Реферат: Характеристика отдельных ферментных препаратов, используемых в различных отраслях промышленности. Ферменты в промышленности реферат

Реферат - Характеристика отдельных ферментных препаратов, используемых в различных отраслях промышленности

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Пермский Государственный Технический Университет

Кафедра Химии и биотехнологии

Характеристика отдельных ферментных препаратов, используемых в различных отраслях промышленности

Выполнила:

Студентка группы ХТБ-05мЭ

И. А. Зернина

Преподаватель:

к.б.н., Д. В. Грязнова

Пермь 2010

Оглавление

Введение 3

1. Основы энзимологии 4

1.1. Структура и свойства ферментов 4

1.2. Промышленные ферментные препараты 5

2. Использование ферментов и ферментных препаратов 5

2.1. Пищевая промышленность 6

2.1.1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов 7

2.1.2. Получение безлактозного молока 7

2.1.3. Получение L-аспарагиновой кислоты 7

2.1.4. Использование ферментов в хлебопечении 8

2.1.5. Использование ферментов в виноделии [8] 9

2.2. Медицина 10

2.2.1. Бактериолитические ферменты 10

2.2.2. Иммуноферментный анализ 10

2.2.3. Лекарственные препараты на основе ферментов 12

2.3. Химический анализ 12

2.3.1. Определение органических соединений 13

2.3.2. Определение неорганических соединений 14

2.4. Тонкий органический синтез 14

2.5. Сельское хозяйство 15

2.6. Другие области применения 16

2.6.1. Разрушение целлюлозы 16

2.6.2. Применение ферментов в стиральных порошках 17

Заключение 19

Список использованной литературы 20Введение

В настоящий момент биотехнология представляет собой наиболее разнообразную область естественных наук. Она включает различные разделы научных знаний: микробиологию, анатомию растений и животных, биохимию, иммунологию, клеточную биологию, физиологию растений и животных, химию, экологию, генетику, биофизику, математику и много других областей естествознания.

Постоянно увеличивающееся разнообразие современной биотехнологии началось после окончания второй мировой войны, когда в биотехнологию внедрились другие естественнонаучные дисциплины, такие как физика, химия и математика, которые сделали возможным описание жизненных процессов на новом качественном уровне – на уровне клетки и молекулярных взаимодействий. Именно существенные успехи в фундаментальных исследованиях в области биохимии, молекулярной генетики и молекулярной биологии, достигнутые во второй половине двадцатого столетия, создали реальные предпосылки управления различными механизмами жизнедеятельности клетки. Сложившаяся благоприятная ситуация явилась мощным толчком в развитии современной биотехнологии, весьма важной области практического приложения результатов фундаментальных наук.

Одним из самых значительных практических результатов биотехнологии является применение различных ферментов и ферментных препаратов. Ферменты, выделяемые микроорганизмами, использовались человеком достаточно давно, но сущность ферментативных процессов не была известна. С развитием биотехнологии и, в частности, инженерной энзимологии стало возможным выделять ферменты из живых организмов и использовать их непосредственно в различных областях промышленности. Поэтому целью реферата является обзор распространенных и новых ферментных препаратов, применяемых в промышленности.^ 1. Основы энзимологии 1.1. Структура и свойства ферментов Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы, ускоряющие реакции в живых организмах и вне клеток. Ферменты – это белки, которые в свою очередь состоят из звеньев – аминокислот. В белках встречаются двадцать типов аминокислот, чередование которых в белковой цепи определяет специфику фермента и его биологическую функцию [1-5].

Ферменты обладают уникальными свойствами, которые выделяют их на фоне обычных химических катализаторов.

1. Прежде всего, это высокая каталитическая активность. Так, добавка незначительной концентрации фермента (10-9 – 10-7 М) ускоряет превращение субстрата в 108 – 1012 раз [1,2].

2. Другое не менее важное свойство ферментов – специфичность (избирательность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения [1-3,5]. Специфичность определяется способностью фермента превращать только данный тип субстратов в определенных реакциях и условиях.

Механизм заключается в образовании комплекса фермент-субстрат. Образовавшийся комплекс вступает в реакцию, при этом энергия активации реакции снижается. Превращение субстрата происходит в активном центре фермента. Для многих ферментов, состоящих из субъединиц, характерно наличие регуляторного участка (рис.1.), который взаимодействует с веществами, влияющими на активность фермента (активаторами, ингибиторами).

Для каждого фермента существует свой оптимум рН, при котором его каталитическое действие максимально. При резком изменении рН среды ферменты могут инактивироваться в результате необратимой денатурации.

Рис.1. Схематическое расположение участков фермента

Поскольку ферменты – вещества белковой природы, то в смеси с другими белками определить их количественно практически невозможно. Наличие фермента в препарате может быть установлено лишь по протеканию той реакции, которую катализирует фермент.^ 1.2. Промышленные ферментные препараты Использование микробных ферментов в некоторых отраслях промышленности началось достаточно давно. Основными группами ферментных препаратов являются:

^ Амилолитические ферменты (α-амилаза, β-амилаза, глюкоамилаза). Их действие проявляется при гидролизе крахмала и гликогена [6].

Протеолитические ферменты относятся к гидролазам, образуя класс пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках. Важная их особенность – выборочный, селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин – только на связь между аргинином и лизином. Применяются в пищевой промышленности для смягчения мяса; кожевенной промышленности при мягчении шкур; в косметической промышленности при производстве паст, кремов; также применяют при создании моющих средств как добавку для удаления загрязнений белковой природы; в медицине при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов [4,6].

^ Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется лишь в деполимеризации молекул целлюлозы, такие ферменты способствуют гидролизу целлюлозы до глюкозы. Используют в гидролизной промышленности, в медицине для выделения лекарственных веществ из растений; в сельском хозяйстве как добавка в комбикорма для жвачных животных [4].

^ Пектолитические ферменты объединены в одну группу по внешнему проявлению своего действия – уменьшению молекулярной массы и снижению вязкости пектиновых веществ. Все пектиназы делятся на 2 вида – гидролазы и трансэлиминазы. Первые отщепляют метильные остатки (пектинэстеразы) или разрывают α-1→4-гликозидные связи (полигалактуроназы). Вторые ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применяются в текстильной промышленности для вымачивания льна; в виноделии для осветления вин, уничтожения мутности; в консервировании для приготовления фруктовых соков [4,6].

Ферментная технология включает продукцию, выделение, очистку, использование в растворенной форме и, наконец, применение в иммобилизованном виде ферментов в широком круге реакторных систем.^ 2. Использование ферментов и ферментных препаратов В настоящее время количество ферментов, используемых в различных областях промышленности, постоянно растет. Основные ферменты и их области применения показаны в таблице 1 [5].

Таблица 1

Некоторые ферменты, использующиеся в промышленности

Фермент

Применение

а-Амилаза

Пивоварение, производство спирта

Аминоацилаза

Получение L-аминокислот

Бромелаин

Размягчение мяса, осветление соков

Каталазае

Антиоксидант в готовых к употреблению пищевых продуктах

Целлюлаза

Получение спирта и глюкозы

Фицин

Размягчение мяса, осветление соков

Глюкоамилаза

Пивоварение, производство спирта

Глюкозоизомераза

Производство сиропов с высоким содержанием фруктозы

Глюкозооксидаза

Антиоксидант в готовых к употреблению пищевых продуктах

Инвертаза

Инверсия сахарозы

Лактаза

Утилизация сыворотки, гидролиз лактозы

Липаза

Сыроварение, получение ароматизаторов

Папанн

Размягчение мяса, осветление соков

Пектиназа

Осветление соков, производство спирта

Протеаза

Детергент, производство спирта

Реннин

Сыроварени

^ 2.1. Пищевая промышленность С давних пор в таких процессах, как пивоварение, изготовление хлеба и производство сыра, использовалась (хотя и не понимаемая) деятельность ферментов. В результате эмпирических совершенствований эти традиционные технологии получили широкое распространение задолго до того момента, когда сформировались научные знания о механизмах этих процессов. Хотя история пищевых технологий насчитывает тысячелетия, тем не мене совершенствование их постоянно продолжается. В последнее время особенно наметились перспективы принципиального сдвига в технологии получения и улучшения качества пищевых продуктов.

Ферментные препараты, предназначенные для использования в пищевой промышленности или в медицинской практике, подлежат строгому контролю на токсичность для животных, мутагенную активность, канцерогенность, а также проверяются в различных фармакологических тестах.^ 2.1.1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов Фруктоза, или иначе фруктовый, плодовый или медовый сахар, широко распространен в природе. Она слаще на 60-70% чем сахароза. По сравнению с сахаром фруктоза обладает более приятным вкусом. Кроме того, фруктоза может употребляться людьми, больными диабетом, поскольку усвоение фруктозы не связано с превращением инсулина. Поэтому существует достаточно эффективный метод превращения глюкозы во фруктозу под действием иммобилизованного фермента глюкоизомеразы [6].

Фермент глюкоизомераза катализирует превращение глюкозы, получаемой при гидролизе крахмала (кукурузного или реже картофельного), в смесь глюкозы и фруктозы. Образующийся глюкозо-фруктозный сироп содержит 42-43% фруктозы, около 51% глюкозы и не более 6% олигосахаридов, по сладости соответствующих обычному сахару.

Для некоторых пищевых производств употребляют глюкозо-фруктозные сиропы с содержанием фруктозы 55 и 90%. Их в свою очередь изготавливают из обычных сиропов с использованием разделительных процессов, например, жидкостной хроматографии [6].

