Что такое критическая контрольная точка: Критические контрольные точки | ООО «Сертификант»

НАССР Принцип 2: Определение критических контрольных точек

НАССР (анализ опасностей и критические контрольные точки) начинается с анализа опасностей. Теперь когда фактические и потенциальные опасности определены, человек или группа со «свежим взглядом», как обсуждалось в предыдущей части, должен(ы) определить критические контрольные точки (ККТ).

Предполагая, что опасности хорошо идентифицированы, можно предположить, о наличии средств контроля. Например, если для измельчения или смешивания ингредиентов используется крупный промышленный или коммерческий измельчитель или смеситель, отверстие может быть достаточно большим, чтобы рука человека туда попала и была повреждена. Большинство из этих машин поставляются с устройствами безопасности, предназначенными для предотвращения таких случаев. Предохранитель предназначен для предотвращения травм работников или повреждения их одежды.

Многие работники часто спешат и используют оборудование, когда предохранительное устройство снято (выключено и т.п.). В то время как работник считает, что он будет в безопасности и так, он может не понимать, что предохранительные устройства также предотвращают попадание физических загрязнений, которые будут разбиты миксером на мелкие, незаметные кусочки, представляющие опасность для потребителя. ККТ, для предотвращения такого происшествия является установка защитного ограждения.

Кроме того, при оценке опасностей во время использования смесителя следует учитывать биологические опасности. Разумеется, если сотрудники обрабатывают пищу голыми руками, то потенциальная опасность заражения микроорганизмами с кожи является серьезной проблемой. Если работник носит головной убор, это может предотвратить попадание волос в пищу, но вы уверены, что этот головной убор используется только для работы и не носится сотрудник в нерабочее время? И если изношенный фартук попадает внутрь емкости, которая была чиста вначале смены, то какие потенциальные биологические опасности он представляет? В таких случаях защитное ограждение, снова может помешать одежде работника заразить пищевую продукцию. ККТ в таких случаях было бы мытье рук оператора, использование санитарных головных уборов и рабочей одежды, которая регулярно проходит санитарную обработку (стирку). ККТ будет включать в себя обеспечение достаточной очистки рук, головного убора и одежды, чтобы удалить вредные микроорганизмы.

В операциях, где используется чистящие химикаты, одним из ККТ будет обучение работников правильному использованию химических веществ. Пестициды и химические вещества, потребуют дополнительного рассмотрения для определения правильных ККТ.

Продолжая на примере смесителя, необходимо учитывать попадание опасных химических веществ. Смеситель, обычно, регулярно очищают с помощью химических чистящих средств, которые, хотя их можно считать не токсичными, могут потенциально вызвать какое-то желудочное расстройство. ККТ здесь будет включать обеспечение надлежащей очистки для устранения или уменьшения вредных микроорганизмов до неопасных уровней, а также обеспечение надлежащего полоскания для удаления всех следов чистящих средств.

Еще одной областью рассмотрения является хранение химических чистящих средств и других подобных материалов. ККТ здесь будет включать в себя проверку места хранения химических веществ, например, не хранятся ли они над зонами приготовления пищи, такими как смеситель. Таким образом предотвращаются случайное их попадание в пищевую продукцию, если они разольются в месте хранения.

В промышленных процессах зачастую применяется полная автоматизация и контроль. Существует множество датчиков для измерения каждого фактора: вес каждого ингредиента, температура готовки, время, а в некоторых случаях цвет, запах и вкус для некоторых продуктов. Измерение и понимание этих факторов важно для определения контрольной точки.

Например, в духовке или морозильной камере необходимо установить температурные датчики, где температура имеет решающее значение для эффективной борьбы с такими опасностями, как микроорганизмы. Точка управления в этом примере операция, при которой необходимо достичь определенной температуры, чтобы убить микроорганизм в печи, или предотвратить размножение микроорганизмов, в морозильной камере. Фактическое управление духовкой – это не датчик, а термостат, к которому он прикреплен. Он включает или выключает теплоснабжение для поддержания температуры. Задача ККТ в этом примере состоит в том, чтобы убедиться, что печь достигает и поддерживает надлежащую температуру в течении требуемого времени не только для того, чтобы гарантировать, что продукт испечен правильно, но и для гарантии того, что вредные микроорганизмы будут убиты.

Ключом к определению ККТ являются точки, в которых контроль может измеряться автоматически или вручную.

Также группа НАССР должна подключать к анализу тех, кто больше всего знаком с процессами, чтобы список ККТ был полным. Поэтому обучение и осведомленность должны быть обеспечены не только для членов группы НАССР, но и для всего предприятия.

ХАССП. 7 принципов системы HACCP

Система ХАССП (расшифровка: HACCP — Hazard Analysis and Critical Control Point, пер. с агл.: Анализ Опасностей и Критические Контрольный Точки), введённая в обязательном порядке для предприятий пищевой отрасли с 1 февраля 2015 года, основывается на 7 основных принципах ХАССП, являющихся фундаментом для разработки системы контроля за качеством и безопасностью продукции.

На сегодняшний день в России действуют: ТР ТС 021/2011, предписывающий работу по ХАССП; ГОСТ Р 51075.1-2001, описывающий принципы ХАССП; ГОСТ Р ИСО 22000-2019 — «расширенная версия» для управления производствами, система менеджента безопасности пищевой продукции и ГОСТ Р 54762-2011 — система FSSC, предварительные требования безопасности пищевой продукции.

Для минимизации противоречий между старыми стандартами и ХАССП, Роспотребнадзором готовится целый ряд обновлённых стандартов, Минэкономразвития подготовил единый документ для общепита.

Что же такое ХАССП и для чего он нужен?

ХАССП – это свод правил организации производственной деятельности на основе 7 принципов, гарантирующий обеспечение на выходе качественного и безопасного для потребителя продукта. Для достижения конечной цели, обеспечение людей безопасными продуктами питания, принципы ХАССП должны соблюдаться всеми предприятиями, через которые продукт проходит путь от состояния сырья к потребителю. Т.е. по ХАССП должны работать все: от сельсхохозяйственных предприятий до розничных магазинов и предприятий общепита.

7 принципов ХАССП

Принцип 1. Анализ рисков

Суть принципа заключается в проведении анализа опасных факторов в отношении каждого технологического процесса. Такой анализ подразумевает выявление и сопоставление перечня рисков и опасностей, которые могут быть причиной заражения определенного пищевого продукта в процессе изготовления, и разработке мер профилактики для недопущения развития рисков. Для обеспечения безопасности пищевых продуктов следует исключить негативное влияние биологических, химических и физических факторов.

Степень бесконтрольности этих факторов и является определяющей в возникновении рисков в производственной деятельности, которые могут стать причиной изменения состава конечного пищевого продукта и, соответственно, сделать его небезопасным для употребления человеком.

Принцип 2. Критические контрольные точки (ККТ)

Задача заключается в выявлении критических контрольных точек (ККТ) в каждой фазе технологического процесса.

Понятие ККТ описывает этап, момент или операцию, в процессе которых существует возможность применить механизмы контроля для ликвидации или уменьшения рисков и опасностей до допустимого уровня, после которых исключается возможное заражение пищевого продукта. Для каждого установленного фактора риска разрабатываются и принимаются адекватные меры.

После анализа рисков и опасностей, полученную информацию используют для определения конкретных этапов производственного процесса, представляющие собой критические точки.

Статистика здравоохранения говорит о том, что основная причина заражения человека — это употребление небезопасных продуктов питания, поэтому нормативами и правилами для идентификации ККТ в первую очередь определен строгий контроль рисков микробиологического заражения сырья и ингредиентов на протяжении всего процесса изготовления продукции.

Специально для определения описанных ККТ комитетом NACMCF был разработан метод «графа принятия решений». Впрочем, никто не обязывает предприятие использовать именно эту модель исследования.

Принцип 3. Установление критических пределов для ККТ

Поставленная задача нацелена на установление критических пределов, при достижении которых следует принимать меры для предупреждения развития выявленных рисков в той или иной критической контрольной точке.

Критическим пределом в данном случае представлено наибольшее или наименьшее значение какого-либо показателя в ККТ, при корректировке которого можно предотвратить, устранить или снизить до допустимого уровня факторы риска, угрожающие безопасности пищевого продукта. Такие пределы основываются на технологических показателях, таких как:

• активность воды и ее количественный показатель;
• уровень тируемой кислотности и pH;
• концентрация соли, хлора;
• температурные показатели;
• время изготовления продукции;
• присутствие небезопасных микроорганизмов, которые подлежат устранению.

Все параметры критических пределов базируются на применяемых нормативных документах или методических рекомендациях FSIS. Такие рекомендации и схемы описаны в научно-технической литературе и обзорах авторитетных экспертов, являющиеся членами отраслевых структур, научных кругов и профессиональных объединений.

Предприятие пищевой промышленности должно стремиться установить более строгие критические пределы по сравнению с предусмотренными документами FSIS и мнением экспертов для более тщательного соблюдения всех нормативных требований. Такой надежный запас показателей гарантированно устранит мельчайшие отклонения от установленных норм и правил.

Принцип 4. Контроль

После определения критических контрольных точек и оптимизации их показателей разрабатывается процедура контроля. В такую систему контроля входят все наблюдения и замеры за состоянием ККТ в целях соблюдения критических пределов.

Наиболее предпочтительным вариантом, конечно, является непрерывный метод контроля. В тех случаях, когда непрерывное наблюдение не оправдывает себя ни с технической, ни с экономической точки зрения, допустимо проведение периодических контрольных процедур с частотой, достаточной для координирования рисками в ККТ.

Для осуществления полноценного контроля над каждой критической контрольной точкой имеет место возложение ответственности на того или иного сотрудника организации. Привлеченный к решению таких задач персонал должен пройти соответствующее обучение, в том числе в предоставлении достоверного учета всех полученных результатов и выявленных отклонений. От качества и уровня организации системы учета будет зависеть скорость принятия ответных мер на возможные отклонения от критических пределов.

Принцип 5. Корректирующие действия

В разрабатываемом плане ХАССП должны быть четко определены корректирующие действия, которые надлежит незамедлительно предпринять в том случае, если для конкретной ККТ значения ее показателей выйдут за рамки установленных пределов. Этот принцип подразумевает, что для безопасного изготовления пищевых продуктов обязательным условием является четкая концепция организации производства с быстрым реагированием на предотвращение факторов риска.

Лежащий на столе у директора предприятия план ХАССП еще не гарантирует отсутствие проблем. Поэтому одной из важных составных частей плана ХАССП является планирование комплексных мероприятий, направленных на устранение возможных отклонений. Именно для экстренных случаев разрабатывается план действий, в котором выявляется причина отклонений и определяется порядок нейтрализации потенциально опасных либо несоответствующих нормам продуктов.

Принцип 6. Порядок учета

Этот принцип обязывает разработать эффективный порядок учета за организацией и функционированием всей системы ХАССП с ведением соответствующей документации. Система ХАССП направлена на оптимизацию процесса изготовления пищевой продукции в области выявления факторов риска и реагирования по их ликвидации. Ввиду этого, продуктивность системы будет напрямую зависеть от умения вести систематический и достоверный учет выполнения плановых процедур. Учетная документация должна находиться в открытом доступе. Ознакомление с документами должно быть доступно как для сотрудников предприятия, так и для контрольных инстанций.

Принцип 7. Систематические ревизии

Эффективное следование плану ХАССП подразумевает проведение систематических ревизий. В ходе первой проверки ревизионная комиссия подтверждает способность системы адекватно и полноценно противостоять существующим рискам.

Дальнейшие периодические ревизии проводятся с применением дополнительных тестов, методов и процедур, в задачи которых входит определение соответствия системы ХАССП плану ХАССП и возможные корректировки с повторным утверждением для обеспечения безопасности пищевых продуктов.

Внедрение принципов ХАССП на производстве

Внедрение ХАССП в производственный процесс состоит из «12 шагов». Поэтапный алгоритм из 12 пунктов описывает последоваельность действий для эффективного перевода работы предприятия в соответствие с ХАССП. На первый взгляд, всё довольно просто (подробное описание шагов вы найдёте в статье):

1. Создание группы ХАССП.
2. Описание сырья и готовой продукции.
3. Определение ожидаемого использования продукта.
4. Построение блок-схемы технологического процесса.
5. Подтверждение схемы технологического процесса на объекте.
6. Анализ потенциальных опасностей.
7. Определение критических контрольных точек (ККТ).
8. Установление критических пределов для каждой ККТ.
9. Разработка системы мониторинга для каждой ККТ.
10. Разработка плана коррекции и корректирующих действий.
11. Установление процедур верификации (проверки).
12. Ведение учетной документации и ревизионные проверки.

На практике же предприниматели и технологи сталкиваются с трудностями: неприятие нововведений коллективом, необходимость вложений в новое оборудование/ремонт/перепланировку, отсутствие опытного консультанта, способного применить «творческие решения» к индивидуальным особенностям. Также, главное, встаёт необходимость обучения персонала. По статистике нашей компании, самостоятельная разработка документов у необученного ХАССП сотрудника (технолога) в режиме выполнения основных штатных обязанностей в среднем занимает 6 месяцев.

Отличие ХАССП от СанПиНов

Принципиальное отличие работы по ХАССП от работы по ГОСТам и СанПиНам — это возможность выбирать оптимальный метод в рамках заданных стандартов продукта на выходе из каждого этапа обработки. В индивидуальности ХАССП для каждого предприятия заключаются её плюсы и минусы.

Невозможно прописать четкие инструкции на «все случаи жизни», что вызывает сложности у большинства начинающих предпринимателей и технологов без опыта практических решений – нет четкого ответа на вопрос: «как нужно делать тут и тут?».

С другой стороны, система ХАССП является гибкой и, за счет оптимизации процессов под конкретные условия, позволяет обеспечивать качество продукта на выходе с наименьшими ресурсными затратами. 

Узнайте, из каких документов состоит ХАССП

Закажите шаблоны документации ХАССП – мы вышлем Вам их бесплатно!

Заказать разработку программы внедрения системы HACCP (ХАССП), получить необходимые сертификаты и полную документацию по внедрению с последующей возможностью их использования, вы можете в нашем Центре сертификации — просто свяжитесь с нами по телефону горячей линии или оставьте заявку на сайте.

Технологические приемы обеспечения безопасности мягкого сыра. Часть 2. Критические контрольные точки Текст научной статьи по специальности «Прочие технологии»

Из данных таблицы 2 следует, что по внешнему виду продукта наивысшую оценку получили сало годового хранения и щековина 8,2 балла. Более низкую оценку 7,4 балла получила свинина 2016 г. и сало более годового хранения. По такому показателю как запах продукта наивысший балл 8,4 получила щековина, а наименьший — 5,4 баллов — сало более годового хранения. По вкусовым качествам щековина получила наивысшую оценку, по сравнению с салом более годового хранения, оценка которого составила 6,2 балла, также и по таким показателям, как консистенция и сочность наивысшую оценку получила щековина, а самый низкий балл — сало более годового хранения. Полученные результаты могут быть связаны с температурными изменениями режимов хранения продуктов. Под действием повышенных температур потери качества вызваны развитием различных микроорганизмов, которые приводят к органолептическим изменениям продукта. Происходящие процессы приводят к накоплению нежелательных и токсичных продуктов распада, в результате чего продукция приобретает неудовлетворительные органолептические свойства [1].

Вывод

На основании проведенной оценки некоторых качественных показателей можно сделать заключение, что представленные для исследования образцы находятся в пределах допустимых физико-химических норм. Умеренное использование данного продукта не нарушит функциональную деятельность организма. Предполагаем, что на данные физико-химические показатели сала влияют не только сроки хранения, но и в большей степени условия кормления и выращивания животных, от которых получают соответствующее сырьё.

По результатам общей органолептической оценки копчёного свиного сала лучшие показатели получили щековина (7,8 балла) и сало годового хранения (7,2 балла).

Библиографический список

1. Свиное сало. Польза и вред свиного сала. — Режим доступа http://foodexpert.pro/produkty/zhivotnovodstvo/svinoe-salo.html (дата обращения: B.G4.1Z).

2. Lard. — Режим доступа: http://www.cooksinfo. com/lard(Дата обращения: B.G4.1Z)

3. Mунгалова Т.Н. Товароведение и экспертиза пищевых жиров: учебно-методическое пособие к лабораторно-прак-тическим занятиям. — Барнаул: Изд-во АГАУ, 2G1G. — бб с.

4. Mанжесов В.И., Курчаева Е.Е., Сысоева M.r. Технология хранения, переработки и стандартизация животноводческой продукции: учебник. — СПб.: Троицкий мост, 2G12. — бЗб с.

б. Mезенова О.Я., Ким И.Н. Технология, экология и оценка качества копченых продуктов: учебное пособие -СПб.: ГИОРД, 2GG9. — 4BB с.

б. Полезно ли свиное сало. — Режим доступа: https://infoeda.com/polezno-li-svinoe-salo-chem-polezno-salo-dlya-organizma.html (дата обращения: B.G4.1Z)

Z. Рогов И.А., Забашта А.Г., Казюлин Г.П. Общая технология мяса и мясопродуктов: учебник. — M.: Колос, 2000. — 36z с.

References

1. Svinoe salo. Polza i vred svinogo sala [Elektronnyy resurs] http://foodexpert.pro/produkty/zhivotnovodstvo/svinoe-salo.html (Data obrashcheniya: 8.04.17).

2. Lard [Elektronnyy resurs] http://www.cooksinfo.com/lard (Data obrashcheniya: 8.04.17).

3. Mungalova T.N. Tovarovedenie i ekspertiza pishchevykh zhirov: uchebno-metodicheskoe posobie k laboratorno-prakticheskim zanyatiyam. — Barnaul: Izd-vo AGAU, 2010. — 56 s.

4. Manzhesov V.l., Kurchaeva E.E., Sysoeva M.G. Tekhnologiya khraneniya, pererabotki i standartizatsiya zhivotnovodcheskoy produktsii: uchebnik. — SPb.: Troitskiy most, 2012. — 536 s.

5. Mezenova O.Ya., Kim I.N. Tekhnologiya, ekologiya i otsenka kachestva kopchenykh produktov: uchebnoe posobie. -SPb.: GIORD, 2009. — 488 s.

6. Polezno li svinoe salo [Elektronnyy resurs] https://infoeda.com/polezno-li-svinoe-salo-chem-polezno-salo-dlya-organizma.html (Data obrashcheniya: 8.04.17).

Z. Rogov I.A., Zabashta A.G., Kazyulin G.P. Obshchaya tekhnologiya myasa i myasoproduktov: uchebnik. — M.: Kolos, 2000. — 367 s.

+ + +

УДК 637.3 А.И. Яшкин

A.I. Yashkin

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ ОБЕСПЕЧЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ МЯГКОГО СЫРА. ЧАСТЬ 2. КРИТИЧЕСКИЕ КОНТРОЛЬНЫЕ ТОЧКИ

TECHNOLOGICAL METHODS OF ENSURING SAFETY OF SOFT CHEESE. PART 2. CRITICAL CONTROL POINTS

Ключевые слова: мягкий сыр, технология, безопасность продукции, менеджмент безопасности, система ХАССП, критические контрольные точки, критические пределы, система мониторинга, корректирующие действия, план ХАССП.

Keywords: soft cheese, technology, product safety, safety management, HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) system, critical control points, critical limits, monitoring system, corrective actions, HACCP plan.

