Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека иживотных явилась разработка методов культивирования их соматических клеток наискусственных питательных средах, а также получение гибридов соматическихклеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь, успехи в культивированиисоматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворениеу человека и животных. Начиная с 60-х гг., в нескольких лабораториях мира быливыполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток вяйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов частобыли противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточныхядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклеток
На основе результатов изучения развития оплодотворенныхяйцеклеток в 60-е гг. были начаты также исследования по выяснению возможностиоплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследованияпривели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами впробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей приимплантации их в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных вэтой области методов привело к тому, что рождение «пробирочных» детейстало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которымбыла дана в лаборатории, в пробирке. В настоящее время этот раздел клеточнойинженерии получил большое распространение, а количество «пробирочных»детей составляет уже десятки тысяч. В нашей стране работы по получению «пробирочных»детей были начаты в 1986 г. В 1993 году была разработана методика получениямонозиготных близнецов человека in vitro, путем разделения эмбрионов на бластомеры и доращиванияпоследних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в маткуженщины.
Под влиянием результатов, связанных с получением «пробирочных»детей, у животных тоже была разработана технология, получившая названиетрансплантации эмбрионов. Она связана с разработкой способа индукцииполиовуляции, способов искусственного оплодотворения яйцеклеток и имплантациизародышей в организм животных — приемных матерей. Суть этой технологии сводитсяк следующему. Высокопродуктивной корове вводят гормоны, в результате чегонаступает полиовуляция, заключающаяся в созревании сразу 10-20 клеток. Затемяйцеклетки искусственно оплодотворяются мужскими половыми клетками в яйцеводе. На7-8-й день зародышей вымывают из матки и трансплантируют в матки другим коровам(приемным матерям), которые затем дают жизнь телятам-близнецам. Телятанаследуют генетический статус своих подлинных родителей.
Другой областью клеточной инженерии у животных являетсяполучение трансгенных животных. Наиболее простой способ получения такихживотных заключается во введении в яйцеклетки исходных животных линейныхмолекул ДНК. Животные, развившиеся из оплодотворенных таким образом яйцеклеток,будут содержать в одной из своих хромосом копию введенного гена. Больше того,они и будут передавать этот ген по наследству. Более сложный способ получениятрансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстногопокрова и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мышиизвлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. Затемиз эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей,предварительно лишенные ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра,помещают в пробирки с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиесяиз яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. Ввыполненных по этой методике экспериментах от пяти белых мышей («приемныхматерей») было получено 36 мышей, среди которых трое были серыми. Такимобразом, в этих экспериментах удалось получить клон мышей с серой окраскойшерстного покрова, т.е. клонировать эмбриональные клетки с заданными свойствами.В § 35 мы рассмотрели результаты оплодотворения искусственно лишенных ядеряйцеклеток овец ядерным материалом соматических клеток животных этого же вида. Вчастности, из яйцеклеток овец удаляли ядра, а затем в такие яйцеклетки вводилиядра соматических клеток (эмбриональных, плодовых или клеток взрослых животных),после чего оплодотворенные таким образом яйцеклетки вводят в матки взрослыховец. Рождающиеся ягнята оказались идентичными овце-донору. Как было отмечено в§ 35, такое получение трансгенных животных представляет собой прямой путьклонирования животных с хозяйственно-полезными признаками, включая особейопределенного пола.
Трансгенные животные получены также при использованииисходного материала, принадлежащего разным видам, в частности, известен способпередачи гена, контролирующего гормон роста, от крыс в яйцеклетки мышей, а такжеспособ комбинирования бластомеров овцы с бластомерами козы, что привело кполучению гибридных животных (ковец). Эти эксперименты указывают на возможностьпреодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития. Особеннозаманчивые перспективы открываются (если видовая несовместимость будетпреодолена полностью) на пути оплодотворения яйцеклеток одного вида ядрамисоматических клеток другого вида. Речь идет о реальной перспективе полученияхозяйственно-ценных гибридов животных, которых невозможно получить путемскрещиваний.
Следует отметить, что ядерно-трансплантационные работы ещене очень эффективны. Эксперименты, выполненные на земноводных и млекопитающих,в целом показали, что их результативность является небольшой, причем оназависит от несовместимости между донорскими ядрами и реципиентными овоцитами. Крометого, препятствием на пути к успехам являются также образующиеся хромосомныеаберрации в трансплантированных ядрах в ходе дальнейшего развития, которыесопровождаются гибелью трансгенных животных.
На стыке работ по изучению гибридизации клеток ииммунологических исследований возникла проблематика, связанная с получением иизучением так называемых моноклональных антител. Как отмечено выше (см. § 96),антитела, продуцируемые организмом в ответ на введение антигена (бактерии, вирусы,эритроциты и т.д.), представляют собой белки, называемые иммуноглобулинами исоставляющие фундаментальную часть защитной системы организма противвозбудителей болезней. Но любое чужеродное тело, вводимое в организм,представляет собой смесь разных антигенов, которые будут возбуждать продукциюразных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только длягрупп крови А (II) и В (III), но и многими другими антигенами, включаярезус-фактор. Далее, белки клеточной стенки бактерий или капсида вирусов такжемогут действовать в качестве разных антигенов, вызывающих образование разныхантител. В то же время лимфоидные клетки иммунной системы организма обычнопредставлены клонами. Значит, даже только по этой причине в сыворотке кровииммунизированных животных антитела всегда представляют собой смесь, состоящуюиз антител, продуцируемых клетками разных клонов. Между тем для практическихпотребностей необходимы антитела только одного типа, т.е. необходимы такназываемые моноспецифические сыворотки, содержащие антитела только одного типа,или, как их называют, моноклональные антитела.
В поисках методов получения моноклональных антителшвейцарскими исследователями в 1975 г. был открыт способ получения гибридовмежду лимфоцитами мышей, иммунизированных тем или иным антигеном, икультивируемыми опухолевыми клетками костного мозга. Такие гибриды получилиназвание «гибридомы». От «лимфоцитарной» части,представленной лимфоцитом одного клона, одиночная гибридома наследуетспособность вызывать образование необходимых антител, причем одного типа, аблагодаря «опухолевой (миеломной)» части она становится способной,как и все опухолевые клетки, бесконечно долго размножаться на искусственныхпитательных средах, давая многочисленную популяцию гибридом. Линии мышиныхклеток, синтезирующих моноклональные антитела, выделяют путем слияния миеломныхклеток с лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной за пять дней до этогожелаемым антигеном. Слияние клеток достигают смешиванием их в присутствииполиэтиленгликоля, который индуцирует слияние клеточных мембран, а затем ввысеве их на питательную среду, позволяющую рост и размножение только гибридныхклеток (гибридом). Размножение гибридомы разводят в жидкой среде, где онирастут далее и секретируют антитела в культуральную жидкость, причем толькоодного типа, к тому же в неограниченных количествах. Эти антитела получилиназвание моноклональных.
Чтобы повысить частоту образования антител, прибегают кклонированию гибридом, т.е. к селекции отдельных колоний гибридом, способныхвызывать образование наибольшего количества антител желаемого типа. Моноклональныеантитела нашли широкое применение в медицине для диагностики и лечения рядаболезней В то же время важнейшее преимущество моноклональной технологиизаключается в том, что с ее помощью могут быть получены антитела противматериалов, которые невозможно очистить. Напротив, можно получитьмоноклональные антитела против клеточных (плазматических) мембран нейроновживотных. Для этого мышей иммунизируют выделенными мембранами нейронов, послечего их селезеночные лимфоциты объединяют с миеломными клетками, а дальшепоступают, как описано выше.
/>Клеточная инженерия урастенийКлеточная инженерия у растений заключается в получениирастений из одной клетки, а также в генетических манипуляциях с изолированнымиклетками, направленными на преобразование их генотипов.
Метод получения растений из одной клетки основан наспособности тканей растений ряда видов к неорганическому росту на специальныхискусственных средах, содержащих питательные вещества и регуляторы роста. Прикультивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываютсяспособными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированныхклеток, получивших название каллуса. Если затем каллус разделить на отдельныеклетки и продолжить культивирование изолированных клеток на питательных средах,то из отдельных (одиночных) клеток могут развиться настоящие растения. Способностьодиночных соматических клеток растений развиваться в настоящее (целое) растение,называют тотипотентностыо. Возможно, тотипотентность присуща клеткамвсех листостебельных растений. Но пока она обнаружена у растений ограниченногокруга. В частности, эта способность обнаружена у клеток картофеля, моркови,табака и ряда других видов сельскохозяйственных культур. Этот метод клеточнойинженерии растений уже вошел в широкую практику. Однако растения, развившиесяиз одной клетки, характеризуются генетической нестабильностью, что связано смутациями их хромосом. Поскольку генетическая нестабильность дает разнообразныеформы растений, они очень полезны в качестве исходного материала для селекции.
Однако растения можно получить и из так называемыхпротопластов растительных клеток, под которыми понимают клетки, у которыхискусственно с помощью гидролитических ферментов (пектиназы и целлюлазы) удаленаклеточная стенка. Обычно протопласты получают из клеток листьев, корней,лепестков, прорастающей пыльцы, плодов и других структур растений. Способностьпротопластов давать начало растениям выявлена у очень большого количества видов.
Получение растений из одной клетки или протопласта частоназывают клональным микроразмножением. Главнейшее преимущество этого методазаключается в том, что он позволяет резко сократить сроки размножения многихвидов растений, а также очень быстро воспроизвести одно и то же растение всотнях тысяч экземпляров, что имеет исключительно важное значение вселекционной работе и в получении посадочного материала, незараженного возбудителямиболезней
Генетические манипуляции, связанные с растительнымиклетками, направлены на преобразование генотипов клеток растений, что достигаютлибо путем соматической гибридизации (получения гибридных клеток) либо путемпереноса в клетки генетического материала, происходящего от других организмов. Вовсех случаях исходным материалом являются протопласты клеток.
