Рис. 3. Неправильное установление 
Рис. 4. Правильное установление Основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к вирусу с помощью иммуноферментного анализа. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% - через 6 месяцев от момента заражения и у 0,5-1% - в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител - 2 недели от момента заражения. В терминальной фазе СПИД количество антител может значительно снижаться, вплоть до полного их исчезновения. Серологическая диагностика инфекции ВИЧ на первом этапе строится на выявлении суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На втором этапе методом иммунного блотинга (Western blot) проводится определение антител к отдельным белкам вируса.
Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь. Полученный материал не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при +4-8 С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. Лучше всего сразу после взятия крови отобрать из нее сыворотку. Сыворотка отделяется центрифугированием или обводкой крови по стенке пробирки пастеровской пипеткой, либо стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может хранится до 7 дней при температуре +4-8 С.
При работе следует соблюдать правила техники безопасности, приведенные в "Инструкции по противоэпидемическому режиму в лабораториях диагностики СПИД" N 42-28/38-90 от 5 июля 1990 года.
Для проведения лабораторных исследований с помощью ферментных методов необходимо иметь следующее оборудование:
1. спектрофотометр;
2. отмыватель планшетов;
3. термостат;
4. автоматические пипетки;
5. наконечники к автоматическим пипеткам;
6. центрифуги;
7. холодильники;
8. тест-системы.
В настоящее время в России рекомендовано к применению достаточное количество тест-систем для выявления антител ВИЧ. Все они основаны на общем принципе иммуноферментного анализа.
Нагрузка на бригаду ИФА-диагностики должна оставлять до 400 исследований в смену, при условии оснащения современным автоматическим оборудованием и до 180-200 исследований, оснащенных отечественным рутинным оборудованием.
Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фасфотаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем - полистироловый планшет с лунками или полистироловые шарики, на поверхности которых сорбирован антиген: вирусный лизат, рекомбинантные белки или синтетические антигенные детерминанты. Из всех модификаций твердофазного ИФА для диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, наиболее широко применяются непрямой и конкурентный варианты.
Предварительно приготовленный согласно инструкции, прилагаемой к набору, исследуемый материал (сыворотка, плазма) вносится в лунку планшета. Если этого требует методика, планшет предварительно отмывается. Несколько лунок планшета заполняются контрольными сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к ВИЧ. При работе с контрольными сыворотками необходимо строго соблюдать инструкции по применению диагностической тест-системы, т.к. интерпретация результатов зависит от значений оптической плотности контрольных сывороток. Планшет с внесенными контрольными сыворотками и исследуемым материалом инкубируется при условиях, указанных в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они образуют комплекс с антигеном, сортированным на поверхности лунок планшета. Несвязавшиеся с антигеном антитела удаляются при отмывке планшета.
Затем во все лунки планшета вносят конъюгат-антитела против иммуноглобулинов человека, меченые ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). При последующей инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-конъюгат. Несвязавшийся конъюгат удаляется во время отмывки планшета. Наиболее широко применяемым индикаторным ферментом для ИФА является пероксидаза хрена. Субстратом для нее является перекись водорода.
Эта реакция протекает без видимых проявлений. Изменение окраски раствора происходит при окислении красителей (ортофенилендиамина или др.), который входит в состав субстратного раствора.
Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом, происходит окрашивание только тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген-антитело-конъюгат. Иногда окрашивание может быть результатом неспецифического связывания иммуноглобулинов с антигенами ВИЧ. Учет реакции проводят на спектрофотометре (ридере) при длине волны, указанной в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Длина волны зависит от красителя, используемого в тест-системе.
studfiles.net
Корректное проведения иммуноферментного анализа достигается при обязательном выполнении следующих требований:
Рис.1. Отдельные емкости для разных реагентов Посуду необходимо мыть, используя жидкие средства для мытья, не содержащие биодобавок. После мытья тщательно ополаскивать посуду проточной, а затем дистиллированной водой. Необходимо обязательно выделять разные емкости для работы с растворами конъюгатов и проявителей (рис. 1). Для манипуляций с растворами конъюгатов и проявителей необходимо использовать одноразовые наконечники.
Перед исследованием в ИФА сыворотку можно хранить в течение 72 часов в холодильнике при 2-8°C. Если нет возможности исследовать сыворотки или плазмы в течение указанного времени, их необходимо заморозить при температуре 20°C или ниже.
Образцы сывороток должны быть прозрачными, без признаков гемолиза, выраженной гиперлипидемии и бактериемии.
Для получения корректного результата при исследовании сывороток в динамике заболевания необходимо создать банк сывороток первичного забора, замораживая их при-20 °C или ниже.
Рис. 2. Заполнение протокола исследования При постановке анализа температура в помещении лаборатории должна составлять 18-25 °С.
Не допускается наличие в лаборатории паров любых окислителей (открытых емкостей с растворами пероксида водорода, гипохлорита и др.) и хлорсодержащих растворов.
В процессе проведения ИФА необходимо использовать качественную дистиллированную воду, которая хранится не дольше двух суток.
Недопустимо повторное использование планшетов тест-систем для любой другой работы.
Качественная работа диагностических наборов гарантирована только в пределах указанного срока годности при соблюдении указанных условий хранения тест-наборов.
Необходимо ограничить попадание прямых солнечных лучей на лунки планшета.
Перед началом проведения анализа необходимо заполнить протокол исследования (рис. 2)
Если при внесении исследуемого образца произошла ошибка, например, две сыворотки внесли в одну лунку, такую лунку забраковывают. При этом в схеме внесения образцов необходимо сделать пометку, какая именно лунка содержит брак. Время заполнения всех необходимых лунок не должно превышать 15-20 мин.
Инкубацию планшета на всех этапах ИФА проводят при температуре, указанной в инструкции, при этом комнатной считается температура 18-25°С.
Не инкубируйте планшеты в термостате, устанавливая их один на один, так как неравномерный прогрев планшета в этом случае приведет к появлению краевого эффекта - повышенного фона по периметру планшета (рис. 3, 4).
| Рис. 3. Неправильное установление | Рис. 4. Правильное установление |
Рис. 5. Правильное и неправильное положение пипетки Погрузите наконечник на 2-3 мм в биологическую жидкость и нажмите на операционную кнопку до первого упора. Не вынимая наконечник из жидкости, осторожно отпустите кнопку в исходное положение. Погрузите наконечник на 2-3 мм в раствор, в который необходимо перенести набранную жидкость, нажмите кнопку до первого упора. Не меняя положения пипетки, плавно отпустите кнопку в исходное положение. Таким образом наконечник заполнится для перемешивания. Повторите эту процедуру 2-3 раза. Нажмите операционную кнопку до второго упора для полного освобождения от жидкости. Выньте наконечник из раствора и отпустите операционную кнопку в исходное положение. Снимите наконечник с пипетки с помощью механизма для снятия наконечников. Замените наконечник и продолжайте работу с последующим образцом биологической жидкости.