Анализ технологического процесса и составление мероприятий по управлению в критических контрольных точках в системе ХАССП — это сложный и ответственный этап, в результате выполнения которого обосновывается набор мероприятий, обеспечивающий безопасность пищевой продукции. Проведена адаптация ключевых элементов системы менеджмента пищевой безопасности, основанной на принципах ХАССП, к производству мягкого кислотно-сычужного сыра. Основная цель работы — разработать план ХАССП по производству мягкого кислотно-сычужного сыра. Цель данного этапа работы — установить критические контрольные точки технологического процесса производства сыра и разработать мероприятия по управлению рисками. В работе определены пять критических контрольных точек технологического процесса производства мягкого сыра, в которых имеется недопустимый риск, а также возможны меры по устранению или снижению риска до приемлемого уровня. Критическими контрольными точками являются процессы: пастеризации и охлаждения молока, приготовления бактериальной закваски, упаковки и маркировка сыра, охлаждения и хранения сыра в охлажденном состоянии. Установлены критические пределы каждой критической контрольной точки, которые основаны на таких факторах, как температура, время, присутствие на этикетке маркировочной информации о составе продукта. Разработана программа мониторинга критических контрольных точек, предусматривающая закрепление персональной ответственности за предмет контроля, своевременность и качество его проведения, места фиксации записей по результатам измерений и наблюдений. Предложен перечень корректирующих

деиствии на случаи выхода критических контрольных точек за пределы допустимых значении.

The analysis of technological process and drawing up action plan for managing the critical control points in the HACCP system is a difficult and responsible stage since its implementation results in a set of measures to ensure food safety. This work adapts the key elements of food safety management system based on the HACCP principles to production of soft acid-rennet cheese. The main goal is to develop a HACCP plan for the production of soft acid-rennet cheese. The goal of this stage of the work is to determine the critical control points of the technological process of cheese production and to develop the measures for risk management. This work identifies five critical control points of the technological process of soft cheese production which have unacceptable risks; possible measures to eliminate or reduce the risks to an acceptable level are determined. The critical control points are the following processes: milk pasteurization and cooling; making bacterial starter cultures; cheese packaging and labeling; cheese cooling and cool storage. The critical limits for each critical control point have been determined; they are based on such factors as temperature, time, and availability of label information about the product ingredients. A program of monitoring the critical control points has been developed which provides for personal responsibility for the monitored object, monitoring timeliness and quality, and proper records of the results of measurements and monitoring. The list of corrective actions in case of critical control point ex-ceedance of acceptable values is proposed.

Яшкин Александр Иванович, к.с.-х.н., доцент, каф. технологии производства и переработки продукции животноводства, Алтайский государственный аграрный университет. Тел.: (3852) 62-20-90. E-mail: [email protected].

Введение

Система менеджмента безопасности пищевой продукции — это система для разработки и осуществления скоординированной деятельности по руководству и управлению организацией в целях обеспечения безопасности пищевой продукции. Система ХАССП является основной моделью управления качеством и безопасностью пищевых продуктов в промышленно развитых странах мира. Система позволяет предвидеть и управлять рисками путем идентификации факторов риска и соответствующих профилактических и корректирующих воздействиях [1, 2].

Анализ технологического процесса и составление мероприятий по управлению в критических контрольных точках (здесь и далее — ККТ) в рамках системы ХАССП является самым сложным и ответственным этапом, так как в результате его выполнения обосновывается набор мероприятий, обеспечивающий безопасность пищевой продукции. При этом автоматически определяются ККТ как места применения мероприятий по управлению, тем самым выполняется требование технического регламента Таможенного Союза

Yashkin Aleksandr Ivanovich, Cand. Agr. Sci., Assoc. Prof., Chair of Animal Production and Processing Technologies, Altai State Agricultural University. Ph.: (3852) 62-20-90. E-mail: [email protected].

V-

«О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011), который наряду с этим предусматривает установление предельных значений параметров, контролируемых в ККТ, их мониторинг и действия в случае нарушения предельных значений [3].

Проведена адаптация ключевых элементов системы менеджмента пищевой безопасности, основанной на принципах ХАССП, к производству мягкого кислотно-сычужного сыра, получаемого с использованием глюконо-дельта-лактона (здесь и далее — ГДЛ) в качестве кислотообразователя.

Основная цель работы — разработать план ХАССП по производству мягкого кислотно-сычужного сыра. Цель второго этапа работы — установить критические контрольные точки технологического процесса производства сыра и разработать мероприятия по управлению рисками.

Для реализации цели поставлены следующие задачи исследования:

1) выявить критические контрольные точки технологического процесса производства продукта, установить критические пределы каждой ККТ;

2) разработать систему мониторинга всех критических контрольных точек, а также перечень корректирующих мероприятий.

Организация выполнения работы, материал и методы исследований

Работа выполнена на кафедре технологии производства и переработки продукции животноводства ФГБОУ ВО «Алтайский государственный аграрный университет» и на кафедре «Товароведение и управление качеством» ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)» в 2017 г.

При выполнении работы использована методика, изложенная в национальных стандартах РФ ГОСТ Р 51705.1-2001 «Системы качества. Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП. Общие требования», ГОСТ Р 56671-2015 «Рекомендации по разработке и внедрению процедур, основанных на принципах ХАССП», а также положения статей 10 и 11 технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) [4-6]. Для определения ККТ использован метод «Дерева принятия решений».

Результаты собственных исследований

Определение критических контрольных точек технологического процесса и установление предельных значений параметров каждой ККТ проводятся для обеспечения уверенности в том, что каждая точка находится под контролем. Указанные мероприятия вытекают из второго и третьего принципов системы ХАССП. Согласно ГОСТ Р 51705.1, критическая контрольная точка — это место проведения контроля для идентификации опасного фактора и (или) управления риском. При этом важно подчеркнуть, что при идентификации критических контрольных точек во внимание принимают только те опасные факторы, риск по которым отнесен к недопустимому. Разграничение «контрольной» точки от «критической контрольной» точки основано на следующих атрибутах последней: наличие признаков недопустимого риска и мер контроля по устранению риска (или его минимизации).

Изменения в рецептуре мягкого сыра при использовании регулятора кислотности ГДЛ являются причиной для возможного пересмотра плана ХАССП. По данным Т. Мейес [7], любые изменения в технологическом процессе или оборудовании автоматически становятся предметом независимого анализа с точки зрения системы менеджмента безопасности пищевой продукции. При этом согласуются все новые риски и вопросы, связанные с ККТ, и затем в план ХАССП вносятся необходимые изменения. Затем согласуются критические технологические параметры и пересматриваются ККТ, после чего они вносятся во временную операционную карту технологического процесса.

Предложенный в национальном стандарте алгоритм поиска ККТ предусматривает проведение анализа по каждому учитываемому (недопустимому) опасному фактору в разрезе всех операций технологического процесса производства мягкого сыра. В таблице 1 показана форма протокола выбора и распределения мер контроля в рамках реализации системы ХАССП на предприятии. Результаты проведенного поиска позволяют выделить пять критических контрольных точек и одну контрольную точку процесса производства мягкого сыра с ГДЛ.

Согласно третьему принципу системы ХАССП, для каждой критической контрольной точки необходимо установить критические пределы, то есть «критерии, разделяющие допустимые и недопустимые значения контролируемой величины». Критические пределы следует отличать от технологических пределов, которые устанавливаются не в целях обеспечения безопасности. Критические пределы в данном случае основаны на таких факторах, как температура, время, присутствие на этикетке маркировочной информации о составе продукта.

Разработка системы мониторинга ККТ призвана решить вторую задачу собственных исследований. Мониторинг — это проведение запланированных наблюдений или измерений параметров в критических контрольных точках с целью своевременного обнаружения их выхода за предельные значения и получения необходимой информации для выработки корректирующих действий (ГОСТ Р 51705.1). В основу комплекса мероприятий положен четвертый принцип системы ХАССП. Мониторинг позволяет решить следующие задачи: проведение планового контроля за операциями; анализ причин отклонения параметров от нормы; документирование мер контроля и предпринимаемых действий. Особую важность имеет поддержание записей системы мониторинга (бумажных, электронных) в рабочем состоянии для осуществления процесса прослеживаемости и полноценного анализа результативности системы менеджмента пищевой безопасности со стороны высшего руководства организации.

Для тех случаев, когда параметры технологического процесса в ККТ вышли за предельные значения, целесообразно составить и задокументировать корректирующие действия (коррекции). В плане ХАССП следует заранее составить план коррекций, а также корректирующих действий, включающий (минимально): перечень предпринимаемых действий по исправлению ситуации; ответственного за осуществление мер по управлению; ответственного за ведение записей по предпринятым действиям. Под коррекцией понимают «действие, предпринятое для устранения выявленного несоответствия и направленное на устранение риска или снижение его до допустимого уровня», в то время как под корректирующим действием -«действие, предпринятое для устранения причины выявленного несоответствия».

Таблица 1

Протокол выбора и распределения мер контроля (фрагмент)

Существенные опасности Описание мер контроля Отнесение к ККТ или КТ Обоснование решения

этап опасность

Приемка сырья и материалов Аллергены: молоко и продукты его переработки Проверка целостности емкости, проверка сопроводительных документов КТ Молоко является основным компонентом продукта. Информация о наличии аллергенов будет размещена на этикетке продукта при маркировке

Пастеризация молока Патогенные микроорганизмы, в т. ч. сальмонеллы, Listeria Monocytogenes, S. Aureus Соблюдение технологических режимов пастеризации молока ККТ1 Пастеризация проводится исключительно в целях снижения уровня микробиальной обсемененности молока. Управление: соблюдение ТИ

БГКП (E. Coli O157:H7)

Охлаждение молока Патогенные микроорганизмы, в т. ч. сальмонеллы, Listeria Monocytogenes, S. Aureus Соблюдение режимов и своевременности охлаждения молока после пастеризации ККТ2 Охлаждение молока позволяет ингибиро- вать развитие бактериальных клеток, устойчивых к термообработке. Управление: соблюдение ТИ

БГКП (E. Coli O157:H7)

Подготовка производственной бактериальной закваски Патогенные микроорганизмы, в т. ч. сальмонеллы, Listeria Monocytogenes, S. Aureus Соблюдение режимов пастеризации молока, сквашивания и охлаждения закваски ККТ3 Пастеризованное молоко может быть загрязнено вносимой закваской. Поэтому необходим контроль процессов ее подготовки к внесению. Управление: соблюдение инструкции по приготовлению бакза-квасок

БГКП (E. Coli O157:H7)

Упаковка и маркировка сыра В маркировке отсутствует информация о составе продукта Проверка маркировки ККТ4 Необходимость доведения до потребителя обязательных сведений о составе продукта

Охлаждение и хранение в охлажденном состоянии Патогенные микроорганизмы, в т. ч. сальмонеллы, Listeria Monocytogenes, S. Aureus Соблюдение режимов охлаждения и хранения сыров ККТ5 Охлаждение и хранение готового продукта — финальные операции по управлению биологическими опасными факторами

БГКП (E. Coli O157:H7)

Таблица 2

Протокол плана ХАССП (фрагмент)

Этап процесса / номер ККТ Описание опасности Предельные значения Мониторинг Коррекции Корректирующие действия Записи

что как как часто ответственный

Пастеризация молока /ККТ1 Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, БГКП Температура от 74 до 76оС, время экспозиции от 20 до 25 с Температура пастеризации, времени экспозиции Термометр-самописец, часы Каждая партия молока Аппаратчик аппаратного цеха Идентифицировать как несоответствующее Профилактический ремонт ПОУ, поверка средств измерения Журнал аппаратного цеха

Охлаждение молока / ККТ2 Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, БГКП Температура от 6 до 10оС Температура охлаждения Термометр-самописец Каждая партия молока Аппаратчик аппаратного цеха Идентифицировать как несоответствующее Профилактический ремонт ПОУ, поверка средств измерения Журнал аппаратного цеха

Подготовка производственной бактериальной закваски / ККТ3 Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, БГКП Температура молока от 94 до 96оС, время пастеризации от 44 до 46 мин. Температура закваски от 2 до 6оС, время охлаждения не более 24 ч Температура пастеризации и охлаждения, времени экспозиции Термометр, часы Каждая партия бакзаква-сок Лаборант заквасочной Идентифицировать как несоответствующее Поверка средств измерения Жарнал баклаборато-рии

Упаковка и маркировка сыра/ККТ4 Аллергены (молоко и продукты его переработки) Присутствие в маркировке информации о наличии в составе продукта молока Содержание этикетки на упаковке сыра Сравнение с образцом-эталоном Каждая упаковочная единица Оператор упаковочного отделения Перемаркировать Обучение персонала Журнал упаковочного отделения

Охлаждение и хранение в охлажденном состоянии / ККТ5 Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, БГКП Температура хранения сыра от 2 до 6оС, продолжительность хранения не более 30 дней Температура в камере охлаждения, время хранения Термометр, часы Три раза в смену (8:00, 13:00, 18:00) Кладовщик Идентифицировать как несоответствующее Профилактический ремонт камеры, поверка средств измерения Журнал склада

Разработанная и согласованная информация по существу процессов мониторинга и осуществления корректирующих действий (коррекций) подлежит размещению в протокол плана ХАССП. В таблице 2 предложен протокол плана ХАССП процесса производства мягкого сыра с ГДЛ.

Как было показано, выстроенная система управления факторами риска требует незначительного анализа конечного продукта, поскольку достаточные и действенные меры контроля встроены в процесс производства и работают на ранних стадиях.

Выводы

1. Определены пять критических контрольных точек технологического процесса производства мягкого сыра, в которых имеет место недопустимый риск, а также возможны меры по устранению или снижению риска до приемлемого уровня. Критическими контрольными точками являются процессы: пастеризация и охлаждение молока, приготовление бактериальной закваски, упаковка и маркировка сыра, охлаждение и хранение сыра в охлажденном состоянии.

2. Разработана программа мониторинга критических контрольных точек, предусматривающая закрепление персональной ответственности за предмет контроля, своевременность и качество его проведения, места фиксации записей по результатам измерений и наблюдений. Предложен перечень корректирующих действий на случай выхода критических контрольных точек за пределы допустимых значений.

Библиографический список

1. Аршакуни В. Л. От системы ХАССП — к системе менеджмента безопасности пищевой продукции по ИСО 22000 // Стандарты и качество. — 2008. — № 2. — С. 88-89.

2. Мортимор С., Уоллес К. НАССР. Практические рекомендации / пер. с англ. 3-го перераб. изд. — СПб.: ИД «Профессия», 2014. — 520 с.

3. Петрова Е.И., Тарасова Е.Ю. Разработка систем менеджмента безопасности как условие реализации требований технического регламента Таможенного союза // Молоч-нохозяйственный вестник. — 2017. — № 1 (25). — С. 158-164.

4. ГОСТ Р 51705.1-2001 Системы качества. Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП. — М.: ИПК Изд-во стандартов, 2001. — 12 с.

5. ГОСТ Р 56671-2015 Рекомендации по разработке и внедрению процедур, основанных на принципах ХАССП. -М.: Стандартинформ, 2015. — 7 с.

6. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) // Евразийская экономическая комиссия: электрон. дан. — М., 2017. — Режим доступа: http://http://www.eurasiancommission. org/ru/act/texnreg/deptexreg/tr/Documents/TR%20TS%20Pishe vayaProd.pdf, свободный. — Загл. с экрана (дата обращения 2.10.2017).

7. Мейес Т., Мортимор С. Эффективное внедрение HACCP. Учимся на опыте других. — СПб.: ИД «Профессия», 2008. — 288 с.

References

1. Arshakuni V.L. Ot sistemy KhASSP — k sisteme menedzhmenta bezopasnosti pishchevoy produktsii po ISO 22000 // Standarty i kachestvo. — 2008. — № 2. — S. 88-89.

2. Mortimor S., Uolles K. HACCP. Prakticheskie rek-omendatsii. — Per. s angl. 3-go pererab. izd. — SPb.: ID «Pro-fessiya», 2014. — 520 s.

3. Petrova E.I., Tarasova E.Yu. Razrabotka sistem menedzhmenta bezopasnosti kak uslovie realizatsii trebovaniy tekhnicheskogo reglamenta Tamozhennogo soyuza // Mo-lochnokhozyaystvennyy vestnik. — 2017. — № 1 (25). -S. 158-164.

4. GOST R 51705.1-2001 Sistemy kachestva. Upravlenie kachestvom pishchevykh produktov na osnove printsipov KhASSP. — M.: IPK Izdatelstvo standartov, 2001. — 12 s.

5. GOST R 56671-2015 Rekomendatsii po razrabotke i vnedreniyu protsedur, osnovannykh na printsipakh KhASSP. -M.: Standartinform, 2015. — 7 s.

6. Tekhnicheskiy reglament Tamozhennogo soyuza «O bezopasnosti pishchevoy produktsii» (TR TS 021/2011) [El-ektronnyy resurs] // Evraziyskaya ekonomicheskaya komissiya.

— Elektron. dan. — M., 2017. — Rezhim dostupa: http://http://www.eurasiancommission.org/ru/act/texnreg/deptexr eg/tr/Documents/TR%20TS%20PishevayaProd.pdf, svobodnyy.

— Zagl. s ekrana (data obrashcheniya 2.10.2017).

7. Meyes T., Mortimor S. Effektivnoe vnedrenie HACCP. Uchimsya na opyte drugikh. — SPb.: ID «Professiya», 2008. -288 s.

+ + +

УДК 637.066 О.М. Соболева, К.-К.А. Шилова

O.M. Soboleva, K.-K.A. Shilova

ЙОГУРТ С ПЛОДАМИ РОЖКОВОГО ДЕРЕВА И ЯГОДНЫМ НАПОЛНИТЕЛЕМ, ОБРАБОТАННЫМ В ЭЛЕКТРОМАГНИТНОМ ПОЛЕ

YOGHOURT WITH CAROB BEANS AND BERRY FILLER TREATED IN ELECTROMAGNETIC FIELD

Ключевые слова: йогурт, ягодный наполнитель, Keywords: yoghourt, berry filling, carob beans, super-high плоды рожкового дерева, кэроб, СВЧ-обработка. requency treatment.

Контрольная точка клеточного цикла — обзор

3 GAPDH — Контрольная точка клеточного цикла в клетках млекопитающих?

Контрольные точки клеточного цикла представляют собой важный механизм, с помощью которого клетки контролируют свое развитие посредством сложных процессов, которые в конечном итоге приводят к росту и делению клеток. Подробные исследования показали роль многочисленных белков, которые действуют как сигналы «стоп / вперед», когда клетки проходят каждую стадию клеточного цикла. Соответственно, те белки, которые используются клетками для этой цели, по определению имеют значение и важность.

Недавние данные свидетельствуют о том, что подрабатывающий GAPDH может быть одним из того набора белков, которые определяют развитие клеточного цикла. В первоначальном исследовании антисмысловые конструкции GAPDH использовали для изучения эффекта истощения GAPDH в серии клеток карциномы шейки матки человека (Kim et al., 1999). Эти исследования продемонстрировали не только значительное ингибирование пролиферации клеток, но и снижение эффективности образования колоний. Никакого эффекта ни в одной из экспериментальных парадигм не наблюдалось при использовании смысловых или антисмысловых конструкций.

По большей части исследования по совместному использованию GAPDH обычно не начинаются с этой целью, хотя такие исследования часто заканчиваются определением нового вида деятельности GAPDH. В качестве подтверждения этой темы, учитывая роль белка p21 в регуляции клеток, было начато исследование для определения взаимодействий белок-белок p21. Белок p21 считается важным, учитывая его взаимодействия с циклинами и с циклин-зависимыми киназами (cdk’s). Соответственно, была проведена аффинная хроматография с использованием GSTp21 ^Cip1 в качестве зонда.Этот анализ обнаружил связывающий белок 38 кДа, впоследствии идентифицированный как GAPDH. Однако, что, возможно, сбивает с толку, при использовании очищенного GAPDH связывания этого белка с матрицей аффинности обнаружено не было.