Крупномасштабный процесс производства фруктозных сиропов из кукурузного крахмала происходит следующим образом. Отделенные из зерен гранулы крахмала ресуспендируются в воде до концентрации 40% при рН 3,5–4,2. На стадии разжижения добавляется α-амилаза и крахмал желируется при рН 6,2–6,5 при прямом нагревании раствора паром. Начальная температура 105–107 °С поддерживается 5–8 минут, затем резко охлаждается до 95 °С и выдерживается 1–2 часа для дальнейшего гидролиза крахмала до размера олигосахаридов в 10–13 глюкозных остатков. Для осахаривания раствор разбавляют до концентрации 32–34% сухого вещества, рН доводят до значения 4,2–4,5, и глюкоза образуется при добавлении глюкоамилазы и пуллаланазы. Реакция проходит в реакторах при температуре 60 °С. Для изомеризации 95,5% раствор глюкозы доводят до рН 7–8 и пропускают через колонну с иммобилизованной глюкоизомеразой. Температура и скорость протока контролируются так, чтобы обеспечить на выходе примерно 42% фруктозный сироп [6].^ 2.1.2. Получение безлактозного молока Лактоза, молочный сахар, содержится в достаточно больших количествах в молоке и молочной сыворотке. Этот сахар характеризуется малой сладостью и низкой растворимостью. Молекулы лактозы распадаются на глюкозу и галактозу при гидролизе под действием лактазы или β-галактозидазы. Молоко после такой обработки приобретает новые диетические качества и может употребляться людьми, не переносящими молочный сахар [4,6].^ 2.1.3. Получение L-аспарагиновой кислоты Аспарагиновая кислота не принадлежит к числу незаменимых, но производится в мире многими тысячами тонн. Она находит широкое применение в пищевой промышленности для придания кондитерским изделиям и напиткам различных оттенков кислого или сладкого вкуса. Аспарагиновую кислоту получают с помощью фермента аспартазы. В качестве исходных реагентов используются фумаровая кислота и аммиак [3,4,6].^ 2.1.4. Использование ферментов в хлебопечении Применение ферментов в хлебопечении дает возможность, прежде всего, сбалансировать содержание этих природных катализирующих соединений в зерне разных урожаев, что обеспечивает стандартизацию и постоянство свойств муки. Однако ферменты способны еще и заменять различные применяемые в хлебопечении и кондитерском производстве химические агенты.

^ Действие ферментов в тесте [7]

Как известно, мука содержит три важнейших компонента: крахмал, белок клейковины и пентозаны. Тесто созревает в процессе поглощения воды и является основой всех хлебопродуктов. Вместе с тем компоненты муки поглощают влагу неодинаково. Крахмал, на долю которого приходится 68% массы пшеничной муки, впитывает лишь 50% влаги. Клейковина (содержание которой в муке около 12%) адсорбирует 27% воды, а пентозаны, которых в муке всего лишь 3%, поглощают 12% влаги.

Соотношение крахмала, белка клейковины и пентозанов должно быть оптимальным. Ферменты, присутствующие в самом зерне, всегда участвуют в процессе получения хлебопродуктов. Амилазы расщепляют крахмал до сахаров, которые служат питательными веществами для дрожжевой клетки; протеазы разрыхляют весьма плотную структуру белка клейковины. Однако уровень нативных ферментов в муке подвержен колебаниям в связи с условиями выращивания зерна, что влияет на отклонение свойств хлеба от принятых стандартов.

Ферменты микробного происхождения полностью устраняют зависимость пекаря от непостоянства состава исходного сырья и в каждом конкретном случае позволяют выбрать наиболее подходящую пропорцию амилаз и протеаз. При этом еще можно улучшить стабильность и подъем теста благодаря гемицеллюлазам.

Амилазы расщепляют цепочку крахмала до декстринов и отдельных сахаров, усиливают созревание теста, благотворно влияют на формирование вкуса и обеспечивают субстратом дрожжи. Протеазы ослабляют белок клейковины и придают тесту эластичность. Гемицеллюлазы и пентозаназы придают тесту большую стабильность и увеличивают его подъем.        Существует несколько теорий, объясняющих действие гемицеллюлаз. Суть их сводится к тому, что ферменты этой группы разрывают полимерные молекулы нерастворимых пентозанов пшеницы до растворимых высокомолекулярных фрагментов. Последние характеризуются высокой водосвязывающей способностью и взаимодействуют с белками, образуя стабильные белковые пены с развитыми заполненными воздухом порами. В результате тесто становится устойчивым к оседанию и при выпечке хорошо поднимается.        Гемицеллюлазы, используемые в хлебопечении, получают из микробных культур рода Aspergillus. Причем такие ферментные добавки лучше адаптированы к рН теста и обеспечивают отличную стабильность.         Новый для хлебопечения фермент - трансглютаминаза - способствует образованию поперечных связей между молекулами клейковинного белка и таким образом улучшает реологические свойства теста в процессе выпечки. Прекрасно дополняя другие хлебопекарные ферменты, трансглютаминаза усиливает белок клейковины и способствует формированию оптимальных характеристик теста [7].^ 2.1.5. Использование ферментов в виноделии [8] Для интенсификации технологический процессов виноделия ферментная промышленность предлагает ряд комплексных препаратов грибного происхождения, различающихся по величине активности и соотношению гидролитических ферментных систем, оказывающих многообразное действие на высокомолекулярные вещества винограда и вина. При получении вин всех типов широкое применение получили пектолитические ферментные препараты — Пектаваморин, а также Пектофоетидин. Препараты стандартизуются по общей пектолитической активности; в качестве основных ферментов они содержат полигалактуроназу эндо- и экзодействия и пектинэстеразу, а в качестве сопутствующих — протеиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы.

Оптимальные условия действия препаратов: рН 3,5—4,0, температура 35°—40°С. При получении крепленых, а также красных столовых виноматериалов ферментные препараты вносят в мезгу. При этом повышается общий выход сусла на 1—5%, а сусла-самотека на 10—20%, облегчается прессование, увеличивается содержание экстрактивных веществ и интенсивность окраски, ускоряются биохимические процессы, протекающие при созревании вин.

При приготовлении белых столовых вин ферментные препараты вносят в сусло. Процесс осветления сусла ускоряется в 2—3 раза, количество осадков снижается на 4—5%. Пектолитические ферментные препараты могут быть использованы для обработки трудноосветляемых виноматериалов. При этом значительно сокращается расход оклеивающих веществ, повышается стабильность вин к помутнениям коллоидного характера.

Использование целлюлолитических и пектолитических ферментных препаратов позволяет усовершенствовать технологию переработки сладких виноградных выжимок. При этом увеличивается выход спирта-сырца и снижается процент примесей в осадке виннокислой извести. Дозировки ферментных препаратов, зависящие от его активности, устанавливают пробной обработкой. Обычно используют суспензии ферментных препаратов концентрацией от 1 до 10%, которые готовят непосредственно перед внесением в обрабатываемый материал. Перспективы дальнейшего совершенствования приемов использования ферментативного катализа в виноделии связаны с созданием композиций высокоочищенных ферментов строго регламентированного состава, а также с получением иммобилизованных форм различных ферментных препаратов [8].2.2. Медицина Крайне широко ферменты и ферментные препараты применяются в медицине. С помощью ферментных препаратов проводят анализ содержания глюкозы, мочевины, молочной кислоты, аминокислот, этанола, ацетальдегида, АТФ, АДФ, полиненасыщенных жирных кислот пенициллина, креатинфосфата [9,10].^ 2.2.1. Бактериолитические ферменты Хорошо известно, что клетки бактерий, грибов и высших растений в отличие от клеток животных обладают мощными клеточными стенками. Вместе с тем для проведения многих экспериментов в области современной науки необходимо иметь клетки, лишенные толстых стенок. В связи с этим пристальное внимание уделяется специфическим ферментам, способным разрушать (лизировать) клеточные стенки бактерий, грибов – литических ферментов. Такие литические ферменты могут стать мощным антибактериальным средством, помогающим бороться с патогенными микроорганизмами, обладающими множественной устойчивостью к антибиотикам [4,9,10].

Основные литические ферменты по субстратной специфичности делятся на три типа. Первый тип представлен гликозидазами, разрушающими полисахаридные цепи.

^ Лизозим. Лизоцим, или N-ацетилмурамидаза гидролизирует связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином.

N-глюкозаминидаза. Гидролизирует связь между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой.

Второй тип представлен одним ферментом – N-ацетилмурамил-L-аланиламидазой (или амидазой), расщепляющей связь между мурамовой кислотой полисахарида и пептидной частью.

К третьему типу относятся пептидазы, гидролизирующие пептидные связи пептидогликана.

Лизоамидаза. Представляет собой комплекс высокомолекулярного полисахарида, заряженного отрицательно, и положительно заряженных ферментов. Лизоамидаза является эффективным средством борьбы с устойчивыми к антибиотикам патогенным микроорганизмам. При медико-биологическом и клиническом испытании препарата оказалось, что он обладает не только литическим действием на патогенные бактерии, но и хорошо очищает раны от некротических тканей, а также стимулирует заживление ран, обладая мощным иммуностимулирующим действием [9,10].^ 2.2.2. Иммуноферментный анализ В последнее время все чаще применяется высокоспецифичный иммуноферментный анализ. Иммунохимические методы основаны на реакции антител с антигеном, образующие друг с другом прочные комплексы. Возможность получения высокоспецифичных антител к широкому кругу различных веществ в сочетании с чувствительными методами регистрации образовавшихся комплексов обуславливают широкое практическое использование методов иммунохимического анализа в медицине, ветеринарии, растениеводстве, области охраны окружающей среды, контроля биотехнологических процессов [3].

Антитело, образуя комплекс с антигеном, может обеспечить уникальное по специфичности узнавание определяемого вещества в любых сложных многокомпонентных системах.

Принципиально новый шаг был сделан при использовании в иммунохимических реакциях компонентов, помеченных маркером, который легко детектируется одним из известных физико-химических методов. В качестве таких маркеров используются различные вещества: радиоактивные изотопы, флуоресцирующие красители, а также ферменты.

Ферментные метки. К ферментам, использующимся в иммуноферментном анализе, предъявляются высокие требования. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так, чтобы его активность сохранялась долгое время. Наиболее часто в иммуноферментном анализе применяются β-галактозидаза, щелочная фосфатаза кишечника теленка, пероксидаза хрена [9,10].

Получение конъюгатов с ферментами. Для введения ферментативной метки разработано много химических, биохимических способов. Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с ε-аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой, глюкоамилазой. Состав полученных генов можно варьировать, изменяя концентрацию альдегида и белковых компонентов.

Широкое распространение получил метод синтеза иммунопероксидазных конъюгатов, в основе которого лежит окисление периодатом натрия углеводной части молекулы пероксидазы с образованием альдегидных групп.

Разработаны методы получения иммуноферментных конъюгатов с β-галактозидазой. Методы основаны на том, что связывание через них антигенов не отражается на каталитических свойствах фермента. Восстановленный меркаптоэтанолом иммуноглобулин или его фрагмент связывают с β-галактозидазой с помощью N–N’-о-фенилендималеимида, специфически реагирующего с SH-группами белков. Выход конъюгата по ферменту достигает 50% при высоком сохранении компонентами специфических свойств [6,10].

Применение. Методы иммуноферментного анализа находят широкое применение в различных областях медицины, сельского хозяйства, контроле технологических процессов и качества пищевых продуктов, научных исследованиях.

В медицинской диагностике методы иммуноферментного анализа все активнее внедряются для обнаружения микробных и вирусных возбудителей. Все шире применяется иммуноферментный анализ в диагностике неинфекционных болезней, таких, как диабет, сердечнососудистые и эндокринные заболевания.