Соматическую гибридизацию осуществляют в несколько этапов, аименно:
1. Получение и слияние протопластов, происходящих от клетокрастений разных видов.
2. Культивирование гибридных протопластов, используяселективные питательные среды.
3. Регенерация растений из соматических гибридов (гибридовпротопластов) через образование последними каллуса.
Перенос генетического материала от одних клеток к другимосуществляют путем трансформации протопластов чужеродной ДНК либо введением впротопласты чужеродной ДНК с помощью плазмид. Из образующегося затем каллусавыращивают растения, содержащие интересующий ген. Растения, полученные такимпутем, называют трансгенными растениями.
Список литературы:1. Биология. В 2 кн. (Учебник) Под ред. В.Н. Ярыгина (2003, 5-е изд., 432с.,3
2. Микробиология. (Учебник) Гусев М.В., Минеева Л.А. (2003, 464с)
3. Биология с основами экологии. (Учебник) Пехов А.П. (2000,
www.ronl.ru
Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека и животных явилась разработка методов культивирования их соматических клеток на искусственных питательных средах, а также получение гибридов соматических клеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь, успехи в культивировании соматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворение у человека и животных. Начиная с 60-х гг., в нескольких лабораториях мира были выполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов часто были противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточных ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклеток
На основе результатов изучения развития оплодотворенных яйцеклеток в 60-е гг. были начаты также исследования по выяснению возможности оплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследования привели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами в пробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей при имплантации их в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных в этой области методов привело к тому, что рождение "пробирочных" детей стало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которым была дана в лаборатории, в пробирке. В настоящее время этот раздел клеточной инженерии получил большое распространение, а количество "пробирочных" детей составляет уже десятки тысяч. В нашей стране работы по получению "пробирочных" детей были начаты в 1986 г. В 1993 году была разработана методика получения монозиготных близнецов человека invitro, путем разделения эмбрионов на бластомеры и доращивания последних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в матку женщины.
Под влиянием результатов, связанных с получением "пробирочных" детей, у животных тоже была разработана технология, получившая название трансплантации эмбрионов. Она связана с разработкой способа индукции полиовуляции, способов искусственного оплодотворения яйцеклеток и имплантации зародышей в организм животных - приемных матерей. Суть этой технологии сводится к следующему. Высокопродуктивной корове вводят гормоны, в результате чего наступает полиовуляция, заключающаяся в созревании сразу 10-20 клеток. Затем яйцеклетки искусственно оплодотворяются мужскими половыми клетками в яйцеводе. На 7-8-й день зародышей вымывают из матки и трансплантируют в матки другим коровам (приемным матерям), которые затем дают жизнь телятам-близнецам. Телята наследуют генетический статус своих подлинных родителей.
Другой областью клеточной инженерии у животных является получение трансгенных животных. Наиболее простой способ получения таких животных заключается во введении в яйцеклетки исходных животных линейных молекул ДНК. Животные, развившиеся из оплодотворенных таким образом яйцеклеток, будут содержать в одной из своих хромосом копию введенного гена. Больше того, они и будут передавать этот ген по наследству. Более сложный способ получения трансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстного покрова и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мыши извлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. Затем из эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей, предварительно лишенные ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра, помещают в пробирки с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиеся из яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. В выполненных по этой методике экспериментах от пяти белых мышей ("приемных матерей") было получено 36 мышей, среди которых трое были серыми. Таким образом, в этих экспериментах удалось получить клон мышей с серой окраской шерстного покрова, т.е. клонировать эмбриональные клетки с заданными свойствами. В § 35 мы рассмотрели результаты оплодотворения искусственно лишенных ядер яйцеклеток овец ядерным материалом соматических клеток животных этого же вида. В частности, из яйцеклеток овец удаляли ядра, а затем в такие яйцеклетки вводили ядра соматических клеток (эмбриональных, плодовых или клеток взрослых животных), после чего оплодотворенные таким образом яйцеклетки вводят в матки взрослых овец. Рождающиеся ягнята оказались идентичными овце-донору. Как было отмечено в § 35, такое получение трансгенных животных представляет собой прямой путь клонирования животных с хозяйственно-полезными признаками, включая особей определенного пола.
Трансгенные животные получены также при использовании исходного материала, принадлежащего разным видам, в частности, известен способ передачи гена, контролирующего гормон роста, от крыс в яйцеклетки мышей, а также способ комбинирования бластомеров овцы с бластомерами козы, что привело к получению гибридных животных (ковец). Эти эксперименты указывают на возможность преодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития. Особенно заманчивые перспективы открываются (если видовая несовместимость будет преодолена полностью) на пути оплодотворения яйцеклеток одного вида ядрами соматических клеток другого вида. Речь идет о реальной перспективе получения хозяйственно-ценных гибридов животных, которых невозможно получить путем скрещиваний.
Следует отметить, что ядерно-трансплантационные работы еще не очень эффективны. Эксперименты, выполненные на земноводных и млекопитающих, в целом показали, что их результативность является небольшой, причем она зависит от несовместимости между донорскими ядрами и реципиентными овоцитами. Кроме того, препятствием на пути к успехам являются также образующиеся хромосомные аберрации в трансплантированных ядрах в ходе дальнейшего развития, которые сопровождаются гибелью трансгенных животных.
На стыке работ по изучению гибридизации клеток и иммунологических исследований возникла проблематика, связанная с получением и изучением так называемых моноклональных антител. Как отмечено выше (см. § 96), антитела, продуцируемые организмом в ответ на введение антигена (бактерии, вирусы, эритроциты и т.д.), представляют собой белки, называемые иммуноглобулинами и составляющие фундаментальную часть защитной системы организма против возбудителей болезней. Но любое чужеродное тело, вводимое в организм, представляет собой смесь разных антигенов, которые будут возбуждать продукцию разных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только для групп крови А (II) и В (III), но и многими другими антиг
енами, включая резус-фактор. Далее, белки клеточной стенки бактерий или капсида вирусов также могут действовать в качестве разных антигенов, вызывающих образование разных антител. В то же время лимфоидные клетки иммунной системы организма обычно представлены клонами. Значит, даже только по этой причине в сыворотке крови иммунизированных животных антитела всегда представляют собой смесь, состоящую из антител, продуцируемых клетками разных клонов. Между тем для практических потребностей необходимы антитела только одного типа, т.е. необходимы так называемые моноспецифические сыворотки, содержащие антитела только одного типа, или, как их называют, моноклональные антитела.В поисках методов получения моноклональных антител швейцарскими исследователями в 1975 г. был открыт способ получения гибридов между лимфоцитами мышей, иммунизированных тем или иным антигеном, и культивируемыми опухолевыми клетками костного мозга. Такие гибриды получили название "гибридомы". От "лимфоцитарной" части, представленной лимфоцитом одного клона, одиночная гибридома наследует способность вызывать образование необходимых антител, причем одного типа, а благодаря "опухолевой (миеломной)" части она становится способной, как и все опухолевые клетки, бесконечно долго размножаться на искусственных питательных средах, давая многочисленную популяцию гибридом. Линии мышиных клеток, синтезирующих моноклональные антитела, выделяют путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной за пять дней до этого желаемым антигеном. Слияние клеток достигают смешиванием их в присутствии полиэтиленгликоля, который индуцирует слияние клеточных мембран, а затем в высеве их на питательную среду, позволяющую рост и размножение только гибридных клеток (гибридом). Размножение гибридомы разводят в жидкой среде, где они растут далее и секретируют антитела в культуральную жидкость, причем только одного типа, к тому же в неограниченных количествах. Эти антитела получили название моноклональных.
Чтобы повысить частоту образования антител, прибегают к клонированию гибридом, т.е. к селекции отдельных колоний гибридом, способных вызывать образование наибольшего количества антител желаемого типа. Моноклональные антитела нашли широкое применение в медицине для диагностики и лечения ряда болезней В то же время важнейшее преимущество моноклональной технологии заключается в том, что с ее помощью могут быть получены антитела против материалов, которые невозможно очистить. Напротив, можно получить моноклональные антитела против клеточных (плазматических) мембран нейронов животных. Для этого мышей иммунизируют выделенными мембранами нейронов, после чего их селезеночные лимфоциты объединяют с миеломными клетками, а дальше поступают, как описано выше.
Клеточная инженерия у растенийКлеточная инженерия у растений заключается в получении растений из одной клетки, а также в генетических манипуляциях с изолированными клетками, направленными на преобразование их генотипов.
Метод получения растений из одной клетки основан на способности тканей растений ряда видов к неорганическому росту на специальных искусственных средах, содержащих питательные вещества и регуляторы роста. При культивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываются способными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированных клеток, получивших название каллуса. Если затем каллус разделить на отдельные клетки и продолжить культивирование изолированных клеток на питательных средах, то из отдельных (одиночных) клеток могут развиться настоящие растения. Способность одиночных соматических клеток растений развиваться в настоящее (целое) растение, называют тотипотентностыо . Возможно, тотипотентность присуща клеткам всех листостебельных растений. Но пока она обнаружена у растений ограниченного круга. В частности, эта способность обнаружена у клеток картофеля, моркови, табака и ряда других видов сельскохозяйственных культур. Этот метод клеточной инженерии растений уже вошел в широкую практику. Однако растения, развившиеся из одной клетки, характеризуются генетической нестабильностью, что связано с мутациями их хромосом. Поскольку генетическая нестабильность дает разнообразные формы растений, они очень полезны в качестве исходного материала для селекции.