Поскольку это указывает на то, что для связывания GAPDH с p21 ^Cip1 могут потребоваться дополнительные белки, в качестве зонда использовали аффинную колонку GAPDH. В этом эксперименте был обнаружен белок 39 кДа, идентифицированный как SET, который был идентифицирован как связывающий белок p21 ^Cip1 (Примечание: он также обнаружил серию белков 13-18 кДа, идентифицированных как гистоны, что также представляет интерес в отношении GAPDH. функции подработки, описанные ранее в этой главе).Контрольные эксперименты с использованием как иммуноблоттинга, так и анализа коиммунопреципитации подтвердили это межбелковое взаимодействие.

Поскольку p21 ^Cip1 и SET могут участвовать в регуляции клеточного цикла, взаимодействие GAPDH-SET было исследовано с использованием модели голодания / добавления сыворотки сначала для синхронизации клеток, а затем для их высвобождения для пролиферации. Колокализация определялась иммуноцитохимическим методом. Эти исследования выявили преимущественную колокализацию как в S-фазе, так и в G ₂ / M. Протоколы коиммунопреципитации использовались для проверки их физической ассоциации in vivo.

Затем была определена функциональная значимость взаимодействия GAPDH – SET. В частности, известно, что SET ингибирует активность циклина B-cdk1. Анализ реакции на дозу показал, что эта активность SET снижалась под действием GAPDH. Это окажет существенное влияние на регуляцию клеточного цикла in vivo. Впоследствии взаимодействие GAPDH и SET с циклином B было подтверждено как с помощью аффинной хроматографии in vitro, так и иммунопреципитации in vivo. Соответственно, кажется, что третичный белковый комплекс может участвовать в подработке функции GAPDH.Как указано в главе 8, это может быть общим свойством взаимодействий с белками GAPDH.

Физиологическое значение этой серии исследований взаимодействия белков было изучено с использованием анализа трансфекции конструкций GAPDH, а затем определения эффекта сверхэкспрессии GAPDH на пролиферацию клеток. При использовании синхронизированных клеток, по-видимому, не было никакого эффекта на прогрессирование через S-фазу, как определено включением ( ³ H) -тимидина в ДНК. Напротив, используя иммуноцитохимический анализ митотического маркера, фосфорилированного гистоном h4, оказалось, что количество митозов в клетках, сверхэкспрессирующих GAPDH, увеличилось на 50% по сравнению с контролем.Используя иммунопреципитацию в сочетании с биохимическим анализом in vitro, было определено, что кинетика клеточного цикла активности циклина B-cdk1 изменялась в зависимости от экспрессии GAPDH, то есть его максимальная активность наблюдалась раньше, чем обычно обнаруживается в синхронно растущих клетках. На основании этих исследований было высказано предположение, что GAPDH может регулировать переход G ₂ / M. Это открытие, наряду с описанными ранее в отношении регуляции клеточного цикла транскрипции и биосинтеза мРНК GAPDH, указывает далее на критическую природу временной последовательности по отношению к связанной с клеточным циклом лунной активности GAPDH.

Значение подработки GAPDH в контроле клеточной пролиферации было снова показано исследованиями, в которых изучалась взаимосвязь между GAPDH, клеточным циклом и эффективностью химиотерапевтических агентов против рака (Phadke et al., 2009). В этих исследованиях использовались клеточные линии карциномы легких и почек человека, короткие дуплексные РНКи и два химиотерапевтических средства против рака, цитарабин и доксорубицин. Значительные результаты этого исследования показали, что истощение GAPDH приводит к снижению пролиферации клеток; накопление ячеек в G ₀ / G ₁ ; механизм, лежащий в основе этого блока клеточного цикла с участием p53 и p21; повышенная устойчивость к противораковому химиотерапевтическому агенту цитарабину (araC, цитозинарабинозид).

Снижение роста клеток в зависимости от истощения GAPDH отслеживали в трех различных линиях раковых клеток: A549, U031 [обе (эффективные по p53) и h458 (без p53)]. Введение GAPDH RNAi в p53-профильные клетки A549 и U031 устраняет пролиферацию клеток в соответствии с предыдущими исследованиями (Kim et al., 1999). Напротив, пролиферация клеток наблюдалась в клеточной линии h458 p53-null. Однако он был снижен примерно на 50% по сравнению с контролем h458. При этом это исследование было первым, указавшим на роль p53 в контроле роста клеток с помощью GAPDH.

Анализ клеточного цикла в линии A549 p53-опытных клеток показал специфические изменения в распределении клеточного цикла как функцию истощения GAPDH. В частности, процент ячеек в G ₀ / G ₁ увеличился с 57% до 77%; в фазе S он снизился с 12% до 6%, а в G ₂ / M с 22% до 11%. Это было первым признаком того, что наблюдаемое снижение количества клеток, истощенных по GAPDH, было связано с блокировкой в ​​G ₀ / G ₁ .

Поскольку разница в ответе на истощение GAPDH наблюдалась в первую очередь в клетках с активным p53, что интересно, иммуноблот-анализ продемонстрировал не только накопление p53, но также накопление p21, ингибитора cdk.Следует отметить, что при инкубации линии A549-р53-эффективных клеток как с siGAPDH, так и с sip21 уровень p21 был ниже по сравнению с пролиферацией в клетках, обработанных только siGAPDH. Однако скорость роста клеток снизилась. Эти исследования были первыми, кто показал, что GAPDH-индуцированный клеточный блок G ₀ / G ₁ опосредуется изменениями экспрессии как p53, так и p21.

Функциональное значение этого блока клеточного цикла G ₀ / G ₁ было показано путем определения влияния истощения GAPDH на эффективность двух, теперь уже классических, химиотерапевтических агентов против рака, цитарабина (araC, цитозинарабинозид) и доксорубицина. .Первый представляет собой агент, специфичный для клеточного цикла (CCS); последний — препарат, неспецифический для клеточного цикла (CCNS). Истощение GAPDH снижает чувствительность обработанных клеток к цитарабину в 50 раз, в то время как не влияет на цитотоксичность доксорубицина. Кроме того, накопление индуцированных цитарабином двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) было ниже в клетках, истощенных по GAPDH, по сравнению с контролем. Никаких различий в степени индуцированных доксорубицином DSB не наблюдалось в первом случае по сравнению со вторым. В целом, эти кумулятивные исследования демонстрируют значение не только GAPDH как белка, контролирующего рост, но также его потенциальное влияние на эффективность химиотерапии рака.

Как описано выше, эти исследования предполагают, что опосредованный истощением GAPDH блок G ₀ / G ₁ клеточного цикла может быть опосредован повышенной экспрессией p53 и cdk-p21. Последнее происходит, по-видимому, за счет опосредованной p53 подавления транскрипции cdk-p21. Интересно, что исследование, описанное выше, выявило GAPDH-опосредованный эффект клеточного цикла, опосредованный взаимодействием белка GAPDH не только с белком cdk-p21, но также с белком SET и циклином B, каждый из которых участвует с белком cdk-p21 — связанные механизмы контроля клеточного цикла (Carujo et al., 2006). Таким образом, вместе с постулируемой ролью G ₂ / M GAPDH в клеточном цикле, эти открытия в отношении GAPDH-опосредованного блока G ₀ / G ₁ снова подчеркивают сложность подработки функции GAPDH.

Контрольная точка клеточного цикла при раке: терапевтически управляемый палка о двух концах | Журнал экспериментальных и клинических исследований рака

Контрольная точка G1 / S

Путь Описание:

Первичная контрольная точка клеточного цикла G1 / S контролирует обязательство эукариотических клеток перейти через фазу G1, чтобы войти в S-фазу синтеза ДНК.Два комплекса киназ клеточного цикла, CDK4 / 6-циклин D и CDK2-циклин E, работают совместно, чтобы ослабить ингибирование динамического комплекса транскрипции, который содержит белок ретинобластомы (Rb) и E2F. В незафиксированных клетках G1-фазы гипофосфорилированный Rb связывается с факторами транскрипции E2F-DP1, образуя ингибиторный комплекс с HDAC, чтобы репрессировать ключевые нижестоящие события транскрипции. Обязательство войти в S-фазу происходит посредством последовательного фосфорилирования Rb циклином D-CDK4 / 6 и циклином E-CDK2, который диссоциирует комплекс HDAC-репрессор, обеспечивая транскрипцию генов, необходимых для репликации ДНК.В присутствии факторов роста Akt может фосфорилировать FoxO1 / 3, что ингибирует их функцию путем экспорта в ядро, тем самым обеспечивая выживание и пролиферацию клеток. Важно отметить, что множество различных стимулов осуществляют контроль контрольных точек, включая TGF-β, повреждение ДНК, репликативное старение и устранение фактора роста. Эти стимулы действуют через факторы транскрипции, индуцируя определенные члены семейств INK4 или Kip / Cip циклинзависимых ингибиторов киназ (CKI). Примечательно, что онкогенный белок поликомб Bmi1 действует как негативный регулятор экспрессии INK4A / B в стволовых клетках и раке человека.Помимо регуляции CKI, TGF-β также ингибирует транскрипцию cdc25A, фосфатазы, непосредственно необходимой для активации CDK. В критической точке конвергенции с контрольной точкой повреждения ДНК cdc25A убиквитинируется и нацеливается на деградацию через SCF убиквитин-лигазный комплекс ниже пути ATM / ATR / Chk. Однако своевременная деградация cdc25A в митозе (M-фаза) с помощью комплекса APC ubiquitin ligase позволяет прогрессировать через митоз. Кроме того, отмена фактора роста активирует GSK-3β, фосфорилируя циклин D, что приводит к его быстрому убиквитинированию и протеасомной деградации.В совокупности убиквитин / протеасомозависимая деградация и ядерный экспорт являются механизмами, обычно используемыми для эффективного снижения концентрации белков, контролирующих клеточный цикл. Важно отметить, что комплексы Cyclin D1 / CKD4 / 6 исследуются в качестве терапевтических мишеней для лечения рака, поскольку исследователи обнаружили, что эта контрольная точка неизменно дерегулируется в опухолях человека.

Клеточный цикл и рак | PNAS

Последние исследования в области клеточного цикла регулирование и рак, каждый по отдельности, стал бы яркими примерами исследования в «Frontiers of Science.”Однако некоторые из самых раскрытие информации по обеим темам получено из пересечение двух полей. Цель этого резюме — познакомить с основами клеточного цикла, рака и их пересечения, а также затем описать исследования двух лабораторий, которые были представлены в сеансе. Более комплексное лечение этих предметов, помимо этого описания для широкой аудитории, содержится в нескольких обзоры (1–5).

Процесс репликации ДНК и деления клетки можно описать как серия скоординированных событий, составляющих «клеточное деление цикл », проиллюстрированный для клеток млекопитающих на рис.1 (подробности см. В легенде). Как минимум два типа механизмов контроля клеточного цикла: каскад белков фосфорилирования, которые переводят клетку с одной стадии на другую и набор контрольно-пропускных пунктов, отслеживающих завершение критических событий и задержку при необходимости переход к следующему этапу. Первый тип контроля включает в себя строго регулируемое семейство киназ (2). Активация киназы обычно требуется связь со второй субъединицей, которая временно экспрессируется в соответствующий период клеточного цикла; в периодическая субъединица «циклина» связывается со своим партнером «Циклин-зависимая киназа» (CDK) для создания активного комплекса с уникальная субстратная специфичность.Регуляторное фосфорилирование и дефосфорилирование регулирует активность комплексов CDK-циклин, обеспечение четко очерченных переходов между стадиями клеточного цикла. в в будущем дополнительное молекулярное определение клеточного цикла может привести к более сложная прогрессия, чем показано на рис.1.

Схематическое изображение клетки млекопитающего. цикл. В каждом цикле деления клетки хромосомы реплицируются один раз. (Синтез ДНК или S-фаза) и разделены, чтобы создать два генетически идентичные дочерние клетки (митоз или М-фаза).Эти события разнесены по интервалам роста и реорганизации (фазы разрыва G ₁ и G ₂ ). Клетки могут прекратить цикл после деления, попадая в состояние покоя (G ₀ ). Обязательство пройти весь цикл выполнен в конце G ₁ . Прогресс в цикле частично осуществляется за счет регулируемой активности многочисленных CDK-циклинов. комплексы, указанные здесь и описанные в тексте.

Второй тип регуляции клеточного цикла — контроль контрольных точек. надзорный.Это не существенная часть цикла. машины. Контрольные точки клеточного цикла обнаруживают недостатки в критических событиях, таких как как репликация ДНК и сегрегация хромосом (4). Когда контрольно-пропускные пункты активированные, например, недостаточно реплицированной или поврежденной ДНК, сигналы передается в механизм развития клеточного цикла. Эти сигналы вызывают задержка развития цикла до тех пор, пока опасность мутации не исчезнет. предотвращено. Потому что функция контрольной точки требуется не в каждой ячейке цикла, степень функции контрольной точки не так очевидна, как у компоненты, являющиеся неотъемлемой частью процесса, такие как CDK.

На первый взгляд связь между клеточным циклом и раком очевидно: механизмы клеточного цикла контролируют пролиферацию клеток и рак заболевание несоответствующей клеточной пролиферации. По сути, все раковые образования допускают существование слишком большого количества клеток. Однако эта ячейка избыток численности связан в замкнутом круге с сокращением чувствительность к сигналам, которые обычно говорят клетке прикрепляться, дифференцировать или умереть. Эта комбинация измененных свойств увеличивает сложность расшифровки того, какие изменения в первую очередь ответственны для того, чтобы вызвать рак.

Первые генетические изменения, способствующие развитию рака были мутациями с усилением функции (6). Эти мутации определяют набор «Онкогены», которые являются мутантными версиями нормальных клеточных «Протоонкогены». Продукты протоонкогенов функционируют в пути передачи сигналов, которые способствуют пролиферации клеток. Тем не мение, трансформация отдельными онкогенами может быть избыточной (мутация один из нескольких генов приведет к трансформации) или может быть клеточным типоспецифичный (мутации трансформируют некоторые клетки, но не оказывают никакого влияния на других).Это говорит о том, что множественные различные пути генетического изменения приводят к раку, но не все пути играют одинаковую роль в каждом типе ячеек.

В последнее время значение мутаций потери функции в канцерогенез становится все более очевидным (7). Мутации в этих так называемые гены-супрессоры опухолей были первоначально признаны играют важную роль в унаследованной предрасположенности к раку. Потому что инактивация обеих копий гена-супрессора опухоли необходима для потеря функции, особи, гетерозиготные по мутациям в локусе фенотипически нормальные.Таким образом, в отличие от мутаций с усилением функции, мутации опухолевого супрессора с потерей функции могут быть переданы в гене пул без прямых вредных последствий. Однако отдельные лица гетерозиготные по опухолевым супрессорам мутации с большей вероятностью разовьются рак, потому что требуется только одно мутационное событие для предотвращения синтез любого функционального генного продукта.

Теперь выясняется, что мутации гена-супрессора опухоли очень высоки. может способствовать продвижению и даже может потребоваться для большого количества спонтанные, а также наследственные формы рака (5).Но какие функции продуктов гена-супрессора опухоли в нормальной клетке? Несмотря на то что это тема для будущих исследований, есть свидетельства того, что несколько генов-супрессоров опухолей кодируют белки, которые негативно регулируют прогрессирование клеточного цикла. Утрата функции гена-супрессора опухоли продукт pRb, например, будет высвобождать E2F активаторы транскрипции без необходимости фосфорилирования и, следовательно, обход нормального отрицательного регулирования, контролирующего вход в цикл (Инжир.1). Потеря продукта гена-супрессора опухоли p16 будет иметь аналогичное последствие, высвобождение E2F за счет увеличения фосфорилирования pRb (Рисунок 1). Кроме того, развитие клеточного цикла может быть остановлено на нескольких указывает на продукт гена супрессора опухоли p53, активированный в ответ к контрольным точкам, распознающим ДНК и, возможно, также повреждение хромосом; утрата p53 устранит этот тормоз для езды на велосипеде (8).

По какому молекулярному пути происходит потеря регуляции клеточного цикла в организм привести к раку? С какими генетическими изменениями могут взаимодействовать осуществить выход раковой клетки из нормального баланса клеток рост? Тайлер Джекс описал результаты своей лаборатории, которые ответили на эти вопросы, используя мышей и клеточные линии, полученные от мышей которые были созданы без индивидуального гена-супрессора опухоли продукты.Чтобы создать «нокаутных» мышей, эмбриональные стволовые клетки, которые могут быть позже введены обратно в развивающееся животное, подлежат направленный мутагенез интересующего гена. Клетки с одним мутантом копию гена вводят ранним эмбрионам, и мышей, которые используют инъецированные клетки для образования ткани зародышевой линии отбираются для разведения. Некоторые потомство будет полностью гетерозиготным по мутантному гену; эти мыши затем могут быть выведены для получения гомозиготных мутантных животных.

Один важный вывод из исследований мышей, лишенных опухолевого супрессора. генов — это зависимость сбалансированного количества клеток не только от регуляции пролиферации клеток, но также и регуляции клеточной смерть.В прошлом гибель клеток считалась случайным отказом нормальная функция клеток. Однако часто бывает наоборот: генетический исследования гибели клеток указывают на необходимость активных сигналов смерти и направленное выполнение (для обзора белков, участвующих в гибели клеток) см. исх. 9). Одна коллекция экспериментов иллюстрирует важность сочетания генетических изменений, дерегулирующих обе клетки пролиферация и гибель клеток (ссылка 10; см. также ссылки 11 и 12). Инактивация pRb во время эмбриогенеза способствует развитию несоответствующих клеток циклическая активность.Это следует из роли pRb в отрицательном регулирующий вход в клеточный цикл (рис. 1). В отличие от ожидания, однако, повышенная активность клеточного цикла в Rb null мышей не приводит к чистому увеличению количества клеток. Это связано с соразмерное увеличение гибели клеток, которое, в частности, устраняет клетки с аномальным циклом. Эта гибель клеток часто зависит от функция p53, как показано при анализе RB / p53 двойные мутантные эмбрионы.

Функция p53 в приговоре неправильно растущих клеток к смерть имеет значение для развития рака и химиотерапии.Мышиный опухоли с функциональным р53 реагируют на химиотерапию, способствуя их собственная кончина, но те, у кого отсутствует p53, обычно этого не происходит (13). Баланс между клеточной пролиферацией и гибелью вероятных функций во время разработка для создания карты тела с мелким рисунком. Эта нормальная функция пути гибели клеток и возможности склонить чашу весов многое навстречу смерти при некоторых дегенеративных заболеваниях будет захватывающим будущим темы исследования.

Очевидно, что продукты регуляторных генов клеточного цикла имеют решающее значение. детерминанты прогрессирования рака.Но как именно последовательность генов изменения и отсутствующие регулирующие компоненты влияют на функционирование механизм клеточного цикла? Имея в руках молекулярные детали белковые структуры могли бы ответить на этот вопрос, а также предложили бы стратегии лечения рака. Никола Павлетич описал исследование в его лаборатория, которая дала структуры высокого разрешения p53 и неактивных и активных состояний CDK2. Эти структуры были определены по дифрактограммам очищенных кристаллизованных белков.

