Чесноков контрольные работы 6 класс: Контрольная работа Виленкин К-14 — В1 гдз по математике 6 класс Чесноков, Нешков дидактические материалы

Чесночная горчица уже захватывает эту лесную подстилку

Многие другие растения похожи на чесночную горчицу на стадии «розетки» (лист) перед цветением, что затрудняет идентификацию!

• Лучше всего сначала тянуть во время цветения, прежде чем растения дадут семена.
• Потяните за основание растения и попробуйте удалить весь корень.
• Вытянутый чесночный горчичный материал все равно завершит цветение и завяжет семена — не оставляйте его на земле! Обязательно упаковывайте и утилизируйте вырванные растения как мусор.
• Скашивание чеснока и горчицы не эффективный контроль , потому что растения по-прежнему будут болеть (посылать цветы) и семена. Чтобы предотвратить распространение, не косите чесночную горчицу при наличии семенных коробочек (май-сентябрь).
• Повторно посещайте вырванные участки как можно чаще , чтобы повторно вырывать растения, прорастающие из оставленных позади фрагментов корней. Это особенно важно в конце весны, когда семена разрастаются.

Более крупные заражения чесночной горчицей могут потребовать других подходов. Посетите нашу страницу о горчице с чесноком для получения дополнительной информации о горчице с чесноком и методах борьбы с ней — некоторые жители нашего округа (наш округ — это весь округ Малтнома к востоку от реки Уилламетт) могут иметь право на бесплатное лечение!

Когда собирать чеснок (и чесночные стебли) и хранить его на зиму

Один овощ, который мне не приходилось покупать уже несколько лет, — это чеснок.Каждую осень в обязательном порядке делаю заказ. Мне нравится пробовать разные сорта, поэтому я делю более крупный заказ с парой других зеленых больших пальцев, а затем делю его на части. Я думаю, что одно из лучших преимуществ выращивания чеснока — это получение двух урожаев! Но главное отметить, если вы новичок в его выращивании, — это когда собирать чеснок и те восхитительные чесночные стебли, которые появляются раньше в этом сезоне.

Я обычно выкладываю чеснок на пару приподнятых грядок. Если мне все еще нужно место, я добавлю еще кое-что в декоративном саду.Джессика написала отличную статью о различиях между твердым и мягким чесноком. Еще один замечательный ресурс — это книга, написанная несколько лет назад канадской писательницей Лиз Примо, под названием « В погоне за чесноком ».

Прежде чем мы поговорим о том, когда собирать чеснок, давайте сначала обсудим, как собирать стебли чеснока и следить за тем, чтобы они не пропадали зря!

Когда собирать стручки чеснока

Стебли чеснока обычно начинают появляться на твердом чесноке где-то в июне (это может отличаться, если вы находитесь в другой зоне).Не все мои сорта всегда готовы одновременно, что приятно, потому что я могу собирать урожай партиями и наслаждаться ими дольше.

Стебли чеснока легко отличить от остального растения, потому что они похожи на зеленый лук с длинной шляпкой эльфа (луковицей) на конце. Вы поймете, что ваши стебли готовы к срыву, когда они образуют спираль. Просто отрежьте стебель (я использую ножницы для трав) у основания, где он выходит из стебля. Если черешки становятся прямыми после того, как они прошли фазу завивки, они прошли свой расцвет.Они будут жестче, чем молодые свежие побеги, и будут горькими на вкус.

Когда у меня есть горсть стручков, я обычно взбиваю их с чесночным соусом песто (некоторые из них я замораживаю в лотках для кубиков льда). Я снимаю шляпы эльфов и просто использую стебель. Если не срезать стебли и не оставить их на растении, луковицы превратятся в цветы и семена. Даже если вы не собираетесь есть чесночные стебли, все же неплохо отрезать их у основания стебля, чтобы вся энергия могла вернуться на выращивание луковицы под землей.

Когда собирать урожай чеснока

После того, как вы нарежете чесночные дольки, у вас будет около месяца, пока сам чеснок не будет готов. Несколько лет назад, когда я писал статью для другого издания, я брал интервью у джентльмена из PEI по имени Эл Пикеттс, у которого есть компания Eureka Garlic. Я обнаружил его, прочитав о черном чесноке, который он выращивает, но это совсем другая тема. Но я спросил его, когда чеснок готов к сбору урожая, потому что время решает все.

Ал объяснил, что он использует календарь, чтобы определить, когда собирать урожай — например, он всегда собирает урожай чеснока тюрбан 25 июля.Но поскольку все мы живем в разных зонах садоводства и в разном климате, в целом он советует искать два мертвых, сухих листа у основания растения, а третий лист начинает отмирать.

«Первый лист может быть трудно увидеть, поскольку он уже съеден почвенными бактериями», — объясняет он. «Когда придет время собирать урожай, зеленых листьев еще будет много, но не позволяйте этому останавливать вас.Причина своевременного сбора урожая в том, что луковица обернута листьями. Когда лист отмирает, его поедают почвенные бактерии. Этот лист исчезнет не только над землей, но и внизу ».

Это эмпирическое правило, которому я следую более 10 лет.

Как собирать чеснок

Лучший способ удалить луковицу чеснока зависит от сорта, который вы посадили. Для сортов тюрбан, артишок и серебристая кожа вы можете использовать вилку или лопату, стараясь не прикасаться к лампочке.Я обычно выбираю свои жесткие варианты, такие как Rocambole и Porcelain, потому что разговоры обычно очень толстые и прочные.

Иногда почву и луковицы нужно немного уговорить. Я обнаружил, что, когда я мульчирую свою приподнятую грядку осенью соломой, почва становится намного более рыхлой, чем если бы я просто оставил грядку открытой на зиму. К тому времени, когда чеснок готов к вытягиванию, иногда он может стать более плотным.

Без зимней мульчи я и раньше обнаруживал, что у меня в руке сломанный стебель, а под землей все еще прячется зубчик чеснока.Но вы также должны быть уверены, что не повредили луковицу и не сломали ее под землей. Синяки влияют на срок хранения.

Я обычно беру большой шпатель или большую лопату и подальше от луковицы осторожно пытаюсь поднять почву под ней. Обычно это немного подталкивает луковицу, разрыхляя почву настолько, что я могу выдернуть стебель. Аккуратно удаляю лишнюю грязь, опять же стараясь не повредить лампочку.

Что делать, если чеснок вытащить слишком рано?

Иногда трудно понять, будет ли расти меньшая головка чеснока, даже если три нижних листа отмерли. Незадолго до того, как чеснок будет готов к сбору урожая, идет стадия быстрого роста, поэтому несколько дней могут иметь большое значение. Но иногда лампочка просто перегорает, несмотря ни на что.

Не подпускайте белок к чесноку

Несмотря на то, что белки не любят чеснок, кажется, что у них есть специальный радар для работы с нарушенной почвой в саду.Я пошла в сад и нашла на земле совершенно хорошую гвоздику. Я считаю, что слой соломенной мульчи помогает их отпугнуть. Я также немного посыпал участок куриным пометом после того, как посадил его.

Как сушить и хранить чеснок?

Вылечить чеснок — это значит высушить его. Вам нужен поток воздуха и прохладное место, чтобы вылечить его. Сушилки — это здорово, потому что вы можете использовать их и для других овощей и трав. Я сделал свою сушильную стойку из сетки, прикрепленной скобами к деревянной раме.Я кладу его на стопку кирпичей или ведер в своем гараже, чтобы воздух проходил под ним. В прошлые годы я также развешивал чеснок пучками, привязанными шпагатом вокруг стеблей, в гараже. Вы также можете заплести стебли для хранения.

