электронного микроскопа состояла в замене опорного электромагнитного излучения на электронный пучок. Известно, что для увеличения разрешения микроскопов, использующих электромагнитное излучение, необходимо уменьшение длины волны электромагнитного излучения до ультрафиолетового диапазон вплоть до рентгеновского (длина волны сопоставима с межатомными расстояниями в веществе) и основная трудность состоит в фокусировке ультрафиолетовых и, тем более, рентгеновских лучей. Последние вообще не поддаются фокусировке.
Особенность взаимодействия рентгеновских лучей с веществом отличает рентгеновские оптические системы от оптических систем для световых и электронных лучей. (Малое отклонение показателя преломления рентгеновских лучей от единицы (меньше чем на 10−4) практически не позволяет использовать для их фокусировки линзы и призмы. Электрические и магнитные линзы для этой цели также неприменимы, так как рентгеновские лучи инертны к электрическому и магнитному полям. Поэтому в микроскопии рентгеновской для фокусировки рентгеновских лучей используют явление их полного внешнего отражения изогнутыми зеркальными плоскостями или отражение от кристаллографических изогнутых плоскостей)[2]. На этом принципе построены отражательные рентгеновские микроскопы.
Получение изображений микрочастиц осуществляется путём использования соответствующих оптических систем — микроскопов.
Степень проникновения в микромир, его изучения зависит от возможности рассмотреть величину микроэлемента, от разрешающей способности прибора.
Если уже достигнут предел величины объекта, выше которого его границы сливаются из-за дифракции лучей, и на изображении границы нельзя различить, дальнейшее увеличение изображения исследуемой частицы теряет смысл.
В оптической микроскопии в настоящее время сделан прорыв, в результате которого преодолен фундаментальный рэлеевский критерий, заключающийся в том, что минимальный размер различимого объекта несколько меньше длины волны используемого света и принципиально ограничен дифракцией излучения. Это был предел возможному в оптической микроскопии. До недавнего времени нельзя было преодолеть баръер, позволяющий различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм.
Тем не мене выдающаяся последняя разработка оптической системы наноскопа с оптическим разрешением 10 нм расширило диапазон оптической микроскопии — наноскопии до десятков нанометров, что по сравнению с 0,20 мкм в 20 раз сократило расстояние между различаемыми элементами. (Например, размер белковых молекул, из которых состоит наш организм, колеблется от 3 до 10 нм).[3]
Бинокулярный стереомикроскоп
Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены оптичские микроскопы различных типов.
Немецкие ученые Штефан Хелль (англ. Stefan Hell) и Мариано Босси (англ. Mariano Bossi) из Института биофизической химии в 2006 году разработали наноскоп, позволяющий наблюдать объекты размером около 15 нм.[4]
Электронный микроскоп
В электронной микроскопии для построения изображения вместо световых лучей используется пучок электронов. Это позволяет увеличить разрешающую способность электронного микроскопа по сравнению со световым в несколько тысяч раз.
Первый работоспособный прототип электронного микроскопа был построен в 1932 году Э. Руска и М. Кнолль; в 1986 году за эту разработку Руски, вместе с другими разработчиками электронных микроскопов, была присуждена Нобелевская премия по физике. Серийное производство электронных микроскопов было начато в конце 30-х годов.
Разрешающая способность методов рентгеновской микроскопии практически достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200 нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). Однако современный оптический микроскоп — наноскоп имеет разрешение до 3-10 нм.
Сканирующий зондовый микроскоп — микроскоп для получения изображения поверхности и её локальных характеристик. Процесс построения изображения основан на сканировании поверхности зондом. В общем случае позволяет получить трехмерное изображение поверхности (топографию) с высоким разрешением.
wreferat.baza-referat.ru
Содержание
Введение
Световая микроскопия
Устройство светового микроскопа Люминесцентная микроскопия Темнопольная микроскопия Фазовоконтрастная микроскопия Устройство светового микроскопа Электронная микроскопия
Введение
Размеры всех объектов, являющихся предметом изучения микробиологии и вирусологии, лежат далеко за пределами разрешающей способности человеческого глаза. Морфология микроорганизма (его форма, размеры, взаиморасположение клеток, поверхностные структуры, внутренняя организация) является чрезвычайно важной его характеристикой и лежит в основе таксономии. Поэтому одним из главных методов в области микробиологии является микроскопия. Основу микроскопических методов исследования составляют световая микроскопия со всеми ее разновидностями и электронная микроскопия. Выбор метода определяется целями, стоящими перед исследователем.
