Контрольный в главу русинов ютуб: Абитуриент 2021

Вопреки нашим ожиданиям, на этой немецкой карте 1939 года регион обозначен как «Карпатская Украина», возможно, в знак любезного признания ее краткого суверенного статуса. К сожалению, точная дата не указана. Отдел географии и картографии. Чехословакия — 1939 — 1: 1,000,000 — Freytag & Berndt

Можно только задаться вопросом, готовы ли исторически обиженные соседи Карпатской Руси поддержать собственное отчуждение, как те, кто выступает за независимое русинское государство, так же стремятся этим воспользоваться.И еще можно надеяться, что их следующая запланированная попытка обретения государственности произойдет в более благоприятный день, а также будет реализована при более реальных обстоятельствах.

В любом случае мышь все равно рычит!

Модели in vitro для испытаний на токсичность для печени

Abstract

За прошедшие годы были разработаны различные системы моделей in vitro на основе печени, позволяющие исследовать потенциальные побочные эффекты химических веществ и лекарств. Срезы ткани печени, изолированные микросомы, перфузируемая печень, иммортализованные клеточные линии и первичные гепатоциты широко используются. Линии иммортализованных клеток и первично изолированные клетки печени в настоящее время наиболее широко используются в моделях in vitro и для тестирования токсичности печени. Ограниченная производительность, потеря жизнеспособности и снижение специфической функции печени и экспрессии генов являются общими недостатками этих моделей. Последние разработки в области гепатотоксичности in vitro включают трехмерные тканевые конструкции и биоискусственную печень, совместное культивирование различных типов клеток с гепатоцитами и дифференцировку стволовых клеток в клетки, подобные клонам печени.В попытке обеспечить более физиологическую среду для культивируемых клеток печени некоторые из новых систем культивирования клеток включают поток жидкости, микроциркуляцию и другие формы органотипической микросреды. Совместное культивирование нацелено на сохранение специфической для печени морфологии и функциональности по сравнению с культурами чистых паренхиматозных клеток. Стволовые клетки, полученные как из эмбриональных, так и из взрослых тканей, могут обеспечивать неограниченное количество гепатоцитов от нескольких индивидуумов для улучшения воспроизводимости и обеспечения возможности тестирования индивидуальной токсичности. В этом обзоре описываются различные традиционные и новые модели печени in vitro и дается представление о проблемах и возможностях, которые предоставляет каждая отдельная тест-система.

1. Тестирование химической токсичности

Золотой стандарт токсикологического подхода к оценке химической токсичности включает в себя сложные in vivo исследования, которые требуют больших затрат времени и средств. Из-за заботы о благополучии животных, ограничений по времени и стоимости, а также постоянно растущего числа химикатов, требующих тестирования, создание работоспособных систем культивирования in vitro и стало приоритетом для токсикологического сообщества.Кроме того, прогностическая точность теста in vivo на грызунах на предмет неблагоприятных воздействий на здоровье человека стала предметом споров в последние годы, отчасти из-за плохого соответствия результатов исследований на животных фенотипам заболеваний, наблюдаемых в гетерогенных популяциях людей. ^{1, 2} Использование модельных систем in vitro для испытаний на токсичность имеет много преимуществ, включая уменьшение количества животных, снижение затрат на содержание и уход за животными, небольшое количество химического вещества, необходимого для тестирования, сокращение необходимого времени , а также увеличение производительности для оценки нескольких химических веществ и их метаболитов. ^{3, 4} Системы In vitro также позволяют изучать химический метаболизм, оценивать механизмы токсичности, измерять кинетику ферментов и изучать зависимости от дозы. ⁴

Межведомственный центр оценки альтернативных токсикологических методов (NICEATM) Национальной токсикологической программы США (NTP) работает совместно с Межведомственным координационным комитетом по валидации альтернативных методов (ICCVAM) для разработки и проверки альтернативных методов. к in vivo токсикологическое тестирование.Три основных направления исследований токсичности животных, проводимые этими агентствами, известны как три «Р»: уточнение, сокращение и замена. Конечная цель — «валидация и одобрение регулирующих органов методов испытаний, которые лучше прогнозируют неблагоприятные воздействия на человека и окружающую среду, чем доступные в настоящее время методы, поддерживая улучшенную защиту здоровья человека и окружающей среды». ⁵

Исторический отчет, выпущенный Национальным исследовательским советом (NRC), «Тестирование токсичности в 21 ^{-м веке} : видение и стратегия», ² , выявил проблемы современной токсикологии и предоставил стратегии для разработки альтернативы in vivo research.Отчет поддерживает движение к использованию in vitro систем вместо in vivo токсикологических исследований и, в соответствии с просьбой Агентства по охране окружающей среды США (EPA), разработало долгосрочную цель сокращения использования в vivo исследовали токсичность и предложили начальную стратегию для достижения этой цели. В дополнение к ограничениям, упомянутым выше, в отчете признается, что результаты исследования in vivo не могут оценить гораздо более низкие концентрации и смеси химических веществ, воздействию которых подвергаются люди, не имеют информации о способах и механизмах действий и не могут учитывать человеческую изменчивость в отклики и восприимчивость. ² В отчете утверждается, что работа in vitro может пролить свет на сети клеточного ответа и пути токсичности, способы и механизмы действия, сделать возможным проведение высокопроизводительных исследований, улучшить взаимосвязь доза-реакция, оценить гораздо больше концентраций, чем in vivo работают, используют концентрации относительно воздействия на человека, предоставляют информацию для создания фармакокинетических и динамических моделей и приводят к основанным на геноме исследованиям нарушений путей токсичности.

Есть три важных фактора, которые препятствуют возможности использования животных моделей для прогнозирования неблагоприятных воздействий на человека, и в отчете Национального исследовательского совета утверждается, что использование моделей in vitro и должно помочь в преодолении этой проблемы. Во-первых, исследования in vivo обычно используют высокие дозы соединений, которые на порядки больше, чем те, которым подвергаются люди. Зависимость доза-реакция сложна, поэтому экстраполяция этих высоких доз на более низкие уровни воздействия на человека затруднена и приводит ко многим неточностям.Во-вторых, исследования in vivo исследуют реакцию стандартного лабораторного животного на токсикант. Этот ответ может возникать, а может и не возникать у людей. Еще более важно то, что человеческая популяция очень разнородна, и отдельная разновидность животных не может точно предсказать вариабельность реакций, наблюдаемых в человеческой популяции. Наконец, in vivo воздействия при тестировании на токсичность обычно состоят из одного соединения. Несмотря на то, что это позволяет внимательно изучить результаты этого единственного соединения, люди постоянно ежедневно подвергаются воздействию смесей соединений, и необходимо изучить эффекты этих совместных воздействий.Проведение исследований in vivo с использованием смесей химических веществ было бы грандиозной задачей из-за большого количества различных химических веществ и комбинаций химических веществ, а также времени, необходимого для завершения каждого исследования in vivo .

Чтобы преодолеть эти ограничения для исследований in vivo и , Национальный исследовательский совет разработал четыре критерия, важных для разработки новой парадигмы тестирования токсичности: 1) расширить исследования, включив в них большее количество химикатов и химических смесей, а также большее количество конечных продуктов. точки и этапы жизни; 2) сократить время, необходимое для получения результатов для оценки риска, за счет сокращения затрат и продолжительности тестов, а также повышения эффективности и гибкости этих тестов; 3) уменьшить количество и страдания животных, участвующих в испытаниях; и 4) более внимательно изучить механистическую и дозиметрическую информацию, чтобы предоставить организациям по оценке риска более широкий спектр информации.Основными компонентами предлагаемой стратегии для установления этой парадигмы являются химическая характеристика, тестирование токсичности, а также моделирование доза-реакция и экстраполяция. Национальный исследовательский совет признал тот факт, что эта новая парадигма тестирования токсичности потребует многих лет исследований и валидации анализов и, возможно, никогда полностью не устранит необходимость в работе in vivo и ; однако выгода от сокращения количества исследований на животных стоит затраченных усилий.

Одним из основных преимуществ систем in vitro в настоящее время является их полезность для проверки химических веществ с целью определения приоритетов.Проект EPA ToxCast ™ был создан в основном с целью определения приоритетности химических веществ для дальнейшего токсикологического исследования с использованием высокопроизводительных анализов in vitro для установления «сигнатур токсичности» химических веществ, определения путей токсичности и прогнозирования потенциальной токсичности. ⁶ Для этого ToxCast ™ использует большое количество бесклеточных или клеточных анализов in vitro с высокой пропускной способностью . Различные анализы измеряют нарушения в путях, которые могут привести к клеточной токсичности, и результаты анализов ToxCast ™ будут использоваться для связывания определенных генов с конечными точками токсичности.Исследователи надеются использовать данные, полученные с помощью высокопроизводительных анализов ToxCast ™, чтобы дополнить данные геномных, протеомических и метаболомных исследований для дальнейшего выяснения путей токсичности. ⁷ К сожалению, результаты высокопроизводительного скрининга плохо коррелируют с токсичностью in vivo и не могут учесть биологические процессы, связанные с токсичностью, такие как воздействие, биотрансформация, токсикокинетика и индивидуальное генетическое разнообразие. ⁸ Таким образом, необходимо изучить другие методы in vitro , чтобы дополнить эти высокопроизводительные анализы.

Печень является основным источником метаболизма и биотрансформации лекарств, поэтому клетки печени являются логическим выбором для токсикологических и фармакологических исследований. Действительно, in vivo, , тестирование токсичности для печени, составляют большую часть из in vitro токсикологии . Высокопроизводительные модели печени in vitro были бы большим ресурсом и позволили бы перейти к более широкому использованию альтернативных методов тестирования токсичности. В этом обзоре мы обсуждаем преимущества и недостатки традиционных систем in vitro , полученных из печени, и исследуем новые модели печени in vitro и их полезность для тестирования токсичности.

На протяжении многих лет использовалось множество различных моделей печени in vitro с надеждой на то, что эффекты после химической обработки будут предсказывать ответы in vivo . Срезы печени, клеточные линии и первичные гепатоциты неизменно оставались ведущими моделями в тестах in vitro на токсичность для печени . Преимущества и недостатки этих систем сильно различаются.