После того, как чеснок высохнет, я «почищу» его, аккуратно удалив грязь, мусор и, возможно, один внешний высохший слой над ведром. Я обрежу длинный стебель, так что у меня есть гвоздика, похожая на ту, что вы видели в продуктовом магазине. Раньше я хранил свои луковицы в миске с плоским дном, пока не увидел в видео Джессики умную идею хранения, где она помещает их в пустые картонные коробки для яиц.

Прикрепите

S-аллилмеркаптоцистеин, полученный из чеснока, является новым антиметастатическим агентом in vivo при андрогеннезависимом раке простаты

Abstract

Цель: Имеются эпидемиологические данные, свидетельствующие о том, что высокое потребление чеснока снижает частоту рака простаты, а соединения, выделенные из чеснока, обладают профилактическим и противоопухолевым действием. Недавние исследования in vitro в нашей лаборатории показали, что сероорганическое соединение S -аллилмеркаптоцистеин, полученное из чеснока, подавляет инвазию и подвижность клеток андроген-независимых клеток рака простаты за счет активации молекулы клеточной адгезии E-кадгерина. S -аллилмеркаптоцистеин, следовательно, является потенциальным антиметастатическим препаратом с широким клиническим применением, который мы протестировали in vivo впервые в этом исследовании.

Дизайн эксперимента: Мы использовали недавно созданную флуоресцентную ортотопическую андроген-независимую модель рака простаты на мышах для оценки способности S -аллилмеркаптоцистеина ингибировать рост и распространение опухоли.

Результаты: Мы показали, что пероральный S -аллилмеркаптоцистеин не только подавлял рост первичных опухолей до 71% ( P <0.001), но также уменьшил количество метастазов в легких и надпочечниках на целых 85,5% ( P = 0,001), не вызывая заметной токсичности. Это метастатическое подавление сопровождалось снижением количества жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток на 91% ( P = 0,041), что позволяет предположить, что S -аллилмеркаптоцистеин предотвращает диссеминацию за счет уменьшения интравазации опухолевых клеток.

Выводы: Наши результаты предоставляют in vivo доказательств, подтверждающих потенциальное использование S -аллилмеркаптоцистеина в качестве антиметастатического средства, активирующего E-кадгерин, для лечения андроген-независимого рака простаты.Это первый отчет о in vivo антиметастатических свойствах чеснока, которые могут также применяться к другим типам рака.

• Чеснок
• Рак простаты
• S -аллилмеркаптоцистеин
• Метастазы
• Ортотопический

Рак простаты — вторая по частоте причина смерти от рака у мужчин в США (1). Несмотря на широкое распространение клинически незначимых опухолей у пожилых мужчин, рак простаты обычно имеет агрессивный фенотип, требующий немедленного вмешательства (2).При метастатическом заболевании начальным лечением является депривация андрогенов, которая вызывает регрессию опухоли и снижение уровня специфического антигена простаты в сыворотке крови в 80–85% случаев. К сожалению, рецидивы опухоли, не зависящие от андрогенов, встречаются практически повсеместно, и для них доступно только паллиативное лечение, и даже новейшие схемы лечения на основе доцетаксела дают только 2,4-месячную выживаемость (3). Смерть от рака простаты является результатом метастатического распространения, характерного для костей, легких, печени, плевры и надпочечников (4).Костные метастазы характеризуются сильной хронической болью, сдавлением спинного мозга и патологическими переломами. Таким образом, рак предстательной железы является очень желательной мишенью для эффективных и переносимых антиметастатических препаратов.

Некоторые диетические агенты могут оказывать профилактическое действие при раке простаты, включая ликопин, полученный из томатов, витамин Е и селен (5). Кроме того, эпидемиологические данные подтверждают защитную роль высокого потребления чеснока: одно исследование показало, что высокое потребление чеснока (> 10 г / день) было связано с низкой распространенностью рака простаты в Китае (относительный риск, 0.51; P <0,001; исх. 6). Чеснок содержит множество уникальных сероорганических соединений, которые, как было показано в многочисленных исследованиях, предотвращают канцерогенез индуцированного канцерогенеза у лабораторных животных, включая рак простаты (7). Чеснок также подавляет экспериментальный рост опухоли: мыши, получавшие чеснок с асцитными опухолями Эрлиха, имели значительно более длительную выживаемость по сравнению с контролем (8), и три группы отметили, что оба подкожно. пероральное введение свежего чеснока и экстракта выдержанного чеснока (AGE) подавляло рост ксенотрансплантатов переходно-клеточной карциномы (9–11).Недавно было показано, что AGE подавляет канцерогенез на моделях гепатоцеллюлярных и карцином толстой кишки на грызунах (12, 13), а в клинических испытаниях на людях 12 месяцев лечения AGE 2,4 г / сут подавляли образование аденом толстой кишки в образце из 57 человек. пациенты ( P = 0,04; ссылка 14).

AGE — широко используемая пищевая добавка, получаемая из сырого чеснока путем выдержки этанолом и водной экстракции. Он более устойчив, чем свежий чеснок, по концентрации стабильных перорально биодоступных сероорганических соединений, включая S -аллилмеркаптоцистеин (15).Хотя S -аллилмеркаптоцистеин не присутствует в сыром чесноке, он является основным продуктом метаболизма in vivo соединений чеснока аллицина и диаллилдисульфида (16), оба из которых обладают хорошо описанными противораковыми свойствами (7). То, что химическая нестабильность этих соединений не ограничивает их эффективность, привело к предположению, что S -аллилмеркаптоцистеин действительно может быть биологически активным метаболитом как в свежем чесноке, так и в AGE (17). Фактически, S -аллилмеркаптоцистеин подавляет пролиферацию in vitro раковых клеток с помощью механизмов, включая промотирование апоптоза c-Jun NH ₂ -концевую киназу 1 и активацию каспазы-3 (17) и G _{2 Остановка клеточного цикла фазы} -M путем прямого разрушения микротрубочек (18).Более того, в клетках рака простаты S -аллилмеркаптоцистеин подавлял пролиферацию за счет дополнительных механизмов подавления продукции простатоспецифического антигена и уровней тестостерона (19) и изменения уровней полиаминов и глутатиона (20).

Недавние исследования in vitro предоставили убедительные доказательства потенциальной антиметастатической активности S -аллилмеркаптоцистеина. Не раскрывая механизма, Hu et al. в новом исследовании показали, что миграция клеток саркомы крысы ингибируется при воздействии AGE (21).Действительно, данные нашей лаборатории показали, что S -аллилмеркаптоцистеин оказывает сильное противоинвазивное действие на андрогеннезависимые клетки рака простаты: уменьшает инвазию матригеля, увеличивает экспрессию молекулы клеточной адгезии E-кадгерина и вызывает морфологические изменения, напоминающие мезенхимальные. -эпителиальный переход (22). Экспрессия E-кадгерина часто подавляется при распространенном раке простаты и является сильным независимым прогностическим индикатором прогрессирования заболевания (23). Его подавление характерно для эпителиально-мезенхимального перехода, ключевой ранней стадии метастатического каскада (24).Таким образом, повышающая регуляция E-кадгерина и снижение инвазивности с помощью S -аллилмеркаптоцистеина является потенциально эффективным методом подавления прогрессирования опухоли и метастазирования.

Несмотря на многочисленные доказательства in vitro , ни противораковый эффект S -аллилмеркаптоцистеина, ни антиметастатическая способность какого-либо соединения чеснока не сообщалось о in vivo . Таким образом, это исследование было разработано для изучения эффекта in vivo S -аллилмеркаптоцистеина на рост рака простаты, метастатическую способность и токсичность.Чтобы достичь этого, мы разработали флуоресцентную ортотопическую модель андроген-независимого рака простаты на мышах с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) и исследовали влияние лечения S -аллилмеркаптоцистеином на рост и распространение опухоли. Наши результаты являются первым доказательством того, что S -аллилмеркаптоцистеин подавляет как рост, так и отдаленные метастазы продвинутых ксенотрансплантатов андроген-независимого рака простаты in vivo , не вызывая патологии органа или других признаков явной токсичности. S -аллилмеркаптоцистеин, таким образом, является многообещающим новым кандидатом для включения в клинические испытания в качестве антиметастатического препарата для пациентов с андроген-независимым раком простаты.

