Жохов контрольные работы 8 класс: ГДЗ по алгебре 8 класс дидактические материалы Жохов, Макарычев, Миндюк Просвещение ответы и решения онлайн Контрольные работы, Вариант 1. Задание: K-10. Итоговая

Эстер Дж.Ли

¹ Департамент антропологии, Бингемтонский университет, Бингемтон, штат Нью-Йорк, Соединенные Штаты Америки,

² Департамент социологии, антропологии и социальной работы, Техасский технический университет, Лаббок, Техас, Соединенные Штаты Америки,

Д. Эндрю Мерриуэзер

¹ Кафедра антропологии, Бингемтонский университет, Бингемтон, штат Нью-Йорк, Соединенные Штаты Америки,

Алексей К. Каспаров

³ Институт истории материальной культуры РАН , Г.Санкт-Петербург, Россия,

Павел Александрович Никольский

⁴ Геологический институт РАН, Москва, Россия,

Сотникова Марина Владимировна

⁴ Геологический институт РАН, Москва, Россия,

Елена Юрьевна Павлова

⁵ Арктический и антарктический научно-исследовательский институт, Санкт-Петербург, Россия,

Питулько Владимир Васильевич

³ Институт истории материальной культуры РАН, г.Санкт-Петербург, Россия,

Дэвид Карамелли, научный редактор

¹ Департамент антропологии, Бингемтонский университет, Бингемтон, штат Нью-Йорк, Соединенные Штаты Америки,

² Департамент социологии, антропологии и социальной работы, Техасский технологический институт Университет, Лаббок, Техас, Соединенные Штаты Америки,

³ Институт истории материальной культуры Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия,

⁴ Геологический институт Российской академии наук, Москва, Россия,

⁵ Арктический и антарктический научно-исследовательский институт, г.Санкт-Петербург, Россия,

Университет Флоренции, ИТАЛИЯ,

Конкурирующие интересы: Компания Ford Motor приняла участие в исследовании территории маяка Ахим. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно было бы декларировать. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Задумал и спроектировал эксперименты: ДАМ ВВП. Проведены эксперименты: EJL DAM. Проанализированы данные: EJL DAM.Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: EJL DAM AKK PAN MVS EYP VVP. Написал статью: EJL DAM PAN MVS VVP.

^¤ Текущий адрес: Департамент социологии, антропологии и социальной работы Техасского технологического университета, Лаббок, Техас, Соединенные Штаты Америки

Поступила в редакцию 19 ноября 2014 г .; Принято 26 марта 2015 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Сопутствующие данные

Дополнительные материалы

S1 Рис. Частичная нижняя челюсть образца S809 из Улахана Суллара. Образец был получен из слоя 2 в Улахан-Сулларе и описан как Canis cf. variabilis .

(TIF)

S2 Рис. Частичная нижняя челюсть образца S504 из Дуванного Яра. Морфологически идентифицированный как Canis lupus , экземпляр был получен в нижнем течении реки Колыма.

(TIF)

S1 Таблица: Описание останков псовых из Дуванного Яра. Информация о двух образцах из Дуванного Яра, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S2 Таблица: Описание особей псовых из Яны РХС. Информация о четырех образцах из Яны РХС, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S3 Таблица: Описание особей псовых из Жохова.Информация о четырех образцах из Жохова, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S4 Table: Описание псовых особей с маяка Ахим. Информация о двух образцах из Ахима, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S5 Таблица: последовательностей праймеров митохондриальной ДНК, использованных в этом исследовании. Для исследования были разработаны три пары праймеров, и одна пара праймеров была использована из предыдущего исследования [64].

(DOCX)

S6 Table: Образцы, использованные в медианной сети древних образцов псовых. Идентификационные коды соответствуют указанным номерам доступа GenBank и справочнику.

(DOCX)

Заявление о доступности данных

Все файлы последовательностей доступны в GenBank (номера доступа KJ1-KJ4).

Abstract

Современная Арктическая Сибирь предоставляет богатые ресурсы для археологических, геологических и палеонтологических исследований, позволяющих изучить динамику популяций фаунистических сообществ плейстоцена, особенно потому, что фаунистический материал, поступающий из вечной мерзлоты, оказался подходящим для генетических исследований.Чтобы изучить историю видов Canid в Сибирской Арктике, мы провели генетический анализ четырнадцати останков псовых из различных памятников, включая хорошо задокументированные памятники верхнего палеолита Яна и остров Жохов раннего голоцена. Предполагаемый возраст образцов варьируется от 1700 лет до настоящего времени (YBP) до 360 000 YBP для останков вымершего волка, Canis cf. variabilis . Чтобы изучить генетическое родство видов древних сибирских псовых с домашней собакой и современными волками, мы получили последовательности контрольных участков митохондриальной ДНК и сравнили их с опубликованными последовательностями древних и современных псовых.Более старые образцы собак демонстрируют сходство с додомашними линиями собак / волков, в то время как другие встречаются в основных филогенетических кладах домашних собак. Наши результаты предполагают, что европейское происхождение домашних собак не может быть окончательным, и иллюстрируют растущую сложность генетического вклада региональных пород волков в современный генофонд Canis .

Введение

Широко признано, что домашняя собака ( Canis lupus knownis ) произошла от серого волка ( Canis lupus ), но процесс приручения, а также географическое происхождение и приблизительная дата первого приручения все еще остаются обсуждается [1,2,3].Генетические исследования современных популяций собак и волков показали различные взгляды, от единственного происхождения в Восточной / Южной Азии [4,5] или на Ближнем Востоке [6] до нескольких областей одомашнивания и / или гибридизации с региональными породами волков [6, 7]. Более того, возможность смешивания с другими видами псовых также предполагалась ранее [8,9]. С другой стороны, недавний анализ митохондриального генома древних собак показал европейское происхождение домашних собак [10]. Археологические данные не всегда просты для морфологической идентификации домашних собак, тем более, что самые ранние собаки были практически того же размера, что и волки [11,12,13], но продвинутый морфометрический анализ улучшил эти усилия [14,15,16].Древнейшие археологические находки домашних собак были обнаружены в Западной Европе и на Ближнем Востоке и датируются по крайней мере 14 000 кал. До н. Э. [17,18]. Некоторые утверждали, что домашние собаки присутствовали до последнего ледникового максимума, но в настоящее время это оспаривается [13,19,20,21,22].