Срезы печени

Срезы ткани печени могут быть полезной моделью, поскольку они сохраняют структуру печени, содержат все типы клеток, обнаруженные in vivo , имеют хорошую in vitro / in vivo корреляцию метаболизма ксенобиотиков и поддерживают зону -специфическая активность цитохрома (с учетом клеточной и зональной токсичности) и механизмы токсичности. ⁹ Было показано, что ферменты фазы II, продукция альбумина и глюконеогенез незначительно снижаются, но остаются достаточно стабильными в течение 20-96 часов при культивировании срезов. ^10-13 Токсикогеномические исследования показали, что срезы печени крысы более тесно коррелировали с in vivo печени крысы в ​​течение 24 часов по сравнению с двумя клеточными линиями и первичными гепатоцитами как в традиционной, так и в сэндвич-культуре ¹⁴ и срезы печени человека показали низкие уровни снижения CYP за тот же период времени. ¹⁵

Исследования с использованием срезов ткани обычно имеют продолжительность культивирования от 30 минут до 5 дней ^{10, 16-18} и условия культивирования, такие как давление кислорода, среды и добавки, а также культуральную систему (т.е. встряхиваемые колбы, многостенные планшеты, лунки с мешалкой и т. д.) были модифицированы для повышения жизнеспособности клеток и уменьшения дегенеративных изменений в ткани в течение периода культивирования. ⁹ К сожалению, даже с этими модификациями некроз все еще происходит через 48-72 часа в культуре, ^{10, 18, 19} и уровни метаболических ферментов значительно снижаются через 6-72 часа. ^{17, 20, 21} Кроме того, было обнаружено, что скорость метаболизма лекарственного средства и внутренний клиренс ниже в срезах печени, чем в изолированных гепатоцитах, ^{22, 23} K _m значения обычно выше в срезах, чем в изолированных гепатоцитах, ²² и исследователи предполагают, что градиент химического воздействия существует в пределах среза ткани, в результате чего не все гепатоциты участвуют в метаболизме соединений. ⁹

Линии иммортализованных клеток

Большинство доступных линий иммортализованных клеток печени не обладают фенотипическими характеристиками ткани печени. ^24-26 Обычно используемые иммортализованные клеточные линии, полученные из печени, включают Fa2N-4, HepG2, Hep3B, PLc / PRFs Huh7, HBG и HepaRG. ^{27, 28} Линия HepG2 была создана в 1970-х годах и экспрессирует многие специфичные для печени гены; ²⁹ , однако, было показано, что профиль экспрессии генов, участвующих в фазе I и фазе метаболизма II, варьируется между пассажами, и в результате данные могут быть трудно интерпретировать в разных лабораториях и пассажах. ²⁸ Недавно разработанная клеточная линия гепатомы человека, HepaRG, сохраняет экспрессию многих специфичных для печени функций, а также многих цитохромов P450, ядерных рецепторов, мембранных переносчиков и ферментов фазы II. ³⁰ Клетки HepaRG имеют стабильный кариотип, могут дифференцироваться либо в гепатоцитарные, либо в билиарные клоны, обладают высокой пролиферативной способностью и, как было показано, дают данные, которые являются воспроизводимыми и согласованными между экспериментами. ^{28, 31, 32} Тем не менее, экспрессия печеночно-специфических функций в клетках HepaRG в среднем намного ниже, чем у первичных гепатоцитов ³¹ , и они представляют фенотип от одного донора, тем самым снижая их прогностическую ценность для человеческое население.

Первичные суспензии гепатоцитов

В большинстве протоколов выделения гепатоцитов используется расщепление коллагеназой для разрушения связей между клетками и получения одноклеточных суспензий. Суспензии гепатоцитов — простой в использовании метод для исследований токсичности с умеренной интенсивностью. Griffin and Houston ³³ продемонстрировали, что суспензии гепатоцитов обеспечивают более точную оценку скорости внутреннего клиренса по сравнению с обычными однослойными культурами. Суспензии также сохраняют высокий уровень функциональности, что позволяет более точно коррелировать с токсичностью in vivo и , чем культивируемые клетки. ^34-37 Однако хорошо известно, что большинство протоколов изоляции приводят к повреждению рецепторов и антигенов клеточной поверхности, межклеточных соединений, клеточных мембран и цитозольного содержимого. ^{9, 38} Расщепление коллагеназы также вызывает окислительный стресс в гепатоцитах, что приводит к потере активности фермента цитохрома, причем наибольшая потеря наблюдается через 4-8 часов после выделения. ^39-41 Потеря контакта с внеклеточным матриксом и другими типами клеток приводит к потере клеточной полярности, целостности и дифференцировки ^{42, 43} , которая может быть восстановлена ​​только после восстановления нормальных межклеточных контактов.Наконец, как отмечает Hewitt et al. ³⁵ и Burke et al. ⁴⁴ , часто гепатотоксичность — это процесс, который происходит в течение нескольких часов (например, при токсичности ацетаминофена), и, таким образом, гепатоциты в суспензии не могут сохранять жизнеспособность в течение времени, необходимого для развития токсичности.

Первичные культуры гепатоцитов

Культуры первичных гепатоцитов были золотым стандартом для тестирования in vitro , поскольку они могут поддерживать функциональную активность в течение 24-72 часов, могут использоваться для исследований индукции и ингибирования ферментов, позволяют проводить скрининг средней производительности соединений, и идеально подходят для изучения межвидовых и межиндивидуальных различий в метаболизме. ^{34, 45} Первичные гепатоциты часто используются с расчетом на то, что химические вещества будут влиять или подвергаться воздействию изолированной клетки таким же образом, как это происходит во всем органе, и, таким образом, будут прогностической моделью. ⁴ К сожалению, первичные культуры гепатоцитов также ограничены как системы in vitro и .

Традиционная первичная культура клеток гепатоцитов включает метод посева клеток на жесткий субстрат, в котором они продолжают формировать монослой на дне лунки планшета для культивирования.В этих условиях первичные гепатоциты претерпевают изменения клеточной морфологии, структуры, полярности, экспрессии генов и специфических для печени функций, ^{3, 46, 47} процесс, называемый дедифференцировкой. Дедифференцировка гепатоцитов является важным ограничением для этой системы in vitro . Поскольку изолированные клетки утратили свою нормальную структуру микроокружения, межклеточные взаимодействия и структуры клеточных мембран, реакция на химическое воздействие может отличаться от реакции, происходящей in vivo .Наконец, одним из наиболее проблемных недостатков использования первичных гепатоцитов для токсикологических исследований является резкое снижение функциональности клеток с течением времени. Специфические функции печени, такие как продукция альбумина и экспрессия цитохрома P450, быстро снижаются в течение первых 24-48 часов культивирования, поскольку клетки начинают терять свой дифференцированный статус. ^{3, 34, 46, 48} Увеличение продолжительности жизни культур, как с точки зрения специфических функций печени, так и основных клеточных функций, было большим препятствием, которое эта область еще не смогла преодолеть.

Стремясь сохранить специфические для печени функциональные возможности в течение более длительных периодов культивирования, была разработана простая сэндвич-конфигурация. В этой системе гепатоциты помещаются между двумя слоями матрикса (традиционно коллагена или Matrigel®. ⁴⁷ Поддержание гепатоцитов в конфигурации сэндвич-культуры увеличивает и поддерживает секрецию альбумина, восстанавливает полигональную морфологию, аналогичную таковой у клеток in vivo , предотвращает потерю жизнеспособности клеток, увеличивает базальную и индуцированную ферментативную активность и имитирует in vivo скорости выделения с желчью . ^47-51 Некоторые из этих функций сохраняются в гепатоцитах крыс в течение относительно длительных периодов от 24 дней до 7 недель. Исследователи связывают эти положительные эффекты с полярностью клеток, индуцированной ECM. ⁴⁷ Исследования показали, что сэндвич-культура предотвращает образование стрессовых волокон в дополнение к увеличению секреции трансферрина, фибриногена и желчных солей, а также стабилизации секреции мочевины в гепатоцитах крысы в ​​течение 42 дней. ⁵²

Несмотря на положительные эффекты, приписываемые методике сэндвич-культивирования, экспрессия генов, ответственных за многие функции печени, со временем снижается (90 часов).Несмотря на то, что экспрессия гена фермента фазы I со временем снижается, а ферменты фазы II остаются экспрессируемыми на относительно высоком уровне, данные показывают, что экспрессия гена P450 в гепатоцитах мышей, культивируемых сэндвичем, все еще более стабильна, чем в монослоях первичных гепатоцитов. ⁵³ Было высказано предположение, что модель сэндвич-культуры наиболее полезна для механистических исследований гепатобилиарной токсичности. ⁵⁴

Были предложены подходы к преодолению проблем in vitro тест-систем печени , включая корректировку компонентов культуральной среды, изменение внеклеточного матрикса, изменение формата клеточной культуры (например, монослой, сфероид или 3D культур), добавление потока в систему культивирования и культивирование гепатоцитов с другими типами клеток, все из которых суммированы в нескольких обзорах. ^{3, 34, 54-57} Хотя ряд исследователей нашли определенные подходы для улучшения культуры гепатоцитов в своих лабораториях, возникают трудности при сравнении экспериментальных результатов, которые продолжают препятствовать идентификации и принятию оптимальных условий культивирования. Кроме того, выбор вида, породы и пола животных сильно различается в зависимости от экспериментов. Условия выделения клеток также различны, как и методы очистки клеток, условия культивирования клеток и методы анализа конечных точек.Урожайность и жизнеспособность конечных клеточных препаратов могут различаться в зависимости от типа коллагеназы и используемых методов перфузии. Также имеются многочисленные различия между видами в оптимальных условиях культивирования. Эти факторы необходимо учитывать при использовании первичных культур гепатоцитов для тестирования токсичности и разработке надлежащих процедур в собственной лаборатории.