Методы иммуноферментного анализа применяются также для контроля лекарственной терапии, особенно препаратов, влияющих на сердечнососудистую систему, психотропных препаратов, антибиотиков. Эти методы позволяют быстро выявлять отравления, наличие наркотиков в препаратах.

Очень важен иммуноферментный анализ при производстве препаратов медицинского назначения, в том числе из животного сырья и донорской крови. Примеси сопутствующих веществ или вирусных антигенов могут оказаться опасными для организма.^ 2.2.3. Лекарственные препараты на основе ферментов Наибольшие успехи сделаны в области лечения острой сердечной недостаточности и терапии раневых процессов.

Сердечнососудистые заболевания. Достаточно эффективен препарат на основе стрептокиназы. Он представляет собой иммобилизованную на полисахариде стрептокиназу-белок, способствующий активации плазминогена, естественного предшественника протеиназы плазмина, предотвращающего образования тромба в кровеносной системе. Стрептокиназа иммобилизуется на окисленном периодатом декстране, при этом она не обнаруживает антигенных свойств, нетоксична и стабильна [5,6].

Препараты на основе стрептокиназы применяются при самых разных патологиях, связанных с тромбообразованием. Важно, что иммобилизация придает стрептокиназе безопасность в отношении иммуногенности.

^ Лечение ран. Хорошо известно, что протеиназы, расщепляя денатурированные белки, способствуют очищению ран, и, следовательно, их заживлению. В качестве носителей для иммобилизации протеолитических ферментов наиболее удобны волокнистые материалы на основе целлюлозы, полиамидное и коллагеновое волокно. Иммобилизованные протеолитические ферменты с большим успехом применяются в лечении гнойных заболеваний легких и плевры [6].

^ 2.3. Химический анализ Для контроля примесей в объектах пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности, в мониторинге окружающей среды, для решения некоторых медицинских и биохимических задач в последние годы все шире применяют ферментативные методы анализа, основанные на использовании зависимости скорости катализируемой ферментом химической реакции от концентрации реагирующих веществ и фермента. Использование биологических катализаторов, отличающихся высокой активностью и избирательностью действия, позволяет значительно повысить чувствительность и селективность методов анализа [1,2].

Наиболее часто применяют фотометрические методы индикации. Их используют в реакциях, катализируемых пероксидазой и другими оксидазами, а также гидролазами. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы, позволяющие контролировать скорость ферментативных реакций (например, с участием люциферазы).

Различные электрохимические методы (потенциометрия, амперометрия) наиболее удобны для контроля скорости реакции, протекающих с поглощением или выделением протонов, а также окислительно-восстановительных процессов. При этом можно выделить ферменты, позволяющие определять целый класс соединений, либо часть этого класса, либо индивидуальное соединение. Так, с помощью алкогольдегидрогеназы можно определять спирты (субстраты этого фермента), алкогольоксидазы – первичные спирты, арилалкогольоксидазы – ароматические первичные спирты. Пределы обнаружения многих органических веществ – субстратов ферментов лежат в интервале 10-6 – 10-4 М [2].^ 2.3.1. Определение органических соединений Ферментативные методы определения органических соединений успешно разрабатываются и применяются в клинических и биохимических лабораториях. Именно применение ферментов дает возможность селективно определять в крови, моче, тканях и других биологических объектах малые количества таких метаболитов и физиологически активных веществ, как мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, сахара, спирты, липиды, холестерин, нуклеотиды, антибиотики [2,6].

Мочевина. Ферментативное определение мочевины основано на реакции ее гидролиза, катализируемой ферментом уреазой. В результате гидролиза выделяются продукты – ионы Nh5+ и СО32-, которые можно определять электрохимически или фотометрически.

Аминокислоты. Определение аминокислот основано на использовании таких ферментов, как ^ L-амино- или D-аминооксидазы, которые катализируют окисление аминокислоты кислородом воздуха до кетокислоты, пероксида водорода и аммиака. Аммиак далее определяют электрохимически с помощью газового электрода.

Глюкоза. Для определения глюкозы используют несколько специфических ферментативных реакций:

Окисление глюкозы до глюконовой кислоты и пероксида водорода с помощью глюкозооксидазы

Взаимодействие с АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата в присутствии гексокиназы.

Дисахариды. Ферментативные методы определения сахарозы и других дисахаридов основаны на использовании специфических ферментов (инвертазы, лактазы), превращающих дисахариды в моносахариды, одним из которых является глюкоза. Далее глюкозу определяют одним из вышеописанных методов.

Этанол. Ферментативное определение этанола основано на использовании одного из двух ферментов: алкогольоксидазы, катализирующей окисление этанола кислородом воздуха до ацетальдегида и воды, или фермента алкогольдегидрогеназы [2,6].^ 2.3.2. Определение неорганических соединений Ферментативные методы успешно применяются для чувствительного и селективного определения ионов металлов, неорганических анионов, пероксида водорода, кислорода, растворенного в воде. Многие ионы металлов (например, Ag, Cu, Hg, Zn, Bi, Cd) можно определять с применением ферментов в количествах, недоступных определению с помощью большинства физико-химических методов анализа. Так, с применением щелочной фосфатазы разработан метод определения нанограммовых количеств бериллия. По ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу возможно определять ионы серебра в концентрации 10 пг/мг.

Для определения анионов, таких, как NO2-, NO3-, CN-, PO42-, AsO43-, чаще всего используют ферментные электроды, позволяющие проводить экспрессный анализ сложных промышленных и биологических объектов. Чаще всего анионы являются субстратами в тех ферментативных реакциях, которые положены в основу методов их определения. Пределы обнаружения ионов при использовании ферментных электродов обычно выше 10 мкм [2].

Определение других неорганических соединений – аммиака, кислорода, диоксиды серы, пероксида водорода основано на том, что они являются субстратами многих ферментов, поэтому могут быть определены с их помощью. В таблице 2 приведены наиболее распространенные методы определение соединений с помощью ферментов [2].

Таблица 2

Примеры использования ферментов для определения различных субстратов (I) и ингибиторов (II)

Фермент

Индикаторная реакция

Определяемое вещество

Сmin, М

I

II

Аланиндегидрогеназа

l-Аланин – НАД+

l-Аланин

5·10-6

Полифенолоксидаза

Фенол – О2

Фенол

6·10-6

Алкогольоксидаза

Этанол – НАД+

Этанол

1·10-5

Пероксидаза

Гомованилиновая кислота – Н2О2

Н2О2

5·10-9

Тетраметилбензидин – Н2О2

Hg(II)

1·10-13

о-Дианизидин - Н2О2

CN-

8·10-10

Сульфитоксидаза

Сульфит - О2

SО2

1·10-6

Холинэстераза

Гидролиз ацетилхолина

Фозалон

5·10-11

Уреаза

Гидролиз мочевины

Мочевина

1·10-6

Щелочная фосфатаза

Гидролиз n-НТФ

(n-нитрофенилфосфат)

Тиокрезол

8·10-8

Кислая фосфатаза

Гидролиз n-НТФ

F-

1·10-10

^ 2.4. Тонкий органический синтез Достаточно эффективно ферменты используются в тонком органическом синтезе. Созданы биокатализаторы процессов анаэробного получения этанола, получения лизина, получения уксусной кислоты, синтез простагландинов и лейкотриенов, синтеза липоксинов [4,5]. Ферменты также применяются для следующих процессов:

Производство β-лактамных антибиотиков

Ферментативное разделение рацематов

Синтез с использованием гидролаз

Регенерация кофакторов

Синтез аминокислот

Синтез простаноидов

Модификация сахаров

www.ronl.ru

Применение ферментов в сельском хозяйстве, промышленности, медицине, науке и технике

8. 1. Области применения растворимых ферментных препаратов

Высокая каталитическая активность, специфичность и разнообразие ферментов, их способность осуществлять биохимические реакции в мягких условиях делают ферменты весьма привлекательными для осуществления различных технологических процессов. Эти же особенности открывает перспективу их использования в качестве медицинских препаратов.

В настоящее время препараты разных ферментов использу­ют более чем в 25-ти отраслях промышленности главным образом в пищевой и легкой промышленности. Широко применяют ферменты в спиртовой промышленности и в пивоваре­нии. Новой, быстро развивающейся и важной областью использо­вания ферментов является их применение для получения высоко­эффективных моющих средств. Начинают также применять фермен­ты при очистке сточных вод (таблица 2)271-272.

В се­льском хозяйстве ферменты применяются для приготовления кормов, а также улучшения их усвоения животными261*266. Все шире фермен­ты используются для приготовления лекарственных средств, а также в медицине при диагностике. Кроме того, ферменты применяют в научных исследованиях, для установления структуры некоторых соедине­ний, в частности белков и НК, их биосинтеза, для изучения организации субклеточных структур, в качестве аналитических реагентов и в других целях259.

Особенно развито производство и применение ферментов в таких странах, как США и Япония271, 272. Так, в США в 1970 г. было выпущено 32 тыс. т. ферментных препаратов более 120 наименований, а в Япония 50 тыс. т. более 80 видов. Из общего объема полученных еще в 1967 году в Японии ферментных препаратов 26 % использовалось в пищевой промышленности 272 , 23 % - в текстильной, 38 % - в производстве кормов и комбикормов, 4 % - в кожевенном производстве, 9 % - в медицине. При этом было выпущено (в тоннах): амилазы - 9850, протеазы - 8906, глюкозооксидазы - 2200, липазы и целлюлазы - по 100, других ферментов - 200.

В США, наряду с пищевой промышленностью, значительная часть ферментов идет на производство моющих средств (в 1971 г. - 34 %).

В СССР ферментная промышленность начала создаваться в 30-х годах. Особенно быстро её развитие в странах СНГ идет в последнее время.259, 263, 273

В качестве сырья для получения ферментов все больше используют микроорганизмы. Так, в Японии, по данным за 1967 год, из общего объема выпущенных ферментов на препа­раты из бактерий приходилось 80 %, из плесневых грибов - 10 %, из дрожжей - 3 %, из животного сырья - 0,2 %.

Ферменты выпускают в виде препаратов, содержащих один или преимущественно один фермент, а также комплексных, в которые входит ряд ферментов, причем препараты одних и тех же ферментов могут иметь разные фирменные названия.

Наиболее широкое применение имеют препараты ферментов гидролитического действия, из которых важнейшими являются амилазы, осуществляющие разжижение и осахаривание крахмала в разных субстратах. Наряду с солодовыми амилазами в раз­ных отраслях пищевой промышленности при производстве спир­та и в пивоварении все шире применяют препараты ферментов из грибов и бактерий263, 266, 274. Весьма удачным оказалось, например, применение грибной амилазы в хлебопечении и в спиртовой промышленности. В текстильной промышленности для расшлихтовки тканей давно используют бактериальные амилазы263, 266.