Для лучшего контроля за внесением компонентов планшет желательно ставить на белый фон.
При работе с восьмиканального пипеткой следует обращать внимание на равномерность заполнения жидкостью всех наконечников пипетки (рис. 6).
Контрольные и опытные образцы вносить необходимо осторожно, пипетируя смесь в лунках, при этом наконечник не должен касаться дна лунки.
Качественное промывание планшета - один из выдающихся факторов при проведении иммуноферментного анализа.
Режим промывки должен строго соответствовать требованиям инструкции. Необходимо следить за равномерным заполнением всех лунок планшета, а также обращать внимание, чтобы не было перетекания промывочного раствора из одной лунки в другую.
Время экспозиции планшета с промывочным раствором на каждом этапе промывки должно составлять не менее 30 секунд, если нет дополнительных требований в инструкции.
Для предупреждения загрязнения промывателя (вошера) необходимо ежедневно промывать его дистиллированной водой, а еженедельно - 30% раствором этилового спирта.
Самая частая причина ошибок - загрязнение каналов промывателя или пространства между иголками кусочками марли, ваты или кристаллами солей.
Раствор проявителя непосредственно перед использованием должен быть прозрачным и бесцветным. Остатки раствора в ванночке рекомендуют не выливать до окончания инкубации планшета с проявителем. Проявитель, оставшийся в ванночке, не должен изменять цвет в течение 30 мин; появление окраски раствора проявителя свидетельствует о его загрязнении.
Очень важным фактором, который влияет на проведение ИФА и позволяет получать корректные результаты, является точность работы оборудования - автоматических пипеток, термостатов и спектрофотометров.
ramintek.com
Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii обеспечивает выявление в сыворотке крови человека антител класса IgG к антигенам Coxiella burnetii - возбудителю Ку-лихорадки.
Выявление антител осуществляется посредством их взаимодействия с сорбированными на полистироловых планшетах антигенами Coxiella burnetii. Визуализацию комплексов антиген-антитело производят с помощью конъюгата, представляющего собой поликлональные IgG(H+L)-антитела, меченные пероксидазой хрена.
Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii предназначена для серологической текущей и ретроспективной диагностики Ку-лихорадки.
Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15 - 25) °С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток, работать в резиновых перчатках. Все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина).
Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в стерильных условиях, исключающих возможность бактериального пророста. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащих осадок и агрегаты, путём центрифугирования. Не использовать сыворотки с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериемией. Для выявления антител к антигенам коксиелл Бернета возможно использование сыворотки крови людей как свежей, так и хранившейся при 2 - 10 °С не более 48 часов после забора крови, либо замороженной и хранившейся (исключить промежуточное оттаивание) при минус 20 °С не более 6 месяцев. Для приготовления реагентов и проведения ИФА следует использовать чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5 %. Для каждого реагента и пробы использовать отдельные чистые наконечники для пипеток.
При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с К+ должно приобрести желто-коричневую окраску.
Результаты эксперимента регистрируются, если: - значение ОП контрольной отрицательной сыворотки - ОПсрК- ≤ 0,2; - среднее значение контрольной положительной сыворотки ОПсрК+ ≥ 0,80.
Интерпретацию результатов для каждой анализируемой сыворотки следует проводить, используя
таблицу.
Таблица интерпретации результатов ИФА
Положительный результат ИФА, то есть выявление антител к C. burnetii, может свидетельствовать как о текущем заболевании Ку-лихорадкой, так и об инфицированности (или иммунизации) C. burnetii в прошлом.
Для постановки окончательного диагноза Ку-лихорадки необходим комплекс серологических, клинических и эпидемиологических данных.
Тест-систему иммуноферментную для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли.
Главная :: Каталог "Иммуноферментные тест-системы" :: Список инструкций
www.dntpasteur.ru
Возбудителем ньюкаслской болезни является РНК-содержащий парамиксовирус птиц типа 1 (APMV-1), относящийся к семейству Paramyxoviridae. Ра зличные штаммы вируса ньюкаслской болезни могут вызывать у птиц заболевания разной степени тяжести, вплоть до 100% смертности.
В настоящее время для выявления антител к вирусу НБ в крови домашних и диких птиц широко используют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). Наряду с РТГА также используют различные варианты иммуноферментного анализа. Достоинствами этого метода являются экспрессность, возможность стандартизации условий постановки реакции. Коммерческие иммуноферментные наборы для выявления антител к вирусу НБ, в основном, основаны на непрямом варианте ИФА и предназначены для исследования сывороток крови кур и индеек. Конкурентный вариант ИФА позволяет исследовать сыворотки крови на наличие антител к определённому антигену вне зависимости от видовой принадлежности птицы и вследствие этого может применяться для мониторинговых исследований.
Цель и задачи. Целью данных исследований было разработать тест-систему на основе конкурентного варианта ИФА (К-ИФА) для выявления специфических к вирусу ньюкаслской болезни антител в сыворотках крови различных видов домашней, дикой и синантропной птицы.
Материалы и методы. Антиген вируса НБ. В качестве антигена для сенсибилизации планшетов использовали инактивированный и концентрированный ультрацентрифугированием вирус НБ штамм «Ла Сота», полученный культивированием в 9-11 суточных эмбрионах СПФ-кур.