Материалы и методы

S-аллилмеркапто-1-цистеин. S -аллилмеркаптоцистеин (чистота> 95%) был щедрым подарком от Wakunaga Pharmaceutical Co. Ltd. (Хиросима, Япония). Его скармливали мышам в виде подкисленной (pH 4,5) суспензии 30 мг / мл в 10% (мас. / Об.) L-декстрозе, 1% (мас. / Об.) Гуммиарабике (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури).

Родительская линия клеток PC-3 и зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующая PC-3. Клетки PC-3 были получены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния) и культивированы в RPMI 1640 с добавлением 5% (мас. / Об.) FCS и 1% (мас. / Об.) Пенициллин-стрептомицин (Invitrogen, Carlsbad, CA). Экспрессирующий вектор, содержащий последовательность зеленого флуоресцентного белка (GFP), был сконструирован с использованием системы экспрессии генов Virapower Lentiviral согласно инструкциям производителей (Invitrogen).Вкратце, кДНК GFP амплифицировали из пустого вектора pEGFP с помощью ПЦР и затем клонировали в вектор plenti6 / V5-D-Topo (Invitrogen). Эту конструкцию трансфицировали в линию упаковывающих клеток лентивируса 293FT вместе с упаковочной смесью ViraPower (Invitrogen) с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Культуральную среду, содержащую вирус, собирали через 48 ч и фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм. Вирусы смешивали с полибреном 6 мкг / мл (Sigma-Aldrich) и использовали для заражения клеток PC-3 путем добавления непосредственно в культуральную среду.Через 48 часов после инфицирования клетки подвергали воздействию бластицидина 8 мкг / мл в течение 6 дней, и GFP-экспрессирующие клоны визуализировали с помощью микроскопии перед переносом с использованием клонального кольца. Мы создали шесть клонов стабильных, экспрессирующих GFP высокого уровня клеток, из которых мы выбрали клон PC-3 GFPC3 (PC-3 GFP-экспрессирующий клон 3) из-за его фенотипического сходства с родительской линией клеток PC-3.

Вестерн-блоттинг. Использовалась ранее описанная методика (25).Вкратце, мы приготовили общий клеточный лизат путем соскабливания клеток с использованием буфера для лизиса для анализа радиоиммунопреципитации [150 ммоль / л NaCl, 50 ммоль / л Трис / HCl (pH 8), 1% (мас. / Об.) NP40, 0,5% (мас. / Об.). дезоксихолат, 0,1% (мас. / об.) SDS плюс ингибиторы протеаз, 1 ммоль / л фенилметилсульфонилфторид, 1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл лейпептина] с последующим 15-минутным центрифугированием при 14000 об / мин, 4 ° C для удаления клеточного мусора. . Концентрацию белка рассчитывали с использованием набора DC Protein Assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Равные количества 30 мкг белка загружали в каждую лунку с 10% (мас. / Об.) Полиакриламидными гелями для электрофореза с последующим переносом на поливинилидендифторидную мембрану (Amersham, Piscataway, NJ).Мембраны блокировали в течение ночи при 4 ° C в 10% (мас. / Об.) Обезжиренном молоке и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с первичными антителами: E-кадгерином, актином и GFP (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния; Santa Cruz Biotechnology. , Санта-Крус, Калифорния; и Рош, Мангейм, Германия, соответственно). Сигналы трансдуцировали с помощью соответствующих вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, и детектировали с помощью системы вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (Amersham).

Анализ включения бромдезоксиуридина. Использовалась ранее описанная методика (25). Клетки выращивали на покровных стеклах в течение 24 часов до ~ 60% конфлюэнтности и обрабатывали в течение 1 часа 10 мкмоль / л бромдезоксиуридина (Sigma-Aldrich). Затем клетки фиксировали в ледяном 70% этаноле в течение 30 мин. Покровные стекла промывали холодным PBS, инкубировали в 2 моль / л HCl в течение 20 мин и нейтрализовали 0,1 моль / л боратным буфером (pH 8,5). Затем предметные стекла блокировали 0,1% бычьим сывороточным альбумином в PBS перед инкубацией с антителом против бромдезоксиуридина (Roche).После промывки добавляли конъюгированные с родамином вторичные антитела козы против IgG мыши на 1 час, а затем клетки контрастировали с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом. Подсчитывали не менее 500 клеток из четырех случайно выбранных полей на слайде и рассчитывали процент бромдезоксиуридин-положительных клеток. Эксперимент воспроизводился не менее четырех раз.

Имплантация ортотопической опухоли. Применяли ранее описанную оперативную технику (26).Вкратце, мышей CB-17 SCID / SCID в возрасте от 6 до 8 недель содержали в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Университета Гонконга. При хирургическом доступе 10 ⁶ клеток в 20 мкл бессывороточного RMPI 1640 вводили в дорсальную часть простаты с помощью стеклянного шприца с иглой 30-го размера (Hamilton, Reno, NV). Затем заменили органы и зашили брюшную полость в два слоя шелковой нитью 5-0. Животные начали лечение на 4 день контроля (носитель, n = 6), 100 мг / кг (низкая доза) S -аллилмеркаптоцистеин ( n = 5) и 300 мг / кг (высокая доза) S -аллилмеркаптоцистеин ( n = 6) при ежедневном орогастральном кормлении.После 28 дней лечения мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и тщательно исследовали при вскрытии (увеличение × 10).

Обработка тканей. Для получения данных о токсичности контрольную мышь и одну мышь, получавших 300 мг / кг / день S -аллилмеркаптоцистеина в течение 28 дней, умерщвляли, а их печень, почки и желудок помещали в 10% нейтральный забуференный формалин на 24 дня. ч до обезвоживания в градуированном спирте и заливки в парафин.Срезы толщиной 4 мкм вырезали по крайней мере в пяти отдельных областях каждого органа, обрабатывали и тщательно сравнивали с контролем. Было проведено окрашивание H&E и иммуногистохимическое исследование; последнее с использованием антитела IgG к цитокератину 18 человека (Santa Cruz Biotechnology). Для создания замороженных срезов фиксированные формалином органы переносили в 30% (мас. / Об.) Раствор сахарозы в 0,1 моль / л натрий-дигидрофосфатном буфере (pH 7,3) на 48 ч, а затем замораживали при -80 ° C перед разрезанием.

Образцы крови. Образцы крови (100 мкл) были взяты непосредственно перед эвтаназией путем пункции левого желудочка и инкубированы в 400 мкл ледяного буфера для лизиса эритроцитов хлорида аммония [0,15 моль / л NH ₄ Cl / 0,2 моль / л Трис-HCl ( pH 7,2)] в течение 4 мин при 4 ° C. Лизис останавливали добавлением 2 мл стерильного ледяного PBS и центрифугированием при 2000 об / мин в течение 2 минут. Осадок ресуспендировали в 4 мл RPMI 1640 и инкубировали при 37 ° C в течение 24 ч в 50-мм чашке Петри (Иваки, Токио, Япония). Для экспериментов по добавлению клеток 50 мкл крови смешивали с 10 мкл PBS, содержащим 10, 50 и 100 клеток.Этот эксперимент повторяли трижды.