Комплексные препараты ферментов микроорганизмов, в состав которых входят амилазы, применяют в животноводстве, а также при очистке стоков и водопроводных труб261,263,271, 272.

Препараты поджелудочной железы, содержащие - и -амилазы (диастаза), используют в медицине. Получают также лечебные препараты, содержащие амилазы микроорганизмов, ко­торые применяют для улучшения пищеварения при некоторых заболеваниях*. В медицине и в парфюмерной промышленно­сти нашел применение специальный препарат грибной диастазы272.

Выпускают препараты глюкоамилазы, которые используют для получения из крахмала глюкозы в крахмало-паточной промышленности, в хлебопечении и других производствах.

Из карбогидраз наиболее часто используют инвертазу, превращающую сахарозу в глюкозу и фруктозу. Её применяют в кондитерской промышленности и при производстве ликеров, для предупреждения кристаллизации продуктов из-за высокой концентрации сахарозы. В этих же целях используют лактозу (расщепляет молочный сахар) при получении мороженого, кремов и концентратов молока266.272, 275

Таблица 2

Источники и области применения основных выпускаемых ферментных препаратов

studfiles.net

Реферат - Особенности использования иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности а. А. Лукин Ассистент кафедры «Прикладная биотехнология» Южно – Уральский государственный университет, г. Челябинск

В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

А.А. Лукин

Ассистент кафедры «Прикладная биотехнология»

Южно – Уральский государственный университет, г. Челябинск

М.Б. Ребезов

Профессор кафедры «Прикладная биотехнология»

Южно-Уральский государственный университет, г. Челябинск

Ферменты — это специфические катализаторы белковой природы, вырабатываемые клетками и тканями организмов.

Микробиологический метод получения ферментов - наиболее перспективен. Его преимущества заключаются в следующем: богатство ассортимента ферментов, синтезируемых микроорганизмами; возможность управления ферментативными системами и составом производимых препаратов; высокие скорости размножения микроорганизмов и возможность использования различных, в том числе доступных и недорогих субстратов. Ферменты в микробных клетках могут иметь как внутриклеточную локализацию, так и выделяться в окружающую среду. Последние более доступны для препаративного получения, поэтому в промышленных масштабах получают главным образом внеклеточные ферменты. Из описанных к настоящему времени более 2000 ферментов практическое значение имеют около 50 [1].

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму).

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечислен­ным требованиям. Тем не менее существует широкий набор носи­телей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы.

^ Органические полимерные носители. Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органической природы. Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических — полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.

К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам — биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена — желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значительных количествах, дешевы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

^ Синтетические полимерные носители. Благодаря разнообразию и доступности материалы этой группы широко используются как носители для иммобилизации. К ним относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функциональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.

^ Носители неорганической природы. В качестве носителей наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей — легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Итак, к настоящему времени создано огромное число разнообразных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каждого индивидуального фермента, используемого в конкретном технологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

^ Физические методы иммобилизации ферментов реализуются посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем включения энзимов в поры поперечносшитого геля, в по­лупроницаемые структуры или двухфазные системы.

^ Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При ад­сорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей.

Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100%, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами — полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

^ Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимериза­цию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго — гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.

^ Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении вод­ного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Достоинства метода микрокапсулирования: простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования). Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отне­сти невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран, по­этому изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

^ Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем — наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.).

Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с преимуществами иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные технологические процессы [2].

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных ферментов и клеток (рис. 1).

Рис. 1. Использование иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов во многих жизненно важных отраслях народного хозяйства становится все более массовым. Выгодное сочетание избирательности и эффективности с долговечностью и стабильностью иммобилизованных ферментов в корне меняет химическое производство, способы добывания сырья, способствует созданию новых биотехнологических процессов.

На кафедре «Прикладная биотехнология» Южно-Уральского государственного университета ведутся исследования направленные на изучение использования ферментных препаратов для переработки вторичного коллагенсодержащего сырья при производстве мясных продуктов с заданными функционально-технологическими свойствами. (www.bio.susu.ru).

Литература:

1. Волова Т.Г. Биотехнология [Текст]. – Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. – 252 с.

2. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. Пед. Учеб. заведений. [Текст]. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 208 с.

www.ronl.ru

Курсовая работа - Ферменты - Биология и химия

Министерство образования РФ

Муниципальная средняя школа № 33

Экзаменационный реферат

по биологии на тему

«Ферменты»

Выполнил:

ученик 10 Г класса

Елизаров Александр

Научный руководитель

Захаров С. П.

Смоленск 2000

Содержание:

1. Введение.

2. Ферменты.

· История открытия.

· Природа ферментов.

а) Структуры.

б) Специфичность.

3. Состав.

4. Классификация.

5. Номенклатура.

6. Активность ферментов.

7. Механизм действия.

8. Значение.

· В организме.

· В науке.

9. Заключение.

ВВЕДЕНИЕ.

«Ферменты ( от латинского слова fermentum – закваска) – белки, которые обладают каталитической активностью и характеризуются очень высокой специфичностью и эффективностью действия. Все процессы в живом организме- дыхание, пищеварение, мышечное сокращение, фотосинтез и другие – осуществляются с помощью ферментов. Ферменты находятся во всех живых клетках и составляют большую часть всех их белков. Они во много миллионов раз ускоряют самые разнообразные химические превращения, из которых складывается обмен веществ. Под действием различных ферментов составные компоненты пищи: белки, жиры и углеводы – расщепляются до более простых соединений, из которых затем в организме синтезируются новые макромолекулы, свойственные данному типу. » Вот, всё что я знал о ферментах. Я решил пополнить свои знания и поэтому взял реферат по ферментам.

ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ.

Науку составляет не только достигнутый результат, но и путь ведущий к результату путь от незнания к знанию, медленный, извилистый, скачкообразный, в каждой области зависящий от достижений смежных наук и общего развития мировоззрения. Ещё в незапамятные времена, на заре возникновения цивилизации, люди в своей практической деятельности сталкивались с различными ферментативными процессами и использовали их для своих целей. Это

спиртовое и молочнокислое брожение, применение сычуга для приготовления сыров, солода и плесневых грибов- для осахаривания продуктов. Вероятно, первым, кто попытался

создать общее представление о химических процессах в живом организме, был врач и ученый Парацельс, родившийся в Швейцарии в конце XV века. Несмотря на наивность

(с совершенной точки зрения), взгляды Парацельса во многом были прогрессивными, так как для понимания жизненных явлений он пытался привлечь реальные силы природы. Именно с этих позиций Парацельс и его последователи подошли к рассмотрению сущности ферментации, давно известного понятия обозначавшего разного рода брожения, главным

образом спиртовое и молочнокислое. В XVI и начале XVII века уже делались попытки рассматривать ферментации как химические процессы. И Василий Валентин ( первая

половина XVI века), и Андрей Либавий (1550-1616 годы) считали ферменты ( или дрожжи) особым веществом, хотя и подчиняли его действия неким не материальным силам. Другим последователем Парацельса был знаменитый голландский химик Иоганн Баптиста Ван Гельмонт (577-1644 годы). Именно он охарактеризовал фермент как агент, вызывающий химические процессы в организме и управляющий ими. Качественный скачёк в развитии учения о ферментациях произошёл в связи с исследованиями великого французского химика Антуана Лавуазье, совершившего переворот в химии и впервые внедрившего в химические исследования строгие количественные методы. К концу XVIII века уже было известно, что встречаются химические процессы, протекающие с участием какого-то агента, без которого процесс практически не идёт.

Первые успехи были достигнуты при изучении превращения крахмала в сахар. Решающая роль в этих исследованиях принадлежит работам петербургского академика К. С Кирхгофа, которые открыли новую страницу в истории и химия ферментов. В начале XIX века было открыто немало химических реакций, среди них были и некоторые ферментативные реакции. Юстус Либих был одним из наиболее крупных авторитетов среди химиков XIX века. В это время было открыто ещё несколько ферментов. В 1836 году Т.Шванн впервые обнаружил в желудочном соке фермент животного происхождения, названный им пепсином. Несколько позже, в 1857 году, А.Корвизар описал другой фермент, переваривающий белки — трипсин. В XIX веке (1897 год) Эдуард Бухнер убедительно доказал химическую природу ферментов. В 1907 году — Эдуард Бухнер был удостоен Нобелевской премии по химии. (В.И.Розенгарт Ферменты- двигатели жизни).

ПРИРОДАФЕРМЕНТОВ .

а) После того как стало возможным исследование ферментов в бес клеточной среде, была окончательно установлена их химическая природа. Было выявлено, что все они представляют собой вещества белковой природы и, как все белки могут быть простыми и сложными в зависимости от сопутствующего компонента небелкового характера ( простетической группы).

Так мы подчёркивали, что свойство каждого белка определяется последовательностью расположения остатков аминокислот в их молекуле. Эта последовательность называется первичнойструктурой белка. В последние годы разработаны очень надёжные, и даже автоматизированные методы изучения первичной структуры, что дало возможность определить

полную аминокислотную последовательность для многих белков, в том числе и для ферментов. Помимо первичной структуры, определяемой последовательностью расположения аминокислот, для проявления специфических свойств белка (в ном числе ферментативной активности) важную роль играют более высокие уровни — вторичная и третичная структуры, сущность которых заключается в определённом расположение полипептидных цепей в пространстве.

Вторичная и третичная структуры белков поддерживаются сравнительно слабыми внутримолекулярными связями, и поэтому легко могут быть разрушены разными физическими и химическими воздействиями. Такое нарушение высших структур белка без повреждения его первичной структуры составляет сущность денатурации. При денатурации белок нередко утрачивает свои биологические свойства, в случае ферментов исчезает ферментативная активность. Современные методы исследования позволяют получить представление не только о первичной структуре белков. Есть ферменты, для которых полностью выяснено пространственное расположение атомов, составляющее их молекулу, то- есть расшифрованы вторичная и третичная структуры. Это достигнуто благодаря применению исключительно тонкого и сложного метода, так называемого рентгеноструктурного анализа. Некоторым белкам свойственен ещё более высокий уровень структуры — четвертичная структура. Это уже надмолекулярный уровень: функционирование такого белка нуждается не в одной, а в нескольких молекулах ( чаще всего в двух или четырёх), которые вместе образуют комплекс, обладающий всеми специфическими свойствами. Каждая отдельная молекула такого белка, составляющая четвертичный комплекс, называется субъединицей. Многие ферменты построены из субъединиц. В одних случаях субъединиц сами обладают активностью, в других их субъединиц по отдельности неактивны. Субъединицы, сопоставляющие молекулу фермента, могут быть одинаковыми, но могут и отличатся друг от друга. Представление о молекуле фермента как структуре, состоящей из субъединиц, позволяет нам объяснить одно очень интересное и практически важное явление. Существуют ферменты, различающиеся по строению, но катализирующие одну и ту же реакцию, они называются изоферментами. Такие ферменты довольно широко распространены в организме, и их выявление имеет большое значение в медицине.