Постановка К-ИФА. 0,5-1,0 мкг/мл на лунку вирусного антигена в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) вносили в лунки 96-луночного пластикового планшета (Nunc, Immunoplate, Дания), инкубировали в течение ночи при 4°С, блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в трис-HCl буферном растворе с 0.1% твин-20 (ТБР-Т) рН 7,4 в течение 1 ч при комнатной температуре и затем отмывали трёхкратно ТБР-Т. Исследуемые и контрольные сыворотки разводили в ТБР-Т, вносили в лунки планшета с антигеном, затем вносили конкурентные антитела (коммерческий препарат моноклональных антител к штамму Ла Сота вируса НБ) в рабочем разведении (всё в объёме 50 мкл на лунку) и инкубировали 30 минут при 37°С. Связавшиеся антитела определяли добавлением иммунопе- роксидазных препаратов антимышиных антител (ГУНИИЭМ им. НФ. Гамалеи (Москва)) в рабочем разведении и планшеты инкубировали при 37°С 30 минут. После удаления несвязавшегося конъюгата добавляли субстратно-индикаторную смесь АБТС. Реакцию останавливали добавлением 1% додецилсульфата натрия и измеряли значение оптической плотности при 405 нм на спектрофотометре-ридере. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводили в значение процента ингибиции (ПИ) по формуле:
ОП иссл.пробы с МАт ОП КОНТрОЛЯ фона
PI = (1 ---------------------------------------------------------------------------- ) х 100,
ОП контроля МАт ОП КОНТрОЛЯ ф0на
РТГА. Проводили по общепринятой методике.
Результаты. В результате проведённых исследований были оптимизированы условия постановки реакции К-ИФА. В качестве рабочего разведения испытуемых и контрольных сывороток крови птиц выбрано разведение 1:2; рабочее разведение конкурентных антител и антивидового конъюгата, определённое в прямом варианте ИФА по блок-схеме, составило 1:1000, рабочее разведение антигена вируса НБ, определённое в непрямом варианте ИФА-1:500.
Для объективной оценки иммунного ответа был установлен позитивно — негативный порог. Для этого 570 сывороток крови от невак- цинированной домашней и дикой птицы, показавших отрицательный результат при исследовании в РТГА на наличие антител к вирусу НБ, тестировали в К-ИФА. В качестве положительного и отрицательного контроля были взяты стандартные контрольные сыворотки. ПНП определяли путем расчета среднего значения PI и стандартного отклонения. Результат реакции считали отрицательным - при значении PI равном 40% и ниже; сомнительным — при PI — от 41 до 50% и положительным при значении PI — 51% и выше.
Специфичность антигена ВНЕ проверяли в К-ИФА с набором гетерологичных сывороток, в качестве которых использовали референтные сыворотки крови кур к вирусам инфекционных болезней и микоплазмам птиц. Было показано, что активность антигена вируса НБ с гетерологичными сыворотками не превышала фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой).
С помощью К-ИФА было исследовано 264 сыворотки крови птиц разных видов. Все исследуемые сыворотки крови птиц параллельно тестировали в РТГА. Результаты исследования представлены в таблице.
|
Таблица 1. Результаты исследования сывороток крови домашней, дикой и синантропной птицы на наличие антител к вирусу НБ в К-ИФА и РТГА
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Результаты тестирования сывороток крови птиц с различным иммунным статусом в К-ИФА согласовывались с данными РТГА, при этом К-ИФА показал более высокую чувствительность, чем РТГА при исследовании сывороток крови дикой птицы.
Выводы. В результате проведённых исследований была разработана тест-система на основе К-ИФА для выявления антител к вирусу НБ в сыворотках крови птиц при тестировании в одном разведении. Показана возможность использования К-ИФА для исследования сывороток крови разных видов птиц, что является актуальным при проведении мониторинговых исследований по ньюкаслской болезни на территории РФ.
www.nukleom.ru
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике вирусных заболеваний крупного рогатого скота. Предложена тест-система иммуноферментного анализа, позволяющая определить антитела к вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекциям крупного рогатого скота. Серологическое обследование животных позволяет определиить зоны распространения инфекции и оценить поствакцинальный иммунитет. Использование заявляемой тест-системы ИФА позволит проводить эпизоотологический мониторинг одновременно пяти важных инфекций крупного рогатого скота, ретроспективную диагностику респираторных инфекций, оценку напряженности иммунитета у животных в результате применения вакцин, определение уровня колостральных антител у молодняка в первые недели (дни) жизни, оценку качества терапевтических препаратов. 10 табл.
Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано как для широкомасштабных, так и для выборочных исследований сывороток крови, молока, молозива животных на наличие специфических антител к возбудителям вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота.
Тест-система ИФА содержит 96-луночные микропланшеты, сенсибилизированные аффинно-очищенными антигенами вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респиратоно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекциями крупного рогатого скота, антиИРТ (положительную), антиВД-БС (положительную), антиПГ-3 (положительную), антиРС (положительную), антиАВИ (положительную) и нормальные (отрицательные) нативные контрольные сыворотки, конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент, 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент. Тест-система повышает чувствительность иммунологической реакции и сокращает время для проведения диагностики и иммуномониторинга респираторных вирусных заболеваний.
Развитие промышленного животноводства, требующее создания производственных комплексов, обострило проблему респираторной патологии крупного рогатого скота (КРС) в хозяйствах РФ. По данным Халенева Г.А. (1975), Гуненкова В.В (1975), Сюрина В.Н. (1976), Соколова М.Н. (1978), Глотова А.Г. (1998), Мищенко В.А. (1991) и др., ведущую роль в респираторной патологии крупного рогатого скота играют вирусы парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекций.
Учитывая сходные эпизоотологические данные, клинические и патологоанатомические признаки заболеваний, вызываемых данной группой возбудителей, особую роль в диагностике занимают лабораторные исследования, которые включают обнаружение антигенов из патологического материала в реакции иммунофлуоресценции (РИФ), иммуноферментном анализе (ИФА), реакции диффузионной преципитации (РДП), выделение возбудителя из патологического материала в культурах клеток перевиваемых линий почки эмбриона коровы Taurus-1 (T-1), эпителия коронарных сосудов теленка (КСТ), легкого эмбриона коровы (ЛЭК), почки теленка (Пт-80), в первичных культурах клеток тестикул бычка (ТБ), почки эмбриона коровы (ПЭК), идентификацию выделенных изолятов в реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции иммунофлуоресценции (РИФ), в реакции нейтрализации (РН), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции торможения гемадсорбции (РТГАд), обнаружение антител в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции связывания комплемента (РСК).
Решающим условием организации необходимых мер борьбы с респираторными болезнями КРС является установление роли инфекционных агентов в этой патологии.
В ветеринарной практике широко применяется в целях диагностики метод иммуноферментного анализа (ИФА). Этот метод позволяет по наличию динамики антител к инфекционному агенту судить о протекании инфекционного процесса в организме животного.
Известен способ дифференциальной диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (RU 2306567 С2). Указанный способ позволяет определять антигены трех вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота и не позволяет определять антитела.