Световая микроскопия
В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа. Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа. Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы. И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света. Виды световой микроскопии: 1) Иммерсионная световая микроскопия. Иммерсионные объективы используются для изучения объектов невидимых или плохо видимых через сухие системы микроскопа. 2) Фазовоконтрастная микроскопия предназначена для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. 3) Аноптральная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.
4) Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). 5) Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). 6) Темнопольная микроскопия. При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо). 7) Люминесцентная микроскопия - метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами
Устройство светового микроскопа
Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза. Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких друг другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм. Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение. Различают полезное и бесполезное увеличения. Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа, увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур. В учебных лабораториях обычно используют световые микроскопы, на которых микропрепараты рассматриваются с использованием естественного или искусственного света. Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий), МБИ (микроскоп биологический исследовательский) и МБС (микроскоп биологический стереоскопический). Они дают увеличение в пределах от 56 до 1350 раз. Стереомикроскоп (МБС) обеспечивает подлинно объемное восприятие микрообъекта и увеличивает от 3,5 до 88 раз. В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую. К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель). Устройство световых микроскопов изображено на рис. 1. Рис. 1. Устройство световых микроскопов: ^ А - МИКМЕД-1; Б - БИОЛАМ. 1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - винт грубой наводки, 5 - микрометренный винт, 6 - подставка, 7 - зеркало, 8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 - предметный столик, 10 - револьверное устройство, 11 - объектив, 12 - корпус коллекторной линзы, 13 - патрон с лампой, 14 - источник электропитания. Объектив - одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта. Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 и х40. Качество объектива определяет его разрешающая способность. Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно. Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом. Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра. Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света. Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало. Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки. Конденсор состоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект. Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света. Кольцо с матовым стеклом или светофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости. Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика. Подставка - это основание микроскопа. Коробка с микрометренным механизмом, построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота. Тубус или трубка - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять. Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера. Тубусодержатель несет тубус и револьвер. Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении. Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляющие препарат. Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой.
Люминесцентная микроскопия
Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждаемого люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуохромами (акридиновый оранжевый, изотиоционат флуоресцеина и др.). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи. В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне видны будут клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом. Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуохромами, не причиняющими вреда миробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки.
Темнопольная микроскопия
При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В обектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо). Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы. Так как аппаратура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру. Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.
Фазовоконтрастная микроскопия
Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим. Фазовоконтрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми. Приспособление для фазовоконтрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазовоконтрастные объективы, которые которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо. При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне. Существенными недостатками фазовоконтрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Фазовоконтрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т.д.).
Электронная микроскопия
Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию. Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света). Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной). При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения. Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания. Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта. После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами. Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами. Виды электронных микроскопов: 1) Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) — это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране. Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университетеТоронто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска. 2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) — прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров). Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв; 3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ. STM — scanning tunneling microscope) — прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем. При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å. Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме. Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение. В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей. При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами. Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую. Недостатки электронного микроскопа: 1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме; 2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру; 3) дорого стоит и сам электронный микроскоп, и его обслуживание; 4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала; 5) исследуемые образцы под действием пучка электронов постепенно разрушаются. Поэтому, если требуется детальное изучение образца, необходимо его фотографировать.
Заключение
Современная диагностика сканирования капли крови на темнопольном микроскопе позволяет определить состояние эритроцитов, их подвижность в плазме, агрегация и сладж. Анализируя состояние тромбоцитов, лимфоцитов и лейкоцитов, можно определить активность иммунной системы и способность организма к самовосстановлению, а также патологические изменения состава крови, приводящие к развитию многих заболеваний. На основе такого анализа клеток крови и плазмы, определяются различные, уже существующие отклонения здоровья и предрасположенность к возникновению новых. Спектр диагностики заболеваний очень широкий. Анализ капли крови на темнопольном микроскопе позволяет выявить наличие кристаллов холестерина, сахара, мочевой кислоты и др., включая дрожжевую и бактериальную инфекцию. На основании сканирования крови на темнопольном микроскопе составляется индивидуальная программа оздоровления. Сканирование крови на темнопольном микроскопе является альтернативным и эксклюзивным методом диагностики здоровья. Современные электронные микроскопы, выпускаемые в промышленности, имеют достаточно большие размеры (примерно размером с рабочий стол), но уже некоторые компании выпускают портативные электронные микроскопы, которые устанавливаются на рабочем столе.