Первичные культуры гепатоцитов в сочетании с медиаторами воспаления

Традиционные 2D-культуры гепатоцитов не особенно хорошо подходят для высокопроизводительных скрининговых исследований.Тем не менее, доступность оборудования, оснащенного робототехникой, и относительно низкая стоимость выборки данных в этих системах побудили исследовать новые форматы культивирования. Например, хорошо известная роль воспаления в токсичности — как в период развития, так и в постнатальном периоде — была продемонстрирована во многих системах органов и болезненных состояниях, от эндометриоза ⁵⁸ до идиосинкразической лекарственной токсичности. ⁵⁹

Подход in vitro к совместному лечению лекарством лекарственного средства / воспалительного цитокина / воспалительного медиатора был использован для воспроизведения клинических признаков гепатотоксичности лекарственного средства, особенно для идиосинкразических лекарств, в культивируемых первичных гепатоцитах человека и крысы, а также клетках HepG2. ⁶⁰ Используя этот подход, было показано, что синергия гепатотоксичности лекарственного средства и цитокина выявляется для нескольких идиосинкразических гепатотоксикантов, но не для нетоксичных. Авторы установили, что TNF, IL-1 alpha и LPS были особенно информативными в контексте смесей мульти-цитокинов. Дальнейшие исследования с использованием этого метода (т. Е. Комбинаций гепатотоксических препаратов и цитокинов) в сочетании с множественной передачей сигналов фосфопротеина и измерениями цитотоксичности в культивируемых гепатоцитах от нескольких доноров-людей дали многомерные данные, пригодные для моделирования данных сигнал-ответ. ⁶¹ Авторы показали, что токсичность лекарства / цитокина для печени интегративно контролируется четырьмя ключевыми сигнальными путями: Akt, киназа p70 S6, MEK-ERK и p38-HSP27. Кроме того, это моделирование предсказало, а экспериментальные исследования подтвердили, что пути MEK-ERK и p38-HSP27 вносят вклад в сигнальное влияние, способствующее смерти, в синергии лекарство-цитокин. Эти исследования могут быть особенно полезны для освещения консенсусных механизмов токсичности в человеческих клетках, поскольку они поддаются высокопроизводительным мультиплексным измерениям внутриклеточной передачи сигналов и выявляют сигнальные сети, которые трудно установить на основе in vivo или традиционной in vitro культуры. системы.

3. Новые системы культивирования клеток печени

Первичные гепатоциты и гепатоцитоподобные клетки имеют ограниченное применение в стандартных условиях культивирования для определенных типов испытаний на токсичность. Постоянной проблемой в культуре как первичных гепатоцитов, так и гепатоцитоподобных клеток является долгосрочное поддержание их функциональности. ^{3, 34, 46, 48, 62, 63} Кроме того, отсутствие надлежащих свойств абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции (ADME) в результате отсоединения клеток от системы кровообращения и других органов также позволяет оценить химическое воздействие результаты трудны с первичными культурами гепатоцитов. ^{4, 34} В настоящее время разрабатываются новые стратегии культивирования, чтобы противодействовать процессу де-дифференцировки, установить более гетеротипную микросреду и создать более предсказуемые модели in vitro токсичности для печени. В этом разделе четыре из этих стратегий будут рассмотрены более подробно: трехмерные системы культивирования, биоискусственная печень, совместные культуры и модели стволовых клеток.

Трехмерные системы культивирования

Трехмерное культивирование гепатоцитов — это быстро расширяющаяся область исследований, поскольку инженеры, специалисты по биоматериалам и биологи пытаются воссоздать сложное клеточное микроокружение печени в надежде увеличить продолжительность жизни и функциональность первичной культуры гепатоцитов.Сложность трехмерных культур варьируется от однослойных сэндвич-культур и сфероидов до более продвинутых систем, включающих пористые материалы, реакторы с уплотненным слоем, полые волокна и перфузионный поток.

Микроокружение гепатоцита in vivo очень важно для поддержания нормальной функции, включая его реакцию на эндогенные и экзогенные субстраты, и может быть сложно имитировать. Ограничения традиционной двумерной культуры, а именно снижение активности генов и экспрессии генов, участвующих в метаболизме лекарств, в основном возникают в течение первых 24-48 часов, и было показано, что эти культуры имеют низкую чувствительность определения гепатотоксичности лекарств. ⁵⁴ Восстановление клеточной полярности было предложено многими исследователями как решающее значение для поддержания активности и экспрессии генов, а также правильной функции гепатоцитов во время культивирования. ⁵² Гепатоциты имеют не только одну апикальную и базальную поверхности, но и несколько апикальных поверхностей (поверхности желчных канальцев) и две базолатеральные поверхности. ⁵² По этой причине восстановление клеточной полярности in vitro является более сложной задачей, чем с другими типами эпителиальных клеток.Различные внеклеточные матрицы (ЕСМ) были тщательно изучены в 2D- и 3D-культуре гепатоцитов в попытке восстановить и впоследствии поддерживать полярность клеток гепатоцитов. Многие конфигурации матриц были оценены для определения оптимальных условий для восстановления полярности гепатоцитов. Использование трехмерных культур печени может преодолеть недостатки системы двумерных культур, предоставляя модели, которые восстанавливают клеточную полярность и создают более сложные локальные условия.

Трехмерные культуральные системы претерпели значительные изменения за последнее десятилетие в стремлении продлить период культивирования и сохранить функцию гепатоцитов.Первоначально сфероиды гепатоцитов были сконструированы с предположением, что клеточные агрегаты лучше имитируют характеристики ткани печени. Работа с самоформирующимися сфероидами гепатоцитов изначально была сложной задачей, предполагавшей длительный период культивирования для формирования сфероидов до того, как гепатоциты стали доступны для любых токсикологических или фармакологических экспериментов. В 1996 году Ву и его коллеги ⁶⁴ оптимизировали протокол для быстрого получения сфероидов гепатоцитов крыс с помощью вращающихся колб.Они наблюдали физиологию сфероидов гепатоцитов крысы и обнаружили, что поступление кислорода имеет решающее значение для правильного образования сфероидов и что эти клетки поддерживают более дифференцированное состояние по сравнению с монослойной культурой. Cyp1a2 и Cyp1a1 Экспрессия быстро падала в традиционной двумерной монослойной культуре гепатоцитов мыши, в то время как в трехмерных сфероидах уровни оставались высокими в течение 5 дней, ^{65, 66} , что указывает на то, что культура сфероидов предпочтительнее монослоев для исследований, оценивающих уровни экспрессии генов.Сфероидная культура гепатоцитов мыши может также поддерживать экспрессию Cyp2b9 и Cyp2b10 в течение нескольких дней на уровнях, равных in vivo. ⁶⁷

Du et al. ⁶⁸ смогли разработать уникальную конфигурацию монослойной культуры на основе сфероидов путем конъюгирования пептидов клеточной адгезии Arg-Gly-Asp (RGD) с галактозным лигандом и полиэтилентерефталатом. Они определили, что конфигурация трехмерного сфероида гепатоцитов крысы была идеальной; при использовании этой новой системы культивирования клетки будут хорошо закрепляться на субстратах и ​​иметь ограниченную способность к распространению, сохраняя при этом функциональные характеристики сфероидов.Специфические для печени функции клеток на новом субстрате, такие как секреция альбумина и синтез мочевины, были аналогичны функциям традиционных сфероидов. Эти клетки также проявляли большую чувствительность к гепатотоксичности, вызванной ацетаминофеном, чем клетки, культивируемые на традиционном 2D-коллагене. Однако из-за трудностей с диффузией кислорода и питательных веществ сфероидная культура ограничена в возможности использования для биоискусственных моделей печени или долгосрочного культивирования; таким образом, исследуются дополнительные стратегии для 3D-моделей.

Гелеобразные материалы были разработаны для сочетания сложности внеклеточного матрикса типа Matrigel® с образованием сфероидов. Идея культивирования гепатоцитов, инкапсулированных в гель, была первоначально разработана для использования в биоискусственной печени, где полупроницаемые картриджи из полых волокон использовались в качестве каркаса для прикрепления гепатоцитов. ⁵⁴ Miccheli et al. ⁶⁹ захватили гепатоциты крысы в ​​альгинатные шарики и поместили их в систему биореактора с непрерывным потоком среды.В этой системе энергетический обмен, жизнеспособность и окислительно-восстановительное состояние были стабильными в течение 3 часов, а правильная форма, микроворсинки, плотные соединения и желчные каналы были преобразованы в течение 8 часов. Авторы подтвердили предыдущие наблюдения, что адекватное снабжение кислородом и субстратами критично для правильной клеточной реорганизации в этих системах. Они наблюдали повышенные уровни глицерофосфорилэтаноламина в статических культурах, что указывает на проблемы с регуляцией метаболизма мембранных фосфолипидов по сравнению с низкими уровнями в системе биореактора.Гели агарозы использовали для поддержания жизнеспособности культур гепатоцитов мышей в течение 21 дня. Внутри этих гелей гепатоциты обычно образуют агрегаты и выделяют значительно большее количество альбумина, чем их двумерные аналоги. ⁷⁰ Шен и др. ⁷¹ продемонстрировали, что заключенные в гель гепатоциты экспрессировали более высокие уровни специфических для печени функций и метаболизма фазы I, поддерживали более высокие внутриклеточные уровни АТФ и потенциал митохондриальной мембраны и накапливали меньше липидов в цитоплазме, чем те, которые культивировались в традиционном 2D монослое.Кроме того, измерения метаболических ферментов фазы I были аналогичны уровням , обнаруженным in vivo . Кроме того, культуры, заключенные в гель, смогли точно отразить гепатотоксичность более чем двадцати контрольных соединений. ⁷² Общее ограничение систем гелевых культур — нарушение переноса кислорода и питательных веществ к клеткам. Кроме того, эти системы трудоемки, малопроизводительны и требуют большого количества реагентов.