Археологические и палеонтологические исследования, проведенные в Арктической Сибири в течение последних нескольких десятилетий, дали большое количество костного материала, пригодного для генетических исследований, поскольку они в основном происходят из отложений вечной мерзлоты, которые распространены в этом районе.Многие исследования древней ДНК были сосредоточены на вымерших плейстоценовых или диких видах, населявших Сибирь [23,24,25,26], но здесь мы сосредоточимся на старейшем одомашненном виде Canis . Различные виды Canidae, такие как песец и волк, были среди плейстоценовой арктической фауны, сохранившейся до наших дней [27,28]. Исследования в этом регионе подтвердили присутствие собак на Русской равнине и Камчатке к 13000 г. до н.э. [29,30]. Недавнее исследование показало, что домашняя собака на юге Сибири датируется ок.33 300 кал. До н. Э., Что предшествует самым старым свидетельствам из Западной Европы и Ближнего Востока [22]. Однако останки сибирских псовых были морфологически наиболее похожи на собак из Гренландии и в отличие от древних и современных волков и предполагаемых собак из центральной России [22]. Саблин и Хлопачев [29] утверждали, что присутствие плейстоценовых собак на равнине в центральной части России в Елисеевичи I, датируемое 13 000–17 000 кал. До н.э., было результатом приручения in situ у местных северных волков. Таким образом, возможность того, что волки позднего плейстоцена / раннего голоцена могли внести свой вклад в региональную породу собак, остается открытой.

Мы исследовали тринадцать останков доисторических псовых и один образец современного волка из сибирской Арктики: Улахан-Суллар, Дуванный Яр, Яна РХС, остров Жохов и маяк Ахим (и). Самые старые образцы происходят из обнажений четвертичных отложений (местонахождение № 1, Canis cf. variabilis ) и из обнажения Дуванный Яр (местонахождение № 2). Подробная информация о каждом участке представлена ​​в следующем разделе. Анализ митохондриальной ДНК (мтДНК) образцов псовых был проведен, чтобы сделать вывод о филогенетических отношениях этих древних псовых с современными видами псовых, с особым вниманием к Canis cf. variabilis экземпляр из Улахан-Суллара, который может дать ключ к разгадке происхождения домашних собак.

Соответствующие номера и информация приведены в.

Таблица 1

Описание образцов псовых, проанализированных в данном исследовании.

Материалы и методы

Информация об образце

Наш набор данных состоит из пяти групп окаменелостей, собранных в нескольких районах Арктической Сибири, которые охватывают территорию от острова Жохов до средней части реки Яна в широтном направлении. в направлении (от 76 ° 06 ‘северной широты до 67 ° 50’ северной широты, или на расстоянии почти 1000 км) и от низкой реки Яна до полуострова Ахим, Западная Чукотка по долготе (от 135 ° 25 ‘восточной долготы до 173 ° 30’ E, или расстояние 1500 км).Современный образец волка был взят в качестве эталона на Новосибирских островах [31].

Образцы, проанализированные в данном исследовании, были собраны в ходе полевых раскопок (1999–2007 гг.), Которые проводились на основании разрешений, выданных государственным органом Владимиру Васильевичу Питулько, старшему научному сотруднику Института истории материальной культуры РАН ( Руководитель проекта «Жохов-2000»): 1) 1999 г .: Мерительная грамота №123 (форма 2 — обследование), выданная Полевой комиссией 7 мая 1999 г. на разведку и раскопки на Западной Чукотке, Певекский район; 2) 2000 г .: Мерительная грамота №307 (форма 2 — обследование), выданная Полевой комиссией 29 мая 2000 г. на обследование на Новосибирских островах и раскопки на Жоховском острове; 3) 2001 г .: Мерительная грамота №381 (форма 1 — раскопки), выданная Полевой комиссией 8 июня 2001 г. на обследование на Новосибирских островах, раскопки на острове Жохов и обследование в Северной Яно-Индигирской низменности; 4) 2002 г .: Мерительная грамота №638 (форма 1 — раскопки), выданная Полевой комиссией 28 июня 2002 г .; 5) 2003 г .: Мерительная грамота №525 (форма 1 — раскопки), выданная Полевой комиссией 16 июня 2003 г., на раскопки на острове Жохов, обследование в Северо-Янинской Индигирской низменности и раскопки на стоянке Яна; 6) 2004 г .: Мерительная грамота №87 (форма 4 — раскопки), выданная Полевой комиссией 16 апреля 2004 г. на раскопки на острове Жохов и раскопки на стоянке Яна; 7) 2005 г .: Мерительная грамота №506 (форма 4 — раскопки-утильсы), выданная Полевой комиссией 10 июня 2005 г. на раскопки на острове Жохов и раскопки на стоянке Яна; 8) 2006 г .: Мерительная грамота №308 (форма 4 — раскопки), выданная Полевой комиссией 26 мая 2006 г. на раскопки на стоянке Яна; 9) 2007 г .: Мерительные грамоты №99 и 100 (форма 1, раскопки и форма 2, обследование), выданные Полевой комиссией 13 апреля 2007 года, раскопки на стоянке Яна и съемка в Северо-Янинской Индигирской низменности.Всю информацию можно проверить через Полевой комитет Института археологии РАН по адресу ur.xednay@naraiipo.

Местоположение и информация о местонахождении

Улахан-Суллар

Нижняя челюсть Canis ср. variabilis (S809) был получен из слоя 2, датированного 360 000 ± 17 000 лет назад, на основе измерений ЭПР раковин двустворчатых моллюсков, обнаруженных в том же слое [32]. Участок представляет собой обрыв высотой 65 м и длиной 1,2 км, расположенный на правом берегу невысокой реки Адыча (бассейн реки Яна) на 67 ° 41’N, 135 ° 44’E.Вид Canis cf. variabilis был охарактеризован Тейяром де Шарденом и Пей по экземплярам мелких среднеплейстоценовых волков в Азии [33]. Часто сгруппированные вместе с Canis mosbachensis в Европе обозначаются как C . mosbachensis-variabilis , вид демонстрирует морфологические особенности, включая относительно небольшой размер тела, удлиненную и тонкую морду и относительно длинный метастиль P4.

Дуванный Яр

Дуванный Яр — ключевой разрез верхнеплейстоценовых отложений Западной Берингии, расположенный на правом берегу нижнего течения реки Колымы в Северо-Восточной Якутии (68 ° 38’N; 159 ° 03’E) [34,35 ].На этом участке были охарактеризованы четыре стратиграфических единицы, особенно группа III, датированная периодом от 45 000 до 13 500 ¹⁴ C лет до настоящего времени (YBP) и обнаружила многочисленные останки млекопитающих и останки растений [36,37,38,39]. Два останка псовых были обнаружены в самой нижней части блока III, для которых радиоуглеродные данные предполагают дату не менее 47 000 ¹⁴ C YBP (таблица S1).

Яна RHS

Четыре экземпляра Canis lupus были получены с участка 28 500–27 000 ¹⁴ C YBP [40,41,42].Расположенный в низовьях реки Яна, на стоянке РГО Яна обнаружены богатые слои культурных артефактов и остатков фауны, которые были подробно описаны в предыдущих исследованиях [41,42,43]. Три из четырех образцов имеют индивидуальную дату AMS ¹⁴ C (таблица S2), и все вместе они имеют твердую оценку возраста около 28 000 радиоуглеродных лет назад. При раскопках Яны РХС был обнаружен ряд возможных останков волка с сильно изношенными зубами.