Вирус ИРТ вызывает заболевание КРС различных возрастных групп, проявляющееся поражением верхних дыхательных путей (у телят возможна пневмония), вагинитами, энцефалитами, конъюнктивитами и артритами. ИРТ - остропротекающая контагиозная болезнь КРС, наносящая значительный экономический ущерб, который складывается из снижения удоя в период болезни, увеличения сервис-периода и яловости коров, слабого развития молодняка и значительным процентом гибели и выбраковки телят.
Вирус диареи-болезни слизистых (ВД-БС) вызывает пневмоэнтериты у телят, аборты у коров в первой половине беременности, а заражение коров в более поздние сроки приводит к рождению телят с врожденными уродствами, слаборазвитых, толерантных, впоследствии превращающихся в постоянный источник инфекции в стаде.
Вирус парагриппа-3 (ПГ-3) вызывает у КРС респираторное заболевание, но наиболее характерной является латентная форма инфекции. ПГ-3 часто осложняет течение других болезней.
Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота - контагиозная болезнь, клинически проявляющаяся повышением температуры, снижением аппетита, затрудненным дыханием, одышкой, истечениями из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем.
Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота не вызывает большого отхода животных, но тяжелое и длительное течение с осложнениями приводит к потере продуктивности, вынужденному убою. Однако в отличие от других вирусных респираторных инфекций распространение и наносимый экономический ущерб этим заболеванием остаются изученными недостаточно, что связано, прежде всего, со сложностью выделения и культивирования PC-вируса. Это в свою очередь затрудняет получение в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью вирусного сырья для диагностических препаратов и средств специфической профилактики.
Аденовирусную инфекцию (АВИ) диагностируют преимущественно у молодняка КРС, она характеризуется острым течением, поражением органов дыхания, пищеварения, конъюнктивитом. У взрослых животных инфекция протекает бессимптомно. Установлено, что аденовирусы являются иммунодепрессантами и способствуют развитию вторичной инфекции. Клинико-эпизоотологическая диагностика АВИ КРС затруднена из-за сходства с другими заболеваниями, поэтому главная роль отводится лабораторной диагностике. Она основана на выделении аденовирусов из патологического материала в первичных культурах клеток тестикул бычка (ТБ), почки эмбриона коровы (ПЭК), легких эмбриона коровы (ЛЭК), идентификации выделенных изолятов в реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции иммунофлуоресценции (РИФ), реакции связывания комплемента (РСК), электронной микроскопии, ретроспективной диагностике, исследовании парных проб сыворотки крови в серологических реакциях непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного анализа (ИФА), реакции нейтрализации (РН). Однако методика получения первичных культур клеток трудоемкая. В связи с этим подбор универсальной перевиваемой культуры клеток является актуальной задачей.
РНГА используется для диагностики аденовирусной инфекции в России на протяжении более чем 15 лет. Единственным и существенным недостатком РНГА является то, что в качестве носителя для антигенов используются эритроциты барана. При этом длительность хранения таких препаратов не превышает шести месяцев.
Указанные инфекции возникают у КРС в виде моноинфекций, смешанных вирусных и вирусно-бактериальных.
Сущность иммуноферментной реакции заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного пероксидазой хрена, способном вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.
Для исследования в лабораторию направляют свежие сыворотки крови от больных и переболевших животных, взятые в начале заболевания и через 7 дней, которые хранят при температуре минус 20°С и исследуют одномоментно. Специальной обработки сывороток перед исследованием не требуется. Сыворотки, гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой, для постановки ИФА не пригодны.
Из молока и молозива предварительно выделяют глобулиновую часть, содержащую антитела основных классов А, М и G, путем добавления 2% пепсина при 37°С для створаживания и отделения казеина, через 6-8 часов фильтруют с помощью ватно-марлевого фильтра и сепарируют для удаления жира и остатков казеина на сепараторе типа ОСБ. Устанавливают рН 7,2-7,4 и приливают постепенно по каплям равный объем 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой (ММ) 6000 Да для концентрирования молочных иммуноглобулинов. Надосадок декантируют, осадок ресуспендируют в буфере 0,01 М калийфосфатном, содержащем 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2-7,4, и осаждают полиэтиленгликолем повторно дважды. Осадок третьего осаждения растворяют в половинном объеме данного буфера и диализуют 24 часа против этого же буфера для удаления ПЭГ и эуглобулинов. Центрифугируют 15 мин при 7-8 тыс. оборотов. Осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость используют для проведения ИФА.
В состав заявляемой тест-системы входят следующие биологические и химические компоненты:
1. 96-луночные микропланшеты, сенсибилизированные аффинно-очищенными антигенами вирусов ИРТ штамма ТК-А (ВИЭВ)В2, ПГ-3 штамма ЗКСМ, ВД-БС штамма «Oregon С 24V», PC штамма «Randall» и АВИ штамма «В 10» в количестве 0,075-0,125 мкг на лунку 10 шт.
2. АнтиИРТ (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки № 1) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см3, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.
3. АнтиВД-БС (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки № 2) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см3, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.
4. АнтиПГ-3 (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки № 3) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см3, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.
5. АнтиАВИ (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки № 4) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см3, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.
6. АнтиРС (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки № 5) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см3, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.
7. Нормальная (отрицательная) контрольная сыворотка (лунки А1, В1 всех пяти плашек) 5 амп. (фл.), объем 0,005 см3, рабочее разведение 1:200.
8. Антивидовой иммунопероксидазный (анти-IgG КРС) коньюгат 1 амп. (1 фл.) объемом 1 см3, 5 амп. (флаконов). Активность коньюгатов указана на этикетках ампул (флаконов).
Химические компоненты:
9. 20-кратный концентрат инкубационного буфера (0,2 М калийфосфатный буфер, содержащий 3 М натрия хлористого, рН 7,3), объем 1 фл. 50 см3, 5фл.
10. 10-кратный концентрат субстратного буфера (1,5 М фосфатно-цитратный буферный раствор, рН 5,0), 5 фл. Объем 5 см3.
11. Твин-20, -40, -80 или Тритон Х-305, 5 фл. 1 см3.
12. Ортофенилендиамин (ОФД) 5фл., 20 мг.
13. Гидроперит (Н2O2) 5 табл., 0,5 г.
14. Стоп-реагент - 1 М раствор серной кислоты, 5 фл., объем 10 см 3. Срок годности препаратов при хранении в холодильнике (температура 2-8°С) 1 год.