Флуоресцентная микроскопия. Клетки и предметные стекла подвергали воздействию ртутной лампы при длине волны 480 нм, и излучение GFP регистрировали при 520 нм с помощью микроскопа Leica DM IRB. Изображения были получены с использованием программного обеспечения Advanced Spot System и камеры Chinetek 2e Enhanced. Для идентификации первичных опухолей и метастазов в лимфатические узлы из каждого образца вырезали пять срезов толщиной 50 мкм на расстоянии не менее 200 мкм. Твердые органы, легкие и надпочечники подвергали серийным 40-мкм срезам и подвергали скринингу под микроскопом с увеличением × 40. зеленые флуоресцентные отложения.Положительные сигналы были подтверждены как содержащие опухолевые клетки с помощью исследования с более высоким увеличением (× 100), прежде чем они были обозначены как метастазы. Образцы крови просматривали в 50-мм культуральных чашках Петри и тщательно сканировали на наличие жизнеспособных флуоресцирующих опухолевых клеток.

Статистический анализ. Результаты анализировали с помощью SPSS 14.0 (Aspire Software International, Лисбург, Вирджиния). Данные каждого эксперимента сравнивали либо с помощью дисперсионного анализа, либо с помощью теста Манна-Уитни U , в зависимости от способа распределения. P считали значимыми, если P <0,05. Вся статистика представлена ​​в тексте и на рисунках как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Результаты

Линия зеленых флуоресцентных клеток PC-3 GFPC3 фенотипически не изменилась по сравнению с родительскими клетками PC-3. Чтобы обеспечить прямую визуализацию метастатических поражений у мышей, мы сконструировали андроген-независимую линию клеток метастатического рака предстательной железы PC-3 для постоянной экспрессии GFP с использованием методов стабильной ретровирусной трансфекции.Один клон (PC-3 GFPC3) был показан с помощью вестерн-блоттинга (фиг. 1A). ) и микроскопии (рис. 1B), чтобы выявить универсальную экспрессию белка GFP, тогда как родительский PC-3 (контроль) был отрицательным по флуоресценции и экспрессии GFP. Анализ включения бромдезоксиуридина подтвердил отсутствие значительного изменения скорости пролиферации клеток PC-3 GFPC3 по сравнению с родительскими клетками ( P = 0,42; фиг. 1C). Затем мы использовали вестерн-блоттинг, чтобы показать, что экспрессия GFP не изменилась в клетках в ответ на обработку S -аллилмеркаптоцистеином, тогда как ранее описанная дозозависимая повышающая регуляция E-кадгерина сохранялась (рис.1D; исх. 22). Эти результаты свидетельствуют об успешном создании стабильной GFP-экспрессирующей клеточной линии PC-3 с свойствами, эквивалентными родительским клеткам.

Получение и характеристика флуоресцентных клеток PC-3 GFPC3. A, GFP-трансфицированные, но не родительские клетки, демонстрируют экспрессию высоких уровней белка GFP с помощью вестерн-блоттинга. B, × 100 изображений трансфицированных клеток PC-3 GFPC3 в инвертированном световом поле и флуоресцентных микроскопах.Обратите внимание, что эти клетки повсеместно флуоресцируют ярко-зеленым светом под флуоресцентным микроскопом. C, скорость включения бромдезоксиуридина ( BrdU ) в родительские клетки и клетки, трансфицированные GFP. Анализ включения бромдезоксиуридина не показывает значительной разницы в индексе пролиферации ( P = 0,42). D, экспрессия GFP и E-кадгерина после воздействия различных доз S -аллилмеркаптоцистеина ( SAMC ) с помощью вестерн-блоттинга. Обратите внимание, что S -аллилмеркаптоцистеин не оказывает заметного влияния на экспрессию GFP, но значительно увеличивает экспрессию E-кадгерина.

Клетки PC-3 GFPC3 образовывали метастатические опухоли, экспрессирующие GFP, у мышей SCID. Инъекцией 10 ⁶ клеток GFPC3 PC-3 в дорсальную простату четырех мышей SCID мы показали, что наш метод хирургической ортотопической имплантации индуцировал не только образование первичной опухоли (рис. 2A, 1, область обведена кружком). ), но также и метастазы в лимфатические узлы (рис. 2A, 2, обведенная область ) у 100% животных через 30 дней. Все положительные лимфатические узлы из каждой группы были расположены в локорегиональной области дренажа, без каких-либо идентифицируемых лимфатических узлов, распространяющихся через диафрагму или в конечности.H&E срезы первичных опухолей (фиг. 2B, 1 ) и лимфатических узлов (фиг. 2B, 2 ) выявили большие недифференцированные клетки с выступающими и нерегулярными ядрами, соответствующими происхождению опухолевых клеток. Затем мы использовали иммуногистохимию человеческого цитокератина-18 на срезах лимфатических узлов и подтвердили, что эти опухолевые клетки были человеческого происхождения (рис. 2С). При последующей флуоресцентной микроскопии все области опухолевого образования демонстрировали ярко-зеленую флуоресценцию, подтверждая происхождение первичной опухоли из PC-3 GFPC3 (рис.2D, 1 ) и отложения в лимфатических узлах (рис. 2D, 2 ). Зеленые флуоресцентные опухолевые отложения были впоследствии идентифицированы в легких 100% мышей (репрезентативное изображение показано на фиг. 2E, контрастно окрашено 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом). Кроме того, отложения были обнаружены в надпочечниках у 75% мышей, но метастазов в печени или почках не наблюдалось. Эти результаты указывают на успешное создание андроген-независимой ортотопической модели рака простаты, которая обеспечит высокочувствительное обнаружение метастазов в легких и надпочечниках.

Флуоресцентная ортотопическая модель рака простаты дает надежные и легко идентифицируемые метастатические заболевания. A, макроскопический вид первичной опухоли ( слева, в кружке) и метастазов в лимфатические узлы ( справа, в кружке) при вскрытии. Увеличение, × 4. B, H&E срезы первичного и лимфатического узла, показывающие присутствие морфологически недифференцированных опухолевых клеток как в первичной опухоли ( слева, ), так и в лимфатическом узле ( справа, ). C, участок лимфатического узла, окрашенный на цитокератин-18 человека с использованием иммуногистохимии. D, флуоресцентных изображений первичной опухоли ( слева, ) и метастазов в лимфатические узлы ( справа, ), демонстрирующих четкую и повсеместную флуоресценцию. E, флуоресцентное изображение метастазов в легких. Этот замороженный срез был контрастно окрашен 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом и показывает многоклеточные зеленые флуоресцентные метастазы на периферии легких.

S -аллилмеркаптоцистеин в дозе 300 мг / кг / сут не вызывал макроскопической или гистологической патологии органов. Чтобы исключить серьезную токсичность, мы проверили наличие патологии органов у мышей, получавших S -аллилмеркаптоцистеин, с использованием на 50% более высокой дозы (300 мг / кг / сут), чем максимальная, описанная ранее (27). После лечения в течение 30 дней при патологоанатомическом исследовании не наблюдалось никаких анатомических аномалий или признаков воспаления, некроза или кровотечения. Кроме того, H&E срезы печени (рис. 3A, 1a и 1b ), почки (рис. 3A, 2a и 2b ) и желудка (рис.3A, 3a и 3b ) выявили нормальную архитектуру ткани и морфологию клеток как у контрольных ( вверху, ), так и у обработанных ( внизу b ) животных. Таким образом, наши первоначальные исследования не предоставили никаких доказательств токсичности до 300 мг / кг / сут S -аллилмеркаптоцистеина.