Хотя p53 может выполнять множество ролей в клетке, он лучше всего охарактеризован функционирует как активатор транскрипции. Остатки p53, которые часто мутируют в раковых клетках, имеют решающее значение для связывания ДНК (14). Совместная кристаллическая структура р53-ДНК показала, что они часто мутировавшие остатки складываются вместе в одну область поверхности белок (15). Таким образом, мутации, способствующие развитию рака, происходят повсюду. первичная последовательность белка фактически сгруппирована в одну функциональная область.

Недавние исследования были сосредоточены на структурных основах регулирования CDK, используя CDK2 в качестве модельной системы (для обзора регуляторных механизмы см. исх. 2). В клетках млекопитающих CDK2 функционирует в S-фазе. с циклином А в качестве партнера (рис. 1). Ассоциация циклина А модифицирует ранее определенную структуру CDK2 (16) путем переориентации каталитически критическая глутаминовая кислота в каталитическую щель и удаление регуляторной петли, которая может блокировать доступ белка субстрат для связывания АТФ (17).Связывание циклина А стимулирует активность CDK2, но для полной активации требуется фосфорилирование треонина-160. Кристаллическая структура треонин-фосфорилированного CDK2 в комплексе с циклин A обнаруживает конформационные изменения в сайте связывания субстрата а также усиление взаимодействия CDK2-циклин A (18).

Наконец, один механизм инактивации CDK2-cyclin A комплекс: связывание ингибитора p27 (19). Со-кристаллы CDK2 – циклин A с N-концевым ингибиторным доменом p27 показывают, что связанный p27 физически блокирует активный сайт, вставляя себя в каталитическая щель.Кроме того, ассоциация p27 изменяет структуру «Крыша» сайта связывания АТФ и блокирует предполагаемый белок область стыковки субстрата на циклине А. С этими структурными Имея в виду модификации, можно создать небольшие молекулы это будет иметь тот же эффект: блокирует активность CDK, тем самым останавливая цикл раковых клеток идет своим чередом.

СОКРАЩЕНИЕ

CDK,

циклинзависимая киназа

• Авторские права © 1997, Национальная академия наук США

«МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЫКЛЮЧАЕТ, ЧТО G2 / M ПЕРЕПРЕВЗИВАЕТ ПЕРЕПРАВКУЮ ТОЧКУ, СОЗДАЕТ A», Хуэй Джу Сие

Идентификатор ORCID автора

орцид.org / 0000-0002-2583-7670

Название степени

Доктор философских наук

Аннотация

Контрольные точки клеточного цикла определяют, соответствуют ли клетки требованиям для прохождения следующей стадии. В ответ на повреждение ДНК то, как клетки активируют контрольные точки, хорошо изучено, но мало известно о деактивации (восстановлении) контрольных точек, которая напрямую влияет на судьбу клеток. В опухолевых клетках сигнальная сеть была изменена из-за эпигенетических и генетических изменений, которые приводят к устойчивости к контролю клеточного цикла и, следовательно, устойчивости к химиотерапии или лучевой терапии.Следовательно, очень важно идентифицировать молекулы, необходимые для восстановления контрольной точки или адаптации после повреждения ДНК.

Для достижения этой цели мы провели мультидисциплинарное исследование, объединяющее данные массива белков с обращенной фазой (RPPA), молекулярную биологию и математическое моделирование для систематической идентификации молекул, необходимых для восстановления контрольной точки повреждения ДНК. Комплекс mTOR 1 (mTORC1) играет важную роль в регуляции митотического входа после облучения. Ингибирование пути mTOR задерживало восстановление контрольной точки G2 / M, тогда как TSC2-нулевые клетки с гиперактивностью mTORC1 показали противоположные результаты.Кроме того, наше механистическое исследование показало, что сигнальный путь mTOR контролирует транскрипционную программу митотического входа посредством регуляции гистон-лизиндеметилазы KDM4B, которая необходима для эпигенетической регуляции ключевых генов, связанных с митозом, включая CCNB1 и PLK1 .

Учитывая ускоренное восстановление контрольной точки G2 / M в TSC2-нулевых клетках с гиперактивностью mTORC1, мы предположили, что дальнейшая отмена контрольной точки G2 / M может способствовать митотической катастрофе и выборочно убивать клетки.Как мы и ожидали, TSC2-нулевые клетки были более чувствительны к ингибитору WEE1, негативному регулятору митотического входа, по сравнению с клетками дикого типа.

Итак, , мы сообщили о новом механизме передачи сигналов mTORC1 в регуляции программы транскрипции, необходимой для восстановления контрольной точки G2 / M после повреждения ДНК. Этот механизм обеспечил терапевтическую стратегию для пациентов с TSC с гиперактивностью mTORC1 с использованием ингибитора WEE1, который может быть использован в клинических испытаниях.

Ключевые слова

клеточный цикл, ионизирующее излучение, повреждение ДНК, контрольная точка G2 / M, восстановление контрольной точки, mTOR, вывод аминокислот, митотическая катастрофа, ингибитор WEE1, комплекс туберозного склероза

Сигнализация контрольной точки клеточного цикла через киназы ATM и ATR

1. Роберт Т. Абрахам 1

1. Отдел фармакологии и биологии рака, Медицинский центр Университета Дьюка, Дарем, Северная Каролина 27710, США

Геномы эукариотических клеток постоянно подвергаются атакам со стороны агентов окружающей среды (например,g., УФ-свет и химически активные вещества) а также побочные продукты нормального внутриклеточного метаболизма (например, реактивные промежуточные соединения кислорода и неточно воспроизведенные ДНК). Независимо от происхождения генетическое повреждение угрожает выживанию клеток и, у многоклеточных животных, приводит к органной недостаточности, иммунодефициту и т. Д. рак и другие патологические последствия. Чтобы гарантировать, что клетки передают точные копии своих геномов следующему поколению, Эволюция наложила на основной механизм клеточного цикла ряд путей наблюдения, названных контрольными точками клеточного цикла.Общая функция этих контрольных точек — обнаружение поврежденной или аномально структурированной ДНК и координация клеточного цикла. прогрессирование с репарацией ДНК. Как правило, активация контрольной точки клеточного цикла замедляет или останавливает развитие клеточного цикла, тем самым дает время для соответствующих механизмов восстановления для исправления генетических повреждений, прежде чем они будут переданы следующему поколению дочерних клеток. В некоторых типах клеток, таких как тимоциты, белки контрольных точек связывают разрывы цепи ДНК с апоптотической клеткой. смерть через индукцию p53.Следовательно, потеря одной из двух биохимически связанных киназ контрольной точки, ATM или Chk2, как это ни парадоксально. повышает устойчивость незрелых (CD4 ⁺ CD8 ⁺ ) Т-клеток к апоптозу, индуцированному ионизирующим излучением (ИК) (Xu and Baltimore 1996; Hirao et al. 2000).

В более широком контексте контрольные точки клеточного цикла можно рассматривать как пути передачи сигналов, которые связывают темп ключевого клеточного цикла. фазовые переходы к своевременному и точному завершению предшествующих, условных событий.Важно понимать, что контрольно-пропускной пункт функции наблюдения не ограничиваются только событиями внутри ядерно-внеядерных параметров, такими как рост доступность факторов и накопление клеточной массы также определяют темп клеточного цикла (Stocker and Hafen 2000). Однако для целей этого обзора мы сосредоточимся исключительно на подмножестве контрольных точек, которые отслеживают статус. и структура хромосомной ДНК в ходе клеточного цикла (рис.1). Эти контрольные точки содержат в качестве наиболее проксимальных сигнальных элементов сенсорные белки, которые сканируют хроматин для частичного сканирования. реплицированная ДНК, разрывы цепей ДНК или другие аномалии и преобразование этих стимулов, полученных из ДНК, в биохимические сигналы которые модулируют функции специфических нижестоящих белков-мишеней.

Общий сигнальный путь контрольной точки клеточного цикла.(ROI) Промежуточный реактивный кислород.

Несмотря на недавний всплеск информации о молекулярных компонентах контрольных точек клеточного цикла в эукариотических клетках, у нас все еще есть только скелетное понимание как идентичности датчиков повреждения ДНК, так и механизмов, посредством которых они инициируют и прекращают активацию контрольно-пропускных пунктов. Однако члены группы белков контрольной точки Rad, которые включают Rad17, Rad1, Rad9, Rad26 и Hus1 (номенклатура основана на продуктах гена Schizosaccharomyces pombe ), широко экспрессируются во всех эукариотических клетках и являются основными подозреваемыми в линейке возможных повреждений ДНК. датчики (Green et al.2000; О’Коннелл и др. 2000). Три из этих белков Rad, Rad1, Rad9 и Hus1, проявляют структурное сходство с ядерным антигеном пролиферирующих клеток. (PCNA), и накопленные данные подтверждают идею о том, что это сходство может распространяться и на функцию (Thelen et al. 1999; Burtelow et al. 2000). Во время репликации ДНК PCNA образует гомотримерный комплекс, который окружает ДНК, создавая «скользящий зажим», удерживающий ДНК. полимеразы δ к цепи ДНК. Rad1, Rad9 и Hus1 также обнаруживаются в виде гетеротримерного комплекса в интактных клетках, и он имеет Было высказано предположение, что комплекс Rad1-Rad9-Hus1 окружает ДНК на участках повреждения или рядом с ними, образуя скользящий зажим контрольной точки. (CSC) (O’Connell et al.2000), который мог бы служить ядром для вербовки сигнального механизма контрольно-пропускных пунктов к сломанным или ненормально структурированным ДНК. Аналогия между PCNA и комплексом Rad1 – Rad9 – Hus1 простирается еще дальше. Загрузка зажима PCNA на ДНК контролируется комплексом нагрузки зажима, фактором репликации C (RFC). Интересно, что еще один член семьи Рэд, Rad17 имеет гомологию с RFC-подблоками и, по сути, ассоциируется с RFC-подблоками, чтобы сформировать предполагаемую контрольную точку загрузки. комплекс (CLC), который управляет взаимодействием CSC Rad1-Rad9-Hus1 с поврежденной ДНК (Green et al.2000; О’Коннелл и др. 2000). Хотя эта модель увлекательна, строгие биохимические оценки взаимодействия между комплексами CLC и CSC, и взаимодействия обоих комплексов с поврежденным хроматином необходимы, прежде чем модель может быть принята без оговорок.

Двигаясь вниз по потоку от сенсорного устройства, мы находим дополнительные аналогии между путями контрольных точек и стандартной передачей сигнала. каскады, в которых оба сильно зависят от фосфорилирования белков для передачи и амплификации сигнала.Контрольная точка клеточного цикла киназы принадлежат в значительной степени, если не полностью, к семейству серин-треониновых киназ, и белки, на которые они нацелены, для модификации колеблются от более низких членов самого пути контрольной точки (например, дополнительных протеинкиназ или некаталитических каркасов белков) к дистальным элементам, которые опосредуют остановку клеточного цикла и ответы репарации ДНК (например, фосфатаза Cdc25C или тип 2A гистоны) (Rogakou et al.1999; Даунс и др. 2000; О’Коннелл и др. 2000; Paull et al. 2000).

На самых ранних стадиях активации контрольной точки датчики повреждения ДНК передают информацию через все еще неуловимый механизм, к членам недавно определенного семейства киназ, родственных фосфоинозитид-3-киназе (PIKKs; Tibbetts and Abraham 2000). В клетках млекопитающих два члена семейства PIKK, ATM (ataxia-telangiectasiamutated) и ATR (ATM и Rad 3-related), играют критическую роль в ранней передаче сигнала через контрольные точки клеточного цикла.Гомологи ATM и ATR являются присутствует во всех типах эукариотических клеток, исследованных на сегодняшний день, включая почкующиеся и делящиеся дрожжи. Настоящий обзор посвящен биохимия и функция киназ контрольных точек млекопитающих, ATM и ATR, с лишь краткими ссылками на прецедент литература по модельным системам дрожжей. Для получения дополнительной информации о дрожжевых гомологах ATM / ATR или более глобального обзора Что касается контрольных точек клеточного цикла, читателю отсылают к нескольким недавним обзорам (Elledge 1996; Weinert 1997; Lowndes and Murguia 2000; Tibbetts and Abraham 2000; Zhou and Elledge 2000).

Семейство PIKK

Как упоминалось ранее, ATM и ATR принадлежат к уникальному по структуре семейству протеин-серин-треониновых киназ, каталитические домены имеют четкое эволюционное родство с таковыми фосфоинозитид-3-киназ млекопитающих и дрожжей (Hunter 1995; Zakian 1995; Tibbetts and Abraham 2000). Молекулярное клонирование кДНК, кодирующих PIKK, началось с выделения продуктов-мишеней генов рапамицина. ( TOR1 и TOR2 ) из ​​ Saccharomyces cerevisiae (Cafferkey et al.1994; Helliwell et al. 1994) с последующим клонированием ортолога млекопитающих, названного mTOR (также называемого FRAP или RAFT1 ) (Brown et al. 1994; Sabatini et al. 1994; Sabers et al. 1995). Как указывает аббревиатура TOR, эти члены семейства PIKK являются белками-мишенями мощного противогрибкового и иммунодепрессивного препарата. агент, рапамицин (обзоры см. Abraham and Wiederrecht 1996; Gingras et al. 2001). Вскоре после этого появилась масса сообщений, описывающих серию белков дрожжей, мух, червей и млекопитающих, которые также экспрессировали характерный фосфоинозитид-3-киназоподобный каталитический домен (Zakian 1995; Tibbetts and Abraham 2000).Одна из клонированных кДНК, названная ATM , привлекла всеобщее внимание, поскольку мутации в этом гене лежат в основе наследственного нарушения хромосомной нестабильности, атаксия-телеангиэктазия (А-Т) (Савицкий и др., 1995). Вслед за этими первоначальными статьями кДНК ATR была обнаружена во время поиска в базе данных EST дополнительных генных продуктов, несущих mTOR / FRAP-подобный каталитический домен. (Cimprich et al. 1996).

Недавние исследования на черве Caenorhabditis elegans и в клетках человека идентифицировали еще одну большую (~ 390 кДа) протеинкиназу, каталитический домен которой указывает на принадлежность к в семье ПИКК.Ген C. elegans , SMG-1 , кодирует предполагаемую протеинкиназу, которая играет важную роль в элиминации видов РНК, содержащих преждевременную терминацию. кодонов, процесс, называемый нонсенс-опосредованным распадом мРНК (NMD; Maquat 2000). Впоследствии член семейства PIKK человека, несущий региональную гомологию последовательностей с SMG-1, был клонирован независимо, по меньшей мере, две исследовательские группы (Denning et al.2001; K.M. Brumbaugh, D.M. Otterness и R.Т. Абрахам, в разработке). Хотя кДНК человека была обозначена как hSMG-1 одной группой (Denning et al. 2001), мы предполагаем, что это название останется условным до тех пор, пока однозначно не будет показана роль этого члена семейства PIKK в NMD. Наш собственные результаты показывают, что hSMG1 обнаруживается как в ядре, так и в цитоплазме и, как ATM и ATR, проявляет фосфотрансферазу активность в отношении различных белков, содержащих мотивы Ser-Gln, в условиях анализа in vitro.На этой ранней стадии кажется вполне вероятно, что предполагаемый гомолог hSmg1 присоединится к ATM и ATR в качестве стресс-чувствительной протеинкиназы, и что, кроме того, к его предполагаемой роли в NMD, это интригующее дополнение к семейству PIKK предложит дальнейшее понимание вызванных стрессом передача сигналов в клетках млекопитающих.

В дополнение к гомологии последовательностей в каталитических доменах члены семейства PIKK демонстрируют сходную общую структурную организация (см. рис.2 для примеров). По сравнению с другими киназами (белками или липидами) PIKK сразу выделяются как очень большие полипептиды, с молекулярными массами от ~ 300 кДа до> 500 кДа. Каталитические домены (~ 300 аминокислот) членов семейства PIKK расположены около их карбоксильных концов и фланкированы двумя слабо консервативными доменами, называемыми FAT (FRAP / ATM / TRRAP) и FATC («C» обозначает карбокси-конец) (Bosotti et al. 2000). Хотя домены FAT / FATC не содержат идентифицируемых каталитических последовательностей, тот факт, что эти домены всегда экспрессируются в парах выдвинула еще не проверенную гипотезу о том, что они взаимодействуют внутримолекулярным образом и тем самым регулируют конформация вставленного киназного домена (Bosotti et al.2000). Несмотря на сходство последовательностей с фосфоинозитидкиназами, каталитические домены PIKK, по-видимому, переносят фосфат исключительно на белковые, а не на липидные субстраты.

Принципиальные схемы структур ATM и ATR. Для каждого белка показаны известные структурные домены с номерами над ATR. диаграмма, показывающая процент идентичности / сходства первичной аминокислотной последовательности ATR по сравнению с последовательностью ATM.Цифры на справа от каждой диаграммы представлено общее количество аминокислот для каждого полипептида на основе предсказанной открытой рамки считывания. Домены FAT и FATC (C) выровнены для ATM и ATR (подробные сведения о доменах FAT см. В тексте). Никакой значительной гомологии обнаружено не было. между предсказанными доменами FATC этих двух белков. Каталитический домен, связанный с PI 3-киназой (PI3Kc), также показан для ATM (остатки 2715–3011) и ATR (остатки 2324–2627).Аминоконцевой заштрихованный прямоугольник указывает на функционально неопределенное область гомологии между ATM (остатки 1493–1773) и ATR (остатки 1191–1463). Выравнивание последовательностей проводили с алгоритм поиска компакт-дисков программы NCBI Blast 2. (aa) Аминокислоты.

Текущие члены семейства PIKK могут быть сгруппированы в шесть подсемейств на основе как гомологии последовательностей, так и функций. (Durocher and Jackson 2001) (Таблица 1).Известно, что представители млекопитающих пяти из шести подсемейств фосфорилируют белковые субстраты по серину или треонину. остатки. Считается, что в клетках млекопитающих ATM и ATR разделяют обязанности апикальных протеинкиназ во всех известных контрольные точки клеточного цикла, за возможным исключением контрольной точки митотического веретена, которая активируется обработкой нокодазол, ингибитор полимеризации микротрубочек. Каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK _cs ) функционирует как гетеротримерный комплекс, содержащий две субъединицы Ku (Ku-70 и Ku-80), и вносит свой собственный решающий вклад. к поддержанию генома путем наблюдения за путем негомологичного соединения концов (NHEJ) репарации двухцепочечных разрывов ДНК (dsb) (Smith and Jackson 1999).С другой стороны, mTOR не играет заметной роли в надзоре за геномом; скорее, этот PIKK координирует прогрессирование фазы G ₁ с поступлением питательных веществ и факторов роста (Gingras et al. 2001). Как обсуждалось ранее, совсем недавно в этот список добавлен hSMG-1, у которого нет дрожжевых аналогов, но он основан на Гомология последовательности с белком Caenorhabditis elegans SMG-1, предположительно, функционирует в NMD (Denning 2001). Наша группа клонировала частично перекрывающуюся открытую рамку считывания, и мы условно назвали кодируемый полипептид ATX (K.М. Брамбо, Д. Оттернес и Р. Авраам, в процессе подготовки). Наконец, члены подсемейства TRAPP экспрессируют каталитические домены, которые выдержали дезинфицирующие мутации во время эволюции эукариот (Grant et al. 1998). Последние белки могут функционировать как молекулярные каркасы во время транскрипции эукариотических генов (McMahon et al. 1998).