Однако растения можно получить и из так называемых протопластов растительных клеток, под которыми понимают клетки, у которых искусственно с помощью гидролитических ферментов (пектиназы и целлюлазы) удалена клеточная стенка. Обычно протопласты получают из клеток листьев, корней, лепестков, прорастающей пыльцы, плодов и других структур растений. Способность протопластов давать начало растениям выявлена у очень большого количества видов.
Получение растений из одной клетки или протопласта часто называют клональным микроразмножением. Главнейшее преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет резко сократить сроки размножения многих видов растений, а также очень быстро воспроизвести одно и то же растение в сотнях тысяч экземпляров, что имеет исключительно важное значение в селекционной работе и в получении посадочного материала, незараженного возбудителями болезней
Генетические манипуляции, связанные с растительными клетками, направлены на преобразование генотипов клеток растений, что достигают либо путем соматической гибридизации (получения гибридных клеток) либо путем переноса в клетки генетического материала, происходящего от других организмов. Во всех случаях исходным материалом являются протопласты клеток.
Соматическую гибридизацию осуществляют в несколько этапов, а именно:
1. Получение и слияние протопластов, происходящих от клеток растений разных видов.
2. Культивирование гибридных протопластов, используя селективные питательные среды.
3. Регенерация растений из соматических гибридов (гибридов протопластов) через образование последними каллуса.
Перенос генетического материала от одних клеток к другим осуществляют путем трансформации протопластов чужеродной ДНК либо введением в протопласты чужеродной ДНК с помощью плазмид. Из образующегося затем каллуса выращивают растения, содержащие интересующий ген. Растения, полученные таким путем, называют трансгенными растениями.
Список литературы:1. Биология. В 2 кн. (Учебник) Под ред. В.Н. Ярыгина (2003, 5-е изд., 432с., 3
2. Микробиология. (Учебник) Гусев М.В., Минеева Л.А. (2003, 464с)
3. Биология с основами экологии. (Учебник) Пехов А.П. (2000,
www.litsoch.ru
Как отмечено в начале главы, клеточной инженерией называют генетические манипуляции с изолированными клетками животных и растений. Эти манипуляции часто осуществляют in vitro, а главной целью они имеют получение генотипов этих организмов с заданными свойствами, в первую очередь хозяйственно полезными. Что касает-
ся человека, то клеточная инженерия оказалась применимой к его половым клеткам.
Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека и животных явилась разработка методов культивирования их сома- тических клеток на искусственных питательных средах, а также получение гибридов соматических клеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь успехи в культивировании соматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворения у человека и животных. Начиная с 60-х гг. ХХ в. в нескольких лабораториях мира были выполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов часто были противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточных ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклетки (см. гл. IV).
На основе результатов изучения развития оплодотворенных яйцеклеток в 60-е гг. XX в. были начаты также исследования по выяснению возможности оплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследования привели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами в пробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей при имплантации в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных в этой области методов привело к тому, что рождение «пробирочных» детей стало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которым была дана в лаборатории, в пробирке. В настоящее время этот раздел клеточной инженерии получил большое распространение, а количество «пробирочных» детей составляет уже десятки тысяч (рис. 130). В России работы по получению «пробирочных» детей были начаты только в 1986 г.
В 1993 г. была разработана методика получения монозиготных близнецов человека in vitro путем разделения эмбрионов на бласто- меры и доращивания последних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в матку женщины.
Под влиянием результатов, связанных с получением «пробирочных» детей, у животных тоже была разработана технология, получившая название трансплантации эмбрионов. Она связана с разработкой способа индукции полиовуляции, способов искусственного оплодот- ворения яйцеклеток и имплантации зародышей в организм животных — приемных матерей. Суть этой технологии сводится к следую-
щему. Высокопродуктивной корове вводят гормоны, в результате чего наступает полиовуляция, заключающаяся в созревании сразу 10-20 клеток. Затем яйцеклетки искусственно оплодотворяются мужскими половыми клетками в яйцеводе. На 7-8-й день зародыши вымывают из матки и трансплантируют в матки другим коровам (приемным матерям), которые затем дают жизнь телятам-близнецам. Телята наследуют генетический статус своих подлинных родителей.
Рис. 130.«Пробирочные» дети
Другой областью клеточной инженерии у животных является создание трансгенных животных. Наиболее простой способ получения таких животных заключается во введении в яйцеклетки исходных животных линейных молекул ДНК. Животные, развившиеся из оплодотворенных таким образом яйцеклеток, будут содержать в одной из своих хромосом копию введенного гена и, кроме того, они будут передавать этот ген по наследству. Более сложный способ получения трансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстного покрова, и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мыши извлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. Затем из эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей, предварительно лишенных ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра, помещают в пробирки
с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиеся из яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. Таким образом, в этих экспериментах удалось получить клон мышей с серой окраской шерстного покрова, т.е. клонировать эмбриональные клетки с заданными свойствами. В главе IV мы рассмотрели результаты оплодотворения искусственно лишенных ядер яйцеклеток овец ядерным материалом соматических клеток животных этого же вида. В частности, из яйцеклеток овец удаляли ядра, а затем в такие яйцеклетки вводили ядра соматических клеток (эмбриональных, плодовых или клеток взрослых животных), после чего оплодотворенные таким образом яйцеклетки вводили в матки взрослых овец. Рождающиеся ягнята оказались идентичными овцедонору. Пример — овца Долли. Получены также клоновые телята, мыши, кролики, кошки, мулы и другие животные. Такое конструирование трансгенных животных представляет собой прямой путь клонирования животных с хозяйственно полезными признаками, включая особей определенного пола.
Трансгенные животные получены также при использовании исходного материала, принадлежащего разным видам. В частности, известен способ передачи гена, контролирующего гормон роста, от крыс в яйцеклетки мышей, а также способ комбинирования бластомеров овцы с бластомерами козы, что привело к возникновению гибридных животных (ковец). Эти эксперименты указывают на воз- можность преодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития. Особенно заманчивые перспективы открываются (если видовая несовместимость будет преодолена полностью) на пути оплодотворения яйцеклеток одного вида ядрами соматических клеток другого вида. Речь идет о реальной перспективе создания хозяйственно ценных гибридов животных, которых невозможно получить путем скрещиваний.
Следует отметить, что ядерно-трансплантационные работы еще не очень эффективны. Эксперименты, выполненные на земноводных и млекопитающих, в целом показали, что их результативность является небольшой, причем она зависит от несовместимости между донорскими ядрами и реципиентными овоцитами. Кроме того, препятствием на пути к успехам являются также образующиеся хромосомные аберрации в трансплантированных ядрах в ходе даль- нейшего развития, которые сопровождаются гибелью трансгенных животных.
На стыке работ по изучению гибридизации клеток и иммунологических исследований возникла проблема, связанная с получением и изучением так называемых моноклональных антител. Как отмечено выше, антитела, продуцируемые организмом в ответ на введение антигена (бактерии, вирусы, эритроциты и т.д.), представляют собой белки, называемые иммуноглобулинами и составляющие фундаментальную часть защитной системы организма против возбудителей болезней. Но любое чужеродное тело, вводимое в организм, представляет собой смесь разных антигенов, которые будут возбуждать продукцию разных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только для групп крови А (II) и В (III), но и многими другими антигенами, включая резус-фактор. Далее, белки клеточной стенки бактерий или капсида вирусов также могут действовать в качестве разных антигенов, вызывающих образование разных антител. В то же время лимфоидные клетки иммунной системы организма обычно представлены клонами. Значит, даже только по этой причине в сыворотке крови иммунизированных животных антитела всегда представляют собой смесь, состоящую из антител, продуцируемых клетками разных клонов. Между тем для практических потребностей необходимы антитела только одного типа, т.е. так называемые моноспецифические сыворотки, содержащие антитела только одного типа или, как их называют, моноклональные антитела.
В поисках методов получения моноклональных антител швейцарскими исследователями в 1975 г. был открыт способ гибридизации между лимфоцитами мышей, иммунизированных тем или иным антигеном, и культивируемыми опухолевыми клетками костного мозга. Такие гибриды получили название «гибри- домные». От «лимфоцитарной» части, представленной лимфоцитом одного клона, одиночная гибридома наследует способность вызывать образование необходимых антител, причем одного типа, а благодаря «опухолевой (миэломной)» части она становится способной, как и все опухолевые клетки, бесконечно долго размно- жаться на искусственных питательных средах, давая многочисленную популяцию гибридов. На рис. 131 показана схема выделения клеточных линий, синтезирующих моноклональные антитела. Линии мышиных клеток, синтезирующих моноклональные антитела, выделяют путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной за пять дней до этого
желаемым антигеном. Слияния клеток достигают смешиванием их в присутствии полиэтиленгликоля, который индуцирует слияние клеточных мембран, а затем в высеве их на питательную среду, позволяющую рост и размножение только гибридных клеток (гибридом). Размножение гибридом проводят в жидкой среде, где они растут далее и секретируют антитела в культуральную жидкость, причем только одного типа, к тому же в неограниченных количествах. Эти антитела получили название моноклональных. Чтобы повысить частоту образования антител, прибегают к клонированию гибридом, т.е. к селекции отдельных колоний гибридом, способных вызывать образование наибольшего количе- ства антител желаемого типа. Моноклональные антитела нашли широкое применение в медицине для диагностики и лечения ряда болезней. В то же время важнейшее преимущество моноклональной технологии заключается в том, что с ее помощью могут быть получены антитела против материалов, которые невозможно очистить. Напротив, можно получить моноклональные антитела против клеточных (плазматических) мембран нейронов животных. Для этого мышей иммунизируют выделенными мембранами нейронов, после чего их селезеночные лимфоциты объединяют с миеломными клетками, а дальше поступают, как описано выше.