1. Приготовление рабочих растворов
1.1. Инкубационный фосфатно-солевой твиновый буферный раствор предназначен для разведения контрольных исследуемых сывороток и антивидового конъюгата, а также для промывки панелей. Содержимое флакона с 20-кратным калийфосфатным буфером доводят дистиллированной водой до 1000 см3 и растворяют в этом объеме 1 см3 Твина-20, -40, -80 или Тритона Х-305. Инкубационный буфер представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4. Срок хранения 7 дней при температуре от 2 до 8°С.
1.2. Для приготовления субстратного цитратно-фосфатного буферного раствора рН 5,0-5,2 растворяют содержимое флаконов № 10 с 10-кратным цитратно-фосфатным буфером до 50 см 3 дистиллированной водой.
Раствор субстрата готовят не ранее чем за 10 мин до внесения в лунки панелей. Для этого 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 2 см3 спирта-ректификата, добавляют 48 см3 субстратного буфера и вносят 0,8 см3 раствора перекиси водорода, полученного растворением гидроперита в 10 см3 дистиллированной воды. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет. Субстратный буфер хранению не подлежит.
2. Приготовление антигена вируса ИРТ
Известен способ получения антигена вируса ИРТ для реакции ИФА (Технические условия 19.10.97-89 «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 01.08.89), включающий репродукцию вируса ИРТ в культуре клеток ПТ-80, концентрирование вируссодержащей суспензии ультрафильтрацией, высокоскоростным ультрацентрифугированием, дезинтеграцию клеток ПТ-80 ультразвуком и осветление суспензии низкоскоростным центрифугированием.
Однако известный способ трудоемок и позволяет получить антиген, сильно загрязненный клеточными обломками, что сказывается на чувствительности реакции. Известны также способы получения антигена ИРТ для использования в ИФА в патентах RU 2196609, RU 2196336.
В заявляемом методе антиген вируса ИРТ готовится следующим способом. Монослой перевиваемой линии клеток МДВК после репродукции вируса ИРТ штамма ТК-А (ВИЭВ)В2 с активностью 7,5-8,5 lg ТЦД50/см3 осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М калийфосфатном буфере, содержащем 0,15 М натрия хлористого, 0,1% Тритона X-100, рН 7,2-7,4. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком на аппарате типа УЗДН-21 мощностью 22 кГц импульсивно 6 раз по 30 секунд. После дезинтеграт центрифугируют при 5 тыс. об./мин в течение 25-30 мин. Образовавшийся осадок отбрасывают, а супернатант разводят в 10 объемах калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2-7,4. Полученную антигенсодержащую суспензию наносят на колонку с иммуносорбентом (BrCN агароза с иммобилизованными в качестве лиганда специфическими антителами к антигенам вируса ИРТ). После часовой инкубации в режиме реактора колонку промывают 10 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, 0,1% Тритона Х-100, рН - 7,2-7,4, и 5 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2-7,4. После промывки колонки антигены элюируют 0,1 М глициновым буфером, рН 2,2. Полученный таким образом антиген вируса ИРТ является комплексом гликопротеинов с молекулярной массой от 54 до 180 килодальтон.
В заявляемом методе получения антигена ИРТ мы изменили культуру клеток при репродукции вируса на МДВК и ввели более щадящий элюирующий буфер с другим значением рН - 0,1 М глициновый буфер, рН 2,2, что позволило получать более активный в ИФА антиген.
Оптимальную концентрацию антигена вируса ИРТ для сенсибилизации микропанелей исследовали шахматным титрованием его с положительной антиИРТ сывороткой в ИФА (таблица 6).
Пример 1. Антиген ИРТ в концентрации 0,75 мкг/см3 калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см3 в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Затем в лунки микропланшета добавляют по 0,1 см3 положительной контрольной сыворотки в разведениях от 1:200 до 1:3200 в инкубационном буфере. После часовой инкубации при 37°С и пятикратной промывки инкубационным буфером в каждую лунку добавляют по 0,1 см3 рабочего разведения антивидового иммунопероксидазного конъюгата и инкубируют в течение часа при 37°С. Затем микропланшеты пятикратно отмывают инкубационным буфером и проявляют реакцию субстратным буфером. Реакцию учитывают через 30 мин спектрофотометрически при длине волны 492 нм (ОП 492). Результаты выражают в оптических единицах (о.е.).
Пример 2. Антиген ИРТ в концентрации 1,0 мкг/см3 калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см3 в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.
Пример 3. Антиген ИРТ в концентрации 1,25 мкг/см3 калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см3 в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.
Пример 4. Антиген ИРТ в концентрации 0,50 мкг/см3 калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см3 в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.
Пример 5. Антиген ИРТ в концентрации 1,50 мкг/см3 калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см3 в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.
По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация аффинно-очищенного антигена вируса ИРТ - 1 мкг/см3 адсорбционного буфера при разведении антиИРТ сыворотки
1:200 в инкубационном буфере.
3. Приготовление антигена респираторно-синцитиального вируса
PC-вирус, штамм «Randall», с титром инфекционности 3,5-3,9 lg ТЦД 50/мл, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки теленка ПТ-80 или перевиваемой линии ВНК-21.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование PC-вируса проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.
В работе по очистке PC-вируса от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные PC-вирусом клетки ПТ-80.
Белки PC-вируса штамма «Randall» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав PC-вируса КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к PC-инфекции животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки PC-вируса, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.
Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиРСВ антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиРСВ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиРСВ IgG пришивали к активированной BrCN Сефарозе 4В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.
После заполнения колонки анти-РСВ IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1 М глицин-НСl и забуференным физиологическим раствором (ЗФР), затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.
Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.
Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины PC-вируса практически без примесей.
Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиРСВ сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.
Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов PC-вируса из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены PC-вируса.
Пример 6. По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация аффинно-очищенного антигена РС-вируса - 0,75 мкг/см3 адсорбционного буфера при разведении антиРС сыворотки 1:200 в инкубационном буфере и показана высокая чувствительность заявляемой тест-системы (Таблица 7).
4. Приготовление антигена вируса аденовирусной инфекции (АВИ)
Вирус АВИ, штамм «Bovine 10» (серотип 1), с титром инфекционности 4,0-4,5 lg ТЦД 50/мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка Т-1.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование вируса АВИ проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифутированием.
В работе по очистке вируса АВИ от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом АВИ клетки Т-1.
Белки вируса АВИ штамма «Bovine 10» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав вируса АВИ КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к АВИ животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки вируса АВИ, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.
Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиАВИ антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиАВИ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиАВИ IgG пришивали к активированной BrCN Сефарозе 4В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.