S -аллилмеркаптоцистеин подавляет рост первичных опухолей без явных доказательств токсичности. A, H&E срезов печени ( 1 ), почек ( 2 ) и желудка ( 3 ) из контроля ( a ) и мышей, обработанных высокой дозой S -аллилмеркаптоцистеина ( b ).Срезы не показывают структурной патологии ни в одном органе ни в одной из групп, что подтверждает низкую токсичность лечения S -аллилмеркаптоцистеином. B, серийные измерения веса экспериментальных мышей. Вес был нормализован до 100% от исходного в день 1. Обратите внимание на отсутствие значительного снижения веса тела на любом этапе в контроле, лечении низкими дозами или обработкой высокими дозами, несмотря на тенденцию к снижению веса тела у контрольных мышей через неделю. 4 ( P = 0,08). C, репрезентативных изображений макроскопического вида резецированных первичных опухолей после 28 дней лечения.Показанные опухоли представляют собой средние опухоли, обработанные носителем ( 1 ), 100 мг / кг / день S -аллилмеркаптоцистеином ( 2 ) и 300 мг / кг / день S -аллилмеркаптоцистеином ( 3 ). Замороженный срез микроскопической первичной ( 4 ) группы высоких доз S -аллилмеркаптоцистеина, который не был виден при вскрытии. D, количественный анализ массы первичной опухоли. Обратите внимание, что обработка 300 мг / кг / сут S -аллилмеркаптоцистеина вызвала значительное уменьшение среднего размера первичной опухоли ( P <0.001).

S Лечение -аллилмеркаптоцистеином не вызывало каких-либо клинических признаков токсичности или потери веса в дозах до 300 мг / кг / сут. Чтобы исследовать опухолевые эффекты S -аллилмеркаптоцистеина на нашей мышиной модели андрогеннезависимого рака простаты, мы инъецировали 10 ⁶ клеток GFPC3 PC-3 в дорсальную простату 17 мышей SCID. Через три дня после инъекции мышей рандомизировали на три группы: контрольная ( n = 6), с низкой дозой (100 мг / кг / день) S -аллилмеркаптоцистеин ( n = 5) и с высокой дозой. (300 мг / кг / сут) S -аллилмеркаптоцистеин ( n = 6).Чтобы оценить токсичность S -аллилмеркаптоцистеина, мы отслеживали реакцию массы тела мыши на лечение в процентах от начальной массы (рис. 3В). Не обнаружив существенной разницы между начальным средним весом мышей в каждой группе ( P > 0,8), мы не наблюдали каких-либо изменений веса в любой группе лечения к конечной точке. Фактически, контрольная группа ( сплошная линия ) показала тенденцию к снижению массы тела в течение последних 3 дней, возможно, из-за высокой опухолевой нагрузки, хотя это не достигло значимости по сравнению с лечением низкой или высокой дозой. группы ( пунктирная линия ; P = 0.08). Эти результаты вместе с данными гистологии органов (рис. 3А) показывают, что длительное введение до 300 S-аллилмеркаптоцистеина переносится мышами.

S -аллилмеркаптоцистеин подавлял рост первичных ортотопических опухолей PC-3 у мышей SCID дозозависимым образом. Чтобы изучить влияние введения S -аллилмеркаптоцистеина на рост первичной опухоли, мы умерщвляли мышей после 28 дней лечения, вырезали и взвешивали первичные опухоли.Контрольные мыши и мыши, получавшие низкие дозы S -аллилмеркаптоцистеина, повсеместно давали относительно большие пальпируемые первичные опухоли (рис. 3C, 1 и 2 ), тогда как у мышей, получавших лечение в дозе 300 мг / кг / сут S -аллилмеркаптоцистеин. мыши были заметно меньше (фиг. 3C, 3 ), включая одну микроскопическую первичную опухоль, которая была слишком маленькой для выявления при вскрытии (фиг. 3C, 4, стрелка ). Было обнаружено, что замороженные срезы образцов опухолей сильно флуоресцируют и не содержат значительного количества нефлуоресцирующей (мышиной) ткани.Анализ данных показал, что высокие дозы S -аллилмеркаптоцистеина вызывали в среднем 71% подавление массы опухоли по сравнению с контролем ( P <0,001; фиг. 3D). Однако низкая доза S -аллилмеркаптоцистеина не вызвала значительного уменьшения опухоли ( P = 0,09), а высокая доза S -аллилмеркаптоцистеина была значительно более эффективной, чем низкая доза ( P = 0,027). Эти данные показывают, что S -аллилмеркаптоцистеин в дозе 300 мг / кг / день способен подавлять рост андроген-независимых опухолей простаты in vivo .

S Лечение -аллилмеркаптоцистеином подавляло образование отдаленных метастазов рака простаты in vivo. Метастазы в локорегиональные лимфатические узлы — частая ранняя стадия прогрессирования опухоли; Таким образом, мы резецировали, подсчитывали и взвешивали видимые лимфатические узлы от каждой мыши. Неожиданно мы не обнаружили значительного уменьшения количества или веса метастатических лимфатических узлов при лечении высокими или низкими дозами S -аллилмеркаптоцистеина (рис.4А ). Наличие отдаленных метастазов часто является решающим различием между излечимым и неизлечимым раком. Поэтому, чтобы оценить потенциальные ингибирующие эффекты S -аллилмеркаптоцистеина на отдаленное распространение метастазов, мы оценили все легкие и надпочечники каждой мыши на наличие многоклеточных метастазов. В легких мы наблюдали значительное снижение на 85,5% ( P = 0,001) среднего числа метастазов, идентифицируемых на одну мышь после приема высокой дозы 300 мг / кг / сут S -аллилмеркаптоцистеина по сравнению с контролем (рис.4Б). Низкие дозы S -аллилмеркаптоцистеина вызывали тенденцию к уменьшению образования метастазов в легких, но это не достигло значимости по сравнению с контролем ( P = 0,33). Затем мы проанализировали надпочечники и снова обнаружили явное снижение количества метастазов после лечения. Фактически, 300 мг / кг / сут S -аллилмеркаптоцистеина полностью устраняли присутствие метастазов ( P = 0,02; фиг. 4C). Эти результаты показали, что терапия S -аллилмеркаптоцистеином значительно снижает отдаленные метастазы во множественные удаленные участки органов дозозависимым образом.

Высокие дозы S -аллилмеркаптоцистеина подавляют образование отдаленных метастазов. A, количественный анализ количества положительных лимфатических узлов. Обратите внимание, что мы не выявили значительного уменьшения количества метастазов в лимфатических узлах после лечения любой дозой. B и C, замороженных срезов легких ( B ) и надпочечников ( C ) контрольных мышей и мышей, обработанных S -аллилмеркаптоцистеином, исследовали на наличие положительных зеленых флуоресцентных сигналов с помощью флуоресцентного микроскопа под × 40 увеличение.Репрезентативные изображения и количественный анализ. B, отмечают, что лечение S -аллилмеркаптоцистеином подавляет образование метастазов в легких дозозависимым образом до 85% в группе высоких доз ( P = 0,001). C, отметим, что S -аллилмеркаптоцистеин полностью устранял наличие метастазов в надпочечниках в группе, получавшей высокие дозы ( P = 0,02).

S Лечение -аллилмеркаптоцистеином значительно уменьшило количество циркулирующих опухолевых клеток. В свете нашего наблюдения, что S -аллилмеркаптоцистеин способен подавлять образование отдаленных метастазов, мы выделили и количественно оценили количество жизнеспособных (флуоресцирующих) опухолевых клеток в кровотоке, чтобы оценить, может ли S -аллилмеркаптоцистеин уменьшить их присутствие. Мы использовали частичный лизис эритроцитов с последующей экстракцией ядерных клеток, культивированием и флуоресцентной микроскопией для количественного определения количества циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) (репрезентативные изображения показаны на рис.5А ). Чтобы оценить эффективность этого метода, мы использовали эксперименты с добавлением клеток, чтобы изучить взаимосвязь между известным количеством жизнеспособных клеток, добавленных в кровь, и количеством клеток, впоследствии обнаруженных в культуре. Мы установили линейную взаимосвязь обнаружения входного сигнала с высокой эффективностью распознавания (среднее значение 78,5%; рис. 5B), что подтвердило количественную точность нашего метода выделения CTC. Затем мы использовали этот метод для количественного определения ЦОК в крови наших экспериментальных мышей. Отобрав 100 мкл артериальной крови у каждой мыши непосредственно перед эвтаназией, мы обнаружили, что обработка высокими дозами S -аллилмеркаптоцистеина снижала среднее количество ЦОК на 91% по сравнению с контролем ( P = 0.041; Рис. 5C). Кроме того, количество мышей с обнаруживаемыми ЦОК снизилось с 83,3% мышей в контрольной группе до 40% в группе, получавшей низкие дозы, и 16,6% в группе, получавшей высокие дозы. Эти результаты предполагают, что обработка S -аллилмеркаптоцистеином может ингибировать инвазивную стадию, на которой первичные опухолевые клетки отделяются и интравазируют, или может снижать выживаемость опухолевых клеток в кровотоке.

