При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазовоконтрастного конденсора и фазового объектива
Фазовоконтрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.
Фазовоконтрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, ФИТЦ, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.
Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 17). Очень важно использование нефлюоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний с помощью реакции иммунофлюоресценции.
Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большойдлиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 18).
В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.
Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследую объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.
С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получит увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.
№8 Классификация прокариотов. Основные таксономические единицы. Понятие о виде, варианте, штамме, клоне, квазивиде
Классификация. Классификация осуществляется по иерархической схеме. Основной единицей является чистая культура выделенной бактерии – «штамм». Штаммы объединяются в виды, виды в роды, а роды в семейства. Основой для классификации служит адекватное описание штаммов, в соответствии с которым и проводят сравнение и разграничение рассматриваемых единиц.
Следует различать два вида классификаций: филогенетические, или «естественные», с одной стороны, и искусственные-с другой. Построение естественной классификации – конечная цель таксономии бактерий, которая состоит в том, чтобы объединить родственные формы, связанные общностью происхождения, и на этой основе создать филогенетическое древо бактерий. Несомненно, когда-нибудь это удастся сделать, исходя из химических признаков – таких, как последовательность аминокислот в функционально сходных ферментных белках или последовательность нуклеотидов в консервативных нуклеиновых кислотах, например в рибосомных РНК.
Искусственная классификация ставит перед собой более скромные цели, чем филогенетическая. Она довольствуется объединением организмов в отдельные группы на основе их сходства и используется для идентификации и распознавания (определения) организмов. Искусственная система, прежде всего, рассчитана на использование ее в качестве ключа для определения.
Вид (лат. species) – таксономическая, систематическая единица, группа особей с общими морфофизиологическими, биохимическими и поведенческими признаками, способная к взаимному скрещиванию, дающему в ряду поколений плодовитое потомство, закономерно распространённая в пределах определённого ареала и сходно изменяющаяся под влиянием факторов внешней среды. Вид – реально существующая генетически неделимая единица живого мира, основная структурная единица в системе организмов.
Штамм (от нем. Stammen, буквально – происходить) – чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и определенном месте. Поскольку многие микроорганизмы размножаются митозом (делением), без участия полового процесса, по существу, виды у таких микроорганизмов состоят изклональных линий, генетически и морфологически идентичных исходной клетке. Штамм не является таксономической категорией, наинизшим таксоном у всех организмов является вид, один и тот же штамм не может быть выделен второй раз из того же источника в другое время.
Штамм – популяция одного вида выделенная из какого-либо одного источника.
Клонирование, в биологии – метод получения нескольких генетически идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения.
Клон – потомство одной клетки.
№9. Основные отличия эукариотических и прокариотических клеток.
1) В клетках эукариот хроматин защищен мембраной, в то время как у прокариот он растворен в цитоплазме. 2) В клетках эукариот рибосомы имеют бОльший размер, чем в клетках прокариот. 3) Эукариоты имеют линейную ДНК. Прокариоты, в большинстве своём, кольцевую (замкнутую). 4) ДНК эукариот во время делений клетки накручивается на гистоны. У прокариот гистоны отсутствуют. 5) Эукариоты делятся митозом, мейозом (кроме, например, простейших).Прокариоты, в основном, делятся простым делением пополам. 6) Клетки эукариот богаты многими органеллами (одних митохондрий может быть до 50000), в том время как прокариоты многих органелл не имеют (митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматическая сеть и пр.) 7) Для эукариотических клеток характерны процессы эндоцитоза, фагоцитоза и пиноцитоза. 8) У эукариотических организмов имеются самые разнообразные клеточные стенки (например, у животных её вообще нет). У большинства прокариот клеточная мембрана состоит преимущественно из муреина. 9) По типу питания эукариоты могут быть самые разные. Прокариоты только хемотрофы, фототрофы и паразиты. 10) Эукариотические клетки имеют бОльшие размеры, чем прокариотические.
№10 Морфология и анатомия бактерий. Постоянные и непостоянные компоненты бактериальной клетки.
По форме клеток бактерии разделяются: на шаровидные - кокки, палочковидные или цилиндрические - собственно бактерии и извитые - вибрионы спириллы и спирохеты. Между этими группами имеются переходные формы, например, кокко-бактерии.
Кроме этих основных групп в природе встречаются и другие формы бактерий: нитевидные, микобактерии (палочковидная ветвящаяся форма).
Я дро у прокариот, которое часто называют нуклеоидом, имеет фибриальную структуру и не отграниченно от цитоплазмы ядерной мембраной. В клетках прокариот отсутствуют митохондрии, хлоропласты, пластинчатый комплекс Гольджи. Окислительно-восстановительные ферменты локализованы в производных образованиях цитоплазматической мембраны — мезосомах.
У прокариот отсутствует митоз. Они размножаются путем бинарного деления и существуют в гаплоидном состоянии, вследствии чего диплоидность эукариот, имеющая огромное значение в их эволюции, не играет никакой роли в эволюции прокариот. У прокариот отсутствует также клеточный центр. Для них нетипичны внутриклеточные перемещения цитоплазмы и амебовидное движение.
По форме клеток собственно бактерии подразделяются на шаровидные, палочковидные и извитые.
Шаровидные бактерии — кокки имеют правильную сферическую или эллипсовидную форму. Одни из них располагаются беспорядочно (микроккоки), другие парами (диплококкки), третьи — цепочками из трех и более кокков (стрептококки) или восьми (сарцины) кокков. Это связано с особенностями их деления. В том случае, если они делятся в разных плоскостях, то образуются скопления, напоминающие виноградную гроздь (стафилококки). Деление в двух взаимоперпендикулярных плоскостях приводит к образованию тетракокков, в трех — сарцины. При делении в одной плоскости дочерние клетки могут не отходить друг от друга, образуя диплококки и цепочки кокков — стрептококки. Патогенные бактерии чаще всего представлены стафилококками, стрептококками, реже микрококками.
Палочковидные бактерии, имеющие цилиндрическую форму, различаются по размерам, форме клеток и их концов, а также по расположению. Большинство из них имеет длину, превышающую поперечник. Другие представляют собой крупные палочки с утолщениями на концах либо с обрубленными или заостренными концами. Они могут беспорядочно располагаться в виде одиночных клеток, парами — диплобактерии, в виде цепочек — стрептобактерии. Патогенные виды относятся ко всем перечисленным формам палочковидных бактерий.
Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками, изгибы которых имеют один (холерный вибрион) или несколько оборотов (кампилобактерии) спирали. Извитые формы — вибрионы и спириллы, а также спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спиральными завитками.