После заполнения колонки антиАВИ IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.
Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.
Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины вируса АВИ практически без примесей.
Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиАВИ сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.
Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса АВИ из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены вируса АВИ.
5. Приготовление антигена вируса парагриппа-3
Вирус парагриппа-3 штамма «ЗКСМ» с титром инфекционности 6,0-7,0 lg ТЦД 50/мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка ПТ-80.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование вируса ПГ-3 проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.
В работе по очистке вируса ПГ-3 от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом ПГ-3 клетки ПТ-80.
Белки вируса ПГ-3 штамма «Randall» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав вируса ПГ-3 КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к ПГ-3 животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки вируса ПГ-3, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.
Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиПГ-3 антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиПГ-3 IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиПГ-3 IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4 В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.
После заполнения колонки антиПГ-3 IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1 М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.
Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.
Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины вируса ПГ-3 практически без примесей.
Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиПГ-3 сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.
Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса ПГ-3 из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены вируса ПГ-3.
6. Приготовление антигена вируса вирусной диареи-болезни слизистой
Вирус ВД-БС, штамм «Oregon C24 V», с титром инфекционности 5,5-6,5 lg ТЦД 50 /мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток МДВК.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование вируса ВД-БС проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.
В работе по очистке вируса ВД-БС от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом ВД-БС клетки МДВК.
Белки вируса ВД-БС штамма «Oregon C24 V» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав вируса ВД-БС КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к ВД-БС животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки вируса ВД-БС, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.
Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиВД-БС антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиРСВ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиРСВ IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.
После заполнения колонки антиВД-БС IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1 М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.
Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.
Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины вируса ВД-БС практически без примесей.
Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиВД-БС сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.
Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса ВД-БС из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены вируса ВД-БС.
Пример 7. Аналогично примерам 1-6 в п.2 устанавливали оптимальные рабочие концентрации аффинно-очищенных антигенов вирусов ПГ-3, ВД-БС и АВИ - 1,0, 1,5 и 1,25 мкг/см 3 адсорбционного буфера при разведении антиПГ-3 сыворотки 1:200, антиВД-БС сыворотки 1:200 и антиАВИ 1:200 в инкубационном буфере соответственно (Таблицы 8-10).
7. Приготовление контрольных сывороток
В качестве положительного контроля используют антиИРТ сыворотки, полученные от естественно переболевших ИРТ животных с титром в ИФА не ниже 1:12600. Для этого у животных проводят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см3 от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при 37°С, затем делают обводку и для отстаивания сыворотки выдерживают 12-14 часов при 4°С. Затем сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют на водяной бане при 56°С 40 мин. Затем сыворотку консервируют 0,02% азида натрия и разливают по 0,0005 см3 в ампулы.
Аналогично готовили положительные сыворотки: антиВД-БС, антиПГ-3, антиРС, антиАВИ, полученные от животных, естественно переболевших вирусной-диареей-болезнью слизистых, парагриппом-3, респираторной синцитиальной и аденовирусной инфекциями соответственнно (с титром в ИФА не ниже 1:12600).
8. Приготовление нормальной (отрицательной) сыворотки
У животных, прошедших карантин в течение двух месяцев и отрицательно реагирующих в ИФА с антигеном вируса ИРТ, проводят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см3 от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при 37°С, затем делают обводку и для отстаивания сыворотки выдерживают 12-14 часов при 4°С. Затем сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют на водяной бане при 56°С 40 мин. Затем сыворотку консервируют 0,02% азида натрия и разливают по 0,0005 см3 в ампулы.
9. Получение коньюгата антивидового иммунопероксидазного
Антивидовые иммуноглобулины антиIgG КРС, меченные ферментом пероксидазой, готовят в соответствии с «Временной инструкцией по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой», утвержденной ГУВ МСХ СССР 09.12.85, ТУ 46-21-78-85(3), и укомплектовывают набор.
10. Иллюстрация применения тест-системы
10.1. Подготовка биологических компонентов тест-системы
Содержимое каждой ампулы или флакона с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом растворяют в 20 см3 инкубационного буфера, получая рабочую концентрацию конъюгата. Положительные и отрицательные сыворотки во фл. или амп. растворяют в 1 см3 инкубационного буфера, получая разведение 1:200. Растворенные сыворотки и конъюгат можно хранить при температуре 5±1°C в течение 3-4 дней.
10.2. Постановка реакции
Затраты времени на постановку реакции не более 3 часов.
10.2.1.Титрование сывороток
В лунки микропанели (кроме A1, B1, C1 и D1) вносят по 0,1 см3 инкубационного буфера.
В лунки горизонтальных рядов А (кроме A1) и B1 вносят 0,1 см3 исследуемых сывороток, предварительно разведенных 1:100 в инкубационном буфере в отдельных пробирках.
Сыворотки всех рядов титруют методом двукратных разведений, начиная с разведения 1:200 до 1:1600 в объеме 0,1 см3, используя при этом разные пипетки или сменные наконечники к микропипеткам.
Из последних лунок каждого ряда по 0,1 см3 разведения сыворотки удаляют.
Микропанели аккуратно встряхивают, добиваясь тщательного перемешивания полученных разведений сывороток, и инкубируют в термостате 1-1,5 часа при 37°С.
10.2.2. Определение уровня антител при стандартном разведении сывороток 1:200
При эпизоотологическом обследовании поголовья с целью выявления серопозитивных и серонегативных животных сыворотки не титруют, а используют в одном разведении 1:200, но в двух повторностях, используя для каждой сыворотки по 2 лунки плашки. Для этого исследуемые сыворотки разводят в отдельных пробирках 1:200 в инкубационном буфере и вносят попарно в лунки микропанели (кроме A1, B1, C1 и D1), используя сменные наконечники к микропипеткам или отдельные стеклянные пипетки. Панели закрывают крышкой и выдерживают при температуре (37±0,5)°С 1 час.
10.2.3. Внесение коньюгата
Все лунки микропанелей промывают 3 раза по 5 мин инкубационным буфером.
Во все лунки вносят по 0,1 см3 рабочего раствора антивидового коньюгата и инкубируют 1 час при температуре (37±0,5)°С. Промывают 3 раза по 5 мин инкубационным буфером.
10.2.4. Проявление реакции
Готовят субстратный раствор. Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 см3 субстратного раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 10-30 мин.
10.2.5. Остановка реакции
В случае если нет возможности провести учет реакции через 15-30 мин реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,05 см3 1 М серной кислоты.