Продолжением этого направления исследований стала разработка моделей, в которых строительные леса используются в качестве опоры конструкции.Примером может служить система на основе полупроницаемого полого волокна. Некоторые из волоконных систем включали улавливание геля, а другие — нет. Культуры гепатоцитов крыс с повышенной функциональностью были получены за счет использования каркасов, состоящих из поливинилформальной смолы и нановолокон. ^{73, 74} Каркас увеличивал адгезию клеток даже при более высокой плотности посева, проявлял более низкое высвобождение ЛДГ и поддерживал биохимические функции, такие как секреция альбумина, синтез мочевины и синтез гликогена.Стабилизация уровней альбумина и мочевины после начального снижения была отмечена в функциональной 20-дневной культуре крыс. ⁷³ Шен и его коллеги ⁷⁵ исследовали простую систему реактора с полыми микроволокнами для гепатоцитов крысы и определили, что функциональность (с точки зрения синтеза мочевины и секреции альбумина) была увеличена в этой системе по сравнению с простой монослойной культурой. Такая система также улучшает метаболические возможности клеток, на что указывает более высокая чувствительность к химическому воздействию, чем наблюдается у клеток в однослойной культуре.Тем не менее, эти модели трудно производить в больших количествах, а также в них отсутствует поток для облегчения доставки кислорода и питательных веществ к культивируемым клеткам.

Включение потока жидкости в трехмерные системы культивирования было важным шагом в тканевой инженерии. Упакованные шарики, полые волокна или другие типы «реакторов» интегрируют микроциркуляцию среды для воссоздания потока жидкости в печени. Добавление потока к 3D-культурам важно для борьбы с проблемами плохой диффузии кислорода и питательных веществ через сфероиды и агрегаты клеток и внеклеточные матриксы.Было показано, что системы, включающие сдвиговый поток, способствуют формированию круглых клеточных агрегатов, которые больше похожи на морфологию in vivo , а также увеличивают и поддерживают специфические функции печени. ⁷⁶ Было показано, что включение потока в систему культивирования увеличивает и поддерживает более высокий уровень синтеза мочевины ⁷⁷ и увеличивает секрецию альбумина, лактата и глюкозы. ⁷⁸ В этих микрофлюидных системах могут быть установлены физиологические градиенты кислорода, которые могут помочь в выяснении физиологических механизмов, участвующих в гепатотоксичности. ⁷⁹ Кроме того, органотипическая физиологическая геометрия и свойства потока в этих системах позволяют изучать взаимодействия лекарство-лекарство и клетка-клетка. ⁸⁰ Хотя эти методы трехмерной культуры гепатоцитов показывают улучшение по сравнению с традиционными двумерными культурами, они все еще недостаточны для длительного культивирования или использования в клинической терапии (например, биоискусственной печени) из-за продолжающейся потери экспрессии метаболических генов после изоляция клеток.

По-прежнему существует потребность в более сложных 3D-системах.Существует ряд усилий по созданию более совершенных систем трехмерного культивирования путем применения существующих знаний о важной динамике клеточной среды между внеклеточным матриксом, микроциркуляцией, типом и плотностью клеток. Общая цель многих из этих усилий — сформировать полнофункциональную модель культуры печени, которую можно использовать для токсикологических и фармакологических исследований или которую можно преобразовать в биоискусственную печень для клинического использования. Здесь мы кратко обсудим несколько систем.

HμREL® Biochip

Chao et al. ⁸⁰ опубликовал оценку нового микрофлюидного устройства, биочипа HμREL® (более ранняя модель этой системы была ранее описана Sin et al. ⁸¹ ). Четыре биочипа заключены в поликарбонатный корпус, соединенный трубопроводами с резервуаром для жидкости и перистальтическим насосом. Каждый биочип имеет одно или несколько отдельных отсеков, в которых могут размещаться разные клетки. Компартменты соединены микрофлюидно линейным путем, чтобы обеспечить взаимодействие между типами клеток.Новая конструкция позволяет проводить отдельные микрофлюидные эксперименты параллельно на большем наборе пластин корпуса. Оценка системы с использованием первичных гепатоцитов человека показала, что система сохраняет жизнеспособность клеток и метаболическую компетентность, по крайней мере, на уровне, а иногда и выше, чем в традиционных статических условиях культивирования. ^{80, 82} Полезность этой модели для тестирования токсичности была исследована путем прогнозирования скорости клиренса in vivo и . Было продемонстрировано, что данные этой модельной системы больше коррелировали с данными in vivo, чем данные, полученные из статических культур гепатоцитов, и эта корреляция еще больше улучшалась при использовании совместных культур. ⁸² Кроме того, in vivo -подобная абсорбция, распределение, метаболизм, биоаккумуляция и токсичность нафталина были продемонстрированы, когда клетки легких, жировой ткани и печени были связаны жидкостной связью. ⁸³ Микромасштабная конструкция позволяет получать изображения под микроскопом, определять кислород, физиологически релевантные соотношения размеров камеры и время пребывания жидкости в каждом отсеке, физиологическое гидродинамическое напряжение сдвига, соотношение физиологической жидкости к клеткам и требует меньше среды и клеток.Однако модель сильно ограничена тем фактом, что удаление образца затруднено без нарушения динамики системы. Кроме того, рециркуляция среды включает сложный набор трубопроводов и резервуаров, а клетки на чипах образуют монослои, а не физиологические тканевые конструкции.

Реактор с полым волокном

Биореактор на основе полого волокна был описан Schmelzer et al. ⁸⁴ для регенерации и культивирования гепатоцитов человека. Клетки засеваются во внекапиллярное пространство и окружены тремя независимыми системами капиллярных мембран.Капиллярные системы состоят из пористого полиэфирсульфона и гидрофобных многослойных мембран из полых волокон, которые обеспечивают газообмен. Слои капилляров переплетаются вокруг экстракапиллярного пространства, и две капиллярные системы перфузируются в противотоке либо культуральной средой, либо плазмой, а третий обеспечивает децентрализованную оксигенацию и доставку питательных веществ. Биореактор функционирует за счет использования перфузионного устройства, которое использует насосы с регулируемым давлением для управления потоком среды.Блок смешения газов также используется для обеспечения системы и регулирования расхода воздуха, O ₂ и CO ₂ . При использовании этой системы функциональные возможности гепатоцитов человека в этой биореакторной системе оставались стабильными до четырех недель. Хотя эта система биореактора позволяла создать микросреду, более похожую на условия in vivo , система была большой и требовала большого количества клеток и большого количества реагентов. Затем была разработана микромасштабная версия прототипа этого биореактора. ⁸⁵ В этой меньшей модели биореактор состоит из четырех камер для клеток, каждая из которых содержит четыре отсека. В первом отсеке находятся клетки, в двух — питательная среда, а в последнем — подача кислорода. Все отсеки соединены, чтобы обеспечить клетки физиологически обоснованной средой. Этот микробиореактор до сих пор использовался для культивирования клеток печени плода человека и поддерживал жизнеспособность и дифференцировку клеток в течение десяти дней. Прототип позволяет использовать небольшое количество клеток и ограниченное количество реагентов, проводить микроскопическую оценку клеток и контролировать концентрацию кислорода.Кроме того, метод перфузии в противоположном направлении уникален тем, что обеспечивает более физиологически схожий поток. Впоследствии аналогичная система была использована для изучения фармакокинетики и токсичности лекарств. Синтез альбумина и активность CYP поддерживались в течение 2-3 недель в совместных культурах паренхиматозных и непаренхиматозных клеток печени. ⁸⁶ Ограничения этой системы включают отсутствие физиологических градиентов, обычно наблюдаемых в ткани печени, сложность многочисленных линий трубок и ограниченную пропускную способность, поскольку только небольшое количество различных условий культивирования может быть оценено в одной системе.

Одно- и многолуночный перфузионный биореактор

Sivaraman et al. ⁴⁵ использовали систему трехмерного биореактора для оценки функциональности сфероидов гепатоцитов крысы. Они выдвинули гипотезу, что система, включающая гетеротипические клеточные взаимодействия, стрессы потока жидкости и микроархитектуру, аналогичную in vivo , обеспечит соответствующее микроокружение для клеток, чтобы они функционировали так же, как in vivo . Эта система содержала сфероиды гепатоцитов крысы, прикрепленные к множеству каналов кремниевого каркаса.Перфузия среды направлялась как поверх каналов, так и через ткань каналов. Фильтр с высоким сопротивлением контролировал перфузию через каналы, поэтому поток был равномерным по всем каналам каркаса. Сначала поток был направлен вниз, чтобы захватить клетки в каналах, а позже, после того, как клетки прилипли к стенкам канала, поток был обратным. Сфероиды, засеянные в системе биореактора, обладали повышенной и устойчивой функциональностью по сравнению со сфероидами как в статической культуре, так и в отдельных клетках, засеянных в систему биореактора.Как синтез мочевины, так и экскреция альбумина были увеличены и более стабильны при использовании сфероидных биореакторов. Эту биореакторную систему можно легко масштабировать для включения большего количества каналов (и, следовательно, большего количества клеток) и до 12 различных реакторов, управляемых одним и тем же устройством, при сохранении жизнеспособности клеток и выработки альбумина в течение 7 дней. ⁸⁷ Пропускная способность и простота использования этой модельной системы выше по сравнению с другими 3D-системами. Использование этой системы, имеющее отношение к испытаниям на токсичность, включает исследования, показывающие, что скорости выведения соединений с известным метаболизмом в печени сравнимы с таковыми, полученными in vivo, и многообещающие результаты с известными опосредованными воспалением идиосинкразическими токсикантами. ⁸⁸ Каркасы в этих перфузируемых биореакторах способствуют морфогенезу тканей и позволяют проводить микроскопические исследования с помощью светового или двухфотонного микроскопа; однако этой системе культивирования клеток по-прежнему не хватает возможностей высокой производительности, она не вмещает большое количество клеток и ее необходимо исследовать с гепатоцитами других видов.

Несмотря на то, что по сравнению с традиционной системой двумерной статической культуры был достигнут значительный прогресс, все еще существует потребность в модели, в которой все уровни специфической функции печени могут поддерживаться в течение длительных периодов времени.Многие из доступных моделей еще не установили, могут ли системы включать и поддерживать гепатоциты разных видов (например, грызунов и людей). Кроме того, исследования применения этих методов в тестировании на токсичность до сих пор были ограниченными, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить, могут ли они принести больше преимуществ по сравнению с традиционными системами культивирования.

Биоискусственная печень

Биоискусственная печень (БАЛ) — многообещающее направление ex vivo терапии пациентов с заболеванием или недостаточностью печени.При правильной разработке и изготовлении устройства можно было бы использовать также для токсикологических исследований. Наиболее распространенными конструкциями БАЛ являются системы с полыми волокнами и системы с плоскими пластинами, в которых используются агрегаты или отдельные слои гепатоцитов соответственно. ⁸⁹ В этих системах плазма может находиться в прямом контакте с гепатоцитами или отделена от них.