Ультраструктура бактериальной клетки отражает уникальность ее организации. С помощью электронно-микроскопического исследования ультратонких срезов бактерий, цитохим-их и других методов исследования можно установить структуру определенных органелл, определить их хим-ий состав и функциональную роль, которую они играют в процессе жизнедеят-ти клетки.
Структура бактериальной клетки. Структурные элементы бактериальной клетки можно условно разделить на: а) постоянные структурные элементы - имеются у каждого вида бактерий, в течение всей жизни бактерии; это клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, нуклеоид; б) непостоянные структурные элементы, которые способны образовывать не все виды бактерий, а те бактерии, которые образуют их, могут терять их и вновь приобретать в зависимости от условий существования. Это капсула, включения, пили, споры, жгутики.
studfiles.net
Многие объекты плохо различимы на фоне окружения из-за своих оптических свойств. Поэтому микроскопы оснащаются разнообразными инструментами, облегчающими выделение объекта на фоне среды.
Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольнои микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами. Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой. При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако Темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру. С помощью темнопольнои микроскопии изучают препараты типа раздавленная «капля». Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.
Фазово-контрастная микроскопия
метод микроскопического исследования, основанный на получении с помощью специальных приспособлений контрастного изображения различающихся по плотности структур бесцветных прозрачных микрообъектов, например живых микроорганизмов и тканевых культур.
Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п.
Содержание:
План…………………………………………………………………………………………..2
Световые микроскопы. Виды……………………………………………………………….3
Комплектация микроскопа…………………………………………………………..4
Уход за микроскопом…………………………………………………………………5
Классификация объективов…………………………………………………………………5
Иммерсионная система………………………………………………………………6
Счетные камеры……………………………………………………………………………...7
Методы контрастирования изображения…………………………………………………..8
Список литературы…………………………………………………………………………11
Список сайтов:
http://altami.ru/microscopes/
http://www.medical-enc.ru/m/12/vidy-svetovoy-mikroskopii.shtml
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B8%D0%BA%D1%80%D0%BE%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BF%D0%B8%D1%8F
http://www.mikroskopia.ru/info/32.html
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9E%D0%BF%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D0%BC%D0%B8%D0%BA%D1%80%D0%BE%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BF
http://micromed.pro/pravila-uhoda-i-raboti-s-mikrosk.htm
http://labx.narod.ru/documents/classification_labeling_of_microscope_objectives.html
http://www.mikroskopia.ru/info/34.html
http://biobib.ru/index.php/mikrobiologiya/rabota-s-mikroskopom/texnika-mikrokopirovaniya.html
http://www.vita-club.ru/micros2.htm
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BC%D0%BC%D0%B5%D1%80%D1%81%D0%B8%D1%8F_(%D0%BC%D0%B8%D0%BA%D1%80%D0%BE%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BF%D0%B8%D1%8F)
http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_physics/1081/%D0%98%D0%9C%D0%9C%D0%95%D0%A0%D0%A1%D0%98%D0%9E%D0%9D%D0%9D%D0%90%D0%AF
http://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/bacter/t_microscop.htm
studfiles.net
Фазово-контрастная микроскопия, впервые описанная в 1934 году голландским физиком Фрицем Цернике, является оптическим методом усиления контраста для формирования высококонтрастных изображений прозрачных образцов, таких как живые клетки (обычно в культуре), микроорганизмы, тонкие срезы тканей, литографические рисунки, волокна, дисперсии латексов, фрагменты стекла и субклеточные структуры (включая ядра и другие органеллы).
Суть метода фазового контраста заключается в применении оптического механизма преобразования незначительных изменений в фазе в соответствующие изменения в амплитуде, которые могут быть визуализированы как изменение контраста изображения. Одним из главных преимуществ фазово-контрастной микроскопии является возможность исследовать живые клетки в их естественном состоянии, не убивая их и не прибегая к связыванию или окрашиванию. В результате, динамика происходящих в клетке биологических процессов может наблюдаться и фиксироваться с высоким контрастом и разрешением мельчайших деталей образца.
На рисунке 1 представлены диаграмма прямого фазово-контрастного микроскопа в разрезе и схематическая иллюстрация фазово-контрастной оптической системы. Частично когерентное освещение, производимое галогенной лампы с вольфрамовой нитью, направляется на собирающую линзу и фокусируется на специальном кольце (на рисунке конденсорное кольцо), расположенном в передней фокальной плоскости конденсора. Проходящие через кольцо волновые фронты освещают образец, в котором они либо не испытывают отклонений, либо дифрагируют с запаздыванием по фазе на присутствующих в нём структурах и фазовых градиентах. Неотклонённый и дифрагированный свет, собираемый объективом, разделяется в его задней фокальной плоскости фазовой пластиной и фокусируется в плоскости промежуточного изображения, где и формируется конечное фазово-контрастное изображение, наблюдаемое в окуляр.
До изобретения метода фазового контраста наблюдение в светлопольном проходящем свете было одним из самых распространённых режимов оптической микроскопии, особенно для связанных и окрашенных образцов и других препаратов с высоким естественным поглощением видимого света. Обобщённо, все образцы, хорошо видимые при светлопольном освещении, называются амплитудными объектами (или образцами), поскольку амплитуда или интенсивность освещающего волнового фронта падает при прохождении света через такие образцы.
Оснащение стандартного светлопольного микроскопа вспомогательными оптическими фазово-контрастными приспособлениями может быть использовано для придания большего контраста прозрачным образцам, изображения которых в этом случае напоминают полученные методом оптического окрашивания (см. рисунок 2). Фазовое смещение дифрагированных в образце (называемом фазовым объектом) световых волн методом фазового контраста может быть преобразовано в разницу амплитуд, наблюдаемых в окуляр. Образцы больших размеров также легко наблюдать фазово-контрастным методом благодаря дифракции и рассеянию, происходящих на краях этих объектов. Производительность современных фазово-контрастных микроскопов настолько высока, что позволяет, в сочетании с электронным усилением и последующей обработкой изображения, визуализировать мельчайшие внутренние структуры образцов, иногда состоящие всего из нескольких белковых молекул.