Организация подсемейств PIKK в клетках человека и дрожжей

Биохимия киназ ATM и ATR

Прежде чем приступить к обсуждению ролей ATM и ATR в сигнализации контрольных точек, представляется целесообразным рассмотреть текущее состояние знаний об их активности протеинкиназ, так как многие лаборатории активно проводят идентификацию субстратов in vivo для каталитических доменов ATM и ATR.Первый член семейства PIKK, который можно охарактеризовать как белок киназой была ДНК-ПК (Готтлиб и Джексон, 1993; Смит и др., 1999). Как и большинство протеинкиназ, частично очищенные препараты DNA-PK проявляли Mg ²⁺ -зависимую серин-треонинкиназную активность в присутствии АТФ и субстрата (например, фактора транскрипции SP1; Gottlieb and Jackson 1993; Hartley et al. . 1995). В соответствии с его ролью в передаче сигналов во время репарации dsb ДНК, киназная активность ДНК-PK in vitro была оптимальной, когда оба фермент и субстрат были связаны с одним и тем же фрагментом ДНК (Gottlieb and Jackson 1993).Кроме того, предпочтительной последовательностью-мишенью для фосфорилирования ДНК-PK был серин или треонин, а затем глутамин. на позиции +1. Следовательно, DNA-PK обычно идентифицируется как «S / T-Q-направленная киназа» на основе однобуквенной аминокислоты. код для сайта консенсусного фосфорилирования.

Доступность антител, специфичных к ATM и ATR, позволила исследователям определить, экспрессируются ли также эти два PIKK. активность протеинкиназы, по крайней мере, в пробирке.Анализы иммунных комплексов киназ быстро показали, что, как и DNA-PK, ATM и ATR демонстрирует S / T-Q-направленную активность киназ в условиях in vitro и является физиологически релевантным субстратом для обе протеинкиназы были p53 (Banin et al. 1998; Canman et al. 1998; Tibbetts et al. 1999; Ziv et al. 2000). Основным сайтом фосфорилирования in vitro для ATM и ATR был Ser 15, который находится в контексте последовательности LSQE (сайт фосфорилирования подчеркнут). Интересно, что все охарактеризованные на сегодняшний день PIKK, млекопитающие или другие, функционируют как S / T-Q-направленные киназы, за заметным исключением TOR белков дрожжей и млекопитающих.В случае mTOR фосфорилирование из наиболее охарактеризованного белкового субстрата PHAS-I (также называемый 4E-BP1) встречается в основном на двух остатках треонина (Thr 36 и Thr 45), вложенные в дублированные последовательности STTPGG (Brunn et al. 1997a, b; Gingras et al. 1999, 2001). Однако mTOR не может фосфорилировать Ser 15 в p53 или сайты S / T-Q в других белках, которые являются известными мишенями для ATM / ATR. (R.T. Abraham, неопубликовано). Читателя не должны вводить в заблуждение протоколы анализа киназ ATM и ATR, в которых в качестве субстрата используется PHAS-I. (е.г., Банин и др. 1998; Ян и Кастан 2000). Полипептид PHAS-I богат остатками серина и треонина и, по сути, содержит три сайта S / T-Q, один из которых (Ser 111) фосфорилируется с помощью ATM или ATR in vitro (Yang and Kastan 2000; R.T. Abraham, неопубликовано). Потенциальное значение фосфорилирования Ser 111 с помощью ATM для функции PHAS-I (Yang and Kastan 2000) обсуждается в следующем разделе этого обзора. Тем не менее, основные сайты фосфорилирования mTOR, Thr 36 и Thr 45, являются не нацелены ни на ATM, ни на ATR в анализах киназ иммунных комплексов.

Два параметра, относящиеся к тестам протеинкиназы для ATM и ATR, заслуживают упоминания, поскольку оба вызывают некоторую осторожность. примечания относительно степени, в которой активность, определенная in vitro, отражает реальную ситуацию в интактных клетках. Первый, протеинкиназная активность ATM, но не ATR или DNA-PK, весьма чувствительна к ингибированию неионными детергентами (е.g., Triton X-100, NP-40), обычно используемых для приготовления экстрактов целых клеток или ядер (Gottlieb and Jackson 1993; Sarkaria et al. 1998, 1999; Yavuzer et al. 1998). Ингибирующее действие некоторых неионогенных детергентов на активность киназы ATM не беспрецедентно в том смысле, что подобное Результат был получен во время первоначальной характеристики каталитической активности mTOR (Brunn et al. 1997a). В обоих случаях проблема с моющим средством была решена путем замены Triton X-100 / NP-40 на менее жесткие. моющее средство (например,g., Tween-20) в буфере для лизиса клеток (Brunn et al. 1997a; Banin et al. 1998; Sarkaria et al. 1998; Tibbetts et al. 1999; Ziv et al. 2000). Хотя объяснение остается неясным, ингибирующие эффекты неионных детергентов на активность киназы ATM могут отражать либо нарушение внутримолекулярных взаимодействий, необходимых для сохранения нативной конформации каталитического домена или потеря регуляторного белка или липидных партнеров в процессе экстракции и очистки.

Активности протеинкиназ ATM и ATR, измеренные в анализах киназ иммунных комплексов, также обнаруживают необычно сильные зависимости о наличии миллимолярных концентраций Mn ²⁺ в буфере для анализа киназы. В условиях пробирки оказывается, что присутствие комплекса Mn ²⁺ –ATP практически необходимо для фосфорилирования различных субстратов с помощью ATM и ATR (Kim et al.1999; Чан и др. 2000; R.T. Авраам, неопубликовано). Опять же, это свойство экстремальной зависимости Mn ²⁺ является общим с mTOR (Brunn et al. 1997a). Каталитическая активность многих обычных протеинкиназ (например, протеинтирозинкиназ семейства Src) стимулируется добавлением Mn ²⁺ вместо Mg ²⁺ в качестве АТФ-связывающего кофактора в киназном реакционном буфере (Cooper and King 1986). Однако тот факт, что ATM и ATR демонстрируют практически неопределяемую активность фосфотрансферазы в присутствии физиологических донор фосфата, Mg ²⁺ –ATP, действительно вызывает вопросы об их действительной активности в интактных клетках.Как кофактор переноса фосфата от АТФ к субстрат, Mn ²⁺ по своей природе намного более активен, чем Mg ²⁺ (Schieven and Martin 1988). Возможно, низкие уровни фосфорилирующей активности, наблюдаемые в присутствии комплексов Mg ²⁺ –ATP, точно отражают тот факт, что ATM и ATR переключают свои соответствующие белковые субстраты при относительно низких ставки в неповрежденных клетках. Этот сценарий хорошо согласуется с идеей, что фосфорилирование субстрата с помощью ATM / ATR в контексте комплекса распознавания повреждений, связанных с ДНК, придает большее значение пространственно ограниченной модификации субстрата, чем усиление сигнала за счет быстрого фосфорилирования многих молекул одного и того же белка-мишени.Альтернатива и в равной степени правдоподобным объяснением является то, что процессы экстракции и очистки ставят под угрозу обычно зависящую от Mg ²⁺ киназную активность ATM / ATR до такой степени, что значительная активность in vitro может быть визуализирована только в присутствии комплексов Mn ²⁺ –АТФ.

Несмотря на эти неопределенности, недавние исследования пролили некоторый значимый свет на предпочтительные последовательности-мишени для фосфорилирования. через банкомат и банкомат.Один подход был основан на более раннем открытии, что ATM фосфорилирует физиологически релевантный субстрат, p53, исключительно внутри мотива S-Q, начинающегося с Ser 15 (Siliciano et al. 1997; Banin et al. 1998). Кастан и его коллеги создали панель слитых белков глутатион S-трансфераза (GST) –p53, в которой остатки, окружающие сайт-мишень ATM / ATR, Ser 15, систематически варьировался (Kim et al. 1999). Общий вывод из этих экспериментов заключался в том, что гидрофобные или кислотные остатки, окружающие целевой Ser-Gln мотив благоприятствовал фосфорилированию остатка Ser с помощью иммуноочищенного АТМ, тогда как положительно заряженные аминокислоты были ингибирующими.Кроме того, ATM продемонстрировал сильное предпочтение Ser над Thr в качестве фосфоакцепторного сайта, по крайней мере, в контексте Аминоконцевая последовательность р53. Вторая группа исследователей использовала итеративный подход к скринингу библиотеки пептидов для определения оптимальный контекст последовательности для фосфорилирования ATM (O’Neill et al. 2000). Эти усилия идентифицировали консенсусный сайт фосфорилирования [(M / F) — (Q / P) -L-S-Q- (E / Q)], который находился в разумном согласии с тем, что было определено Кастаном и соавторами (Kim et al.1999). Примечательно, что относительно объективная стратегия отбора пептидов была сосредоточена на основной последовательности-мишени L-S-Q-E, которая была идентична к тому, что окружает сайт Ser 15 в p53.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что консенсусная последовательность для фосфорилирования с помощью ATR во многом перекрывается с определенной последовательностью. для банкомата (Ким и др., 1999). Сходство с точки зрения предпочтения субстрата резко контрастирует с разной активностью этих белков во время Ответы на повреждение ДНК (см. Обсуждение ниже).Еще раз, эти результаты предполагают, что близость, а не контекст последовательности, играет ключевую роль в выборе тех субстратов, которые подвергаются фосфорилированию с помощью ATM по сравнению с ATR в ответ на генотоксический стресс. В целом, удельная активность ATR по отношению к большинству субстратов in vitro значительно ниже, чем отображаемая. компанией ATM (Canman et al. 1998; R.S. Tibbetts and R.T. Abraham, неопубликовано). Заметным исключением является белок контрольной точки человека hRad17, который содержит два сайта S-Q, которые фосфорилируются как ATM, так и ATR в анализах иммунных комплексов киназ.Пептид, содержащий эти сайты фосфорилировался с помощью ATR с большей скоростью, чем с помощью ATM (Kim et al. 1999), и мы обнаружили, что слитый белок GST-hRad17 является значительно лучшим субстратом для ATR, чем для ATM (Bao et al. 2001; RS Tibbetts and RT Abraham, неопубликов.).

Идентификация контекстов благоприятных последовательностей для фосфорилирования с помощью ATM / ATR, вызванная поиском кандидата in silico физиологические субстраты для этих протеинкиназ (Kim et al.1999; О’Нил и др. 2000). Эти усилия по поиску базы данных дали богатый урожай белков контрольной точки / репарации ДНК, включая p53, hRad17, hChk1, Белок синдрома разрыва Неймегана (NBS1, также называемый p95 или нибрин), BRCA1 и BRCA2. Многие из этих ранних кандидатов теперь используются в качестве основы либо только для банкоматов, либо для банкоматов и ATR. Как станет ясно из остальных разделов В этом обзоре идентификация подложки стала очень горячей темой в области банкоматов / ATR, и теперь поиск расширился включить новых подозреваемых в различные сигнальные пути контрольных точек, частично на основании присутствия консервативной мишени S-Q мотивы в первичных последовательностях этих белков.

Последний и, возможно, самый противоречивый аспект биохимии ATM / ATR касается механизма, посредством которого запускается повреждение ДНК. фосфорилирование субстрата этими протеинкиназами. Стандартная парадигма передачи сигналов протеинкиназы предполагает, что стимул (т.е. генотоксический стресс) каким-то образом сместил бы киназные домены ATM / ATR из состояния низкой активности в состояние высокой активности. Это предсказание подтвердилось для ATM, поскольку активность протеинкиназы иммунопреципитированного фермента увеличивается в несколько раз. в течение 1 часа после воздействия на клетки инфракрасного излучения или радиомиметиков (Banin et al.1998; Canman et al. 1998). С другой стороны, наша группа не смогла обнаружить какого-либо увеличения киназной активности in vitro ATR после лечения. клеток с различными генотоксическими агентами, включая инфракрасный и УФ-свет (R.S. Tibbetts and R.T. Abraham, unpubl.). Однако иммунофлуоресценция микроскопия показала, что ATR реагирует на повреждение ДНК, претерпевая резкий сдвиг во внутриядерной локализации от диффузной к очаговым по природе (Tibbetts et al.2000; см. обсуждение ниже). В идентичных условиях эксперимента АТМ не попадал в ядерные очаги поврежденных клеток. с IR или другими агентами, повреждающими ДНК. В совокупности эти результаты намекают на то, что ATM и ATR в основном реагируют на повреждение ДНК. разные способы: одна киназа контрольной точки (ATM) становится каталитически активной, тогда как другая (ATR) перераспределяется в ДНК вызванные повреждением ядерные фокусы, где он предположительно получает доступ к своим субстратам.

Как это обычно бывает с «простыми» моделями, механизм ответной реакции на бифуркационные повреждения ДНК, предложенный ранее, претерпит существенные изменения. украшение в течение следующих нескольких лет. Хотя иммунопреципитация ATR из экстрактов целых клеток не дает никаких доказательств для активации киназного домена ATR генотоксическими агентами возможно, что активация фермента действительно происходит, но ограничивается субпопуляцией молекул ATR, которая мигрирует в ядерные фокусы.В этой ситуации повышение активности могут быть потеряны в фоновом шуме, создаваемом иммунопреципитацией всего экстрагируемого пула ATR из поврежденного клетки. Биохимические стратегии, направленные на избирательное восстановление локализованных в очагах ATR, могут одновременно способствовать увеличению активированная форма этой протеинкиназы. Напротив, недавние данные Шайло и его коллег показывают, что банкоматы также могут претерпевают перемещение в ядерные очаги в ответ на радиомиметические агенты (Andejecko et al.2001). Эти ATM-содержащие комплексы совместно локализованы с фосфорилированной формой гистона h3AX, что позволяет предположить, что они являются генерируются в непосредственной близости от dsbs ДНК (Даунс и др., 2000; Паулл и др., 2000). Таким образом, будущие эксперименты могут привести нас к выводу, что ранние реакции ATM и ATR на повреждение ДНК не так механистичны. отчетливые, какими они сейчас кажутся.

Большая часть неопределенности связана с механизмом, посредством которого ИК-обработка интактных клеток приводит к увеличению содержания белка. киназная активность АТМ.Очевидная возможность состоит в том, что реактивные кислородные промежуточные соединения или dsbs ДНК, образующиеся во время воздействия инфракрасного излучения запускает посттрансляционную модификацию (например, фосфорилирование) ATM, которая активирует киназный домен. Интересно, кандидатный сайт аутофосфорилирования (Ser 440) был идентифицирован в аминоконцевой области ATM, но был ли этот сайт фактически фосфорилируется в ответ на IR, остается неизвестным (Kim et al. 1999). Альтернативная модель, получившая некоторую экспериментальную поддержку, основана на парадигме ДНК-ПК.Связывание ДНК-ПК Холоферментный комплекс со свободными концами ДНК стимулирует активность субъединицы ДНК-PK _cs (Smith et al. 1999). Семейные отношения между ATM, ATR и DNA-PK вызвали предположения, что деятельность ATM и ATR также может регулироваться, более или менее прямым образом, через взаимодействие с ДНК. Последующие исследования показали, что биохимически очищенный АТМ могут быть захвачены из раствора иммобилизованными фрагментами ДНК (см. обзор Durocher and Jackson 2001).Ассоциацию ATM со свободными концами ДНК также визуализировали непосредственно с помощью атомно-силовой микроскопии (Smith et al. 1999). Точно так же исследования в модельной системе Xenopus показывают, что ATR связывается с ДНК, хотя специфическая активность связывания концов ДНК не исследовалась (Guo et al. 2000). Тем не менее, эти результаты согласуются с представлением о том, что ATM и ATR способны напрямую взаимодействовать с ДНК.

Гораздо более спорный вопрос заключается в том, стимулирует ли одноцепочечная или двухцепочечная ДНК скорость фосфорилирования субстрата за счет ATM и ATR in vitro.К сожалению, несколько групп недавно обратились к этой модели, и результаты диаметрально противоположные. были получены — одни исследователи наблюдают ДНК-зависимую активацию, а другие нет (Guo et al. 2000; Durocher and Jackson 2001). В некоторых, но не во всех случаях (Guo et al. 2000) очевидный стимулирующий эффект ДНК на активность киназы ATM / ATR может быть связан с использованием ДНК-связывающих субстратов, таких как как полноразмерный p53 или репликационный белок A. Здесь проблема заключается в том, что влияние ДНК является полностью косвенным, то есть Связанная с ДНК форма субстрата находится в более благоприятной конформации для фосфорилирования растворимой киназой ATM или ATR.Как обсуждалось ранее, можно утверждать, что присутствие Mn ²⁺ в буферах для анализа киназы ослабляет биологически значимую зависимость активности ATM / ATR от ДНК. Однако Кастан и соавторы сообщили, что полная замена Mn ²⁺ на Mg ²⁺ в буфере для анализа не позволяет выявить какой-либо стимулирующий эффект ДНК на активность киназы ATM / ATR (Kim et al. 1999). Различия в результатах этих анализов могут быть связаны с различными препаратами ATM и ATR (например,г., биохимически очищенный по сравнению с иммунопреципитированным белком), используемый различными лабораториями. Возможно, некоторые группы очищают банкоматы и банкоматы с помощью срезанная хромосомная ДНК, которая заставляет результирующую активность протеинкиназы казаться невосприимчивой к стимуляции экзогенно добавили ДНК in vitro.

Самый убедительный аргумент в пользу ДНК-зависимой активации ATR получен в недавних исследованиях Xatr, полученного из экстрактов яиц Xenopus (Guo et al.2000; Hekmat-Nejad et al. 2000). В одном из этих исследований была использована интересная схема очистки ферментов, начиная с захвата субпопуляции. от общего пула молекул Xatr на ДНК-целлюлозе с последующим расщеплением ДНК ДНКазой I (Guo et al. 2000). Резолюбилизированный Xatr затем подвергали иммунопреципитации анти-Xatr антителами для анализа киназных комплексов иммунных комплексов. Примечательно, что удельная киназная активность ДНК-связывающей субпопуляции молекул Xatr была в 10-20 раз выше, чем у Xatr иммунопреципитируется непосредственно из цитозоля яйца.Эти результаты предполагают, что связывание с ДНК-целлюлозой вызывает увеличение в активности киназы Xatr, или что ДНК-целлюлоза избирательно связывается с предварительно активированной формой Xatr.

Таким образом, несмотря на то, что все более убедительные доказательства указывают на то, что ATM и ATR могут напрямую связываться или косвенно с ДНК, влияние связывания ДНК на их каталитическую активность остается предметом дискуссий.Самый экономный Модель предполагает, что, как и холофермент DNA-PK (Smith et al., 1999), ATM и ATR привлекаются к участкам повреждения ДНК посредством конститутивных или индуцибельных ассоциаций с ДНК-связывающими регуляторами. субъединицы. Члены семейства белков контрольной точки Rad в настоящее время являются лучшими кандидатами на роль предполагаемых аналогов Ku в путь ATM / ATR. Недавние исследования идентифицировали Rad26 и LCD1 / PIE1 / DDC2 как потенциальные регуляторные субъединицы ATM / ATR. гомологи, экспрессируемые в делящихся и почкующихся дрожжах, соответственно (Edwards et al.1999; Paciotti et al. 2000; Роуз и Джексон 2000; Wakayama et al. 2001), и многие лаборатории, несомненно, занимаются поиском гомолога Rad26 млекопитающих. Хотя нет причин чтобы ожидать, что Rad26 сам будет связывать ATM / ATR с поврежденной ДНК, он может поместить эти протеинкиназы в ДНК-чувствительную конформацию. Второй потенциальной субъединицей для нацеливания на ДНК является Rad17 (номенклатура S. pombe ). У делящихся дрожжей rad17 ⁺ связывается с хроматином на протяжении всего цикла дрожжевых клеток, и этот базальный уровень ДНК-связанного rad17 ⁺ либо повышается, либо понижается в ответ на генотоксический стресс, причем направление изменений определяется типом Повреждения ДНК, вызванные этими клетками (Griffiths et al.2000; Kai et al. 2001). В дополнение к его предполагаемой роли в качестве загрузчика зажимов контрольных точек для комплекса Rad1-Rad9-Hus1 (Thelen et al. 1999; Venclovas and Thelen 2000), наша группа показала, что обработка человеческих клеток генотоксичными агентами запускает быструю ассоциацию ATM и ATR с hRad17 (Бао и др., 2001). Таким образом, возможно, что связанный с хроматином Rad17 может регулировать транспортировку ATM и ATR на поврежденные участки и обратно. ДНК в клетках позвоночных.Следующие несколько лет должны предоставить гораздо более четкое представление о привлечении банкоматов / ATR на сайты. повреждений ДНК и ближайших событий, которые связывают распознавание повреждений ДНК с усиленным фосфорилированием субстратов посредством обе эти протеинкиназы.