Жохов

Участок Жохов относится к острову Жохов, расположенному ниже 76 ° северной широты, и относится к Новосибирской цепи островов, которая представляет собой естественную границу между морями Лаптевых и Восточно-Сибирским морем.Датируемый 7 800–8 000 YBP, это один из самых северных археологических памятников в Арктике, в котором хранятся многочисленные артефакты и остатки фауны, в том числе многочисленные микропризматические ядра и микролезвия, охотничье снаряжение и деревянные артефакты [44,45,46]. Останки псовых были найдены среди большого скопления артефактов, включающего останки фауны белого медведя и северного оленя, что составляет около 150 идентифицируемых костей как минимум девяти животных. В это исследование были включены четыре образца собак (S602, S902, S904, S903) (таблица S3).

Маяк Ахим

Участок расположен в северной части полуострова Ахим на побережье Восточно-Сибирского моря [47]. Две нижние челюсти псовых с этого участка (таблица S4) датированы 1760 ± 40 л.н. (Beta-231449) и 1740 ± 40 (Beta-231444), и, исходя из потенциального эффекта морского резервуара, приемлемый возраст будет около 1700 лет назад или немного моложе [46]. Несмотря на возраст, эти экземпляры появились еще до недавнего контакта, поэтому представляют собой местные породы собак. Помимо двух обнаруженных останков псовых, которые мы анализируем в этом исследовании, здесь есть многочисленные останки морских млекопитающих, а также каменные отщепы и артефакты [47].

Подготовка образцов

Все останки, за исключением образцов, собранных в Аахиме, оставались в условиях вечной мерзлоты вскоре после осаждения до раскопок. Образцы были отобраны, чтобы гарантировать наличие отдельных животных (черепа или фрагменты черепа), чтобы избежать дублирования выборки. Зубы получены из останков черепа и нижней челюсти. Остатки для справочного материала были получены от волка, умершего естественной смертью на острове Новая Сибирь в 2003 году.

Экспериментальные методы

Все экспериментальные процедуры анализа ДНК проводились в специализированном стерильном помещении для исследования древней ДНК, включая отдельные помещения, предназначенные для бурения, извлечения и подготовки образцов для ПЦР.Помещение оборудовано воздухом, отфильтрованным с помощью высокоэффективных твердых частиц (HEPA), имеет ультрафиолетовые лучи на всех поверхностях, а воздушный поток между комнатами ограничен магнитными блокировками на дверях и поддержанием постоянного положительного давления. Общие методы включают использование одноразовой одежды и перчаток, а также стерилизацию открытых поверхностей отбеливателем перед каждой процедурой.

Когти и зубы получены для выделения ДНК. Сначала образцы обеззараживали отбеливателем перед сверлением для получения мелкого костного порошка от 0 до 0.От 45 г до 5,45 г. Образцы просверливали и извлекали группами по пять человек плюс один отрицательный контроль. Подробные процедуры экстракции были описаны ранее [48]. Вкратце, сначала образцы декальцинировали в EDTA, затем инкубировали с протеиназой K, затем очищали с использованием модифицированного протокола спин-колонки на основе диоксида кремния с последующим центрифугированием.

ПЦР проводили для контрольной области митохондриальной ДНК с использованием трех перекрывающихся праймеров, охватывающих нуклеотидные положения (np) от 15424 до 15837 (413 пар оснований).Мы использовали два разных праймера для первого сегмента между np 15424 и 15580, как указано в таблице S5. Амплификация проводилась несколько раз для проверки подлинности. При наличии использовали несколько экстрактов, и согласованные последовательности из нескольких амплификаций были определены надежно. Успешно амплифицированные продукты ПЦР проверяли электрофорезом в агарозном геле, и ампликоны очищали на 96-луночном планшете Multiscreen HTS (Millipore, Billerica, MA) для удаления однонитевой ДНК и праймеров.Ампликоны были подготовлены для секвенирования с использованием BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA). После стандартного осаждения спиртом образцы напрямую секвенировали на ДНК-секвенаторе ABI PRISM 377XL (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Последовательности были собраны для древних данных ДНК собак, а также для репрезентативного спектра образцов современных собак и волков из литературы и GenBank [4,10,49,50,51,52,53,54,55,56,57, 58,59,60,61]. Последовательности выравнивали с помощью ClustalX [62] и MEGA 5.2.2 [63], и мы включили наши данные в три отдельные медианные сети, которые включали: 1) последовательности древней ДНК псовых (N = 33), 2) последовательности современных собак (N = 290) и 3) последовательности современных волков ( N = 101). Сети с медианным соединением были рассчитаны в сети 4.6 [64].

Результаты и обсуждение

Мы успешно получили эндогенные последовательности контрольной области мтДНК для всех четырнадцати образцов собак и идентифицировали девять гаплотипов. У двух экземпляров с маяка Ахим был один гаплотип, а у четырех останков с острова Жохов — другой гаплотип.Из четырех экземпляров псовых Yana RHS два имели один и тот же гаплотип. Только гаплотипы Аахима и Жохова соответствовали другим опубликованным последовательностям псовых, тогда как последовательности из Яны RHS, Улахан-Суллара и Дуванного Яра были уникальными. Последовательности можно найти под номерами доступа GenBank KJ1-KJ4.

Прямой анализ целых митогеномов древних образцов псовых недавно позволил предположить европейское происхождение домашних собак на основании филогенетического расположения трех псовых из Бельгии, датированных 26 000–36 000 YBP [10], что в отличие от азиатских или ближневосточных. происхождение по современным образцам [5,6].Основываясь на последовательностях контрольной области мтДНК, образцы псовых из Яны РХС и Улахан-Суллар из нашего исследования выглядят столь же расходящимися, как и древние европейские образцы, которые использовались в качестве доказательства европейского происхождения домашних собак. Поэтому в свете наших результатов европейское происхождение домашних собак не может быть окончательным. Медианная сеть соединений для последовательностей древних псовых () показывает гаплотип Яны (S805), который находится в одном шаге от гаплотипа Жохова (S902), который представляет одну из основных филогенетических клад среди псовых (Clade A).Несколько древних гаплотипов псовых ориентированы вокруг Yana S805, в том числе некоторые из самых старых гаплотипов псовых, о которых сообщалось на сегодняшний день, в том числе образец Улахана-Суллара ( Canis см. variabilis , S809) из нашего исследования, в дополнение к древним гаплотипам псовых из Бельгия датировала 30 000 YBP и 36 000 YBP, а гаплотип псовых из Костенков, Россия, датировал 22 000 YBP [10]. Древние экземпляры псовых в этом кластере могут представлять возможных предков домашней собаки, поскольку время слияния расхождения собаки и волка, как полагают, произошло около 10 000 лет назад [4, 65], хотя некоторые предполагали, что это было уже 32 000 лет назад. [66].Основываясь на положении гаплотипа Yana S805, он потенциально может представлять прямую связь от предполагаемого предка (включая Canis cf. variabilis ) с линиями домашних собак и современных волков.