На рисунке 2 сравниваются изображения живых клеток в культуре, полученные при светлопольном и фазово-контрастном освещении. Клетками является глиальная ткань мозга человека, выращенная в монослойной культуре в питательном растворе, содержащем аминокислоты, витамины, минеральные соли и фетальную телячью сыворотку. При светлопольном освещении (рисунок 2(а)) клетки оказываются полупрозрачными, так что различить можно только участки с высоким преломлением, такие как мембраны, ядра и неприкреплённые клетки (круглые или сферические). При наблюдении с применением вспомогательных фазово-контрастных устройств в том же поле зрения обнаруживается значительно больше структурных деталей (рисунок 2(b)). Становятся различимы места прикрепления клеток, и, в значительной степени, внутренняя структура. К тому же, существенно расширен диапазон контрастности.
Создание Цернике оптической теории фазового контраста является замечательным примером того, как результаты исследования в высоко специализированной области (в данном случае — теоретической физике) могут послужить толчком к развитию новых направлений в таких, казалось бы, не связанных дисциплинах, как биология и медицина.
В микроскопии, метод фазового контраста был впервые применен во время Второй мировой войны компанией Zeiss Optical Works в городе Иена, Германия. Этот метод, внедрение которого оказало незамедлительное и существенное влияние на биологические исследования, остаётся широко распространённым и сегодня. Современные фазово-контрастные объективы, разработанные и выпускаемые компанией Nikon и другими производителями, могут функционировать в сочетании со вспомогательными методами усиления контраста, такими как дифференциальный интерференционный контраст, флуоресценция и поляризация света. Эти объективы могут поставляться с внутренними фазовыми пластинами, имеющими различную степень поглощения и фазового смещения прямого (недифрагированного) света, что обеспечивает широкий диапазон контраста образца и интенсивности фона в фазово-контрастной микроскопии.
При прохождении через фазовый образец, падающий волновой фронт освещающего пучка света оказывается разделённым на два компонента. Основным компонентом является неотклонённый (недифрагированный или нулевого порядка) плоский волновой фронт, обычно называемый прямой волной (или S-волной), который проходит через образец и вокруг него, не взаимодействуя с ним. Кроме этого, появляется и отклонённый или дифрагированный сферический волновой фронт (D-волна, от английского diffract -дифрагировать), рассеиваемый по широкой дуге (во многих направлениях) и заполняющий всю апертуру объектива. Пройдя плоскость образца, прямая и дифрагированная волны падают на переднюю линзу объектива, которая собирает их в плоскости промежуточного изображения, где они интерферируют, образуя результирующую частичную волну (часто называемую P-волной, от английского particle -частица). Математически, соотношение между различными световыми волнами, генерируемыми в фазово-контрастной микроскопии, может быть представлено просто как:
P = S + D
Формирование изображения образца зависит от относительной разницы интенсивностей, а, следовательно, от амплитуд частичной и прямой (P и S) волн. Если в плоскости промежуточного изображения разница амплитуд частичной и прямой волн существенна, образец приобретает значительную степень контраста и легко визуализируется в окуляре микроскопа. В противном случае, образец остаётся прозрачным, как если бы он наблюдался при обычном светлопольном освещении (без применения фазового контраста или других методов усиления контраста).
Если говорить об оптической разности хода между образцом и окружающей средой, то часть падающего волнового фронта, пересекающая образец (D-волна), но не проходящая через окружающую среду (S-волна), оказывается слегка запаздывающей. Для реализации идеи фазового контраста чрезвычайно важна способность образцов менять длину оптического пути (что, на самом деле, эквивалентно фазовому сдвигу). В классической оптике оптическая длина пути (ОДП) через объект или какой-нибудь участок является произведением показателя преломления (n) и толщины (t) объекта или промежуточной среды, как описано соотношением:
Оптическая длина пути (ОДП) = n • t
При попадании света из одной среды в другую, его скорость меняется пропорционально разности показателей преломления этих двух сред. Таким образом, когда когерентная световая волна, испущенная сфокусированной нитью накала микроскопа, проходит сквозь фазовый образец с показателем преломления (n) и толщиной (t), скорость волны либо возрастает, либо уменьшается. Если показатель преломления образца больше показателя преломления окружающей среды, волна замедляется при прохождении через образец и, следовательно, на выходе из него сдвинута с отставанием по фазе. И наоборот, если показатель преломления среды больше, фаза волны набегает при возбуждении образца. Разность положения выходящего из образца волнового фронта (по отношению к волновому фронту, движущемуся через среду) называется фазовым сдвигом (δ) и определяется в радианах следующим уравнением:
δ = 2ΠΔ/λ
В этом уравнении переменной Δ обозначена оптическая разность хода, которая аналогична оптической длине пути:
Оптическая разность хода (ОРХ) = Δ = (n2 — n1) • t
где n(2) — показатель преломления образца, а n(1) — показатель преломления окружающей среды. Оптическая разность хода является произведением двух величин: толщины образца и разности показателей преломления образца и окружающей среды. Во многих случаях, оптическая разность хода бывает достаточно большой, даже когда толщина образца относительно невелика. С другой стороны, при совпадении показателей преломления образца и среды оптическая разность хода равна нулю независимо от толщины образцов.
Для отдельных клеток в тканевой культуре оптическая разность хода относительно невелика. Толщина обычной клетки в монослойной культуре составляет около 5 микрометров, а её показатель преломления приблизительно равен 1,36. Окружающая клетку питательная среда имеет показатель преломления 1,335, что соответствует оптической разности хода 0,125 микрометра, или около четверти длины волны (зелёного света). Субклеточные структуры дают ещё меньшее запаздывание. Эти небольшие оптические разности хода приводят к линейному падению интенсивности с одновременным нарастанием фазового сдвига (изображение постепенно темнеет) до определённого момента (в зависимости от конфигурации фазовых пластинок), после которого изображение образца становится ярче благодаря обращению контраста. В фазово-контрастной микроскопии соотношение между интенсивностью изображения и оптической разностью хода, генерируемой образцом во всём диапазоне толщины и показателя преломления, не является простой линейной зависимостью. Напротив, интенсивность зависит от множества факторов, включая поглощение на фазовой пластине, степень отставания или опережения фазы на ней и относительный знак этого фазового смещения.
Соотношение фаз прямой, дифрагированной и частичной (S,D и P) волн в плоскости изображения в зоне образца при светлопольном освещении (в отсутствие вспомогательных оптических устройств для фазового контраста) приведено на рисунке 3. Прямая и частичная волна, относительные амплитуды которых определяют контраст образца, представлены красной и зелёной линией (соответственно). Волна, порождённая дифракцией в образце, никогда не наблюдаемая непосредственно, изображена синей линией меньшей амплитуды. Прямая и дифрагированная волны вновь объединяются, интерферируя друг с другом, в результате чего в плоскости изображения микроскопа создается частичная волна. Амплитуда каждой из волн на рисунке 3 представляет собой векторную сумму электрических полей отдельных волн.