б) Одно из наиболее поразительных свойств ферментов их специфичность. Специфичность ферментов проявляется по- разному и может быть выражена в разной степени. Прежде всего следует различать специфичность по отношению к субстрату и к типу химической реакции, катализируемой ферментом.

Специфичность по отношению к реакции .

Каждый фермент катализирует одну химическую реакцию или группу реакций одного типа. Наиболее ярким проявлением этого вида специфичности могут служить довольно частые случаи, когда одно и то же химическое соединение выступает как субстрат действия нескольких ферментов, причём каждый из них, катализирует специфическую для него реакцию, приводит к образованию совершенно различных продуктов (смотри приложение № 1).

· В первой реакции под действием фермента оксидазы происходит окисление аминокислот. При этом аминогруппа (Nh3) отделяется в форме аммиака (Nh4) и образуется соединение, содержащие кретонную группу (С=О) и называемое кетокислотой.

· Вторую реакцию катализирует декарбоксилаза. Под влиянием этого фермента из карбоксильной группы (- СООН) отщепляется углекислота (СО2) и остаётся амин.

· Третья реакция более сложна. Она катализируется ферментом трансиминазой и состоит в переносе аминогруппы с аминокислоты на кетонокислоту. Мы видим. что исходная аминокислота имеет радикал R, а образовавшаяся в результате реакции новая аминокислота- радикал R'.

Итак, один и тот же субстрат подвергается разным превращениям под влиянием различных ферментов.

Специфичность по отношению к субстрату .

Наряду с только, что описанной формой специфичности фермента по отношению к катализируемой им реакции существует и другая, тесно связанная с первой форма специфичности, выражающаяся в способности фермента атаковать субстрат только определённого химического строения. Иногда фермент способен действовать только на один единственный субстрат, тогда говорят, что он обладает абсолютной специфичностью. Значительно чаще фермент влияет на группу субстратов, имеющих сходное строение. Такую специфичность называют групповой. Особый интерес представляет так называемая стереохимическая специфичность, состоящая в том, что фермент действует на субстрат или группу субстратов, отличающихся особым расположением атомов в пространстве.

Абсолютная специфичность встречается редко.

Хорошим примером фермента, обладающего очень высокой, практически абсолютной специфичностью может служить уреаза, катализирующая гидролиз мочевины.

h3N\

C=O + h3O = CO2 + 2Nh4

h3N/ вода углекислота аммиак

мочевина

Долгое время считалось, что мочевина является единственным субстратом уреазы. Но не так давно было показано, что кристаллическая уреаза может действовать и на близкого родственника мочевины — оксимочевину, отличающуюся наличием в молекуле одного атома кислорода.

HOHN\

C=O

h3N/

оксимочевина

«Правда, реакция гидролиза мочевины под влиянием уреазы протекает в 120 раз медленнее, чем гидролиз мочевины» (В. И. Розенгарт Ферменты- двигатели жизни)

Таким образом, понятие «абсолютная специфичность» является в известной мере относительным.

Групповая специфичность. Она характеризует подавляющее большинство ферментов и состоит в том, что фермент, проявляя свойственную ему специфичность по отношению к реакции, способен действовать не на один, а на несколько, иногда на большое число субстратов со сходным химическим строением. Например (смотри приложение № 1), три разных фермента, действующие на аминокислоты. все они обладают групповой специфичностью, так как действуют не на какую-нибудь одну аминокислоту, а на многие, иногда на все аминокислоты.

· Относительно групповая специфичность проявляется тогда, когда фермент безразличен к структуре соединения и имеет значение лишь тип связи. Примером служит химотрипсин, расщепляющий только пептидную связь.

Стереохимическая и оптическая специфичность имеет особое значение. Проявляется только в случае оптически активных веществ, и фермент активен только по отношению к одной стереоизомерной форме соединения. Например, L- аргиназа разлагает L-аргинин на L- орнитини мочевину, но не действует на А- аргинин. Известным примером служит d и L- специфичность оксидаз аминокислот. Стереохимическая и оптическая активность так- же может быть абсолютной и относительной; например, карбоксипептидаза, расщепляющая карбобензокси -глицил-L- фенилаланин совсем не действует на субстрат с А- фенилаланином: с другой стороны, эстеразасвиной печени разлагает метиловый эфир L- миндальной кислоты лишь вдвое быстрее, чем его А- изомер.

СОСТАВ .

После того как стало возможным исследование ферментов в бес клеточной среде, была окончательно установлена их химическая природа. Было выявлено, что все они представляют собой вещества белковой природы и как все белки, могут быть простыми и сложными в зависимости от сопутствующего компонента небелкового характера (простетической группы).

Ферменты- простые белки- построены только из аминокислот, и их каталитические свойства обусловлены свойством самой белковой молекулы. К этой группе ферментов относится большинство гидролитических ферментов. Ферменты- сложные белки- содержат в своём составе, помимо белкового компонента, ещё и небелковый- например, нуклеотиды, геминовую группу, витамины, атомы ( катионы ) металла. К таким ферментам обычно относятся ферменты окислительно-восстановительного действия. Прочность связи между белковым компонентом и простетической группой в сложных ферментах может быть различной. В некоторых случаях связь прочная, в других — простетическая группа довольно легко отделяется, например при диализе. Легко диссоциирующие простетические группы ферментов получили название коферментов. При отделении простетической группы от белковой части фермента — последний теряет свою активность. В простых ферментах активный центр образуется непосредственно группировкой аминокислотных остатков в спиральной цепи белковой молекулы. В сложных ферментах он образуется простетической группой и некоторыми прилегающими к ней остатками. Размер активных центров значительно меньше самой молекулы фермента. На один активный центр приходится масса молекулы с молекулярным весом 30000. В простых ферментах пространственная группировка этих аминокислотных остатков сама по себе определяет структуру активного центра и каталитическую активность фермента. В сложных ферментах структура активного центра определяется простетической группой и боковыми группами некоторых аминокислотных остатков, пространственная структура которых оказывает существенное влияние на специфичность и каталитическую активность небелкового компонента. Среди таких аминокислотных остатков наибольшее значение имеют SH- группы цистеина, OH- группы серина, несколько меньшее значение имеет индольная группа триптофана, карбонильные группы дикарбоновых аминокислот. Компоненты активного центра нельзя представлять последовательно расположенными на, каком — либо участке цепи. По- видимому, активный центр формируется из компонентов, удалённых в первичной структуре полипептидной цепи, но пространственно сближенных благодаря специфической укладке полипептидной цепи.

КЛАССИФИКАЦИЯ .

Сейчас известно около 2 тысяч ферментов, но список этот не закончен. В зависимости от типа катализируемой реакции все ферменты подразделяются на 6 классов:

· Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции оксидоредуктазы;

· Ферменты переноса различных группировок ( метильных, амино- и фосфогрупп и другие)- трансферазы.

· Ферменты, осущевствляющие гидролиз химических связей — гидролазы

· Ферменты не гидролитического отщепления от субстрата различных группировок (Nh4, CO2,h3O и другие)- лиазы.

· Ферменты, ускоряющие синтез связей в биологических молекулах при участии доноторов энергии, например АТФ,- лигазы.

· Ферменты, катализирующие превращение изомеров друг в друга,- изомеразы.

ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ – ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы в организме. Они осущевствляют перенос водорода и электронов и по своим привиальным названием известны как дегидрогеназы, оксидазы и пероксидазы. Эти ферменты отличаются тем, что имеют специфические коферменты и простетические группы. Их подразделяют на функциональные группы доноров, от которых они принимают водород или электроны, и акцепторов, на которые они их передают (на СН-ОН группу, СН- NH группу, C-NH группу и другие).

ТРАНСФЕРАЗЫ – ферменты, переносящие атомные группы ( в зависимости от того, перенос какой группы они осуществляют, их соответственно называют). Среди них известны ферменты осуществляющие транспорт больших остатков, например гликозилтрансферазы и другие. Трансферазы благодаря разнообразию переносимых ими остатков принимают участие в промежуточном обмене веществ.

ГИДРОЛАЗЫ – ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление различных субстратов (при участии молекул воды). В зависимости от этого среди них различают эстеразы, расщипляющие сложноэфирную связь между карбоновыми кислотами (липаза) тиоловых эфиров, фосфоэфирную связь и так далее; гликозидазы, расщепляющие гликозидные связи, пептид — гидролазы, действует на пептидную связь и другие.

ЛИАЗЫ. К этой группе относятся ферменты, способные отщеплять различные группы от субстрата не гидролитическим путём с образованием двойных связей или, напротив, присоединять группы к двойной связи. При расщеплении образуется Н2О или СО2 или большие остатки- например ацетил- СоА. Лиазы играют весьма важную роль в процессе обмена веществ.

ИЗОМЕРАЗЫ – ферменты, катализирующие превращение изомерных форм друг в друга, то — есть осуществляющие внутримолекулярное превращение различных групп. К ним относятся не только ферменты, стимулирующие реакции взаимных переходов оптических и геометрических изомеров, но и такие, которые могут способствовать превращению альдоз в кетозы или перемещению эфирной связи и другие.

ЛИГАЗЫ. Раньше эти ферменты не отделяли от лиаз, так как реакция последних часто идёт в двух направлениях, однако недавно было выяснено, что синтез и распад в большинстве случаев происходит под влиянием различных ферментов, и на этом основании выделен отдельный класс лигаз (синтетаз). Ферменты, обладающие двойным действием, получили название бифункциональных. Лигазы принимают участие в реакции соединения двух молекул, то есть синтетических процессах, сопровождающихся расщеплением макроэнергитических связей АТФ или других макроэргов.

«Первое подразделение ферментов на самые крупные группы (6 классов) основано не на названии субстрата, а на природе химической реакции, которую фермент катализирует. Далее, внутри классов ферменты делят на подклассы, руководствуясь строением субстрата. В подклассы объединяют ферменты данного класса, действующие на сходно построенные субстраты. На этом деление не заканчивается. Ферменты каждого подкласса разбивают на подклассы, в которых ещё строже уточняют структуру химических групп, отличающих субстраты друг от друга. Подкласс это последняя низшая ступень классификации. Внутри подклассов перечисляют уже отдельные, индивидуальные ферменты. Таким образом, вся система проста и достаточно стройна:

КЛАСС- ПОДКЛАСС- ПОДПОДКЛАСС- ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ ФЕРМЕНТ.