Три основных критерия должны быть выполнены при разработке полностью функциональной биоискусственной печени: устройство должно (1) использовать и поддерживать большое количество дифференцированных гепатоцитов, (2) уменьшать транспортные ограничения и (3) предотвращать потребность в большом количестве плазмы / среды. ⁹⁰

Ряд биоискусственных моделей печени находится в стадии разработки, и во многих из них используются селективные мембраны для предотвращения прямого контакта между кровью и гепатоцитами. ⁸⁹ Способность оценивать гепатотоксичность в присутствии крови человека позволяет использовать более прогностическую модель за счет влияния факторов, не растворимых в печени. Zhang et al. ⁹¹ разработал многослойный плоский БАЛ, который вызывал снижение иммунного ответа у реципиента. Эти исследователи совместно культивировали свежие гепатоциты свиньи с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга и использовали устройство БАЛ для лечения гончих при острой печеночной недостаточности.Низкие уровни антител и комплемента указывают на то, что этот БАЛ обладает высоким уровнем иммунобезопасности. Дэвидсон и его коллеги ⁹² определили, что зональное распределение кислорода является одним из наиболее важных факторов при проектировании БАЛ. Их результаты показали, что скорость потока плазмы / среды была ключом к созданию метаболических зон в таких устройствах. Органоидная система печени была разработана Лу и соавторами ⁹³ , в которых использовались полые волокна для сборки смесей коллаген-гепатоциты в трехмерные конструкции.В этой системе связанная с глюкозой метаболическая активность и гормональные реакции поддерживались на высоком уровне в течение периода культивирования. В другом устройстве использовались микроносители и альгинат, чтобы обеспечить большое количество клеток, минимальную миграцию и достаточную диффузию кислорода. ⁹⁴

Пространственная неоднородность, которую обеспечивает биоискусственная печень, будет большим преимуществом для токсикологических исследований. Например, ферменты цикла мочевины экспрессируются в высоких уровнях в перипортальной и центрилобулярной областях, но не в перивенозных гепатоцитах. ⁹⁰ Гепатотоксины, такие как ацетаминофен, могут в течение периода повторного воздействия модулировать экспрессию ферментов цитохрома P450 в ацинусе, что приводит к новым паттернам экспрессии. ⁸⁹ Устройства с биоискусственной печенью могут создавать среду, более похожую на среду in vivo, печень, чем 2D- и 3D-культивирование, и могут обеспечивать сохранение функциональной гетерогенности.

Хотя успехи в БАЛ являются многообещающими, Бикчандани и его коллеги ⁹⁵ указывают, что клиническая значимость БАЛ все еще сомнительна, и ни одно устройство не показало статистически значимого преимущества в отношении выживаемости пациентов.Однако отсутствие преимуществ выживания для пациентов не является недостатком для их использования в исследованиях токсичности. Тем не менее, есть и другие атрибуты БАЛ, которые наносят ущерб исследованиям токсичности, в том числе их потребность в большом количестве высокофункциональных клеток (не широко доступных), отсутствие надлежащего микроокружения для гепатоцитов (включая структуру и взаимодействие с другими важными непаренхиматозными типами клеток). , короткая продолжительность жизни гепатоцитов в культуре и отсутствие надлежащих сложных мембран (для обеспечения обмена кислородом, питательными веществами и небольшими молекулами). ⁹⁶

Было высказано предположение, что любое биоискусственное устройство, состоящее из первичных клеток, потребует непаренхимных клеток для поддержания тканеспецифичных функций. ⁹⁷ Биоискусственные устройства для печени разрабатываются не только для помощи в лечении печеночной недостаточности, но также для использования в исследованиях метаболизма лекарств и токсикологических исследованиях. ⁹⁸ Еще неизвестно, сможет ли биоискусственная печень или трехмерная модель другого типа лучше всего предсказать in vivo ответы на химическое воздействие; однако включение ключевых требований микросреды, таких как присутствие непаренхимных клеток, имеет решающее значение для разработки и применения этих систем.

Системы совместного культивирования

В организме клетки функционируют посредством сложных взаимодействий и сигналов от других клеток. По этой причине можно с уверенностью предположить, что одни только культуры гепатоцитов не могут должным образом отражать функциональность in vivo , особенно при исследовании гепатотоксичности, связанной с лекарством. Совместные культуры гепатоцитов обычно состоят из гепатоцитов с одним другим типом клеток, часто с другими клетками печени, ^99-102 непеченочных эпи- или эндотелиальных клеток, ^{103, 104} фибробластов или клеточных линий. ^105-107 Совместные культуры также были приготовлены с использованием гепатоцитов и более чем одного дополнительного типа клеток, таких как культуры гепатоцит-непаренхимальных клеток (NPC). В этих культурах гепатоциты культивируются с другими клетками печени: клетками Купфера (резидентными макрофагами), синусоидальными эндотелиальными клетками и звездчатыми клетками (стромальными клетками). Было показано, что совместное культивирование гепатоцитов с другими типами клеток является одним из наиболее успешных методов поддержания функции гепатоцитов в условиях in vitro . ^{28, 108-110}

Гриффит и его коллеги ¹¹¹ продемонстрировали, что гепатоциты, засеянные эндотелиальными клетками аорты крупного рогатого скота, могут образовывать трехмерные структуры в системе полимерных каркасов с потоком. Внутри этих структур гепатоциты связывались с субстратом, а эндотелиальные клетки уплощались и «покрывали» гепатоциты. Позднее эти исследования были расширены, чтобы продемонстрировать, что совместное культивирование гепатоцитов с эндотелиальными клетками, полученными из печени, в перфузионном реакторе микропроизводства приводило к образованию структур эндотелиальной сети и большему сохранению гепатоцеллюлярной функции по сравнению с клетками без совместного культивирования. ^{112,87, 88} Следует отметить, что совместные культуры, включая иммунные клетки, полученные из печени, наряду с другими непаренхимальными клетками печени, реагировали на воспалительные сигналы, что делало культуры восприимчивыми к идиосинкразической токсичности определенных лекарств, которые проявляют токсичность при их метаболизме. действует синергично с воспалением. ⁸⁸ Другие исследователи обнаружили увеличение секреции альбумина и синтеза мочевины в гепатоцитах крыс при культивировании с эмбриональными фибробластами мыши, клетками 3T3-J2 или NIG-3T3.Другие преимущества включали сохранение полигональной морфологии печени, видимых желчных протоков и отдельных ядер. ¹¹³ Гепатоциты мыши продемонстрировали лучшее поддержание секреции альбумина и синтеза мочевины в течение 7-дневного периода культивирования, когда им позволяли формировать трехмерные агрегаты с фибробластами печени мыши. Важность физического взаимодействия между двумя типами клеток была очевидна. Повышенная специфическая для печени функциональность развивалась, когда клетки контактировали в одной и той же культуре, а не на разных субстратах. ¹¹⁴

Результаты исследования культивирования гепатоцитов с микроструктурой (полученных путем посева на трафарет и последующего удаления трафарета) на фидерном слое фибробластов 3T3-J2, показывают, что этот тип совместного культивирования может привести к увеличению и поддержанию уровня альбумина и мочевины. продукция, а также сохраненная морфология гепатоцитов до 42 дней. ¹¹⁵ Эта система субстратов с микрорельефами коллагена теперь используется Hepregen Corporation в их биоинженерной платформе Microliver HepatoPac ™.Гепатоциты избирательно прикрепляются к доменам, покрытым ECM, в то время как стромальные клетки прикрепляются к остальным областям, окружающим паренхимные клетки. ¹¹⁵ По сравнению с микросомами печени человека, фракциями S-9 и суспензиями первичных гепатоцитов, система Hepregen позволяла более длительные инкубации с 27 известными соединениями, метаболизируемыми печенью, и была способна генерировать большую долю основных метаболитов человека, обычно обнаруживаемых в естественным образом. ¹¹⁶ Аналогичную систему производит Transparent, Inc.в котором фибробласты мыши используются в качестве питающих клеток. В этой системе питающие клетки мигрируют снизу и окружают трехмерную структуру гепатоцитов и образуют пространство, подобное Диссе, между двумя типами клеток. Результаты этой системы показывают, что базальная экспрессия и индукция CYP гепатоцитов, а также активность переносчика могут поддерживаться, увеличиваться или измеряться на уровнях выше, чем в традиционной монослойной культуре в течение 7, 14 или даже 54 дней. ¹¹⁷ Важность гетеротипического интерфейса между гепатоцитами и фибробластами дополнительно иллюстрирует важность межклеточных контактов в культуре гепатоцитов. ¹¹⁸

Не только межклеточные контакты с фибробластами, клеточными линиями, эпи- и эндотелиальными клетками могут влиять на гепатоциты в культуре, но также было показано, что растворимые факторы, выделяемые другими типами клеток, также чрезвычайно важны. Культуры гепатоцитов крыс в среде, кондиционированной эндотелиальными клетками сердца, функционировали аналогично гепатоцитам, культивируемым под слоем эндотелиальных клеток и геля. ¹¹⁹ Было показано, что гепатоциты также модулируют состояния активации эндотелия. ¹²⁰ Morin et al. ¹²¹ наблюдали подобное увеличение секреции альбумина в системах культивирования, в которых эндотелиальные клетки и гепатоциты не контактировали, как культуры, в которых клетки находились в прямом контакте. Эти бесконтактные совместные культуры имели различный успех и ограниченную воспроизводимость между лабораториями, однако, таким образом, межклеточные контакты продолжают оставаться одной из наиболее важных характеристик совместных культур. ^{57, 122}