Связанный с ATM / ATR сигнальный механизм: сложные комплексы

Подобно другим членам семейства PIKK, ATM и ATR содержат очень большие аминоконцевые домены, функции которых в основном неизвестный.Однако долгое время предполагалось, что очень протяженные аминоконцы PIKK также играют центральную роль в скаффолдинг этих протеинкиназ в макромолекулярные сигнальные комплексы. Действительно, анализы гель-фильтрации показывают, что оба ATM и ATR являются конститутивными резидентами белковых комплексов с очень высокой молекулярной массой (M _R ,> 2 × 10 ⁶ D) в клетках млекопитающих (Wright et al. 1998; Shiloh 2001). Идентификация компонентов этих комплексов — область растущего интереса с ожидаемой отдачей. новое понимание как вышестоящих регуляторов, так и нижестоящих целей ATM и ATR в путях контрольных точек клеточного цикла.

Интригующий первый шаг к выяснению сигнальных комплексов, связанных с ATM и ATR, сделан с помощью масс-спектрометрии. анализ иммунопреципитатов против BRCA1, полученных из экстрактов клеток млекопитающих (Wang et al. 2000). Белок восприимчивости к раку груди, BRCA1, является критическим компонентом механизма передачи сигналов контрольной точки и восстановления ДНК. и является прямой мишенью для фосфорилирования ATM и ATR в клетках, подвергшихся генотоксическому стрессу (Cortez et al.1999; Скалли и Ливингстон 2000; Скалли и др. 2000; Tibbetts et al. 2000). Секвенирование полипептидов, ассоциированных с BRCA1, дало удивительно широкий спектр белков с четкими связями с контрольные точки, репарация ДНК и синдромы хромосомной нестабильности человека — результат, который побудил авторов придумать аббревиатуру BASC (BRCA1-ассоциированный комплекс геномного надзора) в качестве глобального дескриптора для этого комплекса (Wang et al. 2000). В дополнение к ATM, члены BASC включают белки восстановления несоответствия, MLh2, MSh3 и MSH6, синдром Блума. геликаза (BLM) и комплекс Mre11 – Rad50 – NBS1.Последний комплекс играет важную роль в рекомбинационной репарации ДНК dsbs, и потеря одного из компонентов этого комплекса, NBS1, вызывает синдром разрыва Неймегена, хромосомный расстройство нестабильности, которое имеет несколько сходств с A-T (Shiloh 1997). Два независимых исследования BRCA1-ассоциированных белков добавили компоненты аппарата ремоделирования хроматина и системы Фанкони. белок FANCD2, связанный с анемией, в расширяющийся список компонентов BASC (Bochar et al.2000; Гарсия-Игера и др. 2001).

Идентификация BASC представляет собой начало сложной, но очень необходимой попытки понять афферентные входные данные. которые регулируют функцию ATM и ATR, а также межмолекулярные взаимодействия, которые контролируют представление соответствующих субстратов. к этим киназам контрольно-пропускных пунктов. Важно понимать, что BASC, скорее всего, не единое целое, а скорее динамичный сбор белковых комплексов, состав которых меняется в зависимости от типа повреждения ДНК, расположения относительно поврежденного участка, и время после инициирования генетического повреждения.Если BRCA1 действительно является центральным каркасом для сложной сборки, тогда это будет важно. чтобы определить, контролирует ли сайт-специфическое фосфорилирование BRCA1 ATM / ATR (Cortez et al. 1999; Tibbetts et al. 2000), hChk2 (JS Lee et al. 2000) и другие протеинкиназы миграцию определенных контрольных точек и репаративные белки в и из BASC.

Связанная область, требующая дополнительных исследований, касается взаимоотношений между биохимически определенными комплексами. содержащие ATR и BRCA1, и ядерные фокусы, вызванные повреждением ДНК, которые наблюдались с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (Скалли и др.1997; Tibbetts et al. 2000). Многие из этих очагов реагируют как с ATR-, так и с BRCA1-специфическими антителами, что позволяет предположить, что эти два белка колокализуются в сайтах повреждения ДНК. Совместная локализация киназы контрольной точки с ее субстратом кажется вполне логичной; однако эта простая модель осложняется пониманием того, что для того, чтобы быть обнаруженными как иммунофлуоресцентные узлы, фокусы, вызванные повреждением ДНК, должны содержать сотни полипептидов ATR и BRCA1. Если предположить, что ядерные фокусы маркируют отдельные участки повреждения ДНК, то вместо тривиального объяснений, таких как структурные артефакты, вызванные фиксацией, становится важным понять, почему каждое повреждение ДНК запускается коалесценция такого количества полипептидов ATR и BRCA1.В соответствии с потенциально динамичным состоянием BASC на различных стадии реакции на повреждение ДНК, вполне вероятно, что один поврежденный участок стимулирует генерацию динамического, интерактивного серии комплексов ATR-BRCA1, каждый из которых включает подмножество компонентов BASC, описанных ранее.

Функции контрольных точек клеточного цикла банкоматов и ATR

Исследования контрольных точек сигнальных функций ATM и ATR в значительной степени следовали проверенной временем стратегии для белков. киназ, который начинается с идентификации субстратов и продолжается через анализ функциональных последствий субстратное фосфорилирование.До клонирования гена ATM целенаправленными усилиями многих лабораторий было документально подтверждено, что ATM-дефицитные клетки обнаруживают значительные дефекты в клетках. G ₁ , S и G ₂ контрольно-пропускных пунктов. Эти наблюдения побудили к интенсивным поискам субстратов АТМ среди множества белков, которые функционируют в каждый из этих контрольно-пропускных пунктов. Большинство этих целей ATM также были испытаны эмпирическим путем в качестве подложек для ATR. Хотя эмпирический подход оказался полезным, неизбежным результатом стало то, что список задокументированных субстратов ATR в значительной степени, если не полностью, совпадает с тем, что связано с банкоматами.Несмотря на кажущееся совпадение, складывающаяся картина предполагает, что сигнальные функции контрольных точек ATM и ATR далеки от избыточности — вывод, который должен стать очевидным по мере того, как мы маршируем. через контрольные точки G ₁ , S и G ₂ в следующих разделах.

КПП G

В основе контрольной точки G ₁ лежит серия событий, ведущих к накоплению белка-супрессора опухоли, p53.Хотя p53 оказывает повсеместно влияя на функции контрольных точек во время клеточного цикла млекопитающих, контрольная точка G ₁ представляет собой единственный случай, когда потеря p53 приводит к полному аннулированию контрольной точки (Ko and Prives 1996; Giaccia and Kastan 1998; North and Hainaut 2000). Повреждение ДНК, вызванное большинством, если не всеми формами генотоксического стресса, вызывает быстрое повышение уровня p53, ответную реакцию это опосредуется, прежде всего, увеличением стабильности белка.Помимо запуска накопления р53, генотоксичен. стресс вызывает посттрансляционные модификации, которые регулируют функции активации транскрипции этого белка. С участием Что касается контрольной точки G ₁ , ключевой мишенью для активации транскрипции с помощью p53 является ингибитор циклин-зависимой киназы, p21 (также называемый WAF1 или CIP1). P53-зависимое увеличение экспрессии p21 подавляет циклин E- и циклин A-ассоциированную активность cdk2, и тем самым предотвращает переход от G ₁ к S-фазе.В дополнение к p21 активированная форма p53 стимулирует экспрессию большой панели генов, которые, в зависимости от клеточного контекста и типа инициирующего поражения, могут модулировать внутриклеточный окислительно-восстановительный статус или вызывать клетка-хозяин подвергается апоптозу (Yu et al. 1999).

Сложная сеть протеинкиназ и фосфатаз, а также гистонацетилаз и убиквитин-конъюгированных ферментов регулирует накопление и активация транскрипции функций p53 (Ko and Prives 1996; Giaccia and Kastan 1998).Связь между ATM и p53 была предсказана на основе более ранних исследований, которые продемонстрировали, что A-T-клетки проявляют задержка и снижение уровня индукции белка р53 после воздействия ИР (Кастан и др., 1992; Лу и Лейн, 1993). Последующее клонирование ATM позволило нескольким группам проверить прямую гипотезу о том, что ATM был прямым эффектором. фосфорилирования p53 в IR-поврежденных клетках (Banin et al. 1998; Canman et al. 1998). Эти исследования выявили единственный остаток серина (Ser 15) в аминоконцевой области р53 в качестве сайта фосфорилирования. для киназы ATM in vitro.Более того, фосфорилирование Ser 15 быстро индуцировалось в IR-обработанных клетках, и этот ответ был ATM-зависимым, так как IR-индуцированное фосфорилирование Ser 15 было значительно, но не полностью, подавлено в A-T клетках (Siliciano et al. 1997; Banin et al. 1998; Canman et al. 1998). Остаточное фосфорилирование Ser 15 в A-T-клетках указывало на то, что ATM была не единственной IR-регулируемой киназой Ser 15, и это Подозрение подтвердилось наблюдением, что УФ-индуцированное фосфорилирование Ser 15 практически не нарушается в А-Т-клетках.Последующие исследования показали, что ATR также способен фосфорилировать p53 по Ser 15 в анализах иммунных комплексов киназ (Hall-Jackson et al. 1999; Lakin et al. 1999; Tibbetts et al. 1999). В клетках, функционально дефицитных для ATR из-за сверхэкспрессии киназно-неактивного мутанта ATR ^KI (Cliby et al. 1998), ранняя фаза (0–2 часа) IR-индуцированного фосфорилирования p53 не нарушалась, что согласуется с идея, что банкомат служит основной киназой Ser 15 во время острого ответа на ИР (Tibbetts et al.1999). Однако клетки, сверхэкспрессирующие ATR ^KI , действительно показали значительный дефект в их способности поддерживать фосфорилирование Ser 15 в более поздние сроки, что предполагает, что поддерживающая фаза фосфорилирования p53 в большей степени зависит от ATR. С другой стороны, лечение человеческих фибробластов с УФ-светом вызвали реакцию фосфорилирования Ser 15, которая в значительной степени не зависела от экспрессии ATM, и сильно снижалась во все времена после облучения за счет сверхэкспрессии ATR ^KI (Tibbetts et al.1999).

Этот паттерн двойной регуляции фосфорилирования субстрата с помощью ATM и ATR в клетках, подвергшихся воздействию различных форм генотоксического стресс стал повторяющейся темой в области сигнализации контрольно-пропускных пунктов. Из членов семейства PIKK банкомат является основным респондент на повреждение ДНК, вызванное инфракрасным излучением или радиомиметическим агентом. В отсутствие банкомата или в нормальных ячейках с высоким уровнем При IR-индуцированном повреждении ДНК ATR служит главным образом резервной киназой для ATM.С другой стороны, ATR берет на себя сигнализацию на переднем крае. обязанности, когда клетки подвергаются другим формам генотоксического стресса, таким как воздействие ультрафиолетового света или лечение агенты, препятствующие репликации ДНК (афидиколин, гидроксимочевина; HU).

Как это часто бывает, расшифровка функциональных последствий фосфорилирования p53 с помощью ATM и ATR оказалась гораздо более сложной задачей. чем идентификация фосфорилирования.Расположение Ser 15 на амино-конце р53 предполагает, что модификация этот остаток может запускать диссоциацию p53 от MDM2, белка, который нацелен на p53 для убиквитинирования, ядерного экспорта, и протеосомная деградация (Freedman et al. 1999; Juven-Gershon and Oren 1999). Следовательно, если модель верна, ATM / ATR-зависимое фосфорилирование Ser 15 освободит p53 от его дестабилизирующего воздействия. связывающий партнер, тем самым способствуя накоплению p53.Однако оказывается, что фосфорилирования Ser 15 недостаточно для нарушить взаимодействие p53-MDM2; скорее, эта модификация стимулирует трансактивирующую функцию p53 за счет увеличения связывание этого белка с коактиватором транскрипции, p300 (Dumaz and Meek 1999). Однако эти результаты не исключают возможность того, что фосфорилирование p53 по Ser 15 настраивает этот белок на вторичная модификация, которая действительно модифицирует связывание MDM2 с p53, тем самым ингибируя деградацию p53.Действительно, Dumaz et al. (1999) показали, что фосфорилирование Ser 15 значительно усиливает последующее фосфорилирование p53 по Ser 18 казеинкиназой. I, по крайней мере, в условиях пробирки с очищенными белками. Присутствие фосфатов в Ser 15 и Ser 18 снижает авидность полноразмерного p53 для MDM2 примерно в три раза. Требуются дальнейшие исследования, чтобы определить, при каких условиях тандемная модификация p53 под действием ATM / ATR и казеинкиназы I способствует накоплению p53 в интактных клетки.

Недавние открытия подтвердили мнение о том, что ATM увеличивает накопление p53, запуская высвобождение этого белка из MDM2. Один из механизмов стабилизации p53 включает промежуточную протеинкиназу, hChk2 (также называемую hCds1), которая передает ATM-зависимые сигналы к p53 и многим другим нижестоящим белкам-мишеням в IR-поврежденных клетках. ATM активирует hChk2 путем фосфорилирования аминоконцевой остаток Thr (Thr 68) (Ahn et al.2000; Melchionna et al. 2000), а hChk2, в свою очередь, фосфорилирует еще один аминоконцевой остаток Ser (Ser 20) в p53 (Chehab et al. 2000; Hirao et al. 2000; Shieh et al. 2000). В отличие от модификации Ser 15, упомянутой ранее, фосфорилирование по Ser 20 напрямую препятствует связыванию p53. к MDM2, тем самым способствуя накоплению p53 в ответ на IR-индуцированное повреждение ДНК. Физиологическое значение hChk2 в регуляция p53 подтверждается открытием того факта, что мутации с потерей функции в hChk2 могут вызывать вариантную форму Синдром Ли-Фраумени, наследственное, склонное к раку заболевание, обычно связанное с мутациями зародышевой линии в p53 (Bell et al.1999).

Теперь кажется вероятным, что ATM также нацелен на взаимодействие p53-MDM2 посредством прямой модификации белка-партнера, MDM2 (Maya et al. 2001). В этом отчете авторы следовали окольному, но полезному направлению расследования, которое началось с установления личности. эпитопов анти-MDM2 антител, которые регулируют способность MDM2 нацеливаться на p53 для деградации. Эти усилия выявили Карбокси-концевой мотив, содержащий хорошо известную последовательность-мишень S-Q, и Ser 395 в этой последовательности был идентифицирован как сайт фосфорилирования для ATM как in vitro, так и в интактных клетках.Похоже, что фосфорилирование Ser 395 способствует стабилизации р53, препятствуя челночной активности MDM2, который обычно экспортирует р53 из ядра для протеосомной деградации в цитоплазме.

Эти находки демонстрируют, что ATM устанавливает множественные регуляторные контакты с p53 во время активации контрольной точки G ₁ ДНК dsbs (рис. 3). Напротив, потенциальная роль ATR в активации контрольной точки G ₁ любой формой генотоксического стресса остается относительно неясной.Возможно, что параллельный путь ATR – Chk1 также способствует накоплению р53 в клетках, подвергшихся повреждению ДНК, вызванному инфракрасным или ультрафиолетовым светом. Окончательные ответы на этот вопрос и многие другие вопросы ждут развития ATR-дефицитной клеточной линии, которая сохраняет неповрежденную контрольную точку G ₁ . В настоящее время реальное действие в отношении ATR начинается с перехода ячеек в S-фазу.

Зависимая от ATM / ATR сигнализация через контрольную точку G ₁ . Клетки, в которых произошли двухцепочечные разрывы ДНК (dsbs) во время фазы G ₁ , активируют p53 главным образом через ATM-зависимый путь. В клетках, экспрессирующих как ATM, так и ATR, активация p53 усиливается и поддерживается ATR (путь, обозначенный пунктирными линиями). ATM регулирует накопление p53 косвенными путями вовлекает Chk2-опосредованное фосфорилирование Ser 20 на р53, способствуя зависимому от казеинкиназы I фосфорилированию Ser 18 (не показан), и путем прямого фосфорилирования MDM2 на Ser 395 (подробности см. В тексте).ATR может влиять на фосфорилирование Ser 20 через активацию Chk1.

КПП S-фазы

Во время репликации ДНК клетки млекопитающих должны быть в состоянии повышенной готовности в отношении структурных аномалий ДНК, таких как разрывы цепей или оснований. модификации, мешающие точному копированию генома.Помимо обычного набора экологических оскорблений, сам процесс репликации ДНК добавляет внутренние риски, такие как ошибки неправильного включения базы и застопорившиеся вилки репликации, которые требуют немедленного ответа от механизма контрольно-пропускного пункта, если мы хотим сохранить целостность генома. К счастью, ДНК Повреждение, обнаруженное во время S-фазы, может быть исправлено именно с помощью механизмов гомологичной рекомбинации с участием сестринских хроматид. (Джонсон и Джасин, 2000).Действительно, исследования на бактериях показывают, что клетки в S-фазе в значительной степени полагаются на гомологичную рекомбинацию, чтобы перезапустить остановившуюся репликацию. вилки, даже в отсутствие генотоксичных агентов (Cox 1999; Cox et al. 2000). Механизмы негомологичной репарации также играют очень важную роль в репарации dsb ДНК на всех фазах клеточного цикла; тем не мение, эти механизмы по своей природе менее точны и, следовательно, представляют повышенный риск того, что неточно восстановленная ДНК будет перенесен в фазу M.Хотя контрольная точка G ₂ в принципе должна улавливать любые клетки, вышедшие из S-фазы с поврежденной ДНК, эти клетки могут уже упустили лучшую возможность выполнить безошибочное восстановление с помощью гомологичной рекомбинации.