Литература
1. Воробьев А.А., Быков А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии 2. Воробьев А.А. Медицинская и санитарная микробиология 3. Королюк А.М., Сбойчаков В.Б. Медицинская микробиология. 4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология
5. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология
6. Ветеринарная микробиология и иммунология. Под ред. Н.А. Радчука.
7. Т. С. Костенко, В. Б. Родионова, Д. И. Скородумов — Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии
turboreferat.ru
Микроскопия вчера, сегодня, завтра
В.А.Исаакян, г. Москва
Взгляд в будущее
Какой
будет рентгеновская микроскопия в будущем? Скорее всего, основным направлением
в этой области станет повышение разрешающей способности. Ряд ведущихся в
настоящее время экспериментов дает основание полагать, что с помощью
специальных приемов его можно будет довести до 10–20
Обратимся к событиям 40-летней давности. В 1956 г. сотрудник картографической службы военного ведомства США Дж.О’Кифи предложил конструкцию микроскопа, в котором свет должен был выходить из крошечного отвестия в непрозрачном экране и освещать объект, расположенный очень близко от экрана. Свет, прошедший через образец или отраженный от него обратно в отверстие, должен был регистрироваться в процессе возвратно-поступательного движения (сканирования) образца. О’Кифи назвал свой метод растровой микроскопией ближнего поля и указал, что разрешение такого микроскопа ограничивается не длиной волны света, а только размером отверстия. Теоретически такое устройство могло бы давать изображение деталей размером меньше, чем половина длины волны. Однако в то время отсутствовали прецизионные устройства позиционирования и перемещения и идея не могла быть реализованной полностью.
В 1972 г. Р.Янг из Национального бюро стандартов США сумел осуществить перемещение (и позиционирование) объектов в трех направлениях с точностью до 1 нм, использовав перемещающие устройства на базе пьезоэлектриков (о них мы уже говорили в разделе, где описывался ультразвуковой микроскоп). Пьезоэлектрические управляющие устройства открыли путь к созданию одного из современных вариантов микроскопа ближнего поля – растрового, или сканирующего, туннельного микроскопа, изобретатели которого, Г. Бинниг и Г. Рорер, из компании IBM (США) были удостоены Нобелевской премии в 1986 г.
В сканирующем туннельном микроскопе роль отверстия играет тончайшее металлическое (как правило, вольфрамовое) острие, или зонд, кончик которого может представлять собой один-единственный атом и иметь размер в поперечнике около 0,2 нм. Пьезоэлектрические устройства подводят зонд на расстояние 1–2 нм от поверхности исследуемого электропроводящего объекта – настолько близко, что электронные облака на кончике зонда и ближайшего к нему атома объекта перекрываются. Если теперь между объектом и зондом создать небольшую разность потенциалов, электроны будут «перескакивать» через зазор (или, как говорят физики, туннелировать), и появится слабый туннельный ток. Величина этого тока чрезвычайно чувствительна к ширине зазора: обычно она уменьшается в 10 раз при увеличении зазора на 0,1 нм.
Пьезоэлектрические двухкоординатные манипуляторы перемещают зонд вдоль поверхности образца, формируя растр наподобие того, как это делается в электронном микроскопе. При этом параллельные строки растра отстоят друг от друга на доли нанометра. Если бы кончик зонда не повторял профиль поверхности, то туннельный ток менялся бы в очень широких пределах, увеличиваясь в те моменты, когда зонд проходит над выпуклостями (например, над атомами на поверхности), и уменьшаясь до ничтожно малых значений при прохождении зазоров между атомами. Однако зонд заставляют двигаться верх и вниз в соответствии с рельефом поверхности. Осуществляется это с помощью механизма обратной связи, который улавливает начинающееся изменение туннельного тока и изменяет напряжение, прикладываемое к третьему манипулятору, который двигает зонд в направлении, перпендикулярном поверхности, таким образом, чтобы величина туннельного тока не менялась, т.е. чтобы зазор между зондом и объектом оставался постоянным.