Черные кружки обозначают образцы из нашего исследования (см. Таблицу S6 для идентификации образца). Последовательности, проанализированные в сети, охватывают положения нуклеотидов 15561–15789.

В целом, большинство сибирских псовых из нашего исследования филогенетически сгруппированы с другими волками из Азии и России (). Одна ветвь от гаплотипа Яны (S805) состоит из современного гаплотипа волка. Интересно, что этот гаплотип взят из ныне вымершего японского волка ( Canis lupus hodophilax ), датируемого 14-18 веками [54]. Сообщается, что японский волк был довольно широко распространен на основных островах Японии с периода Дзёмон (10 000–250 гг. До н. Э.).C.) вплоть до начала 1900-х годов, но неясно, откуда они происходят [54,67]. Хотя широко распространено мнение, что серый волк ( Canis lupus ) является прямым предком домашней собаки, филогенетическая связь между серым волком и Canis cf. variabilis до сих пор остается предметом споров. Canis ср. variabilis , как полагают, был широко распространен в Евразии примерно до 300 000 YBP и, по-видимому, не пересекается с самым ранним появлением морфологически отличительного серого волка [68,69].Наше исследование является первым, в котором представлены результаты анализа ДНК Canis cf. variabilis , и наши результаты предполагают, что variabilis является еще одним возможным источником генетического вклада в развитие домашней собаки.

Черными кружками отмечены образцы из нашего исследования. Последовательности, проанализированные в сети, охватывают позиции нуклеотидов 15547–15792. См. Образцы идентификаторов из этого исследования. Известные гаплотипы включают GQ509 (номер доступа в GenBank).GQ376509; Уральские горы в России [59]), JW237, 240, 255, 257 (регистрационный номер GenBank AB480736-AB480742, AB500700; Canis lupus hodophilax , Япония [54]) и LU51 (регистрационный номер GenBank AY812735; Нью-Мексико. , США [57]).

Одна интересная особенность филогенетической группы древних псовых, окружающих гаплотип Яна (S805), — это псовый Дуванный Яр (S504), который датируется более чем 47 000 ¹⁴ C YBP, но отделен от других древних гаплотипов псовых и похоже, связан с домашними собаками, но не с волками.Как в сетях медианного соединения древних собак, так и домашних собак (рис. И), S504 связан с собачьими гаплотипами, которые находятся на пару мутаций от Clade A, но сеть волков показывает, что S504 генетически отличается от любых других гаплотипов (). Это может указывать на то, что линия собачьих пород Дуванни Яр имеет отличную филогению от волков, но, возможно, генетически унаследована от домашних собак. Хотя возможно, что линия Дуванни Яр просто не сыграла важную роль в одомашнивании современных линий собак, она может представлять собой локализованный генетический источник современных линий собак.

Черными кружками отмечены образцы из нашего исследования. Последовательности, проанализированные в сети, охватывают позиции нуклеотидов 15547–15705. Clade A выделен светло-серым цветом, а образец S504 из Дуванного Яра отмечен в сети. Нижний правый кластер, выделенный пунктирной линией круга, включает образцы S805, S806, S809 и S501.

Филогенетическая сеть с последовательностями домашних собак показывает, что кластер, ориентированный вокруг гаплотипа Яны (S805), сохраняется из сети волков ().И гаплотипы Жохова, и Аахима, расположенные в кладе А, являются общими для нескольких домашних собак из широкого географического распространения [4,53,55]. Эта основная филогенетическая группа, известная как Clade A, наряду с Clades B, C и D, была охарактеризована на основании ранее проведенных исследований на собаках, которые включают большинство линий домашних собак [53,70]. Гаплотипы Жохова и Аахима генетически неотличимы от домашних собак, что может свидетельствовать о том, что домашние собаки обитали в Арктической Сибири не менее 8000 ¹⁴ C YBP.С другой стороны, жоховские и аахимские псовые демонстрируют генетическое родство с азиатскими волками из. В частности, C . lupus chanco и C . lupus hodophilax либо имеют общие гаплотипы, либо отделены одной мутацией от сибирских псовых, включая одного янского псового. В то время как недавний полногеномный анализ местных собак Китая показал более близкое генетическое родство с домашними собаками [66], другое объяснение состоит в том, что сибирские псовые сохранили генетическую подпись от смешения с местными породами благодаря географической изоляции, что предполагалось в других древних породы собак [71].

Выводы

В целом, наши данные предполагают генетический вклад из региональных источников волков, включая, возможно, Canis cf. variabilis , в современную линию собак и подчеркивает важность дальнейшего изучения генетического вклада региональных пород волков в генофонд домашних собак. Кроме того, наши результаты согласуются с недавними исследованиями, предполагающими, что одомашнивание собак происходило в результате сложного процесса смешения различных пород, интегрированного с изоляцией региональных пород на протяжении всей истории.Будущие исследования могут дополнительно пролить свет на филогенетические отношения между различными видами собак.

Дополнительная информация

S1 Рис.

Образец был получен из слоя 2 в Улахан-Сулларе и описан как Canis cf. variabilis .

(TIF)

S2 Рис.

Морфологически идентифицированный как Canis lupus , экземпляр был получен в нижнем течении реки Колыма.

(TIF)

S1 Таблица

Информация о двух образцах из Дуванного Яра, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S2 Таблица

Информация о четырех образцах из Яны РХС, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S3 Таблица

Информация о четырех образцах из Жохова, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S4 Таблица

Информация о двух образцах из Ахима, включая код поля, описание останков, местонахождение и детали радиоуглеродного датирования.

(DOCX)

S5 Таблица

Для исследования были разработаны три пары праймеров, и одна пара праймеров была использована из предыдущего исследования [64].

(DOCX)

S6 Таблица

Идентификационные коды соответствуют указанным номерам доступа GenBank и справочнику.

(DOCX)

Благодарности

Мы благодарим Федора Шидловского за его поддержку в расследовании дела в Дуванном Яре.Мы также благодарим Стейси МакГрат, Дженнифер Люэдтке Кеннеди, Елену Кунески Рапу, Лизу Мандарино и Джулию Фресессу за их помощь с молекулярными процедурами.

Отчет о финансировании

Эти экспериментальные процедуры и раскопки на островах Жохов, Яна РХС и Новосибирские острова были поддержаны Rock Foundation. Компания Ford Motor приняла участие в исследовании района маяка Ахим. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступность данных

Все файлы последовательностей доступны в GenBank (номера доступа KJ1-KJ4).