Рис. 131. Получение моноклональных антител
www.ronl.ru
План:
Введение………………………………………………………………………3
1. Культивирование клеток растений…………………………………..4
· Каллюсные структуры
· Суспензионная культура
· Культура протопластов.
· Меристематическая культура.
· Культура пыльников.
· Регенерация
2. Клеточная инженерия в нанобиологии. ……………………………10
3. Клеточная инженерия приморского края…………………………..14
Вывод………………………………………………………………………...17
Список литературы………………………………………………………….18
Введение.
Большое значение в биотехнологии приобретают методы, получившие название клеточной инженерии. Предварительно клетки искусственно выделяют из организма и переносят на специально созданные питательные среды, где они в стерильных условиях продолжают жить и размножаться. Такие клеточные культуры (или культура тканей) могут служить для продукции ценных веществ. Например, культура клеток растения женьшень продуцирует лекарственное вещество, как и целое растение.
Клеточные культуры используют и для гибридизации клеток. Применяя некоторые специальные приемы, можно объединить клетки разного происхождения организмов, обычная гибридизация которых половым путем невозможна. Метод клеточной инженерии открывает принципиально новый способ создания гибридов на основе соединения в единую систему не половых, а соматических клеток. Уже получены гибридные клетки и организмы картофеля и томатов, яблони и вишни и некоторые другие. Открываются огромные перспективы для создания человеком новых форм культурных растений.
У животных получение гибридных клеток также открывает новые перспективы, главным образом для медицины. Например, в культуре получены гибриды между раковыми клетками (обладающими способностью к неограниченному росту) и некоторыми клетками кровилимфоцитами. Последние вырабатывают вещества, обусловливающие иммунитет (невосприимчивость) к инфекционным, в том числе вирусным, заболеваниям. Используя такие гибридные клетки, можно получать ценные лекарственные вещества, повышающие устойчивость организма к инфекциям.
Культивирование клеток растений
Полемика, вызванная успешным клонированием ряда животных, почему-то оставила в тени успехи, связанные с клонированием растений. Ведь уже достаточно давно мы имеем дело либо непосредственно с растениями, разводимыми на основе клонирования, либо с веществами, полученными из культивируемых растительных клеток и тканей. Так, с помощью культивирования меристемы, гарантирующего безвирусность растения, были выведены всюду продаваемые гвоздики, хризантемы, герберы и другие декоративные растения. Также можно купить и цветки экзотических орхидных растений, производство клонов которых уже имеет промышленную основу. Некоторые сорта клубники, малины, цитрусовых выведены с использованием техники клонирования. Прежде для выведения нового сорта требовалось 10-30 лет, теперь же, благодаря применению методов культивирования тканей этот период сокращен до нескольких месяцев. Весьма перспективными признаются работы, связанные с производством на основе культивирования тканей растений лекарственных и технических веществ, которые невозможно получить путем синтеза. Так, уже получают подобным способом из клеточных структур барбариса изохинолиновый алкалоид берберин, а из женьшеня — гинсеносид.
Основу культивирования растительных клеток и тканей составляют содержащаяся в каждой клетке информация о всех свойствах и возможностях организма и способность клетки к самостоятельному обмену веществ. Для культивирования подходят различные органы растений. Как правило, используют молодые листья и осевые побеги верхних мутовок, а также столоны, клубни, пыльники, кончики корней, пазушные почки и другие части растения. Меристемные ткани верхушек ростовых побегов и корней имеют особое значение для получения безвирусных клонов. Отобранный материал стерилизуется различными веществами. При этом необходимо соблюсти баланс времени, чтобы, с одной стороны, его продолжительность обеспечила уничтожение микроорганизмов, с другой — не повредила бы клетки самой растительной ткани. Подготовка материала к культивированию завершается многократным обмывом стерильной водой, после чего его помещают в стерильную рабочую банку на питательную среду и растят обязательно в стерильных условиях.
Свойство питательной среды определяются поставленными целями культивирования растительного материала, поскольку именно от заданных условий зависит конечный продукт. Питательная среда бывает жидкой или твердой. Она, как правило, состоит из большого числа синтетических веществ с заданной концентрацией. Поскольку изолированные растительные клетки и ткани большей частью являются гетеротрофными, в ней должен содержаться органически связанный углерод, источником которого обычно служат глюкоза или сахароза. Азот добавляется в форме нитратов, используемых клетками с помощью нитратредуктазы. Применяют также фосфор, калий, кальций, магний, сульфаты. Необходимым компонентом являются витамины, в особенности группы В (В1, В2, В6), миоинозит, биотин, а также аминокислоты и органические соли. К безусловно необходимым микроэлементам относятся бор, марганец, иод, медь, кобальт, молибден. Так, недостаток марганца препятствует синтезу белков, уменьшает количество РНК и приводит к увеличению содержания свободных аминокислот. Железо имеет значение для деления ядра и для деятельности дыхательных ферментов. Наконец, необходимо наличие в питательной среде ряда фитогормонов. Манипулируя концентрациями различных веществ в питательных средах, кислотностью последних, температурой, освещенностью и влажностью в камерах для культивирования, можно получить растения и вещества с требуемыми свойствами. В зависимости от используемых растительных клеток и тканей, способов культивирования различают следующие основные типы структур: каллюсные, суспензионные, протопластов, меристематические, пыльников.
Каллюсные структуры
Для каллюсных структур исходным материалом является каллюс — это ткань, образующаяся у растений на местах ранений и способствующая их заживлению. Она состоит из более или менее однородных паренхимных клеток, начало которым дает раневая меристема. Элементы каллюса мало дифференцированы, однако вблизи его поверхности наблюдается рост, обусловленный активностью меристематических клеток. Впоследствии в каллюсе возможна дифференцировка его элементов и образование флоэмы, ксилемы и других тканей. Наружные клетки каллюса опробковевают.
Для культивирования на выбранном органе делают надрез, на всей поверхности которого развивается ткань, состоящая из неорганизованно растущих клеток. Эта образовавшаяся ткань и культивируется в заданных условиях. В зависимости от вида растения и поставленной цели предварительно необходимо установить состав питательных сред и концентрации фитогормонов, требуемых для оптимального роста. Каллюсы могут выглядеть очень различно. Они бывают рыхлыми или плотными. Окраска каллюса позволяет судить об образовании вторичных веществ. Если каллюс содержать в полной темноте, он беловато-желтый. На свету он образует хлорофилл и становится зеленым. Красный свет указывает на наличие антоциана и бетациана. Чтобы ослабить или устранить эти эффекты, в питательную среду добавляют поливинилпирролидон, глутатион или аскорбиновую кислоту. Коричневые клетки образуются перед отмиранием, поэтому такую ткань необходимо поместить в свежую среду. При длительном культивировании каллюсы могут терять свой морфогенетический потенциал. После нескольких смен питательных сред и при добавлении ростовых гормонов каллюс дифференцирует и регенерирует, образует осевые побеги, корни и, наконец, все растение целиком, способное к размножению и выращиванию в грунте. Однако большей частью каллюсы используются в качестве исходного материала для клеточного или суспензионного культивирования.
Суспензионная культура
Для суспензионных культур исходным материалом могут быть кака изолированные целые клетки выбранного органа растения, так и измельченный каллюс. Образовавшиеся клетки помещают в жидкую питательную среду и культивируют при постояном перемешивании. Рост суспензионной культуры происходит во многих случаях существенно быстрее, чем каллюсной культуры, поскольку скопления клеток поглощают питательные вещества значительно большей общей поверхностью, а у каллюса это происходит лишь в той его части, которая лежит на субстрате. При этом происходит деление клеток, новые клетки не отделяются, и их скопление увеличивается. С помощью особых приемов суспензионную культуру можно перенести на твердую питательную среду. Здесь из клеток или комплексов клеток может образоваться способный к жизни каллюс. В суспензии могут возникнуть также и зародыши, которы после их переноса на агар образуют новое растение.
Культура протопластов.
Культуры протопластов получают главным образом из приготовленной из мезофила суспензии, обрабатывая ее ферментами, разрушающими клеточные стенки. В результате этого может произойти присоединение чужих органелл, а также чужой ДНК, которая встраивается в генетический материал ядра, что может выразиться в экспрессивности. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный заряд, необходимо нейтрализовать их отталкивание друг от друга, после чего они соединяются. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться и регенерируют новые растения. Во многих случаях удавались слияния протопластов разных родительских растений и последующая регенерация через культуру каллюса нового растения с заданными свойствами. Оказалось возможным скрещивать представителей разных видов и родов, что прежде не удавалось. Слиянием протопластов вырастили, например, гибрид картофеля и томата, «томофель». Этот способ имеет коммерческое значение при выведении новых сортов соевых бобов, цитрусовых, сахарного тростника, кукурузы, пшеницы и картофеля. Получен также гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше алкалоида тропана в сравнении с родительскими растениями.
Меристематическая культура.
Для меристематической культуры используют меристему — образовательную ткань растений, долго сохраняющую способность к делению и образованию новых клеток и отличающуюся высокой метаболической активностью. Для культивирования изолируют конусы нарастания побегов, корней, а также пазушные почки. Меристематические культуры более известны в садоводстве, так как они дают возможность получить безвирусные клоны. Из этого можно сделать вывод, что распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема их лишена. Из безвирусной меристемы в большом количестве могут регенерировать генетически идентичные безвирусные растения. Этот способ используют для выведения сортов картофеля, винограда, а также декоративных растений и в лесоводстве.
Культура пыльников.