По изменению напряжения на третьем зонде компьютер строит трехмерное изображение поверхности. При этом разрешающая способность микроскопа достигает атомного уровня, т.е. могут быть видны отдельные атомы, размеры которых составляют 0,2 нм. Блок-схема сканирующего туннельного микроскопа показана на рис. 14.
Рассказывая о возможностях сканирующего туннельного микроскопа, нельзя не отметить, что они выходят далеко за рамки чисто микроскопических задач. Например, с его помощью можно, точно прицелившись зондом и приложив нужное напряжение, как бы «рассечь» молекулу на части, оторвав от нее несколько атомов, и исследовать ее электронные свойства. Американские исследователи экспериментально показали, что, прикладывая к зонду определенное напряжение, можно заставить атомы притягиваться к острию или двигаться вдоль поверхности. Чрезвычайно интересные опыты провели экспериментаторы фирмы IBM, написав с помощью атомов инертного газа ксенона на поверхности никеля название своей фирмы.
Манипуляции с отдельными атомами означают, что можно сконструировать искусственные структуры нанометровых размеров, используя отдельные атомы как кирпичики. Первое приложение, по-видимому, будет касаться хранения информации, ведь компьютерная память основана на том, что бит (единица информации) задается определенным состоянием элемента среды (магнитной, электрической, оптической), в которой записывается информация. Упрощенно говоря, элемент памяти показывает, включено что-то или выключено, присутствует что-либо или отсутствует и т.д. Исходя из этого, можно реализовать такую ситуацию на поверхности, когда 1 бит будет записан в виде скопления, например, 1000 атомов. Если такая память будет создана, все содержание библиотеки Конгресса США (а это громадное книгохранилище) уместится на одном диске диаметром 25 см. Для сравнения скажем, что лазерных компакт-дисков для этого потребовалось бы 250 000 штук.
Cканирующий туннельный микроскоп явился прототипом (базовой моделью) целого семейства еще более совершенных сканирующих микроскопов ближнего поля с зондами-остриями. Необходимость дальнейших разработок диктовалась необходимостью избавиться от основного недостатка базового микроскопа – электропроводности объектов, а ведь даже проводники и полупроводники часто покрыты изолирующим слоем оксида. Не проводят ток и биологические материалы.
В 1985 г. в США был создан атомно-силовой микроскоп (рис. 15). Здесь образец уже не обязательно должен быть проводящим. Как и в сканирующем туннельном микроскопе, над объектом перемещается крошечное острие – заостренный до атомных размеров (и даже до размера одного атома!) осколок алмаза, закрепленный на полоске из металлической фольги.
Электронное облако острия алмаза оказывает давление на электронные облака отдельных атомов образца, порождая отталкивающую силу, меняющуюся в соответствии с рельефом поверхности. Эта сила отклоняет кончик острия, перемещения которого регистрируются не электрически (путем измерения туннельного тока), а оптически – с помощью луча лазера, который отражается от верхней части держателя на фотодиодное чувствительное устройство. Механизм обратной связи реагирует на изменения оптического хода луча и воздействует на пьезоэлектрический преобразователь, регулирующий высоту, на которой находится образец, так что отклонение держателя остается постоянным. В соответствии с перемещениями образца строится контур поверхности. (Острие, как игла фонографа, как бы считывает рельеф.) Фольга действует как пружина, прижимая кончик острия к исследуемой поверхности.
Хотя в принципе первые атомно-силовые микроскопы могли давать изображение поверхности любого непроводящего или проводящего образца, давление острия (массой порядка миллионной доли грамма) было достаточно сильным и искажало форму многих биологических молекул или смещало их. Давление острия увеличивается из-за наличия тонких пленок воды и загрязнений, неизбежно собирающихся как на кончике острия, так и на самом образце. При сближении острия и поверхности эти загрязнения входят в соприкосновение, и силы адгезии обуславливают взаимное притяжение острия и объекта, увеличивая, таким образом, отслеживающее давление острия. Недавно это давление удалось снизить в 10 раз, опуская острие и образец в каплю воды. Отметим также, что оптическая регистрация движения острия обеспечивает более надежное измерение зазора, чем обратная связь по туннельному току, и более мягкое и в то же время плотное прикосновение острия. В результате этих усовершенствований исследователям удалось даже зарегистрировать молекулярный процесс в его развитии – полимеризацию белка фибрина, основного компонента свернувшейся крови.