По отношению к прямой волне, дифрагированная волна имеет меньшую амплитуду (поскольку количество дифрагированных фотонов в плоскости изображения гораздо меньше, чем прямых) и благодаря взаимодействию с образцом отстаёт по фазе приблизительно на 90 градусов (четверть длины волны). Небольшое фазовое смещение (на 1/20 длины волны) результирующей частичной волны, возникающее благодаря интерференции дифрагированной и прямой волны, обычно является следствием взаимодействия света с мелкими субклеточными структурами и связано с разницей оптической длины пути. Поскольку амплитуды прямой и частичной волны практически одинаковы, прозрачные образцы полностью лишены контраста и почти невидимы на светлом фоне.
Взаимодействие между отдельными волновыми фронтами в светлопольной и фазово-контрастной микроскопии может быть описано векторным способом в полярной системе координат. В такой системе длина вектора представляет амплитуду отдельной волны, а угол поворота вектора относительно фиксированного направления (угловой фазовый сдвиг) — степень фазового смещения (см. рисунок 3(b)). Векторное представление волнового взаимодействия в фазово-контрастной микроскопии было введено Фрицем Цернике и позже детально разработано Робертом Барером. Хотя этот наглядный способ описания редко используется сегодня, многие исследовательские статьи и научные доклады, опубликованные за последние несколько лет, опираются на представление волнового взаимодействия с помощью векторных диаграмм.
В векторных диаграммах, описывающих фазовый контраст, фазовое запаздывание выражается во вращении по часовой стрелке (относительно произвольного направления), тогда как фазовое опережение — во вращении против часовой стрелки. На рисунке 3(b), который формально является векторной диаграммой, векторная сумма прямого (S) и дифрагированного (D) волновых фронтов даёт частичный(P) волновой фронт. Такой механизм представления взаимодействия волн удобен, поскольку помогает наглядно представить фазовый сдвиг дифрагированной волны, а также влияние этого сдвига на фазу результирующей частичной волны (и наоборот). Фазовый сдвиг дифрагированной волны по отношению к прямой волне на диаграмме 3(b) обозначен через Φ, где:
Φ = ± 90° + φ/2
В этом уравнении φ — относительный фазовый сдвиг (являющийся функцией оптической разности хода) между векторами прямой (S) и частичной (P) волны. Для образцов, демонстрирующих пренебрежимо малую оптическую разность хода (то есть отсутствие фазового сдвига) второе слагаемое уравнения равно нулю, а Φ, соответственно, ± 90 градусов. Как показано на рисунке 3(b), очень низкая амплитуда и малый (или нулевой) фазовый сдвиг дифрагированной (D) волны приводят к тому, что амплитуда частичной волны практически равна амплитуде прямой волны. При одинаковости амплитуд (или интенсивностей) частичной и прямой волн формирования контраста не происходит, и образец остаётся невидимым на светлом фоне.
В основе конструкции фазово-контрастного микроскопа лежит идея разделения прямого и дифрагированного волновых фронтов, выходящих из образца, которые проецируются на разные участки в задней фокальной плоскости объектива (дифракционной плоскости в задней апертуре объектива). К тому же, амплитуда прямого (неотклонённого) света должна быть уменьшена, а её фаза должна быть смещена либо вперёд, либо назад (на четверть длины волны), чтобы максимально увеличить разность между интенсивностью образца и фона в плоскости изображения. Относительное запаздывание по фазе формируется на двух этапах: во-первых, дифрагированные волны отстают по фазе на четверть длины волны по выходе из образца; во-вторых, прямые волны либо набегают (либо отстают) по фазе при прохождении фазовой пластины, расположенной в задней фокальной плоскости объектива или около неё. Для превращения светлопольного микроскопа в фазово-контрастный необходимо всего два специальных вспомогательных устройства. Специальная кольцевая диафрагма в передней фокальной плоскости конденсора, которая соответствует по диаметру и является оптически сопряжённой с внутренней фазовой пластинкой, помещаемой в заднюю фокальную плоскость объектива.
Конденсорное кольцо (изображено на рисунках 1 и 4) обычно представляет собой непрозрачную совершенно чёрную (поглощающую свет) пластину с прозрачным отверстием в виде кольца и располагается в передней фокальной плоскости (апертуре) конденсора с тем, чтобы образец освещался расфокусированным параллельным светом, выходящим из кольца. Изображение кольцевой диафрагмы, создаваемое конденсором микроскопа, проецируется на бесконечность, тогда как объектив проецирует изображение в заднюю фокальную плоскость (где и располагается фазовая пластина, о чём говорится ниже). Необходимо заметить, что во многих работах освещающий поток, выходящий из конденсора фазово-контрастного микроскопа, представляется в виде полого конуса света с тёмным центром. Такое представление удобно с геометрической точки зрения, но не совсем точно. Конденсорное кольцо либо замещает регулируемую ирисовую диафрагму, либо располагается рядом с ней в передней апертуре конденсора. При проведении фазово-контрастных исследований, используя и фазовое кольцо, и апертурную диафрагму, необходимо, чтобы ирисовая диафрагма была раскрыта шире фазового кольца. В отличие от дифференциального интерференционного контраста и модуляционного контраста Хоффмана, круговая геометрия фазово-контрастного освещения и метод регистрации сигнала исключает возникновение артефактов, вызванных анизотропией. Фазовый контраст также не чувствителен к поляризации и двойному лучепреломлению, что является решающим преимуществом при наблюдении живых клеток, выращиваемых в сосудах из пластмассы.
При освещении по Кёлеру прямые световые волны, которые не взаимодействуют с образцом, фокусируются в виде яркого кольца в задней фокальной плоскости объектива (плоскости дифракции). В этих условиях задняя фокальная плоскость объектива сопряжена с передней апертурной плоскостью конденсора; таким образом, недифрагированные (нулевого порядка) световые волны формируют яркое изображение конденсорного кольца в задней апертуре объектива (наложенное на изображение фазовой пластины). Сферический волновой фронт, рассеянный на образце (D-волны), пересекает дифракционную плоскость в различных местах по всей задней апертуре объектива. Распределение (количество и координаты) дифрагированного света зависит от числа, размера светорассеивающих частиц и скачка показателя преломления на них. Большинство образцов рассеивает только малую долю падающих на них световых волн, а остальной свет проходит, не отклоняясь, и равномерно освещает всю плоскость изображения.