Обработка S -аллилмеркаптоцистеином снижает присутствие циркулирующих опухолевых клеток. A, репрезентативное изображение ЦОК, выделенных от мышей и содержащихся в культуре, визуализированное с помощью инвертированной и флуоресцентной микроскопии при увеличении × 100. Слева прикрепленная флуоресцирующая ( вверху ) клетка PC-3 GFPC3, выделенная из кровотока контрольной мыши. Клетка окружена некоторыми оставшимися эритроцитами от неполного лизиса эритроцитов (инвертированный световой микроскоп, , нижняя часть ). Справа: отсутствие флуоресцентных клеток, наблюдаемое у пяти из шести мышей, получавших высокие дозы S -аллилмеркаптоцистеина. B, — графическое изображение эффективности и точности нашего жизнеспособного метода обнаружения ЦОК. График отображает количество клеток, внесенных в каждый образец крови по оси x ( пунктирная линия ) по сравнению с количеством клеток, наблюдаемых при флуоресцентной микроскопии на следующий день ( сплошная линия ). C, относительных количеств ЦОК в крови мышей, обработанных S -аллилмеркаптоцистеином ( заполненных столбцов, ) по сравнению с контролем (обозначено как 100%; открытый столбец ).

Обсуждение

В этом исследовании, используя ортотопическую модель SCID на мышах с развитым андроген-независимым раком простаты, мы предоставляем первое доказательство того, что производное из старого чеснока соединение S -аллилмеркаптоцистеин может ингибировать рост и прогрессирование ксенотрансплантатов рака простаты in vivo . Наши результаты показали, что S -аллилмеркаптоцистеин способен подавлять отдаленные метастазы в легкие и надпочечники, не вызывая явной токсичности, что указывает на то, что S -аллилмеркаптоцистеин может быть новым и эффективным антиметастатическим средством лечения андроген-независимого рака простаты.

Было показано, что ортотопические модели рака являются мощным инструментом для изучения эффективности противоопухолевых препаратов, поскольку они воспроизводят микросреду и циркуляцию первичных опухолей у людей (28). Подобно предыдущим исследованиям, наша модель рака простаты вызвала многоклеточные метастазы в лимфатические узлы и легкие у 100% мышей в течение 30 дней (26). Кроме того, участки метастазирования в нашей модели в высшей степени репрезентативны для терминального рака предстательной железы человека (4), за заметным исключением костных метастазов, которые, как известно, трудно воссоздать у лабораторных животных (29).Использование GFP-экспрессирующих клеток для ортотопической имплантации — это недавно разработанный подход, который значительно повышает эффективность идентификации метастазов, позволяя прямое и однозначное обнаружение (рис. 2; ссылка 26). Хотя аналогичные флуоресцентные модели ортотопического рака простаты использовались для проверки экспериментальной эффективности лекарственного средства по крайней мере в двух других исследованиях (30, 31), в этом исследовании мы использовали мощную микроскопию на серийных замороженных срезах ткани вместо подсчета повреждений поверхности органов при флуоресценции. — ассистированная диссекция, которая не позволяет выявить метастазы в глубоко расположенных органах (32).В качестве доказательства, подтверждающего нашу методологию, среднее количество метастазов, которые мы идентифицируем на контрольную мышь, больше (6,5 на мышь), чем описанное Pchejetski et al. (3,4 на мышь) с использованием той же 30-дневной конечной точки (31). Это предполагает более высокую эффективность обнаружения в нашей модели, хотя прямого сравнения не проводилось.

Используя эту модель мышей SCID, мы впервые показали, что S -аллилмеркаптоцистеин подавляет рост первичной андроген-резистентной опухоли простаты из клеток PC-3 in vivo .Как мы обсуждали выше, S -аллилмеркаптоцистеин вызывает гибель раковых клеток множеством путей (17–20). Наши результаты предполагают, что эти предыдущие данные in vitro переводятся в успешное подавление роста опухоли in vivo . К сожалению, позже было обнаружено, что многие соединения, которые подавляют рост ксенотрансплантата опухоли на доклинических моделях, вызывают неприемлемую токсичность для людей в эффективных дозах, что указывает на необходимость наблюдения за токсичностью у экспериментальных животных.Однако при эффективной дозе 300 мг / кг / сут S -аллилмеркаптоцистеин мы не только наблюдали сохранение здоровой массы тела и отсутствие клинических проявлений токсичности, но также не обнаружили признаков морфологической патологии в органах, восприимчивых к действию S -аллилмеркаптоцистеин-индуцированное повреждение (рис. 3А и В). В частности, мы изучали печень и почки, поскольку соединения чеснока подвергаются метаболизму в печени и выводятся с мочой (15), и мы оценили эпителий желудка из-за его прямого воздействия концентрированным S -аллилмеркаптоцистеином.Фактически, предыдущие исследования на животных показали, что 200 мг / кг S -аллилмеркаптоцистеина на самом деле защищают от токсин-индуцированного повреждения печени с аналогичной эффективностью, как человеческий гепатопротекторный препарат N -ацетилцистеин (27). Примечательно, что N -ацетилцистеин имеет аналогичную химическую структуру на основе цистеина с S -аллилмеркаптоцистеином и обычно вводится людям в пероральных дозах 540 мг / кг / день, что подтверждает клиническую значимость препарата 300 мг / кг. / d S -аллилмеркаптоцистеин в дозе, которую мы вводили нашим мышам.Кроме того, воздействие S -аллилмеркаптоцистеина на людей происходит заранее в результате диетического потребления свежего чеснока и AGE, которые вводили людям в контролируемых условиях в дозах до 10 г / день без серьезных побочных эффектов (15). Таким образом, в то время как формальные исследования токсичности на людях необходимы, чтобы разрешить его клиническое использование, воздействие низких доз S -аллилмеркаптоцистеина уже широко распространено, и наши доклинические данные показывают, что он обладает переносимой токсичностью в эффективных противораковых дозах у мышей.