Добавление непаренхимальных клеток печени к культурам гепатоцитов необходимо для восстановления органотипической среды, которая может приближаться к условиям in vivo и .Во многих публикациях сообщается о пользе непаренхимальных клеток для функции гепатоцитов. Ries et al. ⁹⁹ описали модель совместного культивирования гепатоцитов и NPC, в которой гепатоциты были засеяны поверх слоя NPC (содержащего эндотелиальные клетки Купфера, звездчатые и синусоидальные клетки). В их культурах синусоидальные эндотелиальные клетки выживали и сохраняли свои отверстия в течение 6 дней. Другие типы клеток оставались жизнеспособными до 14 дней. Они смогли продемонстрировать, что присутствие NPC не только поддерживает дифференцировку гепатоцитов, но и способствует выживанию клеток NP.Было показано, что гепатоциты человека, культивированные совместно с непаренхимальными клетками в системе с потоком, обладают большей способностью к метаболизму лекарств и лучшим поддержанием метаболической способности, чем культуры, состоящие исключительно из гепатоцитов. ⁸² Другие культуры гепатоцитов с непаренхимными клетками обнаружили, что стимуляция репликации ДНК гепатоцитов после обработки известным гепатотоксикантом WY-14,643 была усилена по сравнению с культурами одних гепатоцитов, что указывает на то, что совместные культуры приводят к более in vivo — как отзывы на лечение. ¹²³ Туков и др. ¹⁰⁰ исследовали эффекты клеток Купфера, культивируемых в контакте с гепатоцитами крысы. Они обнаружили, что, добавляя клетки Купфера к культурам, они могут имитировать in vivo, вызываемые лекарством воспалительные реакции, тем самым обеспечивая модель, которая может быть полезна для прогнозирования таких взаимодействий до клинических испытаний. Совместное культивирование первичных гепатоцитов и звездчатых клеток крысы на поверхности поли (DL-молочной кислоты) быстро образовывало сфероидальные агрегаты и сохраняло специфические функции печени в течение более 2 месяцев.Индукция фермента цитохрома P450 поддерживалась почти весь период культивирования. ¹²⁴ Звездчатые клетки также способствуют пролиферации клеток при контакте с гепатоцитами и поддерживают дифференцировку гепатоцитов при культивировании без прямого контакта. ¹⁰²

Наконец, RegeneMed Inc. продемонстрировала положительные эффекты посева первичных гепатоцитов на конструкции с нейлоновой сеткой, содержащие устоявшиеся культуры непаренхимных клеток. Эти совместные культуры образовывали трехмерные тканевые конструкции и поддерживали синтез альбумина и индукцию цитохрома в культуре до 48 дней. ¹²⁵ Совсем недавно компания установила, что клетки в трехмерной системе совместного культивирования могут реагировать на химические воздействия (такие как Wy-14643, фенобарбитал, TCDD и IL-6) и индуцировать экспрессию генов несколькими путями. аналогично тому, что обнаружено в in vivo ткани . ¹²⁶

Стволовые клетки

Текущие процедуры, используемые для выделения первичных гепатоцитов, обычно трудозатратны, а результаты сильно различаются между лабораториями и протоколами. Использование криоконсервированных гепатоцитов становится все более популярным; однако качество клеток при оттаивании не всегда стабильно.Более надежный и воспроизводимый источник гепатоцитов принесет большую пользу в области тестирования токсичности и поможет стандартизировать исследования. Теоретически стволовые клетки будут представлять собой возобновляемый источник клеток и потенциально могут предоставить большое количество функционально эквивалентных клеток, которые можно было бы сохранить для дальнейшего использования. Модель токсичности, которая включает относительно неограниченное количество гепатоцитов человека с определенными фенотипами, позволит повысить предсказуемость реакции на лекарственное лечение, а также может учитывать генетическое разнообразие в человеческой популяции.Здесь будут обсуждаться два источника стволовых клеток: эмбриональные и индуцированные плюрипотентные клетки.

Эмбриональные стволовые клетки

Многие лаборатории с некоторым успехом разработали протоколы выделения эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и побуждения их к образованию гепатоцитоподобных клеток. Hamazaki et al. ¹²⁷ оценивали способность мышиных эмбриональных стволовых клеток дифференцироваться в зрелые взрослые гепатоциты in vitro . Исследователи обнаружили, что, хотя ESC не могли дифференцироваться после начальных стадий дифференцировки в середине энтодермы (экспрессия TTR, AFP, AAT, ALB) с использованием только одной базовой среды; Добавление факторов роста позволило клеткам дифференцироваться на дальнейшие стадии печеночного клона (экспрессия зрелых печеночных генов).Другие исследователи получили метаболически активные гепатоцитоподобные клетки из человеческих ESC, используя среду с добавками ^128-130 , а недавно исследователи использовали предварительно подготовленную среду HepG2, чтобы вызвать подобное образование. ¹³¹ Исследователи обрабатывали гепатоцитоподобные клетки этанолом и наблюдали аналогичные эффекты (подавление генов и белков, а также гибель клеток), которые типичны для этого лечения in vivo .

К сожалению, все протоколы дифференцировки приводят к очень вариабельной функциональности в популяции клеток, и через несколько дней клетки начинают терять печеночные характеристики, как и в стандартных условиях культивирования. ⁶² Zamule et al. ¹³² использовали WEM с добавками нормальных гепатоцитов (HEPES, глутамин, дексаметазон и т.д.) и внеклеточным матриксом коллагена I типа для культивирования человеческих ESC в течение 10-20 дней. В течение этого периода времени и в этих условиях клетки становились преданными к дифференцировке по клонам печени. Хотя дифференцированные клетки выражали многие специфические функции печени на высоких уровнях, эти уровни все еще не были сопоставимы с первичными гепатоцитами человека, что указывает на то, что клетки не были полностью зрелыми.Другие исследователи обнаружили множество других веществ, которые индуцируют дифференцировку ЭСК человека по линии печени: FGF, ^{128, 133-136} BMP, ^{129, 134, 135} HGF, ^{128, 136} дексаметазон, ^{135, 137, 138} инсулин, ^{134, 138, 139} и трансферрин. ¹³⁴ Модели на мышах и крысах показали, что они поддерживают пролиферацию и функцию трансплантированных взрослых гепатоцитов в случаях, когда печень серьезно повреждена. ^140-142 К сожалению, гепатоциты, трансплантированные в нормально функционирующую ткань печени, не реагируют таким же пролиферативным образом. ¹⁴³

Исследователи разрабатывают методы для преодоления этих недостатков функциональной изменчивости, низкого уровня экспрессии и потери функциональности с течением времени, однако эмбриональные стволовые клетки являются спорным источником клеток для научных исследований, и это вряд ли изменится в будущем. ближайшее будущее. Другой источник стволовых клеток мог бы устранить эти этические противоречия.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) трансформируются в гепатоцитоподобные клетки, следуя тем же процессам дифференцировки, что и стволовые клетки; однако они происходят из типов соматических клеток, которые сначала необходимо «перепрограммировать».IPSC сохраняют большую способность к делению и дифференцировке клеток. ¹⁴⁴ Поскольку эти клетки не происходят из эмбриона, использование этих клеток не является спорным с этической точки зрения.

В 2010 году был опубликован метод получения гепатоцитоподобных клеток из мышиных фибробластов. ⁶³ Это исследование было важным, поскольку оно продуцировало клетки, экспрессия мРНК которых аналогична экспрессии гепатоцитоподобных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток, что указывает на то, что ИПСК могут быть такой же хорошей моделью, как и ЭСК.Лю и др. ¹⁴⁵ отметил, что создание ИПСК человека из гепатоцитов было более быстрым процессом, чем генерация из других типов соматических клеток, однако функциональность не была определена за пределами минимальной оценки (альбумин, CYP3a4 и CYP1a2). Si-Tayeb и его коллеги ⁶³ постулировали, что если экспрессия фермента должна оставаться на высоком уровне, должны быть установлены надлежащие методы культивирования (аналогично 2D-культивированию). Эти ученые также использовали метод, в котором не использовались какие-либо неопределенные факторы, такие как сыворотка или первичные питающие клетки, что увеличивало воспроизводимость и позволяло большой части клеток проявлять первичные характеристики гепатоцитов.

К сожалению, уровни экспрессии генов метаболизма ксенобиотиков в ИПСК все еще не равны уровням, обнаруженным во всей печени или свежевыделенных первичных гепатоцитах, уровни ферментов быстро снижаются в течение периода культивирования (опять же, аналогично культуре 2D гепатоцитов) и другие незначительные препятствия продолжают препятствовать прогрессу в использовании этих клеток для in vitro токсикологии (вариабельность линий, неполное программирование в популяциях клеток, нехарактерный ответ на прототипы гепатотоксикантов и т. д.). ¹⁴⁶ Сообщалось о необъяснимых различиях в кодировании белков и экспрессии генов miRNA между ES- и iPS-клетками. ¹⁴⁷ Было также обнаружено, что происхождение ИПСК может влиять на их дифференцировку, канцерогенные свойства, экспрессию генов и эпигенетические особенности. ^{148, 149} Наконец, Лю и его коллеги ¹⁴⁵ не смогли определить, были ли конечные гепатоцитоподобные клетки, полученные из их ИПСК, зрелыми гепатоцитами, содержащими надлежащие профили экспрессии генов на уровнях, сопоставимых с уровнем всей печени.

Полнофункциональные гепатоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, могут быть ценным инструментом для разработки лекарств или оценки вклада генетической изменчивости в вариабельные ответы. Однако из-за текущих недостатков и технических ограничений ни индуцированные плюрипотентные, ни эмбриональные стволовые клетки пока не являются широко приемлемым вариантом для токсикологических и фармакологических исследований.

Мировой отчет 2020: Россия | Хьюман Райтс Вотч

В 2019 году ситуация с правами человека в России продолжала ухудшаться.За некоторыми исключениями, власти ответили на рост гражданской активности запретами, репрессивными законами и демонстративными судебными преследованиями. Рекордное количество людей протестовали против безосновательного исключения кандидатов от оппозиции из местных выборов в Москве, и власти ответили подавляющей демонстрацией силы, задержаниями и поспешным уголовным преследованием. Усиление репрессий спровоцировало широкую общественную кампанию «за свободу политических заключенных», в результате которой власти освободили из тюрьмы несколько человек.

Игнорирование должностными лицами озабоченности общественности по поводу воздействия на окружающую среду и здоровье проектов по управлению отходами вызвало массовые протесты, и власти регулярно преследовали и преследовали экологических активистов.