В соответствии с этим принципом классификации предложена очень удобная система нумерации (индексации) ферментов. Каждый индекс состоит из четырёх цифр, разделённых точками:

1. Номер класса.

2. Номер подкласса в данном классе

3. Номер подподкласса

4. Номер, присвоенный данному индивидуальному ферменту этого подподкласса» (В. И. Розенгарт Ферменты- двигатели жизни)

Например, амилаза-фермент, гидролизующий крахмал с которой мы уже встречались неоднократно, имеет индекс 3.2.1.1. Классификация ферментов построена так, что в ней оставлены свободные места для ещё не открытых ферментов.

НОМЕНКЛАТУРА.

Ферментология очень долго не располагала, строг научной номенклатурой ферментов. Наименования ферментам давали по случайным признакам (тривиальная номенклатура ), по названию субстрата (рациональная), по химическому составу фермента, наконец, по типу катализируемой реакции и характеру субстрата. Примерами тривиальной номенклатуры могут служить названия таких ферментов, как пепсин (от греч. пепсин — пищеварение), трипсин (от греч. трипсис — разжижаю) и папаин (от названия дынного дерева Carica papaja, из сока которого он выделен). По действию все эти ферменты являются протеолитическими, т. е. ускоряют гидролиз протеинов (белков). Характерное название была дано группе окрашенных внутриклеточных ферментов, ускоряющих окислительно-восстановительные реакции в клетке, — цитохромы (от лат. citos — клетка и chroma — цвет).

Наибольшее распространение получила рациональная номенклатура, согласно которой название фермента составляется из названия субстрата характерного окончания -аза. Она была предложена более столетия тому назад, в 1883 г. Э. Дюкло — учеником Л. Пастера. Так, фермент, ускоряющий реакцию гидролиза крахмала, получил название амилаза (от греч. амилон — крахмал), гидролиза жиров — липаза (от греч. липос — жир), белков (протеинов) — протеаза, мочевины — уреаза (от греч. уреа — мочевина) и т. п. Когда методами аналитической химии были достигнуты известные успехи в расшифровке химической природы простетических групп, возникла новая номенклатура ферментов. Их стали именовать по названию простетической группы, например, геминфермент (простетическая группа — гем), пиридоксаль- фермент (простетическая группа — пиридоксаль) и т.п. Затем в названии фермента стали указывать как на характер субстрата, так и на тип катализируемой реакции. К примеру, фермент, отнимающий водород от молекулы янтарной кислоты, называют сукцинатдегидрогеназой, подчеркивая этим одновременно и химическую природу субстрата, и отнятие атомов водорода в процессе ферментативного действия:

— 2Н

НООС -Сh3 — СН2 – CООН НООС — СН = СН – СООН

Янтарная кислота Дегидрирование Малеиновая кислота

В 1961 г. Международная комиссия по номенклатуре ферментов представила V Международному биологическому конгрессу проект номенклатуры, построенный на строго научных принципах. Проект был утвержден конгрессом, и новая номенклатура прочно вошла в ферментологию. Согласно этой (Московской) номенклатуре название ферментов составляют из химического названия субстрата и названия той реакции, которая осуществляется ферментом. Если химическая реакция, ускоряемая ферментом, сопровождается переносом группировки атомов от субстрата к акцептору, название фермента включает также химическое наименование акцептора. Например, пиридоксальфермент, катализирующий реакцию переаминирования между L-аланином и -кетоглутаровой кислотой, называется L-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза. В этом названии отмечены сразу три особенности: 1) субстратом является L-аланин; 2) акцептором служит 2-окcоглутаровая кислота; З) от субстрата к акцептору передается аминогруппа.Названия ферментов по научной номенклатуре неизмеримо выигрывают в точности, но становятся в ряде случаев гораздо сложнее старых, тривиальных. Так, уреаза (тривиальное название), ускоряющая реакцию гидролиза — мочевины на оксид углерода (IV) и аммиак, по научной номенклатуре именуется карбамид — амидогидролазой:

Н2N — СО — NН2 + Н2О 2NН3 + СО2

В этом названии дано точное химическое наименование субстрата и указано, что фермент катализирует реакцию гидролиза аминогруппы. Трегалаза, ускоряющая реакцию гидролиза трегалозы, называется трегалоза-1-глюко-гидролазой… В связи со значительным усложнением научных названий в новой номенклатуре допускается сохранение наряду с новыми старых тривиальных, рабочих названий ферментов. Международной комиссией был составлен детальный список всех известных в то время ферментов, существенно дополненный в 1972 г. при пересмотре, как классификации, так и номенклатуры некоторых ферментов, где рядом с новым научным названием каждого фермента приведено старое, а также указан химизм катализируемой ферментом реакции и в некоторых случаях природа фермента. Таким образом, исключается возможность путаницы в наименовании ферментов. В 1964 г. список включал 874 фермента; в последующее время он был существенно дополнен и возрос до 1770 ферментов в 1972 г. и до 2003 ферментов в 1979 г.

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ.

Для исследования или практического работника, занимающегося ферментами, определение активности ферментов — это постоянная, повседневная работа, потому что любое изучение свойств ферментов, любое применение их в практической деятельности- в медицине и в народном хозяйстве- всегда связано с необходимостью знать, с какой скоростью протекает ферментативная реакция. Что бы понять и правильно оценить результаты определения ферментативной активности, нужно совершенно отчётливо представить себе, от каких факторов зависит скорость реакции, какие условия оказывают на неё влияние. Таких условий много. Прежде всего это соотношение концентрации самих реагирующих веществ: фермента и субстрата. Далее, это всевозможные особенности той среды, в которой протекает реакция: температура, кислотность, наличие солей или других примесей, способных как ускорять, так и замедлять ферментативный процесс, и так далее. Попытаемся рассмотреть поближе эти условия.

ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИЙ СРЕДЫ.

Для большинства известных в настоящее время ферментов определён оптимум РН, при котором они обладают максимальной активностью. Эта величина- важный критерий, служащий для характеристик фермента. Иногда это свойство ферментов используют для их препаративного разделения. Наличие оптимума РН можно объяснить тем. Что ферменты представляют собой полиэлектролиты и их заряд зависит от значения РН (Смотри приложение 2). Иногда сопутствующие вещества могут изменить оптимум РН, например буферные растворы. В некоторых случаях в зависимости от субстратов ферменты с неярко выраженной специфичностью имеют несколько оптимумов. Например, пепсин расщепляет белки яйца при РН 1,5- 2,0, синтетические субстраты- при РН 4,0. Отсюда следует, что величина (РН оптимум)- весьма чувствительный признак для данного фермента. Она зависит от природы субстрата, состава буферного раствора и поэтому не является истинной константой. Нужно иметь в виду также свойства ферментов как белковых тел, способных к кислотно-щелочной денатурации. Поэтому при определении оптимума РН, в котором сохраняется физико-химическая стабильность фермента. Кислотно-щелочная денатурация может привести к необратимым изменениям структуры фермента с утратой его каталитических свойств.

ВЛИЯНИЕ ДРУГИХ ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ.

Присутствие в реакционной среде некоторых ионов может активировать образование активного субстрат ферментного комплекса, и в этом случае скорость ферментативной реакции будет увеличивается. Такие вещества получили название активаторов. При этом вещества, катализирующие ферментативные реакции, непосредственного участия в них не принимают. На активность одних ферментов существенно влияет концентрация солей в системе, другие ферменты не чувствительны к присутствию ионов. Однако некоторые ионы абсолютно необходимы для нормального функционирования некоторых ферментов. Известны ионы, которые тормозят активность одних ферментов и являются активаторами для других. К числу специфических активаторов относятся катионы металлов: Na+, K+,Rb+,Cs+,Mg2+, Ca2+,Zn2+,Cd2+,Cr2+,Cu2+,

Mn2+,Co2+,Ni2+,Al3+. Известно также, что катионы

Fe2+,Rb+,Cs+ только в присутствии Mg действуют как активаторы, в других случаях эти катионы не являются активаторами. В большинстве случаев один или два иона могут активировать тот или иной фермент. « Например, Mg2+- обычный активатор для многих ферментов, действующий на фосфоримированные субстраты, почти во всех случаях может быть заменён Mn2+, хотя другие металлы его заменить не могут. Следует заметить, что щелочноземельные металлы вообще конкурируют друг с другом, в частности, Са2+ подавляет активность многих ферментов, активируемых Mg2+ и Zn2+. Причина этого до настоящего времени не ясна» (Г. А. Смирнова Основы биологии). Механизм влияния ионов металлов- активаторов может быть различным. Прежде всего, металл может быть компонентом активного центра фермента. Но может действовать как связующий мостик между ферментом и субстратом удерживая субстрат у активного центра фермента. Имеются данные о том, что ионы металлов способны связывать органическое соединение с белками и, наконец, один из возможных механизмов действия металлов как активаторов- это изменение константы равновесия ферментативной реакции. Доказано, что анионы также влияют на активность ряда ферментов. Например, очень велико влияние СI- на активность А — амилазы животного происхождения. Наряду с

существованием активаторов ферментов известен ряд веществ, присутствие которых тормозит каталитическое действие ферментов или полностью инактивирует его. Такие вещества принято называть ингибиторами. Ингибиторы – это вещества, действующие определённым химическим путём на ферменты и по характеру своего действия, могут быть подразделены на обратимые и необратимые ингибиторы. Для обратимого торможения Характерно равновесие между ферментом и ингибитором с определённой константой равновесия. Система такого типа характеризуется определённой степенью торможения, зависящей от концентрации ингибитора, при этом торможение достигается быстро и после этого не зависит от времени. При удалении ингибитора с помощью диализа активность фермента восстанавливается. Необратимое торможение, прежде всего, выражается в том, что диализ не способствует восстановлению активности фермента. И в отличии от обратимого торможения усиливается со временем, так что может наступить полное торможение каталитической активности фермента при очень низкой концентрации ингибитора. В этом случае эффективность действия ингибитора зависит не от константы равновесия, а от константы скорости, определяющей долю фермента, подвергшегося торможению в данном случае.