Несмотря на эти результаты, мы неожиданно не наблюдали значительного изменения размера или количества метастазов в лимфатические узлы после лечения S -аллилмеркаптоцистеином. Одним из объяснений этого феномена может быть то, что инъекция отдельных клеток в паренхиму простаты обеспечивает прямой доступ к лимфатической системе и предрасполагает к немедленному вовлечению локально-региональных узлов, что мы находимся в процессе модификации для будущих исследований. Тем не менее, способность S -аллилмеркаптоцистеина подавлять отдаленные метастазы является решающим фактором в снижении клинической заболеваемости и смертности (33), и стойкость неинвазивного поражения лимфатических узлов не должна представлять серьезного препятствия для его клинического применения.Фактически, распространение опухоли и метастазирование часто приводят к летальному исходу и являются основным препятствием на пути к успешному лечению рака. В этом исследовании мы обнаружили, что терапия высокими дозами S -аллилмеркаптоцистеина уменьшала количество метастазов в легких на 85% и полностью устраняла наличие метастазов в надпочечниках, что представляет собой значительное клиническое преимущество над мышами, получавшими контрольную группу (рис. 4B и C). ). Предыдущие исследования в нашей лаборатории показали, что S -аллилмеркаптоцистеин снижает миграцию и инвазию андрогеннезависимых клеток рака простаты за счет активации E-кадгерина (22), что мы также наблюдали в клетках PC-3 GFPC3 (рис.1D). E-кадгерин является функциональной единицей адгезивного соединения, а потеря функционального E-кадгерина увеличивает подвижность клеток, что неизменно связано с прогрессированием рака из-за нарушения целостности эпителия. В предыдущих исследованиях экзогенная сверхэкспрессия E-кадгерина в клетках холангиокарциномы не только способствовала межклеточной адгезии, но также уменьшала пролиферацию, подвижность и инвазию клеток (34). Кроме того, агент, активирующий E-кадгерин, 5-аза-2′-дезоксицитидин был способен подавлять метастазы в метастатической мышиной модели рака груди (35).В соответствии с ранее описанным E-cadherin-зависимым противоинвазивным механизмом S -allylmercaptocysteine ​​(22), эти исследования, таким образом, показывают, что восстановление экспрессии E-cadherin является эффективным механизмом снижения инвазии опухоли и метастазирования in vivo . Это подтверждает наши данные, которые показывают, что антиинвазивные свойства in vitro S -аллилмеркаптоцистеина переводятся в эффективное подавление метастазов in vivo .

Метастазирование в отдаленные твердые органы, такие как легкие и надпочечники, обусловлено доставкой опухолевых клеток через кровоток, и предыдущие исследования показали, что жизнеспособные клетки PC-3 присутствуют в кровотоке ортотопически имплантированных мышей и могут быть идентифицированы по их флуоресценции (36).Примечательно, что аномалия экспрессии E-кадгерина также оказалась самой сильной независимой переменной, предсказывающей присутствие ЦОК в крови у людей ( P <0,0001; ссылка 37). Поэтому мы выделили и количественно оценили количество жизнеспособных опухолевых клеток в кровотоке, чтобы оценить, может ли S -аллилмеркаптоцистеин уменьшить их присутствие (репрезентативные изображения показаны на фиг. 5A). Наши результаты показали, что обработка S -аллилмеркаптоцистеином значительно снижает присутствие и количество жизнеспособных ЦОК на 91% по сравнению с контролем (рис.5). Наличие ЦОК коррелировало в ряде исследований с поздней стадией рака и строго предсказывало плохой прогноз заболевания при раке простаты, груди и толстой кишки (38). Вместе с предыдущими доказательствами наши результаты предполагают, что ингибирующий эффект S -аллилмеркаптоцистеина на отдаленные метастазы может быть результатом его подавляющего действия на ЦОК, возможно, из-за его негативного воздействия на миграцию и инвазию опухолевых клеток, как предполагалось ранее (22). Дополнительно следует отметить, что Chu et al.показали, что S -аллилмеркаптоцистеин подавляет Snail , репрессор транскрипции E-кадгерина (22). Помимо регуляции адгезии эпителиальных клеток к клеткам, Snail стимулирует выработку матриксной металлопротеиназы-2 и матриксной металлопротеиназы-9, которые способствуют подвижности опухолевых клеток и разрушают базальные мембраны, а также участвуют в развитии рака предстательной железы и интравазации опухолевых клеток ( 39). Следовательно, возможно, что S -аллилмеркаптоцистеин-опосредованное подавление пути передачи сигналов Snail может играть роль в снижении инвазии и интравазации; Однако эта гипотеза требует дальнейшего изучения.Независимо от задействованного доминирующего механизма, мы показываем, что S -аллилмеркаптоцистеин ограничивает распространение in vivo андроген-независимых клеток рака простаты, что свидетельствует о большом потенциале его клинического применения.

С точки зрения показаний к применению антиметастатических препаратов, таких как S -аллилмеркаптоцистеин, кажется, что рак простаты особенно хорошо подходит из-за его часто длительной латентной стадии, сложного естественного течения болезни и ограниченного ответа на традиционную цитотоксическую химиотерапию.Результаты нашей ортотопической модели PC-3 указывают на роль S -аллилмеркаптоцистеина в лечении неизлечимо распространенного метастатического андрогеннезависимого рака простаты. Из-за своей явно низкой токсичности S -аллилмеркаптоцистеин также может быть подходящим адъювантным пероральным препаратом для лечения локализованного заболевания высокой степени у пожилых мужчин с короткой продолжительностью жизни или плохой переносимостью хирургического вмешательства или цитотоксической терапии. Более того, с появлением широко распространенного скрининга простат-специфических антигенов и, как следствие, преобладания клинических проявлений низкосортных опухолей на ранних стадиях, текущее использование стратегии «бдительного ожидания» может быть дополнено пероральной терапией -аллилмеркаптоцистеином S для снизить частоту прогрессирования опухоли.Однако следует отметить, что PC-3 является крайне недифференцированной клеточной линией, которая представляет собой необычно развитую и метастатическую форму рака простаты. Следовательно, для подтверждения специфичности простаты противоопухолевого и антиметастатического действия S -аллилмеркаптоцистеина потребуются будущие испытания на менее агрессивных андроген-независимых моделях ксенотрансплантатов рака простаты, а также на еще не разработанных моделях спонтанных метастазов в кости. Однако важно отметить, что, поскольку ни ингибирующие рост (40), ни противоинвазивные (22) эффекты S -аллилмеркаптоцистеина, по-видимому, специфичны для простаты, наши результаты предполагают, что S -аллилмеркаптоцистеин на самом деле может быть универсальным антиметастатическим средством. для лечения запущенных карцином.

Таким образом, мы представляем первые доказательства того, что производный из чеснока S -аллилмеркаптоцистеин является эффективным противоопухолевым препаратом на мышиной модели распространенного рака простаты. Что еще более важно, мы продемонстрировали значительный антиметастатический эффект S -аллилмеркаптоцистеина против андроген-независимого ксенотрансплантата рака простаты in vivo , возможно, за счет подавления жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток. Это первый отчет in vivo об антиметастатических свойствах любого соединения чеснока.Есть надежда, что наши данные могут привести к дальнейшим исследованиям, включая клинические испытания на людях, чтобы полностью изучить потенциал S -аллилмеркаптоцистеина в лечении распространенного рака простаты.

Благодарности

Мы благодарим Wakunaga Pharmaceutical Co. Ltd. за поставку S -аллилмеркаптоцистеинового соединения.

Сноски

• Грантовая поддержка: Американский институт исследований рака (X.Ван).

• Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

• Получено 22 августа 2006 г.
• Исправление получено 3 ноября 2006 г.
• Принято 15 ноября 2006 г.

Ссылки

1. ↵

   Эдвардс Б.К., Браун М.Л., Винго ПА и др.Ежегодный отчет для страны о статусе рака, 1975–2002 годы, с указанием популяционных тенденций в лечении рака. J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1407–27.

2. ↵

   Bracarda S, de CO, Greco C, et al. Рак простаты. Crit Rev Oncol Hematol 2005; 56: 379–96.

3. ↵

   Tannock IF, de WR, Berry WR, et al. Доцетаксел плюс преднизон или митоксантрон плюс преднизон при запущенном раке простаты.N Engl J Med 2004; 351: 1502–12.

4. ↵

   Bubendorf L, Schopfer A, Wagner U, et al. Метастатические паттерны рака простаты: вскрытие 1589 пациентов. Хум Патол 2000; 31: 578–83.

5. ↵

   Nelson WG, De Marzo AM, Isaacs WB. Рак простаты. N Engl J Med 2003; 349: 366–81.