Культура пыльников используется для получения галлоидных растений. Как правило, растение является диплоидным, т.е. в его клетках содержится два гомологичных набора хромосом. Только зародышевые клетки являются гаплоидными. Для получения гаплоидной культуры наиболее удобны незрелые пыльники, в которых пыльцевые зерна находятся еще в стадии, предшествующей первому делению микроспор на вегетативное и генеративное зерна. После переноса стерильных пыльников на питательную среду пыльцевые клетки начинают делиться. Развивается промежуточный каллюс или сразу образуется гаплоидный зародыш, который позднее дифференцируется в гаплоидное растение. Такие гаплоидные растения стерильны, но они могут перейти в диплоиды после воздействия колхицина или слияния протопластов. Так образуются плодовитые гомозиготные чистые линии растений, имеющие большое значение для селекции, поскольку в последующих поколениях всегда встречаются те же заданные признаки. Благодаря этому методу выведены новые сорта зерновых и табака, а также получены многочисленные лекарственные растения с улучшенными свойствами.
Регенерация
Регенерация — явление восстановления целого организма из его части. При культивировании регенерация может происходить разными путями: прямая регенерация из культур меристемы, верхушечных побегов, пазушных почек и узлов, причем дифференциация управляется фитогормонами, и косвенная, с промежуточной стадией каллюса. В последнем случае возможны также возможны два пути: при органогенезе определенными концентрациями и соотношениями фитогормонов вызывают образование придаточных побегов и корней; при соматическом эмбриогенезе в каллюсе образуются зародыши, из которых вырастает растение, затем переносимое в грунт.
Клеточная инженерия в нанобиологии.
Второе направление развития нанобиотехнологии связано с клеточной инженерией. Культура растительных клеток может служить, прежде всего, источником свойственных данному растению вторичных продуктов. Пользуясь способностью клеток растений превращаться на специальных средах в сформированное растение, клеточные культуры применяют для получения безвирусных растений, пытаются проводить селекцию форм нужными свойствами. Клетки животных более требовательны к условиям культивирования, им необходимы дорогостоящие среды. Все более широкое применение находят так называемые гибридомы, служащие источником белков, необходимых для диагностики и лечения болезней человека, животных и растений.
В настоящее время нанобиотехнология становится основой крупного промышленного производства. Исследования по генной инженерии и получению новых материалов все более актуальны. Это, например, относится к применению растениеводческой продукции в качестве биотоплива. Предполагается, что в ближайшем будущем разработки нанобиоиндустрии будут востребованы еще больше.
В связи с ростом населения в мире сельскому хозяйству предстоит не только увеличить продуктивность, но и уменьшить потери урожая в процессе уборки, послеуборочной обработки и хранения. Нанобиотехнология может внести существенный вклад в улучшения питания, сопротивляемости культур неблагоприятным погодным условиям, а также болезням и вредителям.
Свойства промышленного и сельскохозяйственного сырья на наноразмерном уровне позволят существенно сократить энергоемкость производства единицы продукции, повысить надежность, сроки службы, автоматизировать и внедрить компьютерную технологию в установки и приборы экспресс-контроля и определения качества пищевой продукции, лечения и удлинения продуктивной деятельности биообъектов.
В настоящее время большой интерес представляют так называемые наноэлектротехнологии, т.е. биологические и физиологические процессы, осуществленные с помощью наноэлектрочастиц (электронов, протонов, ионов, фотонов) на уровне живых клеток и микроорганизмов.
Под термином «наноэлектротехнология» понимаются электрофизические воздействия оптического излучения ультрафиолетового (УФ) диапазона на сельскохозяйственные объекты и их составные элементы на уровне биоклеток и их структур.
К УФ излучению относится часть оптической области спектра с длинами волн от 11 до 400 нм, которые обладают наибольшей энергетической активностью по сравнению с видимыми и инфракрасным (ИК) излучением. Исследованиями воздействия УФ излучения на организм животных и растений установлено выраженное разностороннее биологическое действие как естественного, так и искусственного излучения.
Фитобиологические реакции независимо от того, в каком объекте они протекают, разделяются на две группы: функционально-физиологические и деструктивно-одифицирующие.
В научных коллективах агропромышленного профиля разработано и обосновано боле 110 энергосберегающих наноэлектротехнологий, в том числе с использованием электромагнитных полей сверхвысоких частот (ЭМП СВЧ), оптических и ультразвуковых излучений, электрических зарядов и импульсов, элекроаэрозолей и ионов.
Интерес к нанотехнологиям обусловлен тем, что при воздействии на наноуровне материалы и объекты изменяют свою структуру и преобретают некоторые превосходные свойства, включая химические, электрические и оптические. Перспективными направлениями применения нанотехнологий и наноматериалов в сельском хозяйстве могут быть следующие.
Нанороботы (сравнимы по размерам с кровяными клетками или даже меньше их) способны исследовать каждый капилляр. Они поддаются управлению при проведении диагностических операций. Путем применения высокоскоростных беспроводных средств коммуникации нанороботы могут быть объединены в сеть с другими компьютерами, а также образовывать базы данных исследуемых объектов.
Наноустройства, которые могут имплантироваться в растения, животные, позволяют получать и передавать в реальном времени данные о скорости роста и других физиологических характеристиках, обеспечивают определение структуры и продуктивности исследуемых объектов, состояния окружающей среды, а также уровней химических и физических рисков.
Ключевой особенностью биологических наноструктур является способность к распознаванию на молекулярном уровне, которая играет очень важную роль в процессах самосборки атомных и молекулярных структур. Процесс самосборки имеет две характерные особенности: молекулы обладают высокой аффинностью по отношению друг к другу, а в результате образования связей формируется структура с предсказуемыми свойствами. Ученые, которые стремятся создавать определенные наноструктуры, предпочли бы имитировать подобные механизмы сборки. Вместо того чтобы «спускаться» с макроскопического уровня, используя все более точные и дорогостоящие инструменты, удобнее было бы создавать наноконструкции «снизу вверх», начиная с химических систем.
Одно из преимуществ конструирования «снизу вверх» — огромное химическое разнообразие. Поскольку на поверхности компонентов клетки на единицу площади приходится множество функциональных групп, то в качестве строительного блока можно использовать всю эту сложную в химическом отношении поверхность. В принципе, возможно, менять положение и ориентацию такого блока. Конструирование «сверху вниз», напротив, основано на материалах с небольшим химическим разнообразием. Другое преимущество – значительные количества вещества, с которыми приходится иметь дело на химическом уровне. Всего 1 пмоль вещества содержит 1112 молекул. Компонент, который с наибольшим успехом применяется в экспериментах по имитации биологической самосборки – ДНК.
Обеспечение населения безопасными продуктами питания при минимальном загрязнении окружающей среды – основа выживания человечества. В этом аспекте роль нанотехнологий в сельском хозяйстве развитых и развивающихся стран, в том числе и Казахстана, вероятно, будет доминирующей.
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ PANAX GINSENG C.A.MEY
Флора Приморского края является богатейшим потенциальным источником традиционных и новых лекарственных средств растительного происхождения. По количеству уникальных лекарственных растений, неизвестных, или малоизвестных в нашей стране, но широко используемых за рубежом, Приморский край не имеет себе равных среди других районов России. Однако, как правило, эти растения представлены редкими или исчезающими видами, что не позволяет широко использовать их в медицине.
В полной мере это относится и реликтовому дальневосточному растению — женьшеню настоящему (Panax ginseng C.A.Mey).
Установлено, что биологически активными веществами женьшеня являются гинзенозиды, и главным образом, с этой группой веществ связаны целебные свойства женьшеня (Tanaka and Kasai, 1984). Доказано, что гинзенозиды оказывают сильное иммуностимулирующее, радиопротекторное, противоопухолевое, противовоспалительное, антиязвенное действие. Также эти вещества подавляют развитие тромбов, нормализуют кровяное давление, увеличивают продолжительность жизни нейронов коры головного мозга, положительно действуют на эндокринную систему и углеводный обмен. При применении препаратов женьшеня повышается работоспособность, замедляются процессы старения. Тем не менее, использование женьшеня в медицине ограничено низкими сырьевыми запасами природного растения. Исследованиями последних лет установлено, что генетические ресурсы дикорастущего женьшеня близки к истощению (Zhuravlev et al., 1996).
Недостаток природного сырья можно преодолеть путем введения растительных клеток в культуру in vitro, т.е. в культуру клеток растущих вне организма на специально подобранных питательных средах. Введение в клеточную культуру ценных и редких растений решает одновременно две задачи: во-первых, создается возобновляемый источник сырья для выработки лекарственного препарата, во-вторых, создаются предпосылки для сохранения генофонда растения. Поэтому уже более 30 лет проводятся работы по созданию воспроизводимого биотехнологического источника гинзенозидов путем получения клеточных культур женьшеня, синтезирующих набор гинзенозидов в количествах и соотношениях, близких к нативному растению. В то же время большинство из полученных клеточных культур женьшеня отличаются от натуральных корней тем, что содержат не весь набор гинзенозидов, меньшим содержанием суммы гинзенозидов, соотношениями отдельных гинзенозидов. В настоящее время существует ряд методических приемов, направленных на активацию синтеза биологически активных веществ в культурах in vitro.
В Биолого-почвенном институте ДВО РАН из различных органов растений женьшеня получены клеточные культуры (Журавлев и др. 1990; Булгаков и др., 1991), обладающие способностью к синтезу гинзенозидов. В 1992-1997 гг. нами впервые проведено сравнительное изучение эффективности различных путей регуляции синтеза гинзенозидов в полученных культурах. Увеличения выхода биологически активных веществ женьшеня удалось добиться посредством использования селекции, светового режима культивирования, биосинтетических предшественников гинзенозидов (мевалоновой кислоты и фарнезола) и определенных фитогормонов. Разработана схема комбинированной регуляции синтеза гинзенозидов путем изменения условий культивирования и состава сред в сочетании с методами генетической инженерии. Впервые предпринята работа по получению клеточных культур женьшеня, содержащих чужеродные гены и поиску гена ответственного за увеличение синтеза гинзенозидов. Применение методов генной инженерии позволило получить ряд высокопродуктивных трансгенных корневых культур женьшеня, обладающих способностью к стабильному синтезу целевых веществ в течение продолжительного культивирования, что делает эти культуры новым перспективным источником для выработки биологически активных веществ. Используя генетическую трансформацию геном rolC из Agrobacterium rhizogenes впервые удалось вызвать морфогенез (образование побегов и листьев) в клеточной культуре женьшеня. Установлено, что побеги и листья морфогенной культуры синтезируют гинзенозиды в количествах и соотношениях, свойственных надземной части плантационного растения.