Учитывая такое положение дел, неудивительно, что контрольная точка S-фазы значительно более многогранна, чем эта. бланкетный дескриптор подразумевает (рис.4). Канонический дефект контрольной точки, отображаемый А-Т-клетками, — это синтез радиоустойчивой ДНК (RDS; Painter and Young 1980). В нормальных клетках воздействие ИР вызывает быстрое, но обратимое снижение синтеза ДНК, что отражает снижение скорости как инициирования репликации ориджина, так и удлинения цепи ДНК (Painter and Young 1980). В отсутствие ATM индуцированное IR снижение синтеза ДНК значительно ослабляется, что приводит к фенотипу RDS. Обработка клеток вортманнином в концентрациях, которые отменяют активность киназы ATM, также индуцирует RDS в норме (ATM-proficient) клетки (Sarkaria et al.1998). Хотя потеря функции ATM причинно связана с RDS, нижестоящие эффекторы в этом пути контрольной точки пути S-фазы до недавнего времени в значительной степени ускользали от идентификации. Интригующий отчет теперь показывает, что функции наблюдения пути ATM-hChk2 не ограничиваются фазой G ₁ (Falck et al. 2001). Облучение инфракрасным излучением во время фазы S активирует тот же самый путь, за исключением того, что в этом случае важным результатом является деградация. Cdc25A, протеинтирозинфосфатазы, которая активирует комплексы циклин A · cdk2, когда клетки переходят из G ₁ в S-фазу.Результаты, полученные Фальком и соавт. (2001) показали, что hChk2 фосфорилирует Ser 123 в Cdc25A, и что эта модификация нацелена на Cdc25A для убиквитин-зависимой деградации. Понижающая регуляция Cdc25A препятствует своевременной активации циклина A · cdk2, что является необходимым событием для активации раннего происхождения репликации во время S фазы (Donaldson and Blow 1999; Takisawa et al. 2000). Генетические манипуляции, которые нарушают любой этап пути от hChk2 к циклину A · cdk2, также вызывают фенотип RDS.Примечательно, что мутантные аллели hChk2, связанные с вариантной формой синдрома Ли-Фраумени (Bell et al., 1999), не могут связывать и / или фосфорилировать Cdc25A (Falck et al. 2001), что означает, что генетические повреждения в пути RDS способствуют нестабильности генома. и развитие рака.

Роли ATM и ATR в передаче сигналов через контрольные точки S-фазы.ATM-зависимый путь, показанный на левой панели , инициируется присутствием dsb ДНК в клетке S-фазы. Ответ контрольной точки приводит к опосредованному протеосомами деградация Cdc25A и, в свою очередь, неспособность поддерживать активацию комплексов циклин · cdk2 и, как следствие, ингибирование синтеза ДНК. Нарушение этого пути приводит к фенотипу синтеза радиорезистентной ДНК (RDS). На правой панели путь контрольной точки запускается внутренними событиями или воздействием окружающей среды, которые ухудшают прогрессию репликационной вилки. во время фазы S.Путь регулируется главным образом ATR и может использовать члены семейства Rad белков контрольной точки в качестве датчики повреждений и как подмости для монтажа комплексов сигнализации КПП. Работа этого пути предотвращает митотическая катастрофа, которая возникает в результате неполной или неточной репликации ДНК и управляет восстановлением ДНК с высокой точностью через гомологичную рекомбинацию. Полная потеря этого пути, вероятно, несовместима с жизнеспособностью, даже при отсутствии повреждения ДНК, вызванного генотоксическим агентом.

Как это обычно бывает в исследованиях передачи сигналов, простой линейный путь, описанный ранее, почти наверняка упрощает реальная ситуация in vivo. Сверхэкспрессия ранее описанного мутанта ATR ^KI в SV40-трансформированных (но ATM-позитивных) фибробластах человека также индуцирует RDS (Cliby et al.1998). Принимая во внимание предостережение, что сверхэкспрессия ATR ^KI может неспецифически перекрестно ингибировать функцию ATM, эти результаты предполагают, что либо ATR также находится выше hChk2, либо что ATR регулирует параллельный путь, который способствует подавлению синтеза ДНК в IR-поврежденных клетках. По аналогии к механизму фосфорилирования p53, обсуждавшемуся ранее, будет интересно определить, происходит ли подавление регуляции Cdc25A в УФ-свете (Mailand et al.2000) или HU (если это происходит) опосредуется преимущественно через ATR-зависимый путь, возможно, через альтернативный путь, включающий киназа hChk1.

Вторым участником контрольной точки S-фазы, вызванной повреждением ДНК, является NBS1 (также называемый нибрин), продукт мутировавшего гена. при расстройстве хромосомной нестабильности человека, NBS (Shiloh 1997; Carney 1999; Petrini 1999). Клинические особенности NBS демонстрируют значительное, но не полное совпадение с таковыми у пациентов с A-T.Интересно, Клетки NBS также обладают фенотипом RDS, который предполагает, что белок NBS1 является вышестоящим регулятором стабильности Cdc25A. в IR-обработанных клетках. Белок NBS1 находится в комплексе с двумя другими белками поддержки генома, Mre11 и Rad50, которые играют важную роль в рекомбинационной репарации dsbs ДНК. Обработка клеток ИР вызывает быстрое образование ядерные фокусы, содержащие комплекс NBS1-Mre11-Rad50, и технологически элегантное исследование дало убедительные доказательства того, что фокусы собираются в непосредственной близости от dsbs ДНК (Nelms et al.1998). Появление этих очагов зависит от экспрессии NBS1; однако отсутствие серьезных дефектов репарации ДНК в клеток от пациентов с NBS, указывает на то, что комплекс Mre11-Rad50 достаточно эффективно выполняет свои восстановительные функции в NBS1-дефицитных клетки (Петрини, 1999). Перекрывающиеся клинические фенотипы A-T и NBS побудили предположить, что эти два белка могут быть функционально взаимосвязаны. Этот прогноз был подтвержден сообщениями о том, что ATM фосфорилирует NBS1 по трем сериновым остаткам (Ser 343, Ser 397 и Ser 615), и что замены Ser → Ala в любом из этих сайтов генерировали мутантный белок NBS1, который не смог комплементировать дефекты контрольных точек в ячейках NBS (Gatei et al.2000b; Lim et al. 2000; Wu et al. 2000; Zhao et al. 2000). В настоящее время мы не понимаем точную роль этих событий фосфорилирования в функции NBS1. Тем не менее, функциональная связь между ATM и комплексом NBS1 – Mre11 – Rad50 становится еще более убедительной с открытием, что гипоморфные Аллели Mre11 вызывают у человека A-T-подобное расстройство (Stewart et al. 1999).

Связь между белками контрольной точки S-фазы и заболеванием человека не заканчивается комплексом NBS1 – MRE11 – Rad50.Недавний находки позиционируют ATM и ATR как критические восходящие модуляторы белка восприимчивости к раку груди, BRCA1, который был обсуждался ранее как центральный компонент BASC (Wang et al. 2000). Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что BRCA1 является критически важным хранителем реплицирующегося генома в клетках позвоночных. Подобно комплексу NBS1, BRCA1 участвует как в контрольных точках, так и в путях восстановления в ДНК-поврежденных клетках (Scully and Livingston 2000; Scully et al.2000; Xu et al. 2001). Исследования ответов на повреждение ДНК в BRCA1-дефицитных клетках привлекают все большее внимание к роли BRCA1 в способствуя высокоточной репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации между сестринскими хроматидами (Moynahan et al. 1999; Scully et al. 2000).

Несколько групп документально подтвердили, что BRCA1 фосфорилируется in vitro по множеству сайтов с помощью киназ ATM и ATR (Cortez et al. 1999; Chen 2000; Gatei et al.2000a; Tibbetts et al. 2000). Карбокси-концевая область BRCA1 содержит многочисленные мотивы S-Q (всего 14), и из этих потенциальных мишеней ATM / ATR последовательности, 10 локализованы на участке ~ 300 аминокислот (остатки 1250-1550), называемом кластерным доменом SQ (SCD) (Cortez et al. 1999). Cortez et al. (1999) наблюдали, что фосфорилирование BRCA1 в IR-поврежденных клетках было значительно нарушено в отсутствие ATM, и продемонстрировали что по крайней мере пять из предсказанных сайтов-мишеней S-Q в SCD фосфорилировались ATM in vitro.Три из этих сайтов, Ser 1387, Ser 1423 и Ser 1524 были идентифицированы как основные сайты IR-индуцированного фосфорилирования в интактных клетках (Cortez et al. 1999; Gatei et al. 2000a). Наконец, двойной мутант BRCA1, содержащий замены Ala в Ser 1423 и Ser 1524, показал умеренное ухудшение в терминах способности корректировать радиочувствительный фенотип BRCA1-дефицитной клеточной линии рака молочной железы (HCC1937). Находка то, что ATM является вышестоящим регулятором BRCA1, согласуется с широко разрекламированным, но горячо обсуждаемым открытием, что человеческие гетерозиготы ATM имеют повышенный риск развития рака груди (Meyn 1999).Как и в случае с p53, ATM устанавливает как прямые, так и непрямые соединения с BRCA1. И снова косвенный путь продолжается. через киназу контрольных точек, регулируемую ATM, hChk2 (J.S. Lee et al. 2000). Фосфорилирование BRCA1 по одному сайту (Ser 988) с помощью hChk2 прекращает IR-стимулированное взаимодействие между этими двумя белков в ядрах клеток, а также необходим для радиозащитного эффекта эктопически экспрессируемого BRCA1 в HCC1937 линия клеток, упомянутая ранее.

Предыдущие исследования ясно показали, что по крайней мере одна дополнительная киназа, направленная на BRCA1, была активирована повреждающими ДНК агентами, потому что значительное фосфорилирование BRCA1 наблюдалось в клетках, лишенных ATM или DNA-PK (Scully et al. 1997; Cortez et al. 1999; Tibbetts et al. 2000). ATR был очевидным подозреваемым, и последующие исследования показали, что ATR фосфорилирует карбоксильный конец BRCA1 в шести точках. Остатки Ser / Thr в анализах киназ иммунных комплексов (Tibbetts et al.2000). Сайты фосфорилирования ATR частично перекрываются с сайтами, модифицированными in vitro с помощью ATM. Исследования с фосфо-сер 1423-специфическим антитела указывают на то, что ATM и ATR разделяют ответственность за модификацию BRCA1 во время IR-, UV- и репликации генотоксический стресс, индуцированный ингибиторами. Как и в случае с p53, фосфорилирование BRCA1, индуцированное IR, сильно зависит от ATM, тогда как фосфорилирование этого белка в клетках, поврежденных УФ-излучением или HU, в большей степени зависело от ATR (Tibbetts et al.2000). Учитывая сложность реакции фосфорилирования BRCA1 и плейотропные функции этого опухолевого супрессора в контрольной точке передача сигналов, сборка BASC, убиквитинирование белков и гомологичная рекомбинация (Lorick et al. 1999; Scully et al. 2000; Wang et al. 2000), полное понимание взаимодействия между киназами контрольных точек и BRCA1 может занять довольно много времени.

BRCA1 является архетипическим членом семейства белков репарации контрольных точек, которые содержат консервативный карбокси-конец BRCA1. (BRCT) структурный мотив (Callebaut and Mornon 1997).Помимо BRCA1, еще один член этого семейства, содержащего домен BRCT, недавно был идентифицирован как субстрат. для банкомата и, вероятно, ATR. Связывающий р53 белок 1 (53BP1) представляет собой ядерный белок, который быстро локализуется в сайтах Повреждение ДНК в клетках, обработанных IR и другими повреждающими ДНК агентами (Schultz et al. 2000; Rappold et al. 2001). Этот белок содержит множество сайтов Ser / Thr-Gln и фосфорилируется ATM in vitro (Rappold et al. 2001).В интактных клетках фосфорилирование 53BP1 быстро увеличивается после воздействия ИК, и этот ответ частично зависит от на экспрессию ATM, при этом ATR действует как предполагаемая киназа p53BP1 в ATM-дефицитных клетках (Rappold et al. 2001). Хотя функция p53BP1 неясна, было высказано предположение, что этот белок является гомологом белков S. cerevisiae Rad9p и S. pombe Crb2, которые играют важную роль во множественных контрольных точках, вызванных повреждением ДНК, в этих микроорганизмах ( Элледж 1996).Если 53BP1 действительно является позвоночным аналогом дрожжевого Rad9p / Crb2, этот белок может быть субстратом ATM / ATR первостепенной важности. значимость для передачи сигналов контрольной точки на протяжении клеточного цикла. Результаты экспериментов по реакции на повреждение ДНК с 53BP1-дефицитным ячеек с нетерпением ждут.

Чтобы немного отвлечься, важность понимания молекулярного механизма, который управляет различными путями контрольных точек S-фазы. невозможно переоценить.Пролиферирующие клетки должны пройти S-фазу, и, несмотря на великолепную точность репликации ДНК, аппарата, сам масштаб задачи репликации ДНК диктует, что ошибки неизбежно будут происходить при каждом прохождении через S-фаза. Если их не исправить, эти ошибки и связанная с ними потеря точности репликации могут не только привести к нуклеотидному изменения последовательностей и грубые хромосомные перестройки, традиционно связанные с клеточной трансформацией, но также могут благоприятствуют аберрантному расширению и сокращению повторяющихся последовательностей ДНК.Убедительные результаты указывают на нестабильность триплета. повторяющиеся последовательности ДНК в патогенезе нейродегенеративных заболеваний (Kroutil and Kunkel 1998). Сильная связь между верностью репликации ДНК и заболеванием человека требует интенсивных усилий по определению как контрольные точки и механизмы восстановления, которые обеспечивают точность, с которой геном дублируется во время S-фазы.

КПП G

Последним привратником, блокирующим вход ДНК-поврежденных клеток в митоз, является контрольная точка G ₂ .Хотя теперь у нас есть относительно подробное представление о дистальных событиях, которые связывают этот путь контрольной точки с механизмы, которые контролируют митотический вход (для обзора см. O’Connell et al. 2000), вклад ATM и ATR в ранние стадии активации контрольных точек G ₂ остается гораздо менее ясным. Исследования контрольной точки G ₂ в A-T-клетках привели к некоторым запутанным результатам, по крайней мере, до появления ATR как параллельного инициатора контрольной точки. сигнализация.Когда A-T-клетки подвергаются воздействию IR во время фазы G ₁ или S, любые клетки, которые достигают фазы G ₂ , эффективно задерживаются до того, как они инициируют митоз. Фактически, эти клетки обнаруживают более длительную задержку G ₂ , чем клетки, экспрессирующие АТМ. С другой стороны, если А-Т-клетки облучаются в фазе G ₂ , то клетки не могут арестоваться и перейти к митозу (Бимиш и Лавин, 1994; Скотт и др., 1994). Эти результаты показывают, что ATM незаменим для активации опосредованного контрольной точкой G ₂ ареста, если только повреждение ДНК не происходит во время самого G ₂ .

Независимый от ATM путь, который инициирует задержку G ₂ в клетках, которые испытали генотоксическое поражение до фазы G ₂ , не определен. Однако практически очевидно, что ATR и Chk1 будут центральными игроками в этой альтернативе. путь активации КПП G ₂ . Накапливающиеся свидетельства подтверждают идею о том, что ATR в первую очередь отвечает за активацию Киназа Chk1 повреждающими ДНК агентами в клетках позвоночных.Исследования в модельной системе Xenopus идентифицировали 4 сайта S / T-Q в Xchk1, которые фосфорилировались с помощью ATR in vitro, и чья модификация в ооцитах экстракты были ATR-зависимыми (Guo et al. 2000). Более того, мутированный Xchk1, содержащий замены Ser → Ala во всех четырех сайтах, не смог дополнить контрольную точку репликации ДНК. дефект в экстрактах, обедненных эндогенным Xchk1. Сходным образом сверхэкспрессия неактивного к киназе мутанта ATR ^KI ингибировала индуцированное повреждением ДНК фосфорилирование hChk1 в клеточной линии фибробластов человека (Liu et al.2000).

Регуляторная связь между ATR и Chk1 строго подразумевает ATR как проксимальный компонент индуцированной повреждением ДНК контрольной точки G ₂ в клетках млекопитающих. Исследования на дрожжах определили элегантный механизм отрицательной регуляции митотической проникновение Chk1, и фундаментальные характеристики этого пути, по-видимому, сохраняются во время эволюции позвоночных (Peng et al. 1997; Sanchez et al.1997; О’Коннелл и др. 2000). Текущая модель утверждает, что повреждение ДНК приводит к активации Chk1, который, в свою очередь, фосфорилирует способствующий митозу фосфатаза, Cdc25C. Фосфорилирование Cdc25C с помощью hChk1 создает сайт связывания для белков 14-3-3, а в 14-3-3-связанном В форме Cdc25C либо каталитически ингибируется, либо секвестрируется в цитоплазме (или и то, и другое). В любом случае фосфорилированный, 14-3-3-связанной форме Cdc25C запрещено дефосфорилировать и активировать митотическую киназу циклин B · Cdc2, а поврежденные клетки эффективно блокируются от входа в митоз.Критическая роль Chk1 в реализации контрольно-пропускного пункта G ₂ подчеркивается тем фактом, что Chk1 Эмбриональные стволовые клетки ^{— / —} демонстрируют существенное снижение задержки G ₂ после воздействия инфракрасного излучения (Liu et al. 2000). Модель контрольной точки G ₂ , представленная на рисунке 5, предварительно вводит ATR в качестве восходящего активатора hChk1 в клетки человека.

Роли банкоматов и ATR в активации КПП G ₂ . левая ветвь этого пути активируется, когда клетки подвергаются повреждению ДНК до завершения S-фазы, и в первую очередь регулируется ATR. Правая ветвь пути активируется повреждением ДНК во время самой фазы G ₂ и в значительной степени зависит от активации ATM. Обе ветви сходятся на фосфатазе Cdc25C и предотвращают активация митотического комплекса циклин B · cdc2 путем индукции цитоплазматической секвестрации и / или каталитического ингибирования Cdc25C.

В свете пути ATR – Chk1, описанного ранее, как мы можем объяснить тот факт, что ATM-дефицитные клетки не могут активировать G ₂ контрольная точка, когда повреждение ДНК происходит во время фазы G ₂ ? Одна возможность состоит в том, что ATM также способствует ингибированию активности Cdc25C, особенно в IR-поврежденных клетках, путем активации Chk2, который способен фосфорилировать Ser 216 Cdc25C, по крайней мере, in vitro (Brown et al.1999). В клетках, которые экспрессируют как ATM, так и ATR, ATM может активировать Chk2, чтобы усилить блокировку циклина B · Cdc2 активация, наложенная по пути ATR – hChk1. В Chk2 обнаружен дефект в обслуживании КПП, вызванный арестом G ₂ ^{— / —} эмбриональных стволовых клеток (Hirao et al. 2000). Следовательно, путь ATM-Chk2 может играть вторичную роль в активации контрольной точки G ₂ , когда клетки несут ДНК dsbs во время G ₁ или S фазы.С другой стороны, специфический для фазы клеточного цикла дефект в функции контрольной точки G ₂ , наблюдаемый в ячейках с нулевым ATM, предполагает, что ATM необходим для активации контрольной точки G ₂ после того, как клетки пересекли G ₁ и S-фазу. Неспособность ATR задействовать механизм контрольной точки G ₂ в клетках, завершивших репликацию ДНК, предполагает, что сенсорный и / или эффекторный аппарат через который работает ATR, полностью функционирует только во время фазы S.

Переход к ATM-зависимости для активации контрольной точки G ₂ , когда повреждение ДНК происходит в фазе G ₂ , также вызывает провокационную корреляцию с повышением роли гомологичной рекомбинации как основного способа Восстановление dsb ДНК. Исследования на линии В-клеток курицы DT40 показывают, что ДНК-PK-зависимый NHEJ служит основным модулем ДНК. dsb во время фазы G ₁ и ранней фазы S, тогда как гомологичная рекомбинация занимает центральное место в фазе поздней фазы S и фазы G ₂ (Takata et al.1998). Более поздний отчет той же исследовательской группы предоставил генетические доказательства того, что ATM и поздний механизм рекомбинационной репарации S – G ₂ находятся в одном и том же пути поддержания генома (Morrison et al. 2000). Авторы нарушили либо путь гомологичной рекомбинации (посредством направленной делеции гена Rad54 ), либо путь NHEJ (посредством направленной делеции гена Ku70 ) в ATM . ^{— / —} ячеек DT40. В то время как потеря пути рекомбинационной репарации незначительно увеличивала частоту появления хромосом, индуцированных IR. аберрации в банкомате ^{— / —} клеток, дефицит Ku70 резко усилил как хромосомные повреждения, так и радиочувствительность ATM-дефицитных клеток.Синергетическое увеличение хромосомных аномалий, вызванных ИР, наблюдаемое в клетках с двойным дефицитом ATM / Ku70, предполагает, что АТМ-зависимый путь репарации (предположительно гомологичная рекомбинация) и Ku70-зависимый путь репарации (NHEJ) действуют в дополнительный способ восстановления целостности хромосом после воздействия инфракрасного излучения. Хотя эти исследования предоставляют убедительные доказательства Что касается функциональных связей между АТМ и путем гомологичной рекомбинации, большая неопределенность связана с природой этого отношение.Связь может быть очень прямой; например, фосфорилирование одного или нескольких членов гомологичной рекомбинации проход через банкомат. В качестве альтернативы, имеющиеся свидетельства не исключают возможность потери контрольно-пропускного пункта, зависящего от банкомата. functions косвенно нарушает способность аппарата гомологичной рекомбинации точно восстанавливать dsbs ДНК.