Однако даже усовершенствованные конструкции атомно-силовых микроскопов оказывают все же достаточно большое давление на объект, что может привести к загрязнению или повреждению последнего. Поэтому было разработано новое семейство сканирующих микроскопов с зондами-остриями, среди которых основным следует считать лазерный силовой микроскоп (рис. 16). «Сила», которую чувствует этот микроскоп, – это малая сила притяжения между исследуемой поверхностью и зондом (кремниевым или вольфрамовым), находящимся от нее на расстоянии от 2 до 20 нм. Она складывается из силы поверхностного натяжения воды, конденсирующейся в зазоре между острием и образцом, и слабыми силами Ван дер Ваальса. Притягивающая сила очень мала – в 1000 раз меньше, чем межатомное отталкивание в атомно-силовых микроскопах. При перемещении острие вибрирует с частотой, близкой к резонансной. Лазерно-силовой микроскоп регистрирует силу межатомного взаимодействия по ее воздействию на динамику вибрирующего зонда.
Изменение амплитуды измеряется с помощью сенсорного устройства на базе лазера. Для этого используется другой, уже знакомый нам принцип микроскопии, – интерферометрия. Лазерный луч расщепляется на два: луч сравнения, который отражается от стационарного зеркала или призмы, и зондирующий луч, который отражается от обратной стороны острия. Два луча складываются и интерферируют, порождая сигнал, фаза которого чувствительна к изменению длины пути, пройденного зондирующим лучом. Таким образом, интерферометр измеряет амплитуду вибрации кончика острия амплитудой до 10–5 нм. Рассмотренный принцип позволяет лазерно-силовому микроскопу регистрировать малые неровности рельефа величиной до 5 нм (около 25 атомных слоев).
Отметим вкратце еще некоторые виды лазерно-силовых микроскопов. В магнитно-силовом микроскопе вместо вольфрамового или кремниевого острия используется намагниченный никелевый или железный зонд. Когда вибрирующий зонд подносится к исследуемому образцу-магнетику, воздействующая на кончик острия сила изменяет его резонансную частоту и, следовательно, амплитуду колебаний. Этот микроскоп позволяет исследовать магнитное поле с разрешением лучше 25 нм. С его помощью можно изучать структуру магнитных битов информации на дисках и других магнитных носителях путем непосредственного контроля качества считывающей головки и запоминающей среды.
В электростатическом силовом микроскопе вибрирующий зонд несет электрический заряд, а амплитуда его вибраций зависит от электростатических сил, возникающих в результате взаимодействия с зарядами на поверхности образца. С помощью такого микроскопа можно выявлять картину распределения электрофизических свойств различных материалов, например, концентрации легирующей примеси в кремнии. (Напомним, что легирование полупроводников применяется для изменения соотношения между концентрациями подвижных отрицательных и положительных носителей заряда – электронов и дырок соответственно.) Для этого к зазору между зондом электростатического силового микроскопа и исследуемой поверхностью прикладывается напряжение, которое смещает электроны или дырки под зондом, оставляя там заряженную область, электростатически взаимодействующую с острием. Последовательные перемещения острия зонда позволяют точно и с высоким разрешением измерить величину заряда, а следовательно, и количество смещенных электронов или дырок, соответствующее концентрации легирующих атомов.
Зонд растрового термического микроскопа является, пожалуй, самым крошечным в мире термометром: он позволяет измерять поверхностные изменения температуры в десятитысячную долю градуса на длине несколько десятков нанометров. Зонд представляет собой вольфрамомую проволочку до 30 нм в поперечнике, покрытую никелем, который отделен от вольфрама слоем диэлектрика везде, кроме самого кончика (рис. 17). Такой вольфрамо-никелевый зонд работает как термопара, генерируя напряжение, пропорциональное его температуре.
Когда нагретый кончик зонда приближают к исследуемому (твердотельному) образцу, являющемуся лучшим проводником тепла, чем воздух, теплопотери кончика острия возрастают. Последний охлаждается, термоэдс термопары уменьшается пропорционально изменению ширины зазора. Наоборот, когда зонд удаляется от образца, термоэдс увеличивается. Таким образом, потери тепла выявляют топографию исследуемой поверхности точно так же, как туннельный ток или силы межатомного отталкивания выполняют эту роль в микроскопах ближнего поля. Растровый термический микроскоп применяют для картографирования температуры в живых клетках или для измерения очень малых, практически незаметных скоростей истечения потоков жидкости или газа.