Список литературы

12. Nobis G (1986) Die Wildaugetiere in der Umwelt des Menschen von Oberkassel bei Bonn und das Domestikationsproblem von Wolfen in Jungpaläolithikum.Боннер Ярбухер 186.

Ectopic MicroRNA-150-5p повышает чувствительность глюкокортикоидной терапии в клетках множественной миеломы MM1S, но не может преодолеть резистентность к гормональной терапии в клетках MM1R

Abstract

Глюкокортикоиды (ГК) избирательно запускают гибель клеток в линии клеток множественной миеломы MM1S, которые экспрессируют белок NR3C1 / глюкокортикоидного рецептора (GR), но не способны убить клетки MM1R, в которых отсутствует белок GR.Учитывая недавние демонстрации измененных профилей микроРНК при различных гематологических злокачественных новообразованиях и устойчивости к лекарственным средствам, мы охарактеризовали индуцируемые GC профили транскрипции мРНК и микроРНК в GC-чувствительных MM1S по сравнению с GC-устойчивыми клетками MM1R. Анализ транскриптома показал, что GC регулируют экспрессию множества генов, участвующих в контроле клеточного цикла, организации клеток, гибели клеток и иммунологическом заболевании в клетках MM1S, которые остаются неизменными в клетках MM1R. Что касается микроРНК, mir-150-5p был идентифицирован как наиболее стойкая микроРНК, регулируемая GC, из 5 подтвержденных QPCR микроРНК (mir-26b, mir-125a-5p, mir-146-5p, mir-150-5p, и mir-184), которые индуцируются GC в MM1S, но не в клетках MM1R.Функциональные исследования также показали, что эктопическая трансфекция синтетического mir-150-5p имитирует GR-зависимые изменения экспрессии генов, участвующие в путях гибели и пролиферации клеток. Примечательно, что, несмотря на наблюдаемые изменения экспрессии генов, сверхэкспрессия mir-150-5p в отсутствие GC не вызывала значительной цитотоксичности в клетках MM1S или MM1R. Это предполагает необходимость дополнительных шагов в индуцированной GC гибели клеток, которую нельзя имитировать только сверхэкспрессией mir-150-5p. Интересно, что комбинация трансфекции mir-150-5p с низкими дозами GC в клетках MM1S, как было обнаружено, сенсибилизирует ответ на терапию, тогда как противоположные эффекты могут наблюдаться со специфическим антагомиром mir-150-5p.Хотя сверхэкспрессия mir-150-5p существенно не меняет уровни экспрессии GR, было обнаружено, что mir-150-5p вызывает специфические эффекты GR посредством непрямой регуляции мРНК взаимодействующих с GR факторов транскрипции и рецепторов гормонов, шаперонов GR, а также различных эффекторов развернутый белковый стресс и передача сигналов хемокинов. В целом, GC-индуцибельный mir-150-5p добавляет еще один уровень регуляции к GC-специфическим терапевтическим ответам при множественной миеломе.

Образец цитирования: Palagani A, Op de Beeck K, Naulaerts S, Diddens J, Sekhar Chirumamilla C, Van Camp G, et al.(2014) Эктопическая транскрипция MicroRNA-150-5p сенсибилизирует ответ на глюкокортикоидную терапию в клетках множественной миеломы MM1S, но не может преодолеть резистентность к гормональной терапии в клетках MM1R. PLoS ONE 9 (12): e113842. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842

Редактор: Ян П. Такерманн, Ульмский университет, Германия

Поступила: 19 марта 2014 г .; Принята к печати: 1 ноября 2014 г .; Опубликовано: 4 декабря 2014 г.

Авторские права: © 2014 Palagani et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией. Необработанные данные массива экспрессии генов были загружены в базу данных Gene Expression Omnibus (GEO) и имеют номер доступа GSE59805.

Финансирование: Исследования были поддержаны грантом стратегических фундаментальных исследований (SBO) Агентства по инновациям в науке и технологиях (IWT, Бельгия), Фонда исследований множественной миеломы (MMRF, США), FWO и NOI / DOCPRO (UA) исследовательские гранты. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Множественная миелома (ММ) — это В-клеточное новообразование, характеризующееся накоплением клональных злокачественных плазматических клеток в костном мозге и часто коррелирующее с различными цитогенетическими аномалиями, такими как del (13), t (11-14), non -гипердиплоидия и del (17p) [1], [2]. Заболевание является причиной 10% злокачественных гематологических заболеваний и примерно 1% смертей, связанных с раком, в западных странах [3]. Терапия против множественной миеломы состоит из лекарств, которые могут уменьшить популяцию клональных плазматических клеток.Первоначальное лечение болезни зависит в основном от возраста пациента и сопутствующих заболеваний. Способность глюкокортикоидов (ГК) эффективно убивать лимфоидные клетки привела к их включению практически во все протоколы химиотерапии лимфоидных злокачественных новообразований. Для пациентов в возрасте до 65 лет высокие дозы химиотерапии с различными комбинациями, такими как схемы на основе талидомида-дексаметазона-бортезомиба и леналидомид-дексаметазон, с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток стали практикой в ​​клинике в последние годы [4]. [5], [6], [7], [8].Несмотря на прогресс в терапии, ММ остается неизлечимой из-за низких показателей ремиссии традиционных методов лечения, что приводит к короткой продолжительности жизни (3–4 года) и развитию лекарственной устойчивости. В настоящее время проходят испытания многочисленные новые комбинации лекарственных препаратов для предотвращения резистентности и повышения эффективности ГК в терапии лимфоидных злокачественных новообразований [9].