6. ↵

   Hsing AW, Chokkalingam AP, Gao YT, et al.Овощи лука и риск рака простаты: популяционное исследование. J Natl Cancer Inst 2002; 94: 1648–51.

7. ↵

   Эль-Баюми К., Синха Р., Пинто Дж. Т., Ривлин Р.С. Химиопрофилактика рака чесноком и чеснокосодержащими соединениями серы и селена. J Nutr 2006; 136: 864–9S.

8. ↵

   Унникришнан М.С., Куттан Р. Снижение опухолей и антиканцерогенное действие выбранных специй. Cancer Lett 1990; 51: 85–9.

9. ↵

   Riggs DR, DeHaven JI, Lamm DL. Allium sativum (чеснок) для лечения переходно-клеточного рака мыши. Рак 1997; 79: 1987–94.

10. Marsh CL, Torrey RR, Woolley JL, Barker GR, Lau BH. Превосходство внутрипузырной иммунотерапии с использованием Corynebacterium parvum и Allium sativum в борьбе с раком мочевого пузыря у мышей. J Urol 1987; 137: 359–62.

11. ↵

    Lau BH, Woolley JL, Marsh CL, Barker GR, Koobs DH, Torrey RR. Превосходство внутриочаговой иммунотерапии с использованием Corynebacterium parvum и Allium sativum в контроле над переходно-клеточной карциномой мыши. J Urol 1986; 136: 701–5.

12. ↵

    Uda N, Kashimoto N, Sumioka I, Kyo E, Sumi S, Fukushima S. Выдержанный экстракт чеснока подавляет развитие предполагаемых предопухолевых поражений при гепатоканцерогенезе у крыс.J Nutr 2006; 136: 855–60S.

13. ↵

    Кацуки Т., Хирата К., Исикава Х., Мацуура Н., Суми С., Ито Х. Экстракт выдержанного чеснока оказывает химиопрофилактическое действие на индуцированные 1,2-диметилгидразином опухоли толстой кишки у крыс. J Nutr 2006; 136: 847–51S.

14. ↵

    Танака С., Харума К., Йошихара М. и др. Выдержанный экстракт чеснока потенциально подавляет колоректальные аденомы у людей. J Nutr 2006; 136: 821–6S.

15. ↵

    Amagase H, Petesch BL, Matsuura H, Kasuga S, Itakura Y. Потребление чеснока и его биоактивных компонентов. J Nutr 2001; 131: 955–62S.

16. ↵

    Lawson LD, Wang ZJ. Печеночная судьба сероорганических соединений, полученных из чеснока ( Allium sativum ). Planta Med 1993; 59 (Дополнение): A688–9.

17. ↵

    Сяо Д., Пинто Дж. Т., Со Дж. В. и др.Индукция апоптоза производным чеснока соединением S -аллилмеркаптоцистеин (SAMC) связана с деполимеризацией микротрубочек и активацией c-Jun NH (2) -концевой киназы 1. Cancer Res 2003; 63: 6825–37.

18. ↵

    Shirin H, Pinto JT, Kawabata Y, et al. Антипролиферативные эффекты S -аллилмеркаптоцистеина на раковые клетки толстой кишки при тестировании отдельно или в комбинации с сульфидом сулиндака. Cancer Res 2001; 61: 725–31.

19. ↵

    Пинто Дж. Т., Цяо С., Син Дж. И др. Изменения экспрессии биомаркера простаты и использования тестостерона в клетках карциномы предстательной железы человека LNCaP под действием S -аллилмеркаптоцистеина, производного от чеснока. Простата 2000; 45: 304–14.

20. ↵

    Пинто Дж. Т., Цяо С., Син Дж. И др. Влияние производных тиоаллила чеснока на рост, концентрацию глутатиона и образование полиаминов клеток карциномы простаты человека в культуре.Am J Clin Nutr 1997; 66: 398–405.

21. ↵

    Ху X, Цао Б.Н., Ху Г, Хэ Дж, Ян Д.К., Ван Ю.С. Ослабление миграции клеток и индукция гибели клеток выдержанным экстрактом чеснока в клетках саркомы крысы. Int J Mol Med 2002; 9: 641–3.

22. ↵

    Chu Q, Ling MT, Feng H, et al. Новый противораковый эффект производных чеснока: ингибирование инвазии раковых клеток за счет восстановления экспрессии E-кадгерина.Канцерогенез 2006; 27: 2180–9.

23. ↵

    Родос Д.Р., Санда М.Г., Отте А.П., Чиннайян А.М., Рубин М.А. Мультиплексный биомаркерный подход для определения риска рецидива рака предстательной железы, определяемого специфическим антигеном простаты. J Natl Cancer Inst 2003; 95: 661–8.

24. ↵

    Larue L, Bellacosa A. Эпителиально-мезенхимальный переход в развитии и раке: роль путей фосфатидилинозитол-3′-киназы / AKT.Онкоген 2005; 24: 7443–54.

25. ↵

    Cheung HW, Chun AC, Wang Q и др. Инактивация человеческого MAD2B в клетках карциномы носоглотки приводит к химиосенсибилизации к агентам, повреждающим ДНК. Cancer Res 2006; 66: 4357–67.

26. ↵

    Ян М., Цзян П., Сан FX и др. Модель флуоресцентного ортотопического метастаза в кости рака простаты человека. Cancer Res 1999; 59: 781–6.

27. ↵

    Сумиока I, Мацура Т., Касуга С., Итакура Ю., Ямада К.Механизмы защиты с помощью S -аллилмеркаптоцистеина против ацетаминофен-индуцированного повреждения печени у мышей. Jpn J Pharmacol 1998; 78: 199–207.

28. ↵

    Hoffman RM. Ортотопические метастатические мышиные модели для открытия и оценки противоопухолевых препаратов: мост в клинику. Invest New Drugs 1999; 17: 343–59.

29. ↵

    Сингх А.С., Фигг В.Д. In vivo моделей метастазов рака простаты в кость.Журнал Урол 2005; 174: 820–6.

30. ↵

    Березовская О., Шиммер А.Д., Глинский А.Б. и др. Повышенная экспрессия белка-ингибитора апоптоза XIAP способствует устойчивости к аноикису циркулирующих клеток-предшественников метастазов рака предстательной железы человека. Cancer Res 2005; 65: 2378–86.

31. ↵

    Pchejetski D, Golzio M, Bonhoure E, et al. Сфингозинкиназа-1 как датчик химиотерапии в клетках аденокарциномы простаты и на моделях мышей.Cancer Res 2005; 65: 11667–75.

32. ↵

    Ян М., Баранов Э., Цзян П. и др. Оптическая визуализация всего тела зеленых флуоресцентных опухолей и метастазов, экспрессирующих белок. Proc Natl Acad Sci U S. A 2000; 97: 1206–11.

33. ↵

    Sava T, Basso U, Porcaro A, Cetto GL. Новые стандарты химиотерапии метастатического гормонорезистентного рака простаты. Эксперт Rev Anticancer Ther 2005; 5: 53–62.

34. ↵

    Kohya N, Kitajima Y, Jiao W., Miyazaki K.Влияние трансфекции E-кадгерина на экспрессию гена клеточной линии карциномы желчного пузыря: репрессия экспрессии гена MTS1 / S100A4. Int J Cancer 2003; 104: 44–53.

35. ↵

    Nam JS, Ino Y, Kanai Y, Sakamoto M, Hirohashi S. 5-Аза-2′-дезоксицитидин восстанавливает систему E-кадгерина в раковых клетках, подавляющих E-кадгерин, и уменьшает метастазирование рака. Clin Exp Metastasis 2004; 21: 49–56.

36. ↵

    Глинский А.Б., Смит Б.А., Цзян П. и др.Жизнеспособные циркулирующие метастатические клетки, полученные на моделях ортотопического, но не внематочного рака простаты.

    No related posts.