И напротив, лишь малая часть прямого плоского волнового фронта попадает в заднюю апертуру объектива, которая соответствует форме сопряжённого конденсорного кольца. Таким образом, два волновых фронта перекрываются незначительно и проходят через разные участки задней фокальной плоскости объектива. Поскольку прямой (нулевого порядка) и дифрагированный свет пространственно разделены в плоскости дифракции, фазой каждого из них (прямого (S) или дифрагированного (D)) можно манипулировать независимо от другого.
Фазовая пластина помещается в заднюю фокальную плоскость объектива или около неё (см. рисунки 4 и 5) для того, чтобы можно было независимо (от дифрагированного света) менять фазу и амплитуду прямого (неотклонённого) света, прошедшего через образец. В некоторых фазово-контрастных объективах на фазовой пластине вытравлена кольцевая канавка, которая благодаря уменьшению толщины стекла смещает фазу прямой (S) волны вперёд на четверть её длины. Часто, кольцо покрыто частично поглощающей металлической плёнкой для уменьшения амплитуды прямого света на 60–90 процентов. Поскольку задняя фокальная плоскость часто находится рядом с какой-либо внутренней линзой, в некоторых фазово-контрастных объективах канавка вытравляется прямо на поверхности линзы. Независимо от способа производства главной особенностью любого фазово-контрастного объектива является наличие в нём фазовой пластины, которая отсутствует во всех остальных микроскопических объективах.
Поскольку частичная волна является исключительно результатом интерференции прямого и дифрагированного волновых фронтов, они, интерферируя в плоскости изображения, дают частичную (P) волну, по амплитуде значительно меньшую прямой волны по сравнению с тем, когда применяемое покрытие имеет нейтральную оптическую плотность. Конечной целью является преобразование относительной разности фаз, вносимой образцом, в разницу амплитуд (интенсивностей) световых волн, выходящих из плоскости изображения. Поскольку глаз человека воспринимает разницу интенсивностей как контраст, образец становится видимым в окуляр микроскопа, на фотографической плёнке в обычной камере и в цифровых ПЗС и КМОП-приборах. Все системы позитивного фазового контраста избирательно смещают вперёд фазу плоского прямого (S) волнового фронта по отношению к сферическому дифрагированному (D). При негативном фазовом контрасте, наоборот, прямой волновой фронт запаздывает по отношению к световым волнам, рассеянным в образце.
В общем, изображения образцов с более высоким в сравнении с окружающей средой показателем преломления оказываются тёмными на нейтральном сером фоне, тогда как изображения образцов с менее высоким по отношению к среде показателем преломления ярче серого фона. Тем не менее, это не всегда так, поскольку специальные фазово-контрастные объективы с более высокими нейтральными плотностями в сочетании с меньшей задержкой фазы (на одну восьмую длины волны или меньше) могут инвертировать контраст в толстых образцах. В итоге, участки с очень большой оптической разностью хода становятся яркими.
Для изменения фазы и амплитуды пространственно разделённых прямого и дифрагированного волновых фронтов в фазово-контрастных оптических системах были разработаны фазовые пластины различных конфигураций. Поскольку фазовая пластина располагается в задней фокальной плоскости объектива (плоскость дифракции) или рядом с ней, весь свет, идущий через микроскоп должен пройти и через этот компонент. Участок фазовой пластины, на котором фокусируется конденсорное кольцо, называется сопряжённой областью, тогда как остальную её часть принято называть дополнительной областью. Сопряжённая область содержит материалы, отвечающие за смещение фазы прямого (недифрагированного) света на 90 градусов вперёд или назад по отношению к фазе дифрагированного волнового фронта. Обычно сопряжённая область фазовой пластины шире (примерно на 25 процентов) изображения конденсорного кольца, для минимизации количества прямого света, попадающего в дополнительную область.
Серия стандартных фазово-контрастных объективов с возрастающим увеличением и соответствующими конденсорными кольцами представлена на рисунке 5. Как правило, с ростом числовой апертуры и увеличения объектива ширина и диаметр фазовой пластины падают. Размер конденсорного кольца, наоборот, растёт с увеличением объектива. Изображения фазовых пластин в разрезе, также представленные на рисунке 5, помогают понять основные различия между позитивными и негативными фазовыми пластинами. Позитивная фазовая пластина создаёт тёмный контраст, а частично поглощающая плёнка, нанесённая на неё, предназначена для уменьшения амплитуды прямой волны. Помимо этого, в состав такой пластины входит задерживающий фазу материал, предназначенный для смещения фазы дифрагированного света на 90 градусов назад. В состав негативной фазовой пластины также входит и задерживающий фазу, и частично поглощающий материалы. Тем не менее, в ней оба эти материала проложены таким образом, что воздействию (ослаблению и задержке фазы на 90 градусов) подвержена лишь недифрагированная прямая волна.
Большинство доступных сегодня фазовых пластин производятся методом вакуумного напыления тонких диэлектрических и металлических покрытий (плёнок) на стеклянные пластины или непосредственно на поверхность одной из линз объектива микроскопа. Назначение тонкой диэлектрической плёнки состоит в сдвиге фазы, тогда как металлическая плёнка ослабляет интенсивность недифрагированного света. Некоторые производители дополнительно к этим тонким плёнкам применяют различные просветляющие покрытия для сокращения бликов и постороннего рассеянного света, отражающегося обратно в оптическую систему. Если фазовое кольцо не нанесено на поверхность какой-либо линзы, то фазовая пластина обычно вклеивается между двумя линзами, расположенными рядом с задней фокальной плоскости объектива. Толщина и показатели преломления диэлектрического, металлического и просветляющего покрытий, а также прозрачного клея тщательно подбираются для обеспечения необходимого фазового сдвига между дополнительной и сопряжённой областью фазовой пластины. В оптической терминологии фазовые пластины, меняющие фазу прямого света по отношению к дифрагированному на 90 градусов (либо вперёд, либо назад), называются четвертьволновыми пластинами из-за их влияния на оптическую разность хода.
Контраст модулируется изменением свойств фазовой пластины, включая степень поглощения металлической плёнки (или просветляющих покрытий), показатель преломления смещающего фазу материала и толщину фазовой пластины. Некоторые производители микроскопов предлагают целую серию фазово-контрастных объективов с постепенно меняющейся степенью контраста. Например, в линейку Nikon входит пять типов фазово-контрастных объективов. Объективы серии DL (Тёмные) дают темное изображение на светло-сером фоне. Эти объективы предназначены для формирования позитивного контраста образцов со значительной разницей в показателе преломления по отношению к окружающей среде, таких как клетки тканевой культуры. Объективы чуть менее сильного контраста серии DLL (Тёмно-серые), при светлопольном освещении формируют лучшие изображения, чем DL объективы, и применяются в качестве универсальных объективов для комбинированных наблюдений во флуоресцентном, светлопольном, темнопольном режимах и режиме дифференциального интерференционного контраста.