Глюкокортикоиды (ГК) — это стероидные гормоны, которые проявляют свое про- или антиапоптотическое действие через рецептор глюкокортикоидов (GR, NR3C1) и изменяют экспрессию генов [10], [11].Изоформа GRα, которая является основным медиатором эффектов GC, включает три основных функциональных домена: N-концевой домен (NTD), ДНК-связывающий домен (DBD) и лиганд-связывающий домен (LBD) [12]. Неактивная форма GRα в основном находится в цитоплазме, образуя шаперонный комплекс со своими партнерами по связыванию, такими как белки теплового шока, FKBP51, FKBP52, CYP40 и другие белки [13]. После связывания с GC GR активируется и перемещается в ядро. Активированный GR имеет несколько различных способов действия на клеточном уровне.Наиболее заметной из них является трансактивация, при которой активированный GR связывается с элементом ответа на глюкокортикоиды (GRE) и индуцирует экспрессию генов. Кроме того, GR может связываться с негативными сайтами GRE (nGRE) или связанными факторами транскрипции (NFκB, AP1, P53 или STAT) и, следовательно, (транс) репрессирует экспрессию генов [14]. Хотя он известен как сильный индуктор апоптоза лимфоидных клеток в течение почти столетия, сигнальные пути, регулирующие восприимчивость или устойчивость раковых клеток к ГК, выявлены лишь частично.Помимо медленных геномных действий GC, зависящих от регуляции ядерных генов, также быстрые негеномные эффекты GC в цитоплазме модулируют апоптотический ответ [15], [16]. Что касается развития резистентности к терапии GC, были предложены различные механизмы, включая деградацию GR, Akt-зависимое фосфорилирование GR, снижение активности гистондеацетилазы-2 (HDAC2), чрезмерную активацию фактора транскрипции NFkB или AP1, повышенный фактор ингибирования миграции макрофагов, окислительный стресс и опосредованная Р-гликопротеином регуляция оттока лекарств [17], [18], [19], [20].Новая возникающая гипотеза состоит в том, что микроРНК модулируют ответ на терапию GC посредством (посттранскрипционной) регуляции множества мишеней мРНК, участвующих в передаче сигналов GR, связанных с пролиферацией и гибелью клеток [21], [22], [23], [24]. MiRNA представляют собой короткие некодирующие РНК длиной приблизительно 22 нуклеотида, которые регулируют экспрессию от десятков до сотен генов посредством деградации мРНК или репрессии трансляции на основе комплементарности последовательности к затравочной области miRNA (положения 2-8) в 3’UTR мРНК [25].Альтернативно miRNAs могут косвенно репрограммировать транскрипционные ответы, изменяя уровни мРНК уровней транскрипционных факторов [26]. Таким образом, микроРНК могут представлять собой возможный механизм обратной связи для точной настройки величины индуцированной GC гибели клеток посредством прямой регуляции уровней мРНК / белка GR или косвенной регуляции партнеров по взаимодействию GR или последующих мРНК-мишеней, отвечающих за GC / GR. Поскольку нарушение регуляции miRNA оказывает глубокое влияние на дифференцировку, развитие, апоптоз и прогрессирование клеточного цикла, профили их экспрессии могут использоваться в качестве биомаркеров для определения типа и степени злокачественности (прогноза) и / или индивидуального ответа на терапию [27].Чтобы охарактеризовать регуляторную роль GC-индуцируемых микроРНК в ответе на терапию множественной миеломы, мы сравнили профили транскрипции мРНК и микроРНК в GC-чувствительных клетках MM1S и GC-устойчивых клетках MM1R при воздействии GC. Последняя клеточная модель часто используется для выяснения регуляторных механизмов, участвующих в резистентности к терапии ГК в клетках ММ [28].

Материалы и методы

Культура клеток и жизнеспособность клеток

GC-чувствительные линии клеток MM1S (CRL-2974) и GC-устойчивые MM1R (CRL-2975) были описаны ранее [28] и были приобретены в ATCC.Вкратце, клетки MM1S представляют собой линию клеток миеломы В-лимфобластов, полученную от 42-летней темнокожей женщины. Клеточная линия MM1R представляет собой устойчивый к стероидам субклон, полученный из клеток MM1S, хронически подвергающихся действию дексаметазона (Dex). Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (одобрено ЕС; происхождение из Южной Америки) и 0,5% раствора пенициллина / стрептомицина (Invitrogen). К клеточным линиям дополнительно добавляли 1% незаменимых аминокислот MEM и 1% пирувата натрия (Invitrogen).Каждую клеточную линию поддерживали при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ и 95% воздуха и влажности 95–98% до слияния. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью колориметрического анализа с 3- (4,5-диметилтиозол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромидом (МТТ) (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, Соединенные Штаты Америки), как описано ранее. [29].

Антитела и реагенты

Водорастворимый дексаметазон был приобретен в (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, Соединенные Штаты Америки), и 10 мМ исходные растворы были приготовлены в стерильной воде.Антитело против GRα (sc-8992), антитело против PARP (sc-7150) были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (Даллас, Соединенные Штаты Америки), а антитела против α-тубулина (T5168) были приобретены у Sigma Aldrich (St Луис, Миссури, США).

Экстракция РНК и обработка микрочипов

Суммарная РНК из клеток MM1S и MM1R, обработанных Dex (1 мкМ) или трансфицированных фиктивными миметиками или mir-150-5p, из трех независимых экспериментов была выделена с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Нидерланды) в соответствии с протоколом производителя. .После экстракции и измерения концентрации (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) качество общей РНК контролировали на приборе Bio-Rad Experion (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США). 500 нг тотальной РНК амплифицировали с использованием набора Illumina Total Prep RNA Amplification (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Вкратце, РНК подвергали обратной транскрипции с использованием праймеров олиго (dT) Т7, после чего биотинилированную кРНК синтезировали посредством реакции транскрипции in vitro. 750 нг амплифицированной кРНК гибридизовали с соответствующим массивом бус-чипа HumanHT12 (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).Были выполнены умножения. Гранулированный чип инкубировали в течение 18 часов при 58 ° C в гибридизационной печи при непрерывном качании. После нескольких последовательных этапов промывки (см. Протокол производителя) интенсивность шариков считывали на Illumina Iscan.

Анализ данных микрочипов

Все сгенерированные значения интенсивности необработанных данных были считаны с использованием пакета «beadarray» (v2.8.1) в R [30]. Интенсивность была нормирована на квантиль, и дифференциальная экспрессия генов между образцами оценивалась с помощью «Limma» (v3.14.1). Полученные p-значения были скорректированы для проверки множественных гипотез с использованием метода Бенджамини-Хохберга. После оценки экспрессии генов были рассчитаны евклидовы расстояния между образцами и генами, которые использовались в качестве метрики расстояния в иерархическом кластерном анализе с МэВ [31]. Анализ пути был выполнен в базе знаний Ingenuity Pathway (Ingenuity Systems, Редвуд-Сити, Калифорния, США) в соответствии с предоставленными инструкциями. Отсечка кратности изменения 2, а также коэффициент ложного обнаружения 0.1% были установлены для идентификации генов, экспрессия которых значительно дифференцировалась. Необработанные данные массива были загружены в базу данных Gene Expression Omnibus (GEO) и имеют номер доступа GSE59805.

Конверсия кДНК и анализ QPCR

Вкратце, 1 мкг РНК превращали в кДНК с использованием системы обратной транскрипции Go Script в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Madison, WI, Соединенные Штаты Америки). Sybr green был приобретен в (Bioline, Лондон, Великобритания). QPCR выполняли с использованием системы ABI7300 (Applied biosystems, Life Technologies Corporation).