Экстраядерные цели для банкоматов?

Хотя ранние исследования субклеточного распределения ATM изобиловали вопросами, связанными с особенностями антитела против ATM, присутствие ATM в цитоплазме определенных типов клеток, особенно нейронов, теперь хорошо задокументировано (Барлоу и др.2000). Экспрессия цитоплазматического ATM побудила предположить, что сигнальные функции этого члена семейства PIKK могут не ограничиваться только ядром. Одна еще не доказанная гипотеза гласит, что цитоплазматический АТМ реагирует на определенные генотоксические реакции. оскорбления, такие как увеличение количества реактивных кислородных промежуточных соединений, и координирует цитоплазматические реакции с ядерными событиями связанные с активацией контрольной точки. Защитная роль цитоплазматического АТМ против свободных радикалов, производных от кислорода, последовательна. с предположением, что пациенты с А-Т и клетки, полученные от этих пациентов, демонстрируют признаки хронического окислительного стресса (Rotman and Shiloh 1997).

Тема экстраядерных функций для банкоматов вызвала особый интерес в связи с разрушительными нейродегенеративными заболеваниями. патологии, связанные с A-T (Crawford 1998). Молодые пациенты с A-T неизменно страдают от прогрессирующей гибели нейрональных клеток, которая первоначально поражает мозжечок Пуркинье. нейроны. Интересно, что клетки Пуркинье содержат значительный пул цитоплазматических АТМ (Barlow et al.2000). В целом нейроны чрезвычайно чувствительны к окислительному стрессу и подвергаются апоптозу при воздействии неуправляемого уровень реакционноспособных кислородных интермедиатов in vitro. Эти наблюдения породили предположение, что цитоплазматический АТМ защищает Нейроны Пуркинье от окислительного стресса за счет стимуляции антиоксидантной защиты в клетках-хозяевах. Индукция NF-κB-зависимой гены ATM могут представлять один из таких механизмов антиоксидантной защиты (Jung et al.1995, 1997), хотя другая группа оспаривает доказательства прямой связи между ATM и активацией NF-κB (Ashburner et al. 1999).

Провокационная модель нейропротекторных функций банкоматов возникла в результате исследований инсулин / инсулиноподобного фактора роста. (IGF) рецепторы в ненейрональных клетках. Авторы показывают, что стимуляция инсулином вызывает быстрое повышение активности киназы ATM. в человеческих эмбриональных клетках почек, и предоставить доказательства того, что физиологической мишенью для ATM является белок-репрессор трансляции PHAS-I / 4E-BP1 (Ян и др.2000). Авторы предполагают, что ATM-зависимое фосфорилирование PHAS-I при фосфорилировании Ser 111 создает основу для последующего фосфорилирования по Thr 69 и Ser 64, которые опосредуются mTOR или другими протеинкиназами (Gingras et al. 1999; Mothe-Satney et al. 2000). Эти события завершаются высвобождением PHAS-I / 4E-BP1 из фактора инициации трансляции eIF-4E и стимуляции. кэп-зависимой трансляции (Gingras et al. 2001). Хотя для полного документирования этих результатов требуется дальнейшая работа (для обсуждения см. Lavin 2000), неожиданный вывод состоит в том, что ATM играет прямую роль в синтезе белка, стимулированного инсулином / IGF.В этом сценарии позиции ATM как относительно проксимальный компонент инсулин / IGF-1-зависимых сигнальных путей, ведущих к критическим клеточным ответам, от поглощения и метаболизма глюкозы до роста и выживания клеток. Учитывая предварительные доказательства того, что подобный путь могут присутствовать в нейрональных клетках (Yang et al. 2000), возможно, что ATM является важным преобразователем сигналов, способствующих выживанию, от рецепторов IGF в нейронах ЦНС.У пациентов с A-T дефекты IGF и чувствительности к инсулину могут способствовать как нейродегенерации, так и возникновению инсулинорезистентного диабета в субпопуляции пациентов с АТ.

Предполагаемая связь между передачей сигналов рецептора ATM и IGF была дополнительно усилена с недавним открытием, что внутриклеточный ATM положительно регулирует экспрессию рецепторов IGF-1 на уровне транскрипции генов (Peretz et al.2001). Было показано, что фибробласты от пациентов с A-T демонстрируют пониженные уровни белка рецептора IGF-1, и этот дефект был исправлен. трансфекцией этих клеток экспрессионным вектором, кодирующим ATM дикого типа. Самое главное, принудительная экспрессия IGF-1 рецепторы в фибробластах А-Т снижали радиочувствительность этих клеток до уровня, аналогичного тому, который наблюдается у их трансфицированных АТМ аналоги. Если эти данные могут быть экстраполированы на нейроны ЦНС, то дефекты экспрессии рецептора IGF-1 могут быть основным фактором. способствует развитию различных невропатологий, связанных с синдромом А-Т.Было бы интересно изучить клеточные линии от пациентов с NBS для аналогичных дефектов экспрессии рецептора IGF-1 и IGF-1-зависимой радиозащиты. Как обсуждалось ранее, белки ATM и NBS1, по-видимому, лежат в одном и том же пути контрольной точки, и клинические особенности A-T частично перекрываются с таковыми из NBS1 (Shiloh 1997). Однако нейродегенерация мозжечка не является характерной чертой NBS. Если потеря NBS1 не может подавить рецептор IGF-1 экспрессии, то можно предположительно заключить, что стимулирующее действие ATM на активность промотора IGF-1 не обязательно связано с его ролью в dsb-индуцированной передаче сигналов ДНК.Каким бы ни был результат, имеющиеся данные убедительно свидетельствуют о том, что дальнейшие исследования влияния дефицита ATM на экспрессию рецептора IGF-1 и сигнальные функции могут радикально изменить текущие концепции относительно патогенеза и лечения A-T.

Какими бы интригующими ни казались связи между рецептором ATM и IGF-1, другие результаты столь же убедительно подтверждают концепцию, что Ответы на повреждение дефектной ДНК предрасполагают пациентов с А-Т к преждевременной нейродегенерации (Rolig and McKinnon 2000).Эти исследования начались с открытия, что нейроны мышей с дефицитом АТМ неожиданно показали повышенный уровень устойчивости к убийству с помощью IR (Herzog et al. 1998). Впоследствии было показано, что мыши с дефицитом ДНК-лигазы IV, фермента, необходимого для негомологичного пути соединения концов репарации dsb ДНК, погибло внутриутробно из-за массивного апоптоза развивающихся нейронов центральной нервной системы (ЦНС). Переход из них Lig4 ^{— / —} мышей на нуллизиготном фоне ATM приводит к значительному снижению как эмбриональной летальности, так и апоптоза. гибель нейронов ЦНС (Y.Ли и др. 2000). Эти результаты предполагают, что на раннем этапе развития ЦНС АТМ выполняет функцию смотрителя, маркирующего генетически поврежденные нейроны. для устранения, в то время как их здоровые когорты могут легко заменить их. В отсутствие ATM поврежденные нейроны не удаляются и не заменяются, и в послеродовом периоде эти функционально нарушенные клетки обречены на раннюю гибель в головном мозге молодых пациентов с АТ. Если эта модель верна, то окончательная терапия, направленная на предотвращение нейродегенерации. у пациентов с A-T может быть очень сложно, так как его нужно будет начать во время беременности.

Выводы

Идентификация полноразмерных кДНК, кодирующих ATM и ATR, открыла бурную эру исследований, сфокусированных на клеточном цикле. передача сигналов контрольной точки в клетках млекопитающих. Без сомнения, большая часть недавнего прогресса в этой области лежит прямо на плечах элегантных исследований, выполненных на генетически поддающихся обработке модельных системах, особенно на делящихся и почкующихся дрожжах.Сохранение многих основных компонентов сигнальных путей контрольных точек, а также самого аппарата клеточного цикла способствовали попытки определить механизмы, с помощью которых клетки млекопитающих охраняют целостность своих геномов. Общая модель для разделение труда между ATM и ATR возникает в результате работы, выполняемой в основном в клетках млекопитающих и экстрактах яиц Xenopus . В каком-то смысле ATR можно было бы рассматривать как помощника по поддержанию этого дуэта в поддержании генома во время нормальная пролиферация клеток зависит от функций наблюдения ATR.Ранняя эмбриональная летальность, вызванная разрушением гена ATR , может отражать нарушение как контрольной точки репликации ДНК, так и ответов контрольной точки на явную ДНК. ущерб, нанесенный во время фазы S (Браун и Балтимор, 2000; де Кляйн и др., 2000).

ATR также играет центральную роль в ответе на определенные типы генотоксических агентов, включая гидроксимочевину и УФ-свет. Опять таки, мы можем провести четкую связь с фазой S, поскольку клетки обычно предупреждают о поражениях, вызванных этими агентами, когда дезоксирибонуклеотид истощение или аномальные структуры ДНК препятствуют продвижению репликационных вилок.В этом плане интригует что связывание ATR с ДНК и активация контрольной точки репликации требуют синтеза праймера РНК с помощью ДНК-полимеразы-α (Хекмат-Неджад и др., 2000; Майкл и др., 2000). Синтез доступных данных предполагает, что ATR может играть критическую роль в контрольных точках S и G ₂ (хотя дополнительные функции в контрольной точке M-фазы не следует сбрасывать со счетов), а ATM может принимать на себя основные функции. ответственность за управление КПП G ₁ .

В отличие от ATR, ATM, кажется, предназначен для обеспечения клетки быстрой защитной реакцией на чрезвычайно смертельную форму. повреждений ДНК, ДНК dsb. Хотя исследования ATM в значительной степени сосредоточены на реакции на IR-индуцированные dsbs ДНК, вполне вероятно, что что вне лабораторных условий присущие жизни как многоклеточному организму присущие атаки радикалов, производных от кислорода, и необходимость создания разнообразного репертуара антиген-чувствительных лимфоцитов, генерируемых эволюционное давление для разработки модуля сигнализации контрольно-пропускных пунктов, ориентированного на подачу сигнала тревоги DNA dsb на первый признак неприятностей.Идентификация ATM как ключевого регулятора p53 в клетках, несущих ДНК dsbs, не только связывает Банкомат к контрольно-пропускному пункту G ₁ , но также предполагает, что банкомат непосредственно участвует в принятии решений о жизни и смерти в определенных типах ячеек, в частности тимоциты и нейроны на ранних стадиях. У пациентов с A-T нарушение p53-зависимых путей, которые обычно непоправимо управляют поврежденные клетки, подвергшиеся апоптозу во время эмбриональной или ранней постнатальной жизни, могут посеять семена нейродегенерации и предрасположенность к онкологическим заболеваниям, так характерным для этого заболевания.Интересная возможность, требующая дополнительного внимания, заключается в том, что ATM играет более общую роль в цитопротекции против окислительного стресса, возможно, за счет индукции экспрессии регулируемого NFκB гены (Ли и др., 2001).

Наконец, значительный интерес возник в области открытия лекарств, связанных с ATM, ATR и другими белками контрольных точек. Низкомолекулярные ингибиторы этих белков, несомненно, найдут широкое применение в лабораторных условиях, поскольку исследователи продолжаем анализировать вклад этих протеинкиназ в различные пути передачи сигналов, контрольные точки и т. д.Тем не мение, реальный импульс для открытия лекарств в этой области основан на представлении о том, что специфические ингибиторы ATM и ATR, а также их нижестоящие белки-мишени могут найти клиническое применение, особенно при лечении рака. Центральная предпосылка современная биология раковых клеток утверждает, что развитие рака — это гиперреволюционный процесс, подпитываемый генетической нестабильностью (Hartwell and Kastan, 1994; Weinert, 1997; Longauer et al., 1998; Cahill et al.1999). Основным механизмом, посредством которого опухолевые клетки приобретают генетическую нестабильность, является приобретение мутаций, которые ослабляют или устранение контрольных точек клеточного цикла. Потеря контрольных точек особенно распространена на более поздних стадиях развития рака, и именно эти опухолевые клетки имеют тенденцию быть особенно невосприимчивыми к уничтожению обычными противораковыми агентами, многие из которых либо напрямую повреждают ДНК, либо препятствуют репликации ДНК.Возможно, фармакологические ингибиторы ATM и / или ATR позволят клинические онкологи, чтобы победить опухолевые клетки в своей игре. На фоне взломанных контрольно-пропускных пунктов можно предположить, что комбинированная терапия, например, с ингибитором синтеза ДНК (например, 5-фторурацил или гемцитибин) и киназой ATR ингибитор будет приводить к преждевременному летальному митозу опухолевые клетки с нарушенными контрольными точками, сохраняя при этом доброкачественные клетки, которые сохраняют полный набор контрольных точек клеточного цикла.Обнаружение, что кофеин, ингибитор ATM и ATR млекопитающих (Sarkaria et al. 1999), избирательно сенсибилизирует p53-дефицитные опухолевые клетки к уничтожению с помощью IR, что придает достоверность этой терапевтической стратегии (Powell et al. 1995; Yao et al. 1996). Открытие высокоспецифичных ингибиторов ATM и ATR и их успешное применение в терапии рака человека, сделает долгое путешествие по сигнальным путям контрольно-пропускных пунктов действительно полезным.

Благодарности

Благодарю докторов.Салли Корнблут, Кэти Брамбо, Крису Хадсон и анонимным рецензентам за полезные комментарии относительно рукопись. Работа в авторской лаборатории поддерживается грантом Национального института рака (CA76193) и грантами. от Детского проекта A-T и Целевой программы благотворительности Johnson & Johnson.

Сноски

• ↵1 Нынешний адрес: The Burnham Institute, 10901 N.Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, США

• ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА abraham {at} burnham.org; ФАКС (858) 713-6268.

• Статья и публикации находятся по адресу http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101 / гад.914401.

• Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор

Вторая бактериальная контрольная система останавливает клеточное деление

Образец цитирования: Robinson R (2014) SOS не требуется: вторая бактериальная контрольная система останавливает клеточное деление. PLoS Biol 12 (10): e1001978. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001978

Опубликовано: 28 октября 2014 г.

Авторские права: © 2014 Ричард Робинсон.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Конкурирующие интересы: Автор заявил, что конкурирующих интересов не существует.

Деление клетки должно быть тесно скоординировано с репликацией ДНК, чтобы полный геном попал в каждую дочернюю клетку. Эта координация особенно важна при повреждении ДНК, поскольку для восстановления поврежденных цепей могут потребоваться длительные задержки.Чтобы предотвратить преждевременное деление, клетки обнаруживают наличие разорванной ДНК с помощью специальных сенсорных белков, которые препятствуют делению, но способствуют восстановлению.

У бактерий эта система «контрольных точек» изначально считалась единственной ответственностью так называемого SOS-ответа, при котором поврежденная ДНК приводит к расщеплению репрессора транскрипции, вызывая синтез как ферментов репарации, так и ингибитора деления клеток. Однако многочисленные эксперименты показали, что даже когда SOS-ответ отключен, некоторые бактерии способны ощущать повреждение и задерживать деление.В этом выпуске PLOS Biology Джошуа Моделл, Майкл Лауб и его коллеги показывают, что вторая, независимая система работает вместе с системой SOS, которая чувствительна к определенному типу повреждения ДНК и индуцирует свой собственный набор белков ответа. .

Авторы начали поиск загадочного ингибитора с индукции повреждения ДНК в клетках модельной бактерии Caulobacter crescentus , в которой система SOS была инактивирована. Они обнаружили шесть генов, повышающая регуляция которых не может быть объяснена действием известных регуляторов SOS.В результате серии экспериментов был получен один ген, который обладал всеми характеристиками ингибитора клеточного деления и, следовательно, был назван ингибитором A, индуцированным повреждением, или didA .

Сверхэкспрессия гена didA сильно ингибировала деление (рис. 1) в отсутствие белков SOS, что указывает на его независимость от этой системы. Напротив, обработка ДНК-токсином в отсутствие как didA , так и ингибитора SOS-системы sidA приводила к делению большинства клеток, несмотря на повреждение ДНК, снижая жизнеспособность.

Наличие как SOS-систем, так и не-SOS-систем вводит избыточность, что, несомненно, является преимуществом в такой критической реакции управления сотовой связью. Однако авторы обнаружили, что эти две системы не реагировали на одни и те же оскорбления. Обе системы ответили на токсин, который образовал поперечные связи между двумя цепями. Система SOS, но не система didA , особенно реагировала на истощение пула нуклеотидов, в то время как система didA , но не система SOS, сильно реагировала на создание двухцепочечных разрывов.

Ключевым этапом в SOS-системе Escherichia coli является ингибирование полимеризации структурного белка FtsZ, который образует кольцо в месте сжатия, что имеет решающее значение для позиционирования механизма деления («дивисома»). В отличие от многих ингибиторов бактериального деления, авторы показали, что DidA не взаимодействует с FtsZ. Вместо этого они нашли доказательства того, что он, скорее всего, связывается с поздно прибывшим членом дивизома, FtsN. Однако это взаимодействие, как они показали, не нарушает дивисому и не препятствует локализации других членов комплекса.

Фактический механизм, как они предполагают, включает комплекс, образованный между тремя белками-дивизомами: FtsN, FtsI и FtsW. Избыточная продукция DidA обычно останавливает деление клеток, но этот эффект может быть преодолен мутациями в генах ftsW или ftsI , несмотря на тот факт, что DidA напрямую не связывается ни с одним белком. Вместо этого авт. Предполагают, что в отсутствие DidA три белка образуют активный комплекс, который способствует сжатию, а когда DidA связывает FtsN, он переводит комплекс в неактивное состояние.

Наконец, авт. Показали, что экспрессия didA управляется транскрипционным регулятором DriD. Обработка зеоцином, ДНК-токсином, специфичным для didA , заставляла DriD связываться с промотором didA и увеличивать транскрипцию. Однако зеоцин не активировал сам ген driD , что указывает на то, что индуцированная повреждением посттрансляционная модификация уже существующего белка DriD является ключевым этапом в регуляторном пути.

Вместе эти результаты идентифицируют новый механизм контроля клеточного деления в Caulobacter .Хотя детали, вероятно, будут отличаться для других типов бактерий, идентификация второй системы контроля, вероятно, приведет к поиску аналогичных систем в другом месте. Вдобавок, поскольку даже отключение как SOS, так и не-SOS систем не полностью предотвратило нормальную регуляцию клеточного деления в Caulobacter , авторы отмечают, что еще предстоит открыть еще больше систем контроля.

Modell JW, Kambara TK, Perchuk BS, Laub MT (2014) SOS-независимая контрольная точка, вызванная повреждением ДНК, регулирует деление клеток в Caulobacter crescentus .