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ. Температура – один из важнейших факторов внешней среды, который независимо от состояния равновесия реакции меняет её скорость. Поэтому при ферментативных реакциях при повышении температуры на 10 С процесс ускоряется в 1,5 – 2 раза. При дальнейшем повышении температуры присоединяются денатурационные процессы, характерные для всех белков и в то м числе для ферментов, поэтому наблюдается затухание скорости реакции (Смотри приложение 3). Температурным оптимумом реакции называют температуру, при которой одно её действие вызывает ускорение реакции, катализируемой данным ферментом. Для большинства ферментов животного происхождения он равен 40 – 50 С, для растительного происхождения он равен 50 – 60 С. Почти все ферменты разрушаются при температуре 80 С. Но для некоторых ферментов в настоящее время доказана возможность восстановления их каталитической активности в случае обратимого процесса денатурации белка. Известны и такие ферменты, максимальная активность которых проявляется при более низких температурах. «Например, каталаза, температурный оптимум которой лежит в пределах между 0-10С» (Г. А. Смирнова Основы биохимии). Понижение температуры снижает скорость ферментативных реакций. Большинство ферментов при 0 С ещё не утрачивают своих каталитических свойств, но при замораживании химические реакции прекращаются. При последующем оттаивании, если соблюдается определённые условия, ферментативная активность клеток может быть восстановлена.

ВЛИЯНИЕ ДАВЛЕНИЯ. При изучении действия давления на скорость ферментативных реакций необходимо, прежде всего, учитывать, как и при изучении других факторов, возможность денатурации ферментов при высоком давлении. Если константа скорости ферментативной реакции растёт с повышением давления, то образование активного комплекса происходит с уменьшением объёма и наоборот, если при увеличении давления образование активного комплекса сопровождается увеличением объёма, то константа скорости реакции снижается.

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА И ЕГО СУБСТРАТА.

Скорость любого ферментативного процесса в значительной степени зависит от концентрации, как субстрата, так и фермента. Обычно скорость реакции прямо пропорциональна количеству фермента, при условии если содержание субстрата в в пределах оптимума или немного выше. При постоянном количестве фермента скорость возрастает с увеличением концентрации субстрата. Эта реакция подчинена закону действующих масс и рассматривается в свете теории Михаэлиса – Ментона, то есть

V = K ( F ) V — скорость реакции

K — константа скорости

F- концентрация фермента

(Смотри приложение 4).

На графике показано соотношение скорости реакции и концентрации субстрата. В восходящей части гиперболы при низких концентрациях субстрата скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата. В верхней части, когда концентрация субстрата высока, скорость реакции приближается к максимальному значению и почти не зависит от концентрации. Первое объяснение этой кривой было дано Генри (1901 год). Он высказал предположение, что а основе этой реакции лежит образование субстрат — ферментного комплекса. В дальнейшем эта теория была экспериментально обоснована Михаэлисом – Ментеном и не утратила своего значения до настоящего времени.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ.

Предполагалось, что ферменты адсорбируют на своей поверхности реагирующие молекулы, в результате чего на участках сорбции концентрация молекул субстрата увеличивается, и это повышает вероятность протекания реакции между ними. Постепенно сложилось мнение, что фермент не сорбирует субстрат на своей поверхности, а вступает с ним во взаимодействие, причём это взаимодействие на первом этапе состоит в образовании непрочного соединения- комплекса между ферментом и субстратом. С каждой молекулой фермента ( а точнее, с каждым его каталитическим центром) реагирует одна молекула субстрата, причём реакция носит необратимый характер. Если фермент обозначить буквой Е, а субстрат буквой S, то реакцию можно написать в виде уравнения:

E+SES

Совершенно очевидно, что ферментативный процесс в целом не может закончиться образованием фермент- субстратного комплекса. Этот комплекс представляет собой лишь промежуточное соединение, которое подвергается дальнейшим преобразованиям. В простейшем случае- это химическое превращение комплекса, в результате которого субстрат (S ) распадается на продукты ( обозначим их буквой Р ), а фермент выходит из реакции в неизменном виде. В целом уравнение будет выглядеть так::

E+S ES E+P

Именно таким образом представляли себе протекание ферментативной реакции немецкие учёные Л. Михаэлис и его сотрудница М. Ментен, которые ещё в 1913 году развили общую теорию ферментативного действия, основанную на идее образования промежуточного фермент- субстратного комплекса как первой стадии реакций. Чаще всего распаду комплекса предшествует его химическое преобразование( активирование), которое составляет ещё одну промежуточную стадию и снова усложняет уравнение реакции:

E+S ES ES* E+P

Здесь активный комплекс обозначен ES * (Смотри приложение 5)

Скорости протекания отдельных стадий ферментативного процесса неодинаковы. Одни идут быстрее, другие медленнее. Скорость всей реакции будет определяться скоростью самой медленной реакции. В ферментативном процессе скорости разных стадий тоже неодинаковы. Первый этап этого процесса — образование фермент- субстратного комплекса ES представляет собой, как мы уже говорили, обратимую реакцию и в обычных условиях протекает чрезвычайно быстро, по- видимому, значительно быстрее, чем последующие стадии. Поэтому общая суммарная скорость всего процесса определяется не этой реакцией. Но эта стадия наиболее ответственна, так как сама важность каталитического действия фермента зависит от того, образуется фермент- субстратный комплекс или нет. Все последующие этапы — это только преобразование возникшего комплекса. Как же представить себе образование такого комплекса? Какие условия должны быть соблюдены для того, чтобы он возник? Если снова обратиться к схеме (Смотри приложение 5) и присмотреться к причудливой форме молекулы фермента и субстрата, то заметили, что участок молекулы фермента, на который «садится» субстрат,. Своими очертаниями как бы повторяют форму субстрата. Это символизирует строгое пространственное и химическое соответствие, существующее между активным центром фермента и субстратом. Такое соответствие совершенно необходимо для того, чтобы комплекс мог образоваться. Ещё в конце прошлого века известный немецкий химик Эмиль Фишер высказал предположение, что фермент должен подходить к субстрату как ключ к замку. Это выражение стало крылатым и дожило до наших дней. Однако образ «ключ-замок» перестал удовлетворять учёных. Этот образ предполагает жёсткость, неизменность структуры, железную прочность фермента и субстрата. Такие свойства не типичны для гибких, подвижных молекул биологических веществ. Поэтому, главным образом благодаря работам американского биохимика Д. Кашленда, возникла другая теория, дополняющая и расширяющая представления Фишера. Согласно этой гипотезе, полное соответствие между молекулой субстрата и каталитическим центром фермента возникает лишь тогда, когда они встречаются с друг другом. Субстрат вызывает в молекуле фермента такое изменение расположения химических групп в пространстве, что ранее отсутствовавшее соответствие появляется и вместе с этим появляется возможность образовать фермент- субстратный комплекс. Его возникновение связано с гибкостью белковой молекулы, с подвижностью её структуры, но оно возможно, разумеется, только в том случае когда молекула субстрата имеет пригодные для этого свойства и форму. В приложении 5 изображена схема, поясняющая возникновение наведённого соответствия между ферментом и субстратом.

Только после контакта фермента с субстратом химические группировки активного центра (А, В, С) в результате изменения их пространственного расположения приходят в состояние строгого соответствия молекуле субстрата.

Нужно иметь также в виду, что молекула субстрата, хотя она, как правило, и значительно меньше молекулы фермента, тоже обладает некоторой подвижностью и при взаимодействии с ферментом эта подвижность может способствовать более полному соответствию.

Особенность ферментов состоит в том, что об их наличии мы можем судить только по их действию. Мы умеем измерять скорость ферментативных реакций, то есть количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, например в одну минуту или в один час. Разным ферментам свойственна далеко не одинаковая молекулярная активность. Некоторое представление о реальных величинах этой активности даёт таблица (Смотри приложение 7). Из таблицы видно, насколько различна молекулярная активность различных ферментов и каких огромных величин она может достигать в отдельных случаях. «Карбоангидраза, занимающая первое место в таблице и обладающая чудовищной молекулярной активностью (36 миллионов), является самым активным из всех известных ферментов. «(В. И. Розенгарт Ферменты – двигатели

жизни).

ЗНАЧЕНИЕ.

Постоянный обмен нуклеиновыми кислотами, составляет основную часть генетического материала клетки. В ходе обмена нуклеиновых кислот наряду с синтезом происходит и распад. Этот процесс катализирует большая группа ферментов, объединенных названием нуклеаз. Цепочка нуклеиновых кислот образованна фосфорной кислотой и углеводородом; азотистые основания служат боковыми группами. Поэтому разрушение нуклеиновых кислот – это разрыв связей между остатками фосфорной кислоты и углевода. Все нуклеазы могут быть разделены на две группы: экзонуклеазы иэндонуклеазы. Экзонуклеазы действуют с одного из концов полинуклеотидной цепи и на каждом этапе отсекает по одному нуклеотиду, постепенно укорачивая цепочку. В отличие от этого эндонуклеазы сразу во многих местах разрывают связи внутри молекулы нуклеиновых кислот и поэтому приводят к быстрой деградации молекулы. Весь комплекс ферментов обмена нуклеиновых кислот выполняет важную биологическую задачу: сохранение в целостности генетического материала клетки и репарации (исправления) тех повреждений структуры ДНК, которые могут возникнуть а результате радиоактивного или ультрафиолетового облучения и других вредных воздействий.

Известно, что все проявления жизнедеятельности связаны с затратой энергии. Эта энергия освобождается при химических превращениях в клетке тех веществ, которые в виде пищи поступают в наш организм. Задача пищеварения сводится к тому, чтобы превратить главные пищевые вещества: белки, углеводы и жиры, — в такие продукты, которые непосредственно смогут быть использованы во внутриклеточном обмене. Свой путь в организме пища начинает, попадая в рот, и уже на этом этапе она сталкивается с ферментами. В слюне содержится фермент амилазы, катализирующий разложения крахмала и превращение его в сахар. Разжёванная и смоченная слюной пища проглатывается и через пищевод попадает в желудок. Слизистая оболочка желудка вырабатывает желудочный сок. В желудочном соке есть соляная кислота, придающая желудочному содержимому кислую среду. Так же в желудочном соке имеется протеолитический (расщепляющий белки) фермент – пепсин. Он как раз лучше всего действует в кислой среде. Пепсин не расщепляет белки до конца, он только ''раскладывает'' крупную белковую молекулу на части, доступные для действия пищеварительных ферментов кишечника. Из желудка пищевая кашица поступает в двенадцатиперстную кишку, где на неё изливаются соки дву самых крупных желёз человеческого организма: печени и поджелудочной железы. Сок поджелудочной железы содержит большой набор ферментов, действующих на все важнейшие пищевые вещества. Ферменты:трипсин и химотрипсин (расщепляющие белки) расщепляют пептидные цепи в разных местах. Комбинированная атака протеолитических ферментов желудочного и поджелудочного соков приводят к распаду белков на мелкие пептиды, содержащие небольшое количество аминокислотных остатков. В поджелудочном соке содержится чрезвычайно активная амилаза, она практически полностью завершает расщепление крахмала, начатое слюной. В результате крахмал превращается в солодовый сахар – мальтозу – дисахарид, состоящий из двух остатков глюкозы. Третий главный компонент пищи – жиры тоже расщепляются под влиянием поджелудочного сока. Для этой цели там содержится специальный фермент – липаза. Простейшая и наиболее распространённая форма жиров – триглицериды. Под действием липазы молекула триглицерида присоединяет три молекулы воды и распадается на составляющие его глицерин и жирные кислоты. Но заключительную работу в области пищеварения совершает кишечный сок, вырабатываемый клетками слизистых оболочек тонких кишок. Он содержит много ферментов, заканчивающих процесс окончательного разложения пищевых веществ. Осколки белковых молекул распадаются на отдельные аминокислоты; мальтоза, образовавшаяся из крахмала, и другие сложные углеводы превращаются в простые углеводы – моносахариды – вроде глюкозы. На этом заканчивается процесс пищеварения.