анализ miRNA

miRNA выполняли с помощью набора miRNeasy (Qiagen, Venlo, Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя. Профили экспрессии 760 микроРНК стволовой петли RT-qPCR miRNA проводили, как описано ранее [32], [33]. Необработанные значения экспрессии были нормализованы с использованием стратегии нормализации глобального среднего [32]. Подтверждение результатов массива QPCR было выполнено путем обратной транскрипции тотальной РНК, содержащей miRNA, и обнаружение miRNA с помощью ПЦР в реальном времени с использованием соответственно miScript II RT Kit и miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Венло, Нидерланды).Наборы специфичных для микроРНК праймеров QPCR против человека mir-146a (MS00003535), mir-491-5p (MS00031899), mir-146b-5p (MS00003542), mir-26b-5p (MS00003234), mir-150-5p (MS00003577), mir-330-3p (MS00031738), mir-195 (MS00003703), mir-184 (MS00003640), mir-125a-5p (MS00003423) были приобретены у Qiagen (Венло, Нидерланды). Для прогнозирования мишеней и путей микроРНК использовалось программное обеспечение miRWalk [34]. Корреляцию профилей транскрипции мРНК и микроРНК клеток MM1S и MM1R, необработанных или обработанных Dex, или после имитации трансфекции или трансфекции миметиком mir-150-5p, проводили с помощью программного обеспечения IPA.

Трансфекция клеток ММ in vitro синтетическим миметиком miR-150-5p и антагомиром

Миметик Мир-150-5р и антагомир были приобретены в компании Qiagen (Венло, Нидерланды). Всего 5 × 10 ⁶ клеток подвергали электропорации с имитацией контроля или синтетическим mir-150-5p при конечной концентрации 150 нмоль / л с помощью Nucleofector Kit V, с использованием системы трансфекции AMAXA, программа O23 из (LONZA, Базель, Швейцария), как описано в другом месте [35].

Изоляция белка

5 × 10 ⁶ клеток высевали в чашки диаметром 10 см и готовили лизаты белков для различных экспериментальных установок для вестерн-анализа с буфером для образцов 1XSDS, содержащим 62.5 мМ трис-HCL pH-6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 0,5% бромфеноловый синий, DTT (5 мМ).

Статистический анализ

Статистические данные были выполнены с использованием однофакторного дисперсионного анализа, двухфакторного дисперсионного анализа с последующим пост-тестом Даннета и Бонферрони и односторонним парным t-критерием Стьюдента с использованием программного обеспечения с графической подушечкой prism5.

Результаты

Дексаметазон снижает жизнеспособность клеток в зависимости от дозы и времени в GC-чувствительных MM1S, но не в GC-устойчивых MM1R клетках

Перед исследованием регуляторной роли GC-индуцибельной микроРНК в экспрессии NR3C1 / GR-зависимых генов и ответах на гибель клеток мы сначала охарактеризовали ответ на терапию GC в клетках MM1S и MM1R.Вкратце, клетки MM1S и MM1R оставляли необработанными или обрабатывали 1 мкМ синтетического агониста GC дексаметазона (Dex) в течение соответственно 6 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов. мРНК и белки выделяли в каждый момент времени и анализировали на соответствующую экспрессию NR3C1 / GRα. Обработка клеток различными концентрациями Dex в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч с последующим измерением жизнеспособности клеток с помощью колориметрического анализа MTT выявила зависимое от дозы и времени снижение выживаемости клеток MM1S после воздействия GC (рис.1A и 1B). Напротив, Dex не обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках MM1R и скорее вызывает слабый эффект стимуляции роста [28], [35], [36], [37]. В соответствии с различным ответом GC в обеих клеточных линиях, анализ QPCR демонстрирует значительную транскрипцию мРНК NR3C1 / GRα в MM1S, но близкие к фоновым уровням мРНК NR3C1 / GRα в клетках MM1R (рис. 1C). Вестерн-анализ, наконец, подтверждает значительные уровни экспрессии белка GRα в MM1S и неопределяемые уровни белка GRα в клетках MM1R (рис.1D – E). Как видно из рис. 1D, клетки MM1S экспрессируют множественные трансляционные изоформы GRα [38], [39], экспрессия которых снижается после обработки GC.

Рис. 1. Дексаметазон снижает жизнеспособность клеток в зависимости от дозы и времени в GC-чувствительных MM1S, но не в GC-устойчивых MM1R клетках.

( A – B ) кривые доза-ответ клеток MM1S и MM1R, обработанных дексаметазоном в различных концентрациях в течение 24, 48 и 72 часов, как определено колориметрическим анализом МТТ.Данные представляют собой (среднее ± SEM) значения трех независимых экспериментов. ( C ) Зависимые от времени изменения уровней мРНК GRα после обработки 1 мкМ дексаметазоном. Данные представляют собой (среднее ± SEM) значения трех независимых экспериментов, нормализованные для гена домашнего хозяйства 28sРНК и относительно необработанного состояния MM1S (S UT). Средние с ***, **, * значительно различаются (p <0,001, <0,01 или <0,05 и ns существенно не различаются, как определено односторонним дисперсионным анализом ANOVA (пост-тест Даннета) ( D ) Изменения, зависящие от времени в уровнях белка GRα и расщеплении PARP в клетках MM1S и MM1R после обработки 1 мкМ Dex.( E ) Денситометрический анализ сигналов вестерн-блоттинга (n = 2) уровней белка GR (92 кДа), β-актина (40 кДа), полноразмерного PARP (116 кДа) и расщепленного PARP (89 кДа) в MM1S и MM1R после обработки 1 мкМ Dex. Показаны существенные различия между западными сигналами в MM1R и MM1S.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g001

Несмотря на зависящее от времени снижение уровней мРНК и белка GR после 24–72 ч обработки GC (рис. 1C – 1D), реакция гибели клеток в MM1S не отменяется.Более того, вызванная GC гибель клеток запускает зависимое от времени расщепление апоптотического маркера PARP в MM1S, но не в клетках MM1R (Fig. 1D-E). В отличие от уровней GR, наблюдаемых в MM1S, уровни экспрессии большинства изоформ GR в MM1R ниже предела обнаружения, хотя фоновые уровни варианта 70 кДа все еще могут быть обнаружены при длительном воздействии (данные не показаны). Примечательно, что хотя Dex полностью лишен способности вызывать цитотоксичность в клетках MM1R, слабый эффект стимуляции роста может наблюдаться при длительном воздействии GC на клетки MM1R.Это может быть связано с остаточной активностью возможной антиапоптотической трансляционной изоформы GR [38].