10.2.6. Учет результатов реакции
Результаты учитывают не позднее 30 минут визуально или спекгрофотометрически.
10.2.6.1. Визуальный учет: при наличии специфических антител ряд лунок с исследуемыми сыворотками имеет оранжево-коричневое окрашивание с разведения сыворотки 1:200, сравнимое с цветом раствора в положительном контроле (лунки C1, D1).
Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля (лунки А1, В1).
10.2.6.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности.
Положительными считаются пробы, уровень оптической плотности которых, начиная с разведения 1:200 в два и более раза, превосходит уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 ед.
Сомнительные пробы - это те, уровень оптической плотности которых выше отрицательного контроля и составляет 0,150-0,199 ед.
Уровень оптической плотности ниже 0,150 свидетельствует об отрицательной реакции.
11. Интерпретация результатов ИФА
11.1. Основанием для постановки диагноза является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.
Заявляемая тест-система была испытана при сравнительном титровании исследуемых сывороток методами РН, РНГА и ИФА для каждой вирусной инфекции соответственно (Таблицы 1-5).
Установлено, что в 86% случаях положительные результаты были получены во всех предложенных методах. Все отрицательные сыворотки в ИФА были отрицательны и в РН, РНГА.
Тест-система повышает чувствительность иммунологической реакции и сокращает время для проведения диагностики и иммуномониторинга указанных выше заболеваний.
Предложенная тест-система найдет применение при обследовании крупного рогатого скота в неблагополучных по респираторным инфекциям хозяйствах.
Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов исследования позволяет в короткие сроки проводить массовые обследования поголовья животных.
Источники информации
1. Кочиш Т.Ю. Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе. Автореф. дис. канд. биол. наук. - Щелково, 2004.
2. Технические условия 19.10.97-89 «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», утвержденный ГУВ Госагропрома СССР от 01.08.89 (прототип).
3. Паспорт Всероссийского контрольного института ветеринарных препаратов на штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, на штамм ЗКСМ, на штамм «Oregon С24 V», на штамм «Randall» и на штамм «В 10».
4. RU 2306567 G01N 33/535. Способ дифференциальной диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа
5. Технические условия 46-21-78-85. «Временная инструкция по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой», утвержденная ГУВ МСХ СССР 09.12.85.
6. Jakobson R.H. Validation of serological assays for diagnosis of infectious diseases. / Jakobson R.H. // Rev.S. Tech. (OIE). - 1998. - V.17. - P.469-526.
7. OIE Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. - 5 hted. - Paris, 2004. - P.142-152.
| Таблица 1 | |||
| Сравнительная оценка титров антител к PC-вирусу КРС в РНГА, РН и ИФА. | |||
| Количество сывороток | Титр в ИФА | Титр в РН* | Титр в РИГА |
| 41 | - | - | - |
| 6 | 200 | - | - |
| 83 | 400 | 2-4 | 4-8 |
| 56 | 400-800 | 4-16 | 16-64 |
| 27 | 800-1600 | 16-32 | 32-256 |
| 17 | 3200-6400 | 32-64 | 128-512 |
| 6 | 12800 | 64-128 | 1024 |
| Примечание * представлены данные, обратные значениям титров РН, РИГА и ИФА. |
| Таблица 2 | ||||
| Сравнительная оценка титров антител к вирусу ИРТ в РН и ИФА. | ||||
| Общее количество сывороток | Количество сывороток, положительных в РН | Титр в РН * | Количество сывороток, положительных в ИФА | Титр в ИФА |
| 28 | 14 | 2-4 | 28 | 200 |
| 12 | 12 | 2-4 | 12 | 800-1600 |
| 18 | 18 | 8-16 | 18 | 800-1600 |
| 22 | 22 | 32-64 | 22 | 3200-6400 |
| 27 | 27 | 128-256 | 27 | 12800-25600 |
| 17 | 17 | >256 | 17 | >25600 |
| * представлены данные, обратные значениям титров РН и ИФА. |
| Таблица 3 | |||
| Сравнительная оценка титров антител к вирусу ВД-БС в РН, РИГА и ИФА | |||
| Количество сывороток | Титр в ИФА* | Титр в РН * | Титр в РИГА* |
| 77 | - | - | - |
| 16 | 200 | - | - |
| 183 | 400 | 2-4 | 4-8 |
| 156 | 400-800 | 4-16 | 16-64 |
| 99 | 800-1600 | 16-32 | 32-256 |
| 17 | 3200-6400 | 32-64 | 128-512 |
| * представлены данные, обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА. |
| Таблица 4 | |||
| Сравнительная оценка титров антител к вирусу ПГ-3 в РН, РНГА и ИФА | |||
| количество сывороток | Титр в ИФА | Титр в РН * | Титр в РНГА |
| 41 | - | - | - |
| 6 | 200 | - | - |
| 83 | 400 | 2-4 | 4-8 |
| 56 | 400-800 | 4-16 | 16-64 |
| 27 | 800-1600 | 16-32 | 32-256 |
| 17 | 3200-6400 | 32-64 | 128-512 |
| 6 | 12800 | 64-128 | 1024 |
| * представлены данные, обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА. |
| Таблица 5 | |||
| Сравнительная оценка титров антител к аденовирусной инфекции (АВИ) в РН, РНГА и ИФА | |||
| количество сывороток | титр в ИФА | титр в РН * | титр в РНГА |
| 41 | - | - | - |
| 6 | 200 | - | - |
| 73 | 400 | 2-4 | 4-8 |
| 54 | 400-800 | 4-16 | 16-64 |
| 28 | 800-1600 | 16-32 | 32-256 |
| 37 | 3200-6400 | 32-64 | 128-512 |
| 6 | 12800 | 64-128 | 1024 |