Вывод:
Подводя итог можно сказать, что клеточная инженерия – одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта – изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях. Клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотепотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. при решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения значительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.
Список литературы:
«Основы биотехнологии» Егорова, Клунова, Живухина; М. 2003.
«Биология» — еженедельное приложение к газете «Первое сентября» (№21 1998)
www.ronl.ru
www.coolreferat.com
План:
Введение………………………………………………………………………3
1. Культивирование клеток растений…………………………………..4
· Каллюсные структуры
· Суспензионная культура
· Культура протопластов.
· Меристематическая культура.
· Культура пыльников.
· Регенерация
2. Клеточная инженерия в нанобиологии. ……………………………10
3. Клеточная инженерия приморского края…………………………..14
Вывод………………………………………………………………………...17
Список литературы………………………………………………………….18
Введение.
Большое значение в биотехнологии приобретают методы, получившие название клеточной инженерии. Предварительно клетки искусственно выделяют из организма и переносят на специально созданные питательные среды, где они в стерильных условиях продолжают жить и размножаться. Такие клеточные культуры (или культура тканей) могут служить для продукции ценных веществ. Например, культура клеток растения женьшень продуцирует лекарственное вещество, как и целое растение.
Клеточные культуры используют и для гибридизации клеток. Применяя некоторые специальные приемы, можно объединить клетки разного происхождения организмов, обычная гибридизация которых половым путем невозможна. Метод клеточной инженерии открывает принципиально новый способ создания гибридов на основе соединения в единую систему не половых, а соматических клеток. Уже получены гибридные клетки и организмы картофеля и томатов, яблони и вишни и некоторые другие. Открываются огромные перспективы для создания человеком новых форм культурных растений.
У животных получение гибридных клеток также открывает новые перспективы, главным образом для медицины. Например, в культуре получены гибриды между раковыми клетками (обладающими способностью к неограниченному росту) и некоторыми клетками кровилимфоцитами. Последние вырабатывают вещества, обусловливающие иммунитет (невосприимчивость) к инфекционным, в том числе вирусным, заболеваниям. Используя такие гибридные клетки, можно получать ценные лекарственные вещества, повышающие устойчивость организма к инфекциям.
Культивирование клеток растений
Полемика, вызванная успешным клонированием ряда животных, почему-то оставила в тени успехи, связанные с клонированием растений. Ведь уже достаточно давно мы имеем дело либо непосредственно с растениями, разводимыми на основе клонирования, либо с веществами, полученными из культивируемых растительных клеток и тканей. Так, с помощью культивирования меристемы, гарантирующего безвирусность растения, были выведены всюду продаваемые гвоздики, хризантемы, герберы и другие декоративные растения. Также можно купить и цветки экзотических орхидных растений, производство клонов которых уже имеет промышленную основу. Некоторые сорта клубники, малины, цитрусовых выведены с использованием техники клонирования. Прежде для выведения нового сорта требовалось 10-30 лет, теперь же, благодаря применению методов культивирования тканей этот период сокращен до нескольких месяцев. Весьма перспективными признаются работы, связанные с производством на основе культивирования тканей растений лекарственных и технических веществ, которые невозможно получить путем синтеза. Так, уже получают подобным способом из клеточных структур барбариса изохинолиновый алкалоид берберин, а из женьшеня — гинсеносид.
Основу культивирования растительных клеток и тканей составляют содержащаяся в каждой клетке информация о всех свойствах и возможностях организма и способность клетки к самостоятельному обмену веществ. Для культивирования подходят различные органы растений. Как правило, используют молодые листья и осевые побеги верхних мутовок, а также столоны, клубни, пыльники, кончики корней, пазушные почки и другие части растения. Меристемные ткани верхушек ростовых побегов и корней имеют особое значение для получения безвирусных клонов. Отобранный материал стерилизуется различными веществами. При этом необходимо соблюсти баланс времени, чтобы, с одной стороны, его продолжительность обеспечила уничтожение микроорганизмов, с другой — не повредила бы клетки самой растительной ткани. Подготовка материала к культивированию завершается многократным обмывом стерильной водой, после чего его помещают в стерильную рабочую банку на питательную среду и растят обязательно в стерильных условиях.
Свойство питательной среды определяются поставленными целями культивирования растительного материала, поскольку именно от заданных условий зависит конечный продукт. Питательная среда бывает жидкой или твердой. Она, как правило, состоит из большого числа синтетических веществ с заданной концентрацией. Поскольку изолированные растительные клетки и ткани большей частью являются гетеротрофными, в ней должен содержаться органически связанный углерод, источником которого обычно служат глюкоза или сахароза. Азот добавляется в форме нитратов, используемых клетками с помощью нитратредуктазы. Применяют также фосфор, калий, кальций, магний, сульфаты. Необходимым компонентом являются витамины, в особенности группы В (В1, В2, В6), миоинозит, биотин, а также аминокислоты и органические соли. К безусловно необходимым микроэлементам относятся бор, марганец, иод, медь, кобальт, молибден. Так, недостаток марганца препятствует синтезу белков, уменьшает количество РНК и приводит к увеличению содержания свободных аминокислот. Железо имеет значение для деления ядра и для деятельности дыхательных ферментов. Наконец, необходимо наличие в питательной среде ряда фитогормонов. Манипулируя концентрациями различных веществ в питательных средах, кислотностью последних, температурой, освещенностью и влажностью в камерах для культивирования, можно получить растения и вещества с требуемыми свойствами. В зависимости от используемых растительных клеток и тканей, способов культивирования различают следующие основные типы структур: каллюсные, суспензионные, протопластов, меристематические, пыльников.
Каллюсные структуры
Для каллюсных структур исходным материалом является каллюс — это ткань, образующаяся у растений на местах ранений и способствующая их заживлению. Она состоит из более или менее однородных паренхимных клеток, начало которым дает раневая меристема. Элементы каллюса мало дифференцированы, однако вблизи его поверхности наблюдается рост, обусловленный активностью меристематических клеток. Впоследствии в каллюсе возможна дифференцировка его элементов и образование флоэмы, ксилемы и других тканей. Наружные клетки каллюса опробковевают.
Для культивирования на выбранном органе делают надрез, на всей поверхности которого развивается ткань, состоящая из неорганизованно растущих клеток. Эта образовавшаяся ткань и культивируется в заданных условиях. В зависимости от вида растения и поставленной цели предварительно необходимо установить состав питательных сред и концентрации фитогормонов, требуемых для оптимального роста. Каллюсы могут выглядеть очень различно. Они бывают рыхлыми или плотными. Окраска каллюса позволяет судить об образовании вторичных веществ. Если каллюс содержать в полной темноте, он беловато-желтый. На свету он образует хлорофилл и становится зеленым. Красный свет указывает на наличие антоциана и бетациана. Чтобы ослабить или устранить эти эффекты, в питательную среду добавляют поливинилпирролидон, глутатион или аскорбиновую кислоту. Коричневые клетки образуются перед отмиранием, поэтому такую ткань необходимо поместить в свежую среду. При длительном культивировании каллюсы могут терять свой морфогенетический потенциал. После нескольких смен питательных сред и при добавлении ростовых гормонов каллюс дифференцирует и регенерирует, образует осевые побеги, корни и, наконец, все растение целиком, способное к размножению и выращиванию в грунте. Однако большей частью каллюсы используются в качестве исходного материала для клеточного или суспензионного культивирования.
Суспензионная культура
Для суспензионных культур исходным материалом могут быть кака изолированные целые клетки выбранного органа растения, так и измельченный каллюс. Образовавшиеся клетки помещают в жидкую питательную среду и культивируют при постояном перемешивании. Рост суспензионной культуры происходит во многих случаях существенно быстрее, чем каллюсной культуры, поскольку скопления клеток поглощают питательные вещества значительно большей общей поверхностью, а у каллюса это происходит лишь в той его части, которая лежит на субстрате. При этом происходит деление клеток, новые клетки не отделяются, и их скопление увеличивается. С помощью особых приемов суспензионную культуру можно перенести на твердую питательную среду. Здесь из клеток или комплексов клеток может образоваться способный к жизни каллюс. В суспензии могут возникнуть также и зародыши, которы после их переноса на агар образуют новое растение.
Культура протопластов.
Культуры протопластов получают главным образом из приготовленной из мезофила суспензии, обрабатывая ее ферментами, разрушающими клеточные стенки. В результате этого может произойти присоединение чужих органелл, а также чужой ДНК, которая встраивается в генетический материал ядра, что может выразиться в экспрессивности. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный заряд, необходимо нейтрализовать их отталкивание друг от друга, после чего они соединяются. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться и регенерируют новые растения. Во многих случаях удавались слияния протопластов разных родительских растений и последующая регенерация через культуру каллюса нового растения с заданными свойствами. Оказалось возможным скрещивать представителей разных видов и родов, что прежде не удавалось. Слиянием протопластов вырастили, например, гибрид картофеля и томата, «томофель». Этот способ имеет коммерческое значение при выведении новых сортов соевых бобов, цитрусовых, сахарного тростника, кукурузы, пшеницы и картофеля. Получен также гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше алкалоида тропана в сравнении с родительскими растениями.
Меристематическая культура.