Правительство ввело новые ограничения на свободу слова в Интернете и приняло закон, позволяющий изолировать российский сегмент Интернета.

Закон об «иностранных агентах» продолжал душить неправительственные организации (НПО), в то время как власти развязали кампанию запугивания против лиц, якобы нарушающих закон, запрещающий «нежелательные» иностранные организации.

Пытки и жестокое и унижающее достоинство обращение

Пытки и другие виды жестокого обращения оставались широко распространенным явлением; особенно в местах предварительного заключения и в тюрьмах. Продолжался судебный процесс над сотрудниками Ярославской тюрьмы, арестованными за избиение заключенного в 2018 году. В августе власти пообещали провести расследование сообщений о жестоком обращении с заключенными для получения признательных показаний в специально отведенных камерах следственного изолятора Санкт-Петербурга. В сентябре суд вынес первый в истории приговор бывшему сотруднику Федеральной службы безопасности (ФСБ) за пытки подозреваемого.

Однако власти часто отрицают факт жестокого обращения и отказываются привлекать к ответственности виновных. Правозащитники задокументировали многочисленные случаи неспособности обеспечить справедливость для выживших.

Протесты на выборах

В середине июля отстранение жизнеспособных кандидатов от оппозиции — многие из которых являются союзниками оппозиционного политика Алексея Навального — от сентябрьских выборов в Моссовет, вызвало продолжительные несанкционированные, но мирные протесты. Полиция применила чрезмерную силу против мирных демонстрантов, десятки из которых получили ранения, и арестовала рекордное количество демонстрантов и случайных прохожих.

Очевидно, стремясь воспрепятствовать дальнейшим протестам, власти возбудили несколько серьезных уголовных расследований. К ноябрю 23 человека были арестованы по необоснованным обвинениям в «массовых беспорядках» и / или нападении на полицию. Пятеро были приговорены за нападение к двум-трем с половиной годам лишения свободы, один из которых был освобожден в сентябре после активной общественной кампании.

Апелляционный суд приговорил его к одному году условно. Семеро были освобождены, а их дела закрыты. Одиннадцать человек остались в СИЗО или под домашним арестом, в том числе Егор Жуков, обвинение которого было изменено на «разжигание экстремизма в Интернете».«Айдар Губайдулин был объявлен в международный розыск после того, как бежал из России, опасаясь тюремного заключения. Один активист, Константин Котов, был приговорен к четырем годам лишения свободы только за неоднократное участие в несанкционированных демонстрациях. Суды вынесли предупреждения двум парам, которые привели своих детей на акции протеста, после того, как прокуратура потребовала лишить их родительских прав. Один мужчина был приговорен к пяти годам тюремного заключения за твит, который был истолкован как угроза детям сотрудников правоохранительных органов.

Власти возбудили уголовное дело по факту вмешательства в выборы в отношении деятелей оппозиции, исключенных из избирательного бюллетеня, а незарегистрированные независимые кандидаты отбыли несколько срочных приговоров к временному аресту. Гражданские иски стремятся привлечь лидеров протестов к ответственности за предполагаемый ущерб на миллионы рублей, связанный с несанкционированными протестами. Расследование об отмывании денег, начатое в августе, было направлено против Фонда борьбы с коррупцией (ФБК) — организации, возглавляемой Навальным. Всенародные обыски в помещениях организации и замораживание банковских счетов ее активистов последовали за сентябрьским голосованием.

Милиция в Улан-Удэ применила чрезмерную силу и произвела задержания для разгона мирных протестов, связанных с выборами, вызванных, среди прочего, победой кандидата в мэры правящей партии. Около 20 человек были задержаны; двое были оштрафованы, двое приговорены к краткосрочному тюремному заключению, а остальные были освобождены без предъявления обвинений. Один из лидеров протеста получил сотрясение мозга и перелом позвонка после задержания в полиции. Полиция возбудила уголовное дело по факту нападения на сотрудника полиции за распыление перечного газа, который, по утверждениям активистов, полиция применила против них.В октябре активиста приговорили к штрафу.

Свобода объединений

Власти продолжили широкомасштабную клеветническую кампанию против НПО.

Закон, принятый в октябре 2018 года, запретил организациям, обозначенным как «иностранные агенты», проводить антикоррупционную оценку проектов правовых актов.

С декабря 2018 года Минюст внес в список «иностранных агентов» 12 организаций, в том числе три правозащитные организации, группу по профилактике ВИЧ / СПИДа и ФБК.

Власти продолжали штрафовать организации и их руководителей за нарушение закона об «иностранных агентах», включая отказ от ответственности «иностранных агентов» в своих сообщениях в социальных сетях и других публикациях. Штрафы и другое давление вынудили закрыть еще несколько групп, в том числе одну, которая поддерживала людей с диабетом.

В ноябре Верховный суд постановил закрыть Движение за права человека, одну из старейших правозащитных групп страны.

Власти начали первое в истории уголовное расследование по факту причастности к «нежелательным организациям» против четырех активистов продемократического движения «Открытая Россия».В сентябре дело Яны Антоновой было передано в суд. Другая активистка Анастасия Шевченко с января оставалась под домашним арестом. Обоим грозит до шести лет тюрьмы в случае признания виновным. Десятки других были допрошены или оштрафованы за различные действия — от публикаций в социальных сетях о «Открытой России» до плакатов с желтыми и черными цветами движения.

В октябре власти провели массовые обыски в домах и заблокировали банковские счета нескольких активистов, которых они подозревают в связях с ФБК.

В ноябре российские власти запретили как нежелательную чешскую гуманитарную организацию «Люди в беде».

Свобода выражения мнения

В декабре 2018 года президент Владимир Путин подписал поправки к закону, отменяющие уголовную ответственность за подстрекательство к ненависти в первый раз. Российские власти часто злоупотребляют подстрекательством к ненависти, чтобы подавить законную защищенную речь.

Российские власти продолжали использовать репрессивное законодательство для подавления критических и независимых голосов в Интернете и офлайн.

В рамках новой тенденции власти ограничили свободу творчества, отменив многочисленные выступления в стиле рэп и поп-музыку под предлогом защиты детей от пропаганды наркотиков, самоубийств и гомосексуализма.

Правительство продолжало ограничивать свободу Интернета. Отчет Google о прозрачности показал, что общий объем контента, который правительство России просило его заблокировать на YouTube и других платформах, резко увеличился в 2018 году.

В мае Путин подписал закон, позволяющий российским властям частично или полностью блокировать доступ к Интернету. в России, без судебного надзора, в случае еще неопределенных угроз безопасности.Закон, который частично вступил в силу в ноябре и на момент написания должен был полностью вступить в силу в январе 2021 года, предусматривает создание национальной доменной системы, предоставляющей правительству централизованный контроль над интернет-трафиком страны, что повысит его пропускную способность. проводить точную цензуру интернет-трафика.

Суды наложили серьезные штрафы на НПО и независимые СМИ. В конце 2018 года был наложен крупный штраф в отношении журнала The New Times , известного своим критическим освещением политики правительства, якобы за отказ от сообщения об иностранном финансировании.В октябре 2018 года суд обязал Transparency International Russia выплатить миллион рублей (15 200 долларов США) в качестве компенсации за клевету соруководителю избирательной кампании Путина 2018 года. В том же месяце НПО, занимающаяся наркополитикой, была оштрафована за пропаганду употребления наркотиков из-за статьи о том, как определенные потребители наркотиков могут снизить риски для здоровья. Все трое избежали закрытия, собирая деньги на штрафы с помощью краудфандинга.

На основании закона от марта 2019 года, который запрещает распространение «фейковых новостей» или выражение «вопиющего неуважения» к государству, возбуждены дела в отношении не менее 45 человек, и суды уже наложили 23 штрафа за оскорбление властей.

В феврале власти возбудили уголовное дело о пропаганде терроризма в отношении журналистки Светланы Прокопьевой, которая в передаче о взрыве террориста-смертника отметила, что политика правительства может радикализировать молодежь. Новостные агентства, опубликовавшие ее комментарий, также были оштрафованы.

В мае два опытных репортера из Коммерсант , очень уважаемого новостного агентства, были вынуждены уйти в отставку в отместку за новость, что вынудило уволиться весь политический отдел.Иван Голунов, журналист независимого информационного агентства Meduza , был арестован по фальшивому обвинению в наркотиках из-за его следственной работы по коррупции на высоком уровне. После масштабных местных и международных кампаний власти освободили Голунова, сняли обвинения и уволили двух высокопоставленных полицейских. По факту попытки сфабриковать дело против Голунова продолжается расследование.

В ноябре российский парламент принял новый закон, позволяющий властям распространить статус «иностранных агентов» на частных лиц, включая блогеров и независимых журналистов.

Свобода религии

Российские власти продолжали преследовать группы религиозных меньшинств, безосновательно обозначенные как «экстремистские» в соответствии с чрезмерно широким российским законом о борьбе с экстремизмом, несмотря на отсутствие доказательств того, что они поддерживали или совершали насилие.

В феврале орловский суд приговорил Свидетеля Иеговы и гражданина Дании Денниса Кристенсена к шести годам лишения свободы по обвинению в экстремизме. В ноябре суд Томска вынес такой же приговор другому Свидетелю Иеговы Сергею Климову.По меньшей мере 285 Свидетелей Иеговы были осуждены, предстали перед судом или находились под следствием в России в 2019 году. 46 человек находятся под стражей до суда.

Власти привлечены к уголовной ответственности по обвинению в экстремизме членов определенных исламских групп, которые не имели опыта подстрекательства или насилия. В октябре 2019 года как минимум двое последователей покойного турецкого богослова Саида Нурси, объявленного экстремистом и запрещенного в 2008 году, продолжали отбывать срок от трех до восьми лет. Четыре были выпущены в 2019 году; один из них, Евгений Ким, был лишен российского гражданства, отсидев почти четыре года, и с апреля 2019 года оставался под стражей в ожидании депортации.В отношении двух других лиц продолжались судебные процессы по обвинению в экстремизме.

Правозащитники

В марте суд Чечни приговорил директора грозненского правозащитного центра «Мемориал» Оюба Титиева к четырем годам по обвинению в незаконном обороте наркотиков. В июне Титиев был условно освобожден после 17 месяцев за решеткой.