Компанией Nikon также производятся аподизированные фазово-контрастные объективы, имеющие вторичные кольца нейтральной плотности по обе стороны от фазового кольца, которые предназначены для уменьшения «гало» эффектов. Образцы, дающие очень малое фазовое смещение, являются идеальными для наблюдения с помощью позитивных фазово-контрастных объективов серии DM (Серые), формирующих тёмное изображение на средне-сером фоне. Для негативного фазового контраста Nikon предлагает объективы серии BM (Светло-серые), разработанные специально для визуального изучения бактериальных жгутиков, протозоа, волокон фибрина, мельчайших шариков и клеток крови. Объективы светло-серого фазового контраста дают светлые изображения на среднем сером фоне.
В большинстве случаев простого набегания относительной фазы прямого волнового фронта недостаточно для формирования высоко контрастных микроскопических изображений. Это происходит потому, что амплитуда прямых волн существенно больше амплитуды дифрагированных волн, и изображения, формируемые в результате интерференции лишь малой доли общего количества волн, едва различимы. Для уменьшения амплитуды прямого волнового фронта до значений, сравнимых с амплитудой дифрагированной волны (и усиления интерференции в плоскости изображения), увеличивается непрозрачность фазовой пластины объектива нанесением на неё полупрозрачного металлического покрытия нейтральной оптической плотности. Амплитуда прямых световых волн, которые благодаря конструкции фазово-контрастного микроскопа проходят почти исключительно через фазовую пластину, понижается непрозрачным покрытием этой пластины до 10 — 30 процентов от начального значения.
Типы фазовых пластинок, взаимодействие волн и векторные диаграммы, связанные с формированием позитивных и негативных фазово-контрастных изображений представлены на рисунке 6. В дополнение, приведены изображения образцов, полученные этими методами. Как уже говорилось выше, фаза сферического волнового фронта дифрагированного света, выходящего из образца, запаздывает на четверть длины волны по отношению к фазе плоского прямого (или недифрагированного) волнового фронта. В оптической конфигурации, обеспечивающей позитивный фазовый контраст (верхний ряд на рисунке 6), прямой (S) волновой фронт при прохождении фазовой пластины смещается по фазе вперёд на четверть длины волны, чтобы итоговый фазовый сдвиг был 180 градусов (половина длины волны). Таким образом, набежавший прямой волновой фронт теперь может участвовать в ослабляющей интерференции с дифрагированными (D) волнами в плоскости промежуточного изображения.
Позитивный фазовый контраст представлен в верхнем ряду рисунка 6. Фазовая пластина позитивного контраста (слева) смещает прямую волну вперёд на четверть длины благодаря вытравленному на её стекле кольцу, которое физически уменьшает путь, проходимый волной через среду (пластину) с высоким показателем преломления. А, поскольку дифрагированные в образце волны (D-волны) при взаимодействии с кольцом тоже отстали на четверть длины волны, оптическая разность хода между прямыми и дифрагированными волнами по прохождении фазовой пластины составит половину длины волны. В результате, оптическая разность хода между прямыми и дифрагированными волнами оказывается равной 180 градусам, что для образцов с высоким показателем преломления приводит к ослабляющей интерференции в плоскости изображения. Амплитудные кривые деструктивно интерферирующих волн для позитивного фазового контраста изображены на верхнем графике рисунка 6. Результирующая частичная (P) волна по амплитуде меньше прямой (S) волны, в результате чего объект оказывается темнее фона, что иллюстрируется изображением зелёной водоросли Zygnema справа (обозначенным надписью POS). Векторная диаграмма, на которой четвертьволновое опережение прямой волны при позитивном фазовом контрасте представлено поворотом её вектора на 90 градусов против часовой стрелки, расположена на рисунке 6 между графиком и изображением.
Возможны и такие конструкции оптических систем микроскопов, при которых формируемый фазовый контраст будет негативным, как показано в нижней части рисунка 6. В этом случае прямая (S) волна не опережает, а отстаёт от дифрагированной (D) волны на четверть длины. В результате, образцы с высоким показателем преломления оказываются ярче тёмно-серого фона, на котором они представлены (см. изображение с надписью NEG в нижней части рисунка 6). В негативном фазовом контрасте на фазовую пластину объектива нанесено кольцо определённой толщины, сдвигающее фазу прямой (нулевого порядка) волны назад (а не вперёд, как в позитивном фазовом контрасте) на четверть длины волны по отношению к дифрагированной волне. Поскольку при прохождении образца дифрагированная волна тоже отстала на четверть своей длины, оптическая разность хода между прямыми и дифрагированными волнами исчезает, и для образцов с высоким показателем преломления в плоскости изображения имеет место усиливающая интерференция. Следует обратить внимание на то, что в негативном фазовом контрасте результирующая частичная (P) волна по амплитуде больше прямой (S) волны (см. нижний график на рисунке 6). На представленной там же векторной диаграмме негативного фазового контраста вектор прямой волны повёрнут на 90 градусов по часовой стрелке.