Для меристематической культуры используют меристему — образовательную ткань растений, долго сохраняющую способность к делению и образованию новых клеток и отличающуюся высокой метаболической активностью. Для культивирования изолируют конусы нарастания побегов, корней, а также пазушные почки. Меристематические культуры более известны в садоводстве, так как они дают возможность получить безвирусные клоны. Из этого можно сделать вывод, что распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема их лишена. Из безвирусной меристемы в большом количестве могут регенерировать генетически идентичные безвирусные растения. Этот способ используют для выведения сортов картофеля, винограда, а также декоративных растений и в лесоводстве.
Культура пыльников.
Культура пыльников используется для получения галлоидных растений. Как правило, растение является диплоидным, т.е. в его клетках содержится два гомологичных набора хромосом. Только зародышевые клетки являются гаплоидными. Для получения гаплоидной культуры наиболее удобны незрелые пыльники, в которых пыльцевые зерна находятся еще в стадии, предшествующей первому делению микроспор на вегетативное и генеративное зерна. После переноса стерильных пыльников на питательную среду пыльцевые клетки начинают делиться. Развивается промежуточный каллюс или сразу образуется гаплоидный зародыш, который позднее дифференцируется в гаплоидное растение. Такие гаплоидные растения стерильны, но они могут перейти в диплоиды после воздействия колхицина или слияния протопластов. Так образуются плодовитые гомозиготные чистые линии растений, имеющие большое значение для селекции, поскольку в последующих поколениях всегда встречаются те же заданные признаки. Благодаря этому методу выведены новые сорта зерновых и табака, а также получены многочисленные лекарственные растения с улучшенными свойствами.
Регенерация
Регенерация — явление восстановления целого организма из его части. При культивировании регенерация может происходить разными путями: прямая регенерация из культур меристемы, верхушечных побегов, пазушных почек и узлов, причем дифференциация управляется фитогормонами, и косвенная, с промежуточной стадией каллюса. В последнем случае возможны также возможны два пути: при органогенезе определенными концентрациями и соотношениями фитогормонов вызывают образование придаточных побегов и корней; при соматическом эмбриогенезе в каллюсе образуются зародыши, из которых вырастает растение, затем переносимое в грунт.
Клеточная инженерия в нанобиологии.
Второе направление развития нанобиотехнологии связано с клеточной инженерией. Культура растительных клеток может служить, прежде всего, источником свойственных данному растению вторичных продуктов. Пользуясь способностью клеток растений превращаться на специальных средах в сформированное растение, клеточные культуры применяют для получения безвирусных растений, пытаются проводить селекцию форм нужными свойствами. Клетки животных более требовательны к условиям культивирования, им необходимы дорогостоящие среды. Все более широкое применение находят так называемые гибридомы, служащие источником белков, необходимых для диагностики и лечения болезней человека, животных и растений.
В настоящее время нанобиотехнология становится основой крупного промышленного производства. Исследования по генной инженерии и получению новых материалов все более актуальны. Это, например, относится к применению растениеводческой продукции в качестве биотоплива. Предполагается, что в ближайшем будущем разработки нанобиоиндустрии будут востребованы еще больше.
В связи с ростом населения в мире сельскому хозяйству предстоит не только увеличить продуктивность, но и уменьшить потери урожая в процессе уборки, послеуборочной обработки и хранения. Нанобиотехнология может внести существенный вклад в улучшения питания, сопротивляемости культур неблагоприятным погодным условиям, а также болезням и вредителям.
Свойства промышленного и сельскохозяйственного сырья на наноразмерном уровне позволят существенно сократить энергоемкость производства единицы продукции, повысить надежность, сроки службы, автоматизировать и внедрить компьютерную технологию в установки и приборы экспресс-контроля и определения качества пищевой продукции, лечения и удлинения продуктивной деятельности биообъектов.
В настоящее время большой интерес представляют так называемые наноэлектротехнологии, т.е. биологические и физиологические процессы, осуществленные с помощью наноэлектрочастиц (электронов, протонов, ионов, фотонов) на уровне живых клеток и микроорганизмов.
Под термином «наноэлектротехнология» понимаются электрофизические воздействия оптического излучения ультрафиолетового (УФ) диапазона на сельскохозяйственные объекты и их составные элементы на уровне биоклеток и их структур.
К УФ излучению относится часть оптической области спектра с длинами волн от 11 до 400 нм, которые обладают наибольшей энергетической активностью по сравнению с видимыми и инфракрасным (ИК) излучением. Исследованиями воздействия УФ излучения на организм животных и растений установлено выраженное разностороннее биологическое действие как естественного, так и искусственного излучения.
Фитобиологические реакции независимо от того, в каком объекте они протекают, разделяются на две группы: функционально-физиологические и деструктивно-одифицирующие.
В научных коллективах агропромышленного профиля разработано и обосновано боле 110 энергосберегающих наноэлектротехнологий, в том числе с использованием электромагнитных полей сверхвысоких частот (ЭМП СВЧ), оптических и ультразвуковых излучений, электрических зарядов и импульсов, элекроаэрозолей и ионов.
Интерес к нанотехнологиям обусловлен тем, что при воздействии на наноуровне материалы и объекты изменяют свою структуру и преобретают некоторые превосходные свойства, включая химические, электрические и оптические. Перспективными направлениями применения нанотехнологий и наноматериалов в сельском хозяйстве могут быть следующие.
Нанороботы (сравнимы по размерам с кровяными клетками или даже меньше их) способны исследовать каждый капилляр. Они поддаются управлению при проведении диагностических операций. Путем применения высокоскоростных беспроводных средств коммуникации нанороботы могут быть объединены в сеть с другими компьютерами, а также образовывать базы данных исследуемых объектов.
Наноустройства, которые могут имплантироваться в растения, животные, позволяют получать и передавать в реальном времени данные о скорости роста и других физиологических характеристиках, обеспечивают определение структуры и продуктивности исследуемых объектов, состояния окружающей среды, а также уровней химических и физических рисков.
Ключевой особенностью биологических наноструктур является способность к распознаванию на молекулярном уровне, которая играет очень важную роль в процессах самосборки атомных и молекулярных структур. Процесс самосборки имеет две характерные особенности: молекулы обладают высокой аффинностью по отношению друг к другу, а в результате образования связей формируется структура с предсказуемыми свойствами. Ученые, которые стремятся создавать определенные наноструктуры, предпочли бы имитировать подобные механизмы сборки. Вместо того чтобы «спускаться» с макроскопического уровня, используя все более точные и дорогостоящие инструменты, удобнее было бы создавать наноконструкции «снизу вверх», начиная с химических систем.
Одно из преимуществ конструирования «снизу вверх» — огромное химическое разнообразие. Поскольку на поверхности компонентов клетки на единицу площади приходится множество функциональных групп, то в качестве строительного блока можно использовать всю эту сложную в химическом отношении поверхность. В принципе, возможно, менять положение и ориентацию такого блока. Конструирование «сверху вниз», напротив, основано на материалах с небольшим химическим разнообразием. Другое преимущество – значительные количества вещества, с которыми приходится иметь дело на химическом уровне. Всего 1 пмоль вещества содержит 1112 молекул. Компонент, который с наибольшим успехом применяется в экспериментах по имитации биологической самосборки – ДНК.
Обеспечение населения безопасными продуктами питания при минимальном загрязнении окружающей среды – основа выживания человечества. В этом аспекте роль нанотехнологий в сельском хозяйстве развитых и развивающихся стран, в том числе и Казахстана, вероятно, будет доминирующей.
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ PANAX GINSENG C.A.MEY
Флора Приморского края является богатейшим потенциальным источником традиционных и новых лекарственных средств растительного происхождения. По количеству уникальных лекарственных растений, неизвестных, или малоизвестных в нашей стране, но широко используемых за рубежом, Приморский край не имеет себе равных среди других районов России. Однако, как правило, эти растения представлены редкими или исчезающими видами, что не позволяет широко использовать их в медицине.
В полной мере это относится и реликтовому дальневосточному растению — женьшеню настоящему (Panax ginseng C.A.Mey).
Установлено, что биологически активными веществами женьшеня являются гинзенозиды, и главным образом, с этой группой веществ связаны целебные свойства женьшеня (Tanaka and Kasai, 1984). Доказано, что гинзенозиды оказывают сильное иммуностимулирующее, радиопротекторное, противоопухолевое, противовоспалительное, антиязвенное действие. Также эти вещества подавляют развитие тромбов, нормализуют кровяное давление, увеличивают продолжительность жизни нейронов коры головного мозга, положительно действуют на эндокринную систему и углеводный обмен. При применении препаратов женьшеня повышается работоспособность, замедляются процессы старения. Тем не менее, использование женьшеня в медицине ограничено низкими сырьевыми запасами природного растения. Исследованиями последних лет установлено, что генетические ресурсы дикорастущего женьшеня близки к истощению (Zhuravlev et al., 1996).
Недостаток природного сырья можно преодолеть путем введения растительных клеток в культуру in vitro, т.е. в культуру клеток растущих вне организма на специально подобранных питательных средах. Введение в клеточную культуру ценных и редких растений решает одновременно две задачи: во-первых, создается возобновляемый источник сырья для выработки лекарственного препарата, во-вторых, создаются предпосылки для сохранения генофонда растения. Поэтому уже более 30 лет проводятся работы по созданию воспроизводимого биотехнологического источника гинзенозидов путем получения клеточных культур женьшеня, синтезирующих набор гинзенозидов в количествах и соотношениях, близких к нативному растению. В то же время большинство из полученных клеточных культур женьшеня отличаются от натуральных корней тем, что содержат не весь набор гинзенозидов, меньшим содержанием суммы гинзенозидов, соотношениями отдельных гинзенозидов. В настоящее время существует ряд методических приемов, направленных на активацию синтеза биологически активных веществ в культурах in vitro.