Одна из защитных реакций – свёртывание крови, происходит с участием ферментов. Как же происходит свертывание крови? Кровь, как известно состоит из жидкой части – плазмы и так называемых ферменных элементов, которые в ней плавают. Это кровяные клетки: эритроциты (красные кровяные тельца) и тромбоциты (кровяные пластинки). Плазма представляет собой сложный раствор многих веществ, в том числе самых разнообразных белков. Из белков плазмы для нас сейчас особый интерес представляет один – фибриноген. Пока кровь течёт по кровеносным сосудам, с фибриногеном ничего не происходит. Но стоит поранить сосуд настолько, чтобы кровь вытекала из него, как фибриноген очень быстро превращается в другой белок – фибрин. Фибрин, в отличии от фибриногена, не растворяется в плазме. В виде тонких нитей, переплетённых в густую сетку, он выпадает в осадок. В этой сетке застревают кровяные клетки и образуется плотный сгусток – тромб, препятствующий дальнейшему кровотечению. Превращение фибриногена в фибрин – процесс ферментативный, катализируемый ферментом тромбином. Тромбин – протеолитический фермент, подобный трипсину и химотрипсину. Но это фермент очень специфичный. Он действует только на фибриноген, отщепляя от его молекулы два сравнительно небольших полипептида. Оставшаяся часть молекулы фибриногена перестраивается и превращается в нерастворимый фибрин.

(тромбин)

Фибриноген 2 Полипептида + фибрин

Также ферменты играют важную роль во всех проявлениях жизни. Успехи учения о ферментах внесли весомый вклад в развитие всех направлений человеческой практики.

Ферменты нашли широкое применение в медицине. Это, прежде всего, изучение таких болезней причина, которых лежит в недостаточности тех или иных ферментов. Далее это использование определения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях для диагностики различных заболеваний. И, наконец, это применение ферментов в качестве лекарственных средств. Генетически обусловленные нарушения. Время от времени в бесконечно длинных цепях ДНК, где записаны все инструкции по синтезу белков, вдруг появляются случайные замены: вместо одного нуклеотида становится другой. Такие замены называются мутациями. Чаще всего конкретные причины мутации неизвестны. А последствия их нередко бывают роковыми. Приведем такой пример. Люди отличаются друг от друга цветом кожи, волос и глаз. Причина этого – разные пигменты, меланины, синтезируемые из некоторых аминокислот под влиянием определённых ферментов. Если образование этих пигментов не происходит из — за отсутствия одного из участвующих в реакции ферментов, возникает альбинизм – отсутствие окраски. Люди альбиносы имеют очень белые волосы и светлые глаза. Альбиносы по здоровью не уступают людям с нормальной окраской. Гораздо более тяжёлым заболеванием, нередко приводящим к гибели новорождённых, является непереносимость простых углеводов – моносахаридов (галактозы и фруктозы ). Здесь речь идёт о невозможности нормального обмена веществ в клетках из- за отсутствия необходимых ферментов. Достаточно подробно изучены врождённые болезни, связанные с недостатком ферментов, катализирующих разложение гликогена. В результате нарушения этого процесса гликоген начинает накапливаться в тканях в избыточном количестве и препятствует нормальному течению обмена веществ. Такие болезни получили название гликогенозов. Болезни, связанные с отсутствием витаминов, называют авитаминозом. Но по существу они являются ферментозами. Давно известна и когда – то была широко распространена болезнь ''бери – бери ''(сейчас её называют полиневритом – множественное воспаление нервов, в некоторых слаборазвитых странах она и теперь встречается нередко). Причина её отсутствие в пище витамина В1. Этот витамин – тиамин – в соединении с фосфорной кислотой представляет собой небелковую часть фермента декарбоксилазы. Декарбоксилаза разрушает карбоксильную группу (- СООН) некоторых органических кислот, отщепляя от неё углекислоту (СО2). В отсутствии витамина В1 декарбоксилаза образоваться не может, реакция прекращается и в нервной ткани наступают нарушения, типичные для полиневрита: параличи конечностей, боли в мышцах, слабость, контрактуры. Тяжёлое заболевание – пеллагра – связано с отсутствием в пище витамина РР – никотиновой кислоты. Упомянем ещё об одном витамине. Он называется витамином В2, а по химической природе представляет собой довольно сложную циклическую структуру – рибофлавин. Авитаминоз В2 связан с тяжёлым поражением кожи лица и глаз. Причина недостаток фермента.

Ферменты также используются в диагностике. Определение активности ферментов в биологических жидкостях и тканях стало неотъемлемым средством лабораторной диагностики различных заболеваний. Для диагностических целей ферментативную активность определяют почти исключительно в крови, значительно реже в моче и лишь в отдельных случаях в тканях. Не все ткани в одинаковой мере синтезируют разные ферменты. Для печени, например, типична высокая активность одних ферментов, для почек или скелетных мышц – других. Это явление называют органоспецифичностью ферментов. Иногда органоспецифичность выражена очень чётко: фермент содержится только в каком – нибудь одном органе и отсутствует, а других. Таким образом, врач получает возможность по повышению активности некоторых ферментов в плазме выявить заболевание, связанные с нарушением функций совершенно определенных органов. В последнее время предпринимаются всё более успешные попытки использовать ферменты и для лечения некоторых болезней. Уже давно некоторые ферменты применяют для так называемой заместительной терапии – для возмещения дефицита ферментов, возникающего при некоторых заболеваниях. Особенно успешна такая терапия при нарушениях функций желудочно-кишечного тракта, связанных с недостаточной выработкой пищеварительных ферментов. С успехом применяют ферменты в тех случаях, когда лечение требует разрушить накопившиеся в большом количестве белковые образования, мешающие нормальному функционированию тканей. Это бывает при ожогах, гнойных ранах, гнойно-воспалительных заболеваниях лёгких, когда в бронхах скапливается густая масса, препятствующая прохождению воздуха. Наметился очень перспективный путь применения ферментов для рассасывания сгустков крови, образовавшихся внутри кровеносных сосудов. Такие сгустки называются тромбами, они закупоривают сосуд и нарушают кровообращение. Велико значение ферментов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Сыроварение, виноделие, производство кисломолочных продуктов, пивоварение, производство колбасных продуктов, хлебопечение, производство животных жиров, чая, уксуса, лимонной кислоты – всё это и многое другое, здесь не перечисленное – технологические процессы пищевой промышленности, в которых главным действующим лицом являются ферменты. Одна из важнейших проблем пищевой промышленности – это развитие комплексной переработки сырья и отходов пищевой промышленности и повышение эффективности этой переработки. Ферментные препараты могут сказать здесь решающее слово. Серьёзной проблемой в консервной промышленности, переработки плодов и овощей является использование семян и косточек, главная трудность которого состоит в необходимости разрушать прочную оболочку косточек. И здесь реальную пользу могут принести препараты ферментов. С помощью ферментных препаратов удаётся уменьшить расход сырья растительного и животного происхождения, идущего на приготовления пищевых продуктов. Использование ферментов в сельском хозяйстве необычайно широко и разнообразно. В растениеводстве селекция многих сельскохозяйственных культур направлена на создание сортов, обогащённых определёнными ферментами. Это имеет значение и для скорости созревания культур, и для получения более высококачественной продукции, и для повышения устойчивости растений к изменению погодных условий, к болезням, к действию вредных насекомых. Специальный интерес представляет использования ферментов в кормопроизводстве. Агрономы заботятся о том, чтобы получить полноценный растительный корм, содержащий все существенные составные части, необходимые для обеспеченья потребностей животного организма. Вот здесь роль ферментов оказалась особенно значительной, как в пищевой промышленности. Ферментативные препараты для производства кормов получают из плесневых грибов и бактерий, но задачи здесь ставят иные. Для повышения усвояемости грубых кормов необходим фермент целлюлоза, гидролизирующий клетчатку и повышающий возможность её переваривания и усвоения, особенно у таких животных, как свиньи, которые переваривают клетчатку хуже, чем крупный рогатый скот.

Мы познакомились с некоторыми аспектами практического использования ферментов в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проделанной работы я узнал, что ферменты это белки, катализирующие определённые химические реакции, входящие в процессы обмена веществ, отличаются чрезвычайно высокой эффективностью и специфичностью своего действия. По своему составу ферменты разделяют на простые ферменты, состоящие только из молекул белка, и сложные ферменты, состоящие из белка и небелкового компонента (простетические группы, коферменты). Каталитическое действие ферментов определяется главным образом, частью молекулы — активным центром. Действие всех ферментов происходит через стадию образования промежуточного соединения с молекулой субстрата. Ферменты играют важную роль в организме, в науке, в хозяйственной деятельности человека. Открытие разнообразных наук позволяет шире использовать ферменты.

Литература:

''Энциклопедический словарь юного биолога''

(М. С. Гиляров)

''Биофизическая химия'' (А. Г. Пасынский)

''Ферменты-двигатели жизни'' (В. И. Розенгарт)

''Основы биохимии'' (Г. А. Смирнова)

[email protected]

www.ronl.ru

Смотрите также

• 
  Реферат наследственные заболевания человека
• 
  Сухомлинский реферат по педагогике
• 
  Компоненты физической культуры реферат
• 
  Источники муниципального права реферат
• 
  Реферат философская лирика пушкина
• 
  Реферат резонанс по физике
• 
  Резонанс реферат по физике
• 
  Резонанс по физике реферат
• 
  Насилие в семье реферат
• 
  Реферат инвестиции и сбережения
• 
  Реферат способы закаливания организма