www.stormoff.ru
Особенности фазово-контрастной микроскопии - раздел Биология, УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ПО «МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ»
Принятые сокращения и условные обозначения Аг - антиген Ат - антитело БАК - бактерицидная активность кожи БАСК - бактерицидная активность
Правила организации и оборудования микробиологической лаборатории (техника безопасности). Морфология эукариотов (грибы) Цель занятия: 1. Ознакомиться с принципами организации и оборудования бактериологич
Структура бактериологической лаборатории Работа на кафедре микробиологии и в бактериологической лаборатории требует соблюдения специальных правил
Оборудование рабочего места бактериолога На рабочем столе должно быть все необходимое для работы: · микроскоп · иммерсионное масл
В случае воспламенения спирта огонь тушить асбестовой тканью, полотенцем. Обязанности дежурного: • -подготовить кабинет к работе - проверить состояния рабочи
Морфологические особенности грибов препарат рисунок описание
Морфология грибов и методы их изучения I. Грибы – эукариоты. Они имеют хорошо оформленное ядро, митохондрии и вакуоли. Грибная клетка содержит одно
Методы изучения 1.Микроскопический – изучение морфологических и тинкториальных свойств. Препараты:
Основные характеристики светового микроскопа
Принцип иммерсионного метода микроскопии
Особенности темнопольной микроскопии
Особенности люминесцентной микроскопии
Основные характеристики электронного микроскопа
Типы микроскопов и принципы микроскопии; правила работы с микроскопом при использовании иммерсионной системы Микроскопический метод исследования - это изучение под микроскопом окрашенных препаратов из
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Разрешающая способность микроскопа определяется размером наименьшего объекта, который можно увидеть в да
ЗАНЯТИЯЕ 1.1.2 Морфология прокариот. Методы выявления: окраска, микроскопия Цель занятия: изуч
Работа № 2. Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки Цель:изучить строение бактериальной клетки и структуру клеточной стенки бактерий; освоить техник
Окраска по Цилю-Нильсену. Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойч
Окраска по Ожешко Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обра
Самостоятельная работа во внеурочное время 1. Дайте определение: а) морфологические свойства - __________________________________________________ ____________________________________
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ И ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ Признак Эукариоты Прокариоты 1. Хранение генетической информации
ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ Формы бактерий Рисунок Морфологические и тикториальные свойства
ЗАНЯТИЕ 1.1.3 Сравнительная морфология микроорганизмов: актиномицеты, спирохеты, микоплазмы, хламидии, риккетсии, в
Работа№1. Актиномицеты. Методы выявления Цель:изучить морфологию актиномицет (см. теоретическую справку) Самостоятельна
Методы выявления актиномицет По химическому составу оболочка актиномицетов близка к оболочке бактерий, поэтому они окрашиваются анилин
Работа№2. Спирохеты. Методы выявления Цель:изучить морфологию спирохет: боррелий, лептоспир и трепонем (см. теоретическую справку).
L. interogans (лептоспира) Результат:
Ультраструктура спирохет Вывод:
Методы выявления спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир) Оболочка спирохет тонкая, эластичная, содержит большое количество липопротеидов до 70 - 80% и тонкий фрагмент
Работа №3. Микоплазмы. Методы выявления Цель:изучить морфологию микоплазм (см. теоретическую справку) Самостоятельная работа
Методы выявления микоплазм Микоплазмы –это прокариоты малых размеров, имеют только цитоплазматическую мембрану и не способ
Хламидии (морфология, жизненный цикл хламидий). Хламидии - мелкие, чувствительные к антибиотикам бактерии диаметром около 0,2-1,5 мкм, которые развиваются тол
Методы выявления хламидий Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями располаг
Работа№5. Морфология риккетсии и цикл развития Цель:изучить морфологию риккетсий (см. теоретическую справку) Самостоятельная р
Методы выявления риккетсий Риккетсии –грамотрицательные микроорганизмы малых размеров. Они занимают промежуточное положен
Работа №6. Вирусы. Методы выявления Цель:изучить морфологические особенности вирусов. Самостоятельная работа:
Самостоятельная работа во внеурочное время Используя лекционный материал, учебник, атлас и теоретическую справку охарактеризовать вирусы.
Взаимодействие бактериофага с оболочкой бактерии
ЗАНЯТИЕ 1.1.4 Физиология микроорганизмов. Бактериологический метод диагностики Цель занятий: изу
Теоретическая справка Работа № 1 Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть естестве
Дифференциально-диагностические среды. 1. ПС для культивирования и изучения биохимических свойств. 1.1. Среды Эндо,Левина, Плоск
Теоретическая справка Работа № 2 Микроорганизмам как всему живому присущи три основные физиологические функции: питание, ды
Работа № 3. Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах Цель:изучить характер роста бактерий на жидких питательных средах; изучить особенности роста мик
Теоретическая справка Работа № 3 Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением необход
Работа № 4. Техника посева на питательные среды Цель:ознакомиться с техникой посева на жидкие и плотные питательные среды и указать значение мето
Метод Дригальского Стерильной пипеткой материал помещают на по
А) Сахаролитическая и протеолитическая активность вид м/о Сахаролитическая активность Протеолитическая а
Б) Каталазная активность аэробов Цель:изучить каталазную активность микроорганизмов; определить тип дыхания исследуемой культуры
Теоретическая справка Работа № 5 Б) Каталазная активность. Каталаза - это фермент, катализирующий реакц
Теоретическая справка Бактериологический метод является основным при диагностике инфекционных заболеваний. Его сущнос
Охарактеризовать все фазы процесса
ЗАНЯТИЕ 1.1.5 Физиология микробов. Бактериологический метод диагностики (продолжение). Методы культивирования облигатн
Работа №2. Методы создания анаэробных условий Цель: изучить методы создания анаэробных условий (см.теоретическую справку) Самостоятел
Работа №3. Биохимическая активность анаэробов Цель: изучить биохимическую активность анаэробных бактерий. Самостоятельная работа: указать
Куриный эмбрион 1. Воздушное пространство 2. Отверстие в ско
Культура тканей первичные перевиваемые полуперевиваемые &nb
Лабораторные животные
Методы создания анаэробных условий 1) Физические методы. Методы основаны на выращивании микроорганизмов в среде без воздуха •Посев в ср
К работе № 3 Культивирование вирусов Для культивирования вирусов используют: 1) Куриные эмбрионы. Ку
Самостоятельная работа во внеурочное время Что изображено на фотографии? Цель
allrefers.ru
Метод, который позволяет резко повысить контрастность изображения объекта. Принцип метода состоит в выявлении сдвигов фазы световых колебаний, которые возникают, когда свет проходит сквозь структуру, имеющую показатель преломления, отличающийся от показателя преломления окружающей среды.
Фазовые сдвиги глазом непосредственно не улавливаются, но в специальном фазово-контрастном микроскопе структуры, имеющие более высокий показатель преломления (даже совершенно прозрачные), оказываются более темными (или более светлыми в зависимости от конструкции прибора), чем окружающий фон (рис. 1.28).
Рис. 1.28. Фото амебы (фазово-контрастная микроскопия)
Поляризационная микроскопия
Метод наблюдения в поляризованном свете для исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр.
Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете (рис. 1.29).
Рис. 1.29. Кристаллы урата натрия (Samaras N, Rossi C. N Engl J Med. 2012)
Ультрафиолетовая микроскопия
Метод основан на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны, принципиально почти ничем не отличается от обычной световой микроскопии и осуществляется при помощи микроскопов с кварцевой или отражательной (зеркальной) оптикой. Изображение рассматривается на флюоресцирующем экране визуально, а также фотографируется. Микроскопирование объектов позволяет выявить исследуемые вещества, не применяя окрашивания.
Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флюоресценцию ряда веществ, так и вторичную флюоресценцию, вызванную окрашиванием клеточных структур специальными красителями — флюорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении начинают светиться сами.