В Биолого-почвенном институте ДВО РАН из различных органов растений женьшеня получены клеточные культуры (Журавлев и др. 1990; Булгаков и др., 1991), обладающие способностью к синтезу гинзенозидов. В 1992-1997 гг. нами впервые проведено сравнительное изучение эффективности различных путей регуляции синтеза гинзенозидов в полученных культурах. Увеличения выхода биологически активных веществ женьшеня удалось добиться посредством использования селекции, светового режима культивирования, биосинтетических предшественников гинзенозидов (мевалоновой кислоты и фарнезола) и определенных фитогормонов. Разработана схема комбинированной регуляции синтеза гинзенозидов путем изменения условий культивирования и состава сред в сочетании с методами генетической инженерии. Впервые предпринята работа по получению клеточных культур женьшеня, содержащих чужеродные гены и поиску гена ответственного за увеличение синтеза гинзенозидов. Применение методов генной инженерии позволило получить ряд высокопродуктивных трансгенных корневых культур женьшеня, обладающих способностью к стабильному синтезу целевых веществ в течение продолжительного культивирования, что делает эти культуры новым перспективным источником для выработки биологически активных веществ. Используя генетическую трансформацию геном rolC из Agrobacterium rhizogenes впервые удалось вызвать морфогенез (образование побегов и листьев) в клеточной культуре женьшеня. Установлено, что побеги и листья морфогенной культуры синтезируют гинзенозиды в количествах и соотношениях, свойственных надземной части плантационного растения.
Вывод:
Подводя итог можно сказать, что клеточная инженерия – одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта – изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях. Клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотепотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. при решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения значительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.
Список литературы:
«Основы биотехнологии» Егорова, Клунова, Живухина; М. 2003.
«Биология» — еженедельное приложение к газете «Первое сентября» (№21 1998)
www.ronl.ru
Как отмечено в начале главы, клеточной инженерией называют генетические манипуляции с изолированными клетками животных и растений. Эти манипуляции часто осуществляют in vitro, а главной целью они имеют получение генотипов этих организмов с заданными свойствами, в первую очередь хозяйственно полезными. Что касает-
ся человека, то клеточная инженерия оказалась применимой к его половым клеткам.
Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека и животных явилась разработка методов культивирования их сома- тических клеток на искусственных питательных средах, а также получение гибридов соматических клеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь успехи в культивировании соматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворения у человека и животных. Начиная с 60-х гг. ХХ в. в нескольких лабораториях мира были выполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов часто были противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточных ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклетки (см. гл. IV).
На основе результатов изучения развития оплодотворенных яйцеклеток в 60-е гг. XX в. были начаты также исследования по выяснению возможности оплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследования привели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами в пробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей при имплантации в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных в этой области методов привело к тому, что рождение «пробирочных» детей стало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которым была дана в лаборатории, в пробирке. В настоящее время этот раздел клеточной инженерии получил большое распространение, а количество «пробирочных» детей составляет уже десятки тысяч (рис. 130). В России работы по получению «пробирочных» детей были начаты только в 1986 г.
В 1993 г. была разработана методика получения монозиготных близнецов человека in vitro путем разделения эмбрионов на бласто- меры и доращивания последних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в матку женщины.
Под влиянием результатов, связанных с получением «пробирочных» детей, у животных тоже была разработана технология, получившая название трансплантации эмбрионов. Она связана с разработкой способа индукции полиовуляции, способов искусственного оплодот- ворения яйцеклеток и имплантации зародышей в организм животных — приемных матерей. Суть этой технологии сводится к следую-
щему. Высокопродуктивной корове вводят гормоны, в результате чего наступает полиовуляция, заключающаяся в созревании сразу 10-20 клеток. Затем яйцеклетки искусственно оплодотворяются мужскими половыми клетками в яйцеводе. На 7-8-й день зародыши вымывают из матки и трансплантируют в матки другим коровам (приемным матерям), которые затем дают жизнь телятам-близнецам. Телята наследуют генетический статус своих подлинных родителей.
Рис. 130.«Пробирочные» дети
Другой областью клеточной инженерии у животных является создание трансгенных животных. Наиболее простой способ получения таких животных заключается во введении в яйцеклетки исходных животных линейных молекул ДНК. Животные, развившиеся из оплодотворенных таким образом яйцеклеток, будут содержать в одной из своих хромосом копию введенного гена и, кроме того, они будут передавать этот ген по наследству. Более сложный способ получения трансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстного покрова, и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мыши извлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. Затем из эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей, предварительно лишенных ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра, помещают в пробирки
с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиеся из яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. Таким образом, в этих экспериментах удалось получить клон мышей с серой окраской шерстного покрова, т.е. клонировать эмбриональные клетки с заданными свойствами. В главе IV мы рассмотрели результаты оплодотворения искусственно лишенных ядер яйцеклеток овец ядерным материалом соматических клеток животных этого же вида. В частности, из яйцеклеток овец удаляли ядра, а затем в такие яйцеклетки вводили ядра соматических клеток (эмбриональных, плодовых или клеток взрослых животных), после чего оплодотворенные таким образом яйцеклетки вводили в матки взрослых овец. Рождающиеся ягнята оказались идентичными овцедонору. Пример — овца Долли. Получены также клоновые телята, мыши, кролики, кошки, мулы и другие животные. Такое конструирование трансгенных животных представляет собой прямой путь клонирования животных с хозяйственно полезными признаками, включая особей определенного пола.
Трансгенные животные получены также при использовании исходного материала, принадлежащего разным видам. В частности, известен способ передачи гена, контролирующего гормон роста, от крыс в яйцеклетки мышей, а также способ комбинирования бластомеров овцы с бластомерами козы, что привело к возникновению гибридных животных (ковец). Эти эксперименты указывают на воз- можность преодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития. Особенно заманчивые перспективы открываются (если видовая несовместимость будет преодолена полностью) на пути оплодотворения яйцеклеток одного вида ядрами соматических клеток другого вида. Речь идет о реальной перспективе создания хозяйственно ценных гибридов животных, которых невозможно получить путем скрещиваний.
Следует отметить, что ядерно-трансплантационные работы еще не очень эффективны. Эксперименты, выполненные на земноводных и млекопитающих, в целом показали, что их результативность является небольшой, причем она зависит от несовместимости между донорскими ядрами и реципиентными овоцитами. Кроме того, препятствием на пути к успехам являются также образующиеся хромосомные аберрации в трансплантированных ядрах в ходе даль- нейшего развития, которые сопровождаются гибелью трансгенных животных.
На стыке работ по изучению гибридизации клеток и иммунологических исследований возникла проблема, связанная с получением и изучением так называемых моноклональных антител. Как отмечено выше, антитела, продуцируемые организмом в ответ на введение антигена (бактерии, вирусы, эритроциты и т.д.), представляют собой белки, называемые иммуноглобулинами и составляющие фундаментальную часть защитной системы организма против возбудителей болезней. Но любое чужеродное тело, вводимое в организм, представляет собой смесь разных антигенов, которые будут возбуждать продукцию разных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только для групп крови А (II) и В (III), но и многими другими антигенами, включая резус-фактор. Далее, белки клеточной стенки бактерий или капсида вирусов также могут действовать в качестве разных антигенов, вызывающих образование разных антител. В то же время лимфоидные клетки иммунной системы организма обычно представлены клонами. Значит, даже только по этой причине в сыворотке крови иммунизированных животных антитела всегда представляют собой смесь, состоящую из антител, продуцируемых клетками разных клонов. Между тем для практических потребностей необходимы антитела только одного типа, т.е. так называемые моноспецифические сыворотки, содержащие антитела только одного типа или, как их называют, моноклональные антитела.
В поисках методов получения моноклональных антител швейцарскими исследователями в 1975 г. был открыт способ гибридизации между лимфоцитами мышей, иммунизированных тем или иным антигеном, и культивируемыми опухолевыми клетками костного мозга. Такие гибриды получили название «гибри- домные». От «лимфоцитарной» части, представленной лимфоцитом одного клона, одиночная гибридома наследует способность вызывать образование необходимых антител, причем одного типа, а благодаря «опухолевой (миэломной)» части она становится способной, как и все опухолевые клетки, бесконечно долго размно- жаться на искусственных питательных средах, давая многочисленную популяцию гибридов. На рис. 131 показана схема выделения клеточных линий, синтезирующих моноклональные антитела. Линии мышиных клеток, синтезирующих моноклональные антитела, выделяют путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной за пять дней до этого
желаемым антигеном. Слияния клеток достигают смешиванием их в присутствии полиэтиленгликоля, который индуцирует слияние клеточных мембран, а затем в высеве их на питательную среду, позволяющую рост и размножение только гибридных клеток (гибридом). Размножение гибридом проводят в жидкой среде, где они растут далее и секретируют антитела в культуральную жидкость, причем только одного типа, к тому же в неограниченных количествах. Эти антитела получили название моноклональных. Чтобы повысить частоту образования антител, прибегают к клонированию гибридом, т.е. к селекции отдельных колоний гибридом, способных вызывать образование наибольшего количе- ства антител желаемого типа. Моноклональные антитела нашли широкое применение в медицине для диагностики и лечения ряда болезней. В то же время важнейшее преимущество моноклональной технологии заключается в том, что с ее помощью могут быть получены антитела против материалов, которые невозможно очистить. Напротив, можно получить моноклональные антитела против клеточных (плазматических) мембран нейронов животных. Для этого мышей иммунизируют выделенными мембранами нейронов, после чего их селезеночные лимфоциты объединяют с миеломными клетками, а дальше поступают, как описано выше.
Рис. 131. Получение моноклональных антител
www.ronl.ru