Несколько адвокатов и активистов-правозащитников подверглись преследованию в Краснодарском крае. Адвокат-правозащитник Михаил Беняш был приговорен к штрафу за нападение на сотрудника милиции. Обвинения против Беньяша были предъявлены после того, как он был арестован в 2018 году, содержался под стражей без связи с внешним миром и был избит.В ноябре 2018 года неизвестные подожгли машину адвоката Беняша Людмилы Александровой, которая также представляет интересы потерпевших в делах против правоохранительных органов. В сентябре милиция в Сочи провела обыск в доме правозащитника Семена Симонова, взломав его дверь и изъяв у него и его жены электронику и документацию, относящуюся к его работе.

В августе милиция и службы безопасности провели обыск в московском и Назранском офисах «Правовой инициативы по России», неправительственной организации, которая выиграла несколько сотен исков против России в Европейском суде по правам человека.В Москве власти не предъявили ордер на обыск. Власти Назрани заявили, что обыск был проведен в результате расследования предполагаемого иностранного финансирования несанкционированных акций протеста.

В 2019 году исполнилось 10 лет со дня убийства правозащитницы в Чечне Натальи Эстемировой. Российские власти не провели эффективного расследования.

Защитники окружающей среды

В течение года люди по всей России протестовали, пытаясь предотвратить строительство или расширение полигонов, мусоросжигательных заводов и заводов по переработке отходов, которые, по их мнению, могут поставить под угрозу их права на здоровье и здоровую окружающую среду.

В Архангельской области частные охранники применили насилие к протестующим, которые пытались заблокировать незаконное строительство в заболоченных лесах крупнейшей свалки в Европе. В марте полиция обвинила трех активистов в бдительности за попытку пресечь действия частного субподрядчика, который использовал экскаватор для угроз активистам, в результате чего один из них был ранен. Но власти отказались привлечь к ответственности частных лиц, ответственных за это, и частную безопасность за насилие над протестующими.

Местные власти также преследовали лидеров протестов и рядовых активистов, которые возражали против проектов по «экспорту» московского мусора в свои регионы. Двум активистам, Вячеславу Егорову в Коломне Московской области и Андрею Боровикову в Архангельске, были предъявлены обвинения в неоднократных нарушениях правил проведения публичных собраний, и им может грозить до пяти лет лишения свободы за мирный протест. Боровиков был приговорен к штрафу. На момент написания статьи суд над Егоровым еще не завершился. Власти Коломны и Архангельска неоднократно отказывали в разрешении на проведение мирных акций протеста в центре этих городов, отодвигая их на окраины.

В июне Александра Королева, лидер экологической группы «Экозащита!», Бежала из России после того, как власти возбудили против нее пять уголовных дел за один день за неуплату штрафов «иностранному агенту», угрожая ей тюремным заключением.

Другая группа «Экологическая вахта Северного Кавказа» и ее руководитель Андрей Рудомаха несколько раз подвергались преследованиям за связь с движением «Открытая Россия». В апреле организацию оштрафовали за размещение блогов на сайте «Открытой России».В апреле и июле полиция провела обыск в помещении группы, во время которого избила и обрызгала Рудомаху перцовым баллончиком. Оба раза полиция конфисковала электронику и документацию, парализовав работу организации.

В январе Гринпис России узнал, что расследование избиений его сотрудников в 2016 году было закрыто без привлечения к ответственности. Расследование факта жестокого избиения Рудомахи в 2017 году застопорилось. Оба инцидента произошли в Краснодаре.

Северный Кавказ

В июле независимая газета «Новая газета», «Мемориал» и «Комитет против пыток», две известные российские правозащитные группы, опубликовали результаты своего совместного расследования внесудебной казни 27 жителей Чечни местными властями в январе 2017 года.По этим обвинениям не было проведено эффективных расследований.

В марте возобновились массовые акции протеста против демаркации границы между Ингушетией и Чечней. Акция протеста была санкционирована 26 марта, но на следующий день протестующие были принудительно разогнаны. Некоторые оказали физическое сопротивление полиции. Тридцать три человека, включая лидеров протеста, были арестованы по обвинению в насилии в отношении полиции. В июле полиция арестовала бывшего редактора интернет-СМИ Fortanga, который писал о протестах, по обвинению в хранении наркотиков.Журналист утверждал, что сотрудники службы безопасности подбрасывали ему наркотики и пытали его, чтобы добиться признания.

В июне власти Дагестана арестовали Абдулмумина Гаджиева по ложному обвинению в терроризме в явном отместку за его журналистскую деятельность в независимой газете Черновик . В случае признания виновным Гаджиеву грозит до 20 лет лишения свободы.

Сексуальная ориентация и гендерная идентичность

В декабре 2018 и январе 2019 года милиция Чечни провела новую серию незаконных задержаний, избиений и унижений мужчин, которых они считали геями или бисексуалами.Никто не был привлечен к ответственности ни за это, ни за чистку против геев в Чечне в 2017 году. По оценкам общественной организации «Российская ЛГБТ-сеть», задержали 20 человек. Считалось, что все были освобождены. В мае 2019 года неизвестные ворвались в квартиру волонтера Российской ЛГБТ-сети в Санкт-Петербурге и угрожали ей и координатору программы по чрезвычайным ситуациям.

В июне российская однополая пара с двумя приемными детьми была вынуждена бежать из страны после преследования властей.Российский закон запрещает усыновление для однополых пар. Власти предъявили обвинение работникам, закрепленным за семьей, в ненадлежащем исполнении служебных обязанностей как уголовное преступление.

В ноябре власти возбудили уголовное дело по факту предполагаемого сексуального нападения на детей из-за видео на YouTube, где дети разговаривают с геем о его жизни.

Гендерное насилие

Насилие в семье оставалось повсеместным, но о нем не сообщалось, а услуги для выживших были недостаточными. В июле омбудсмен России публично подтвердила свою поддержку закона о домашнем насилии.В октябре парламент провел первые предварительные обсуждения законопроекта.

В июле Европейский суд по правам человека (ЕСПЧ) вынес первое постановление по делу о домашнем насилии в России. Суд обязал власти выплатить заявителю 20 000 евро в качестве компенсации за ущерб и признал «нежелание российских властей признать» серьезность домашнего насилия.

Расовая дискриминация и права меньшинств

Полиция продолжала расовое профилирование людей неславянской внешности, часто подвергая их произвольным задержаниям и вымогательствам.

Национальные переписи населения показали продолжающееся сокращение, в некоторых случаях резкое, числа носителей языков меньшинств. Эксперты Совета Европы (СЕ) по национальным меньшинствам обнаружили, что политика продолжает усиливать доминирование русского языка без эффективной поддержки языков меньшинств.

В ноябре власти приказали закрыть Центр помощи коренным народам Севера под бюрократическим предлогом.

Россия и Украина (см. Также главу, посвященную Украине)

Российское правительство продолжало оказывать политическую и материальную поддержку вооруженным группам на востоке Украины, но не приняло мер по пресечению их злоупотреблений, включая произвольные задержания и жестокое обращение с задержанными.Де-факто власти Крыма продолжали преследовать крымских татар. С 2015 года российские власти привлекли к ответственности не менее 63 крымских татар по сфабрикованным обвинениям в терроризме и приговорили к 17 годам лишения свободы.

В сентябре в рамках обмена пленными с Украиной Россия освободила 35 человек, в том числе крымского режиссера Олега Сенцова, отбывавшего 20 лет по ложному обвинению в терроризме.

Россия и Сирия (см. Также главу о Сирии)

Россия продолжала играть ключевую военную роль вместе с сирийским правительством в наступлении на контролируемые правительством районы, участвуя в неизбирательных атаках на школы, больницы и объекты гражданской инфраструктуры.

Начиная с апреля, сирийско-российское наступление с целью восстановления контроля над провинцией Идлиб, которое включало использование запрещенного в международном масштабе оружия, привело к гибели более тысячи мирных жителей и перемещению более 600 тысяч человек. Россия остается крупнейшим поставщиком оружия сирийскому правительству.

Россия продолжала использовать свою дипломатическую власть в Совете Безопасности ООН и других местах, чтобы заблокировать ответственность за сирийские преступления. Российские официальные лица призвали страны начать усилия по восстановлению, чтобы облегчить возвращение беженцев, но не смогли устранить основные препятствия для возвращения.

19 сентября Россия наложила 13-е вето на Сирию с начала конфликта, чтобы заблокировать резолюцию Совета Безопасности, требующую перемирия на северо-западе страны, поскольку она не включала исключение для военных наступлений против групп, которые, по мнению России и правительства Дамаска, быть террористическими организациями.

Ключевые международные участники

В январе и феврале комиссар Совета Европы по правам человека и дипломатической службе ЕС (EEAS) призвал российские власти расследовать преследование ЛГБТ в Чечне.

В июне Парламентская ассамблея СЕ (ПАСЕ) утвердила полномочия российской делегации, которая полностью возобновила свою работу в ПАСЕ после потери права голоса в 2014 году из-за оккупации Крыма. В свою очередь, ПАСЕ призвала Россию сотрудничать с расследованием крушения рейса Mh27 Malaysia Airlines в Украине и положить конец нарушениям прав ЛГБТ.

В июле ЕСПЧ установил, что России пришлось выплатить 42 500 евро в качестве компенсации за ущерб трем правозащитным группам ЛГБТ за отказ в их регистрации.

В августе ЕСПЧ вынес решение против России в связи со смертью Сергея Магнитского в 2009 году в следственном изоляторе, установив, среди прочего, что Россия нарушила его право на жизнь.

В июле Европейский парламент принял резолюцию по России, осуждающую преследования экологических активистов и положение украинских политзаключенных. ЕСВД раскритиковал Россию за задержание протестующих в Москве, задержание граждан Украины и злоупотребления в отношении крымских татар.

На мартовской сессии Совета ООН по правам человека Великобритания выступила с совместным заявлением от имени более чем 30 стран, осуждая «возобновление преследований ЛГБТИ в Чечне».

На пресс-конференции с Путиным перед августовской встречей президент Франции Эммануэль Макрон заявил, что применение силы полицией во время протестов в Москве не соответствует международным стандартам.