Для возбуждения флюоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синим светом или ультрафиолетовыми лучами. Многие вещества, не флюоресцирующие в видимой области (в особенности нуклеиновые кислоты), при освещении ультрафиолетовыми лучами начинают флюоресцировать и могут выявляться без применения флюорохромов (рис. 1.30).
Рис. 1.30. Процесс митоза (флюоресцентная микроскопия)
Метод электронной микроскопии
Метод, при котором вместо света используют поток электронов, стеклянные линзы заменены электромагнитными полями, максимальное увеличение 1,5 млн. раз. Не требует окраски препарата. (1933 г. - Германия)
Применениеэлектронноймикроскопиивбиологии позволило изучить сверхтонкую структуру клетки внеклеточных компонентов тканей. На основании результатов, полученных с помощью данного метода (максимальное увеличение до 800 — 1200 тыс.), начиная с 40-х гг. было описано тонкое строение мембран, митохондрий, рибосом и других клеточных, а также внеклеточных структур, выявлены некоторые макромолекулы, например ДНК.
Растровая (сканирующая) электронная микроскопия дает возможность изучать тонкое строение поверхности клеток и тканевых структур не только фиксированных объектов, но и живых животных. Техника приготовления биологических препаратов для электронноймикроскопиивключает процедуры, сохраняющие ткань в условиях глубокого вакуума под пучком электронов и реализующие высокое разрешение. Для повышения контраста изображения клеток их обрабатывают «электронными красителями», сильно рассеивающими электроны.
Применение электронноймикроскопиив биологии существенно изменило и углубило прежние представления о тонком строении клетки(рис. 1.31-1.34).
Рис. 1.31. Снимок стафиллококков с помощью растрового электронного микроскопа
Рис. 1.32. Электронный микроскоп
Рис. 1.33. Устройство электронного микроскопа
Рис. 1.34. Снимок Helicobacter с помощью растрового электронного микроскопа
(Dr. Patricia Fields, Dr. Collette Fitzgerald)
Метод центрифугирования
Разделение смесей на составные части под действием центробежной силы. Применяется при разделении органоидов клетки, легких и тяжелых фракций органических веществ и т. д. при этом ускорение в 300 раз больше, чем земное притяжение.
Центрифуга служит для разделения сыпучих тел или жидкостей различного удельного веса и отделения жидкостей от твёрдых тел путем использования центробежной силы. При вращении в центрифуге частицы с наибольшим удельным весом располагаются на периферии, а частицы с меньшим удельным весом — ближе к оси вращения(рис. 1.35).
Рис. 1.35. Устройство центрифуги
Читайте также:
lektsia.com
Самым главным достоинством фазово-контрастного метода микроскопирования живых неокрашенных микроорганизмов является чёткое и контрастное их изображение. Данный способ изучения наиболее приемлем для исследований в клинических лабораториях для изучения различного рода выделений и осадков, простейших, их цист, процессов агглютинации, рассмотрение ретикулоцитов, а также кровяных пластинок, костного мозга качественных и злокачественных опухолей и прочее.
Для того чтоб понять сущность и принцип работы фазово-контрастного метода необходимо знать, что фотоплёнка и человеческий глаз способен воспринимать исключительно изменения амплитуды, то есть размахи колебаний световой волны, однако они не восприимчивы к изменениям её фазы, задержкам или ускорениям.
Все препараты, которые наблюдались в микроскопах в тех частях, где были смещения амплитуды световых волн, являются контрастными, а там, где присутствовали фазовые смещения, были малоконтрастные. Используя фазово-контрастные приспособления микроскопа, существующие фазовые неконтрастные колебания искусственно конвертируются в колебания с другой амплитудой, из-за чего фазовые элементы препарата становятся такими же контрастными, как и амплитудные. Вследствие этого изображение всего исследуемого объекта становится чётким и контрастным.
Для достижения подобного результата можно использовать обычный микроскоп МБИ – 2, а также специальный к нему набор фазово-контрастных приборов, в состав которых входят: конденсатор с комплектом кольцевых диафрагм, комплект фазовых объективов (10Х, 20 X, 40 X и 90Х), вспомогательный микроскоп малой степени увеличения, который используется вместо окуляра, осветитель и светофильтр.
Как правило, обычный конденсатор микроскопа заменяют фазовым и при этом необходимо проверить, чтоб этот конденсатор правильно и точно вошёл в держатель, и в процессе подъёма его передняя линза становилась вровень с предметным столиком микроскопа. Объективы также необходимо заменить на фазовые.
Для начала следует установить правильное освещение для объекта. Для этого осветительную лампу ставят на расстоянии пятнадцати-двадцати сантиметров от самого микроскопа, сужают диафрагму осветителя и направляют лучи на поверхность плоского зеркала, таким образом, чтоб точное и отчётливое изображение накаленной нити лампы оказалось в самом центре зеркала. Зеркало двигают, отбрасывая свет на поверхность диафрагмы конденсатора, которую затем полностью открывают.
Если увеличение слишком маленькое и его не достаточно, то в таких случаях устанавливают препарат для излучения. Опуская и поднимая конденсатор, выходит наиболее резкое изображение препарата при условии закрытой диафрагмы осветителя. Если же поле зрения всё-таки оказывается слишком освещённым, в таких случаях ставят дополнительный светофильтр. С помощью лёгких передвижений зеркал ярко освещённое пятно двигают в центр поля зрения и затем открывают диафрагму осветителя, таким образом, чтоб все поля зрения были полностью и равномерно освещены. На этом этапе заканчивается установка света.
Вместо окуляра устанавливают вспомогательный микроскоп. Ставят также тот фазовый объектив, который будут использовать и соответствующую ему кольцевую диафрагму конденсатора. При передвижении окулярной части вспомогательного микроскопа изучают изображение кольцевой щели диафрагмы конденсатора, то есть светлое кольцо, а также изображение фазовой пластинки в объективе – тёмное кольцо, для того, чтоб узнать, насколько совмещены эти два изображения.
Для того чтоб получить фазовый контраст нужно более полно совместить изображения этих двух колец. Данный процесс выполняется с помощью центрировочных винтов фазового конденсатора, благодаря которым щель конденсорной диафрагмы движется настолько, чтоб её изображение совместилось с изображением фазовой тёмной пластинки. Вспомогательный микроскоп достают из тубуса и устанавливают на его месте рабочий окуляр, после чего изучают необходимый объект.
Стоит также отметить основные условия успешного процесса подготовки фазово-контрастного исследования:
mykonspekts.ru