| * представлены данные, обратные значениям титров РН и ИФА. |
| Таблица 6 | ||||||
| Результаты шахматного титрования антигена ИРТ и антиИРТ сывороток в реакции ИФА (n=6) | ||||||
| Примеры | Концентрация антигена (мкг/см) | Разведение антиИРТ сыворотки * | ||||
| 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | ||
| 1 | 0,75 | 1,47+0,3 | 1,34+0,3 | 1,14+0,2 | 0,84+0,4 | 0,63+0,2 |
| 2 | 1,00 | >1,5 | >1,5 | 1,41+0,3 | 0,96+0,5 | 0,74+0,3 |
| 3 | 1,25 | >1,5 | >1,5 | 1,42+0,2 | 0,95+0,4 | 0,73+0,4 |
| 4 | 0,50 | 1,28+0,3 | 1,01+0,2 | 0,87+0,3 | 0,63+0,5 | 0,49+0,4 |
| 5 | 1,50 | >1,5 | >1,5 | 1,41+0,3 | 0,96+0,3 | 0,74+0,2 |
| Прототип | ** | >1,5 | 1,39+0,4 | 1,13+0,5 | 0,79+0,4 | 0,53+0,3 |
| Примечание * - результаты представлены в единицах оптической плотности при 492 нм; ** - антиген растворен и нанесен на микропланшеты для проведения ИФА согласно наставлению по применению. |
| Таблица 7 | ||||||
| Результаты шахматного титрования РСВ антигена и антиРСВ сывороток в реакции ИФА (n=6) | ||||||
| Примеры | Концентрация антигена (мкг/см3) | Разведение антиРСВ сыворотки * | ||||
| 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | ||
| 1 | 0,75 | >1,5 | >1,5 | 1,43+0,2 | 0,86+0,4 | 0,65+0,2 |
| 2 | 1,00 | >1,5 | >1,5 | 1,40+0,3 | 0,93+0,4 | 0,75+0,3 |
| 3 | 1,25 | >1,5 | >1,5 | 1,42+0,2 | 0,95+0,4 | 0,73+0,4 |
| 4 | 0,50 | >1,5 | 1,01+0,2 | 0,87+0,3 | 0,60+0,5 | 0,49+0,4 |
| 5 | 1,50 | >1,5 | >1,5 | 1,41+0,3 | 0,96+0,3 | 0,74+0,2 |
| Прототип | ** | >1,5 | 1,38+0,4 | 1,13+0,5 | 0,79+0,4 | 0,50+0,3 |
| Примечание * - результаты представлены в единицах оптической плотности при 492 нм; ** - антиген растворен и нанесен на микропланшеты для проведения ИФА согласно наставлению по применению. |
| Таблица 8 | ||||||
| Результаты шахматного титрования антигена АВИ и антиАВИ сывороток в реакции ИФА (n=6) | ||||||
| Примеры | Концентрация антигена (мкг/см3) | Разведение антиАВИ сыворотки * | ||||
| 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | ||
| 1 | 0,75 | 1,54+0,2 | 1,39+0,2 | 1,18+0,2 | 0,84+0,4 | 0,61+0,2 |
| 2 | 1,00 | 1,64+0,2 | 1,48+0,2 | 1,41+0,3 | 0,96+0,5 | 0,72+0,3 |
| 3 | 1,25 | >1,5 | >1,5 | 1,44+0,2 | 0,95+0,4 | 0,71+0,4 |
| 4 | 0,50 | >1,5 | >1,5 | 0,87+0,3 | 0,63+0,5 | 0,48+0,4 |
| 5 | 1,50 | >1,5 | >1,5 | 1,41+0,3 | 0,93+0,3 | 0,73+0,2 |
| Прототип | ** | >1,5 | 1,39+0,4 | 1,13+0,5 | 0,77+0,4 | 0,52+0,3 |
| Примечание * - результаты представлены в единицах оптической плотности при 492 нм; ** - антиген растворен и нанесен на микропланшеты для проведения ИФА согласно наставлению по применению. |
| Таблица 9 | ||||||
| Результаты шахматного титрования антигена ВД-БС и антиВД-БС сывороток в реакции ИФА (n=6) | ||||||
| Примеры | Концентрация антигена (мкг/см3) | Разведение антиВД-БС сыворотки * | ||||
| 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | ||
| 1 | 0,75 | 1,47+03 | 134+03 | 1,14+0,2 | 0,84+0,4 | 0,63+0,2 |
| 2 | 1,00 | 1,53+03 | 1,48+03 | 1,44+0,3 | 0,99+0,5 | 0,84+0,3 |
| 3 | 1,25 | >1,5 | >1,5 | 1,46+0,2 | 0,97+0,4 | 0,74+0,4 |
| 4 | 0,50 | >1,5 | >1,5 | 0,88+0,3 | 0,64+0,5 | 0,48+0,4 |
| 5 | 1,50 | >1,5 | >1,5 | 1,41+03 | 0,96+0,3 | 0,74+0,2 |
| Прототип | ** | >1,5 | 1,36+0,4 | 1,14+0,5 | 0,77+0,4 | 0,54+0,3 |
| Примечание * - результаты представлены в единицах оптической плотности при 492 нм; ** - антиген растворен и нанесен на микропланшеты для проведения ИФА согласно наставлению по применению. |
| Таблица 10 | ||||||
| Результаты шахматного титрования антигена ПГ-3 и антиПГ-3 сывороток в реакции ИФА (n=6) | ||||||
| Примеры | Концентрация антигена (мкг/см) | Разведение антиПГ-3 сыворотки * | ||||
| 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | ||
| 1 | 0,75 | 1,38+0,3 | 1,24+0,3 | 1,18+0,2 | 0,91+0,4 | 0,61+0,2 |
| 2 | 1,00 | >1,5 | >1,5 | 1,44+0,3 | 0,94+0,5 | 0,72+0,3 |
| 3 | 1,25 | >1,5 | >1,5 | 1,41+0,2 | 0,92+0,4 | 0,74+0,4 |
| 4 | 0,50 | 1,29+0,3 | 1,02+0,2 | 0,85+0,3 | 0,61+0,5 | 0,50+0,4 |
| 5 | 1,50 | >1,5 | >1,5 | 1,43+0,3 | 0,92+0,3 | 0,72+0,2 |
| Прототип | ** | >1,5 | 1,38+0,4 | 1,14+0,5 | 0,79+0,4 | 0,54+0,3 |
| Примечание * - результаты представлены в единицах оптической плотности при 492 нм; ** - антиген растворен и нанесен на микропланшеты для проведения ИФА согласно наставлению по применению. |
Диагностическая тест-система иммуноферментного анализа для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота, характеризующаяся тем, что она содержит 96-луночные микропланшеты, сенсибилизированные аффинно очищенными антигенами вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекций крупного рогатого скота; в качестве положительных контрольных сывороток - вирусспецифическую антиИРТ, вирусспецифическую антиВД-БС, вирусспецифическую антиПГ-3, вирусспецифическую антиРС, вирусспецифическую антиАВИ, и в качестве отрицательных - нативные контрольные сыворотки, конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент (Твин-20, -80 или Тритон X-305), 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент.
www.freepatent.ru
.jpg)