Не претендуя на вытеснение оптической микроскопии, техника сканирующих зондов обещает расширить ее возможности. Сейчас рассматриваются способы перенесения в микроскопию ближнего поля таких чисто оптических эффектов, как поляризационный контраст, фазовый контраст, методы усиления контраста и т.д. Существующие сканирующие микроскопы с зондами-остриями позволяют с разрешением в несколько нанометров «увидеть» мир молекул или микросхем, а в совокупности со средствами оптической микроскопии эта же техника, по-видимому, раскроет перед нами этот мир в привычных для нас свете, тенях и цвете.
И в заключение упомянем еще об одном, совершенно новом методе – протонной микроскопии, или протонной радиографии. Этот термин, правда, соответствует методу в такой же степени, что и название «микроскопия» рентгеноструктурному анализу. В основе лежит так называемый эффект теней. В одном из вариантов кристаллический образец «освещают» параллельным пучком протонов, высокая энергия которых (сотни или даже тысячи кэВ) позволяет им проникнуть чрезвычайно близко к ядрам атомов, составляющих кристаллическую решетку образца. Рассеиваясь на ядрах в различных направлениях, протоны «продираются» скавозь кристалл, частично выходят из него и засвечивают расположенную с «освещаемой» стороны образца фотопластинку, где получается специфическая сетка ярких линий с пятнами разных размеров. Эта картина напоминает картины дифракции электронов или рентгеновских лучей на кристаллах. Однако подобие это чисто внешнее, т.к. принципиально различны механизмы их получения. В первых двух случаях происходит волновое взаимодействие, тогда как при протонографии – корпускулярное взаимодействие протонов и ядер. Это отличие дает определенное преимущество: повышая энергию протонов, мы увеличиваем глубину их проникновения в образец, не ухудшая при этом (что наиболее важно) способность «видеть» атомы.
Физика взаимодействия протонов с ядрами очень сложна, и мы останавливаться на ней не будем. Отметим лишь возможности протонографии. По протонограмме можно определить тип структуры кристалла, кристаллографическую ориентацию, углы между кристаллографическими осями. Ее вид чрезвычайно чувствителен к малейшим искажениям (деформациям) кристаллической решетки. Протонограмма также регистрирует точечные дефекты. Важным преимуществом протонографии является возможность послойного анализа микроструктуры кристаллических образцов без их разрушения: повышая энергию протонов, можно проникать все глубже и глубже.
Послойное исследование можно проводить, и не меняя энергии. Для этого перед фотопластинкой помещают металлическую фольгу определенной толщины. Протоны, вышедшие из глубины образца и потерявшие, таким образом, значительную часть энергии, будут поглощаться фольгой, тогда как протоны, рассеянные вблизи поверхности, пройдут сквозь фольгу и попадут на пластинку. Последовательно меняя толщину фольги, можно получить серию протонограмм с различной глубины образца и установить, например, распределение по глубине каких-либо дефектов. При этом, отметим еще раз, образец не разрушается.
Чего же можно ждать от микроскопии завтрашнего дня? На решение каких задач можно рассчитывать? Прежде всего – распространение на все новые и новые объекты. Достижение атомарного разрешения, безусловно, является крупнейшим завоеванием научной и технической мысли. Однако не будем забывать, что это достижение распространяется лишь на ограниченный круг объектов, помещенных к тому же в весьма специфические, необычные и сильно воздействующие условия. Поэтому необходимо стремиться распространить атомарное разрешение на широкий круг объектов.
Со временем можно ожидать привлечения «на работу» в микроскопах другие заряженные частицы. Ясно, однако, что этому должны предшествовать поиски и разработка мощных источников таких частиц; кроме того, создание микроскопов нового типа будет определяться появлением конкретных научных задач, в решение которых именно эти новые частицы внесут решающий вклад.
Будут совершенствоваться микроскопические исследования процессов в динамике, т.е. происходящих непосредственно в микроскопе или в сочлененных с ним установках. К таким процессам относятся испытания образцов в микроскопе (нагрев, растяжение и т.д.) непосредственно во время анализа их микроструктуры. Здесь успех будет обусловлен, в первую очередь, развитием техники высокоскоростной фотографии и повышением временного разрешения детекторов (экранов) микроскопов, а также использованием мощных современных компьютеров.
www.referatmix.ru