Дексаметазон вызывает специфические для GC транскрипционные изменения в клеточном цикле, повреждение / репарацию ДНК, гибель клеток и иммунологические пути в MM1S, но не в MM1R

Для оценки изменений экспрессии специфических генов, связанных с ответом на терапию GC при множественной миеломе, мРНК была выделена в трех независимых экспериментах из клеток MM1S и MM1R, подвергнутых воздействию GC Dex (1 мкМ) в течение 72 часов.После выделения мРНК профили транскрипции по всему геному определяли гибридизацией массива Illumina. Результаты были проанализированы с помощью R-пакета «Limma» (v3.14.1) [40], [41], что привело к идентификации 268 гена с пониженной регуляцией и 151 гена с повышенной регуляцией в MM1S после фильтрации для минимального двукратного изменения транскрипции в Образцы, обработанные Dex, по сравнению с контрольной установкой (абсолютное кратное изменение> 2) и скорректированное значение P <0,05 (база данных Gene Expression Omnibus (GEO) GSE59805). В MM1R не удалось обнаружить никаких значительных изменений, связанных с Dex, в соответствии с фенотипом устойчивости к GC и отсутствием GRα в клетках MM1R (см.рис.1). Тепловая карта (рис. 2A) представляет собой графическое представление специфических для Dex транскрипционных изменений в MM1S и отсутствия ответа Dex в клетках MM1R в трех биологических повторах, демонстрируя воспроизводимые и устойчивые паттерны экспрессии генов. С помощью анализа QPCR мы подтвердили GC-зависимую трансактивацию целевого гена GILZ (TSC22D3), а также GC-специфическую (транс) репрессию CDK2 в MM1S, но не в MM1R, в соответствии с данными массива Illumina и предыдущими отчетами [37], [42] ], [43], [44] (рис.2Б). Примечательно, что длительное воздействие GC (72 часа) на клетки MM1R выявляет слабо повышенные уровни CDK2 согласно анализу QPCR, что не может быть обнаружено с помощью менее чувствительного анализа микроматрицы. Этот эффект может быть связан с остаточной активностью антиапоптотических изоформ GR в MM1R, что также может способствовать слабому стимулирующему эффекту роста (рис. 1А) при длительном воздействии [38]. Комплексный анализ путей (IPA) также показал, что GC запускают изменения экспрессии генов, которые способствуют гибели клеток, уменьшают пролиферацию клеток (клеточный цикл, репликацию ДНК) и регулируют иммунологические гематологические пути в MM1S, но не в MM1R (Таблица 1), в соответствии с уменьшенной клеткой. анализ жизнеспособности MM1S (см. рис.1). Затем мы дополнительно подтвердили результаты микроматрицы некоторых дополнительных генов-мишеней, участвующих в клеточном цикле, повреждении / репарации ДНК и гибели клеток. Как видно из (рис. 2C и 2D), результаты проверки QPCR коррелируют с полученными данными микрочипа. Кроме того, анализируя паттерны корегулируемых генов, программное обеспечение IPA позволяет идентифицировать активацию или ингибирование возможных вышестоящих регуляторов (киназ, рецепторов, факторов транскрипции), участвующих в изменениях экспрессии генов [45]. Последний анализ предсказывает весьма значительную активацию факторов транскрипции NR3C1 и TP53, связанных с Dex-лиганом, в регуляции остановки клеточного цикла MM1S и / или апоптоза [46] (Таблица 2).Более того, предсказанная активация IKK и циклин-зависимых киназ CDKN2A, CDKN1A может быть индикаторами повреждения ДНК / гибели клеток и событий клеточного цикла, запускаемых Dex [47], [48], [49], [50]. Наконец, возможное ингибирование антиапоптотических сигналов просуществования, стимулированных киназами TNF и AKT, также может вносить вклад в индуцированную Dex гибель клеток в MM1S (таблица 2).

Рис. 2. Дексаметазон запускает специфические для GC транскрипционные изменения в клеточном цикле, повреждение / репарацию ДНК, гибель клеток и иммунологические пути в MM1S, но не в MM1R.

( A ) Тепловая карта представляет относительные уровни экспрессии генов в клетках MM1S и MM1R, оставленных без обработки (растворитель) или обработанных 1 мкМ Dex в течение 72 часов. Экспрессия гена изменяется более чем в 2 раза, а значение p <0,05 отображается на тепловой карте. ( B ) Левая панель: Количественная ПЦР в реальном времени (QPCR) проверка Dex-зависимой активации транскрипции мРНК GILZ (TSC22D3) Правая панель: Количественная ПЦР в реальном времени (QPCR) проверка Dex-зависимой репрессии мРНК CDK2 в MM1S, но нет в MM1R.Средние значения с ***, **, * значительно отличаются (p <0,001, <0,01 или <0,05 соответственно) по сравнению с контрольными установками, определенными односторонним методом (пост-тест Даннета) ( C – D ) в реальном времени. количественная проверка ПЦР (QPCR) и наблюдение на микроматрице Illumina верхних регулируемых GC генов включали клеточный цикл, повреждение / репарацию ДНК и гибель клеток в S = MM1S, но не в R = MM1R. Все валидационные исследования QPCR были нормализованы для гена домашнего хозяйства РНК 28S и представлены относительно необработанного состояния MM1S (S UT).Гистограммы представляют относительные уровни мРНК (среднее ± стандартная ошибка среднего) трех независимых экспериментов. Средние значения с ***, **, * значительно отличаются (p <0,001, <0,01 или <0,05 соответственно) от контрольных установок, как определено с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (пост-тесты Бонферрони).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g002

Предполагается, что микроРНК, реагирующие на GC в клетках MM1S, но не отвечающие на GC в клетках MM1R, модулируют клеточный цикл, пути роста и пролиферации клеток

Тотальную РНК выделяли из клеток MM1S и MM1R, обработанных 1 мкМ Dex в течение 72 часов, профилирование 760 микроРНК методом qPCR, как описано ранее [32].Это позволило идентифицировать 30 GC индуцибельных и 14 GC репрессированных miRNA (более чем в 2 раза) в MM1S, которые не изменяют транскрипцию в клетках MM1R (суммировано в Таблице 3). Затем был применен анализ IPA для перекрестного сравнения профилей микроРНК и мРНК в MM1S для прогнозирования генов-мишеней и основных путей, на которые влияет экспрессия микроРНК. Анализ диаграммы Венна 5 основных молекулярных и клеточных путей, обогащенных генами, дифференциально экспрессирующимися в MM1S при воздействии Dex, и прогнозируемые гены-мишени микроРНК, реагирующие на лечение Dex, показывает, что чувствительные к GC микроРНК могут нацеливаться на мРНК, участвующие в клеточном цикле и путях пролиферации клеток (рис.3А). Например, индуцируемые Dex микроРНК mir-150-5p, mir-152, mir-146b-5p, mir-1290, mir-125a-5p, mir-1206, как предполагается, модулируют несколько генов-мишеней, участвующих в клеточном цикле, клеточном росте и пути распространения (отмечены желтым цветом в таблице S1).

Рис. 3. Экспериментальная проверка GC-индуцируемых микроРНК, потенциально участвующих в регуляции пути NR3C1 (GR) в клетках MM1S

( A ) Диаграмма Венна, которая суммирует перекрытие между 5 основными предсказанными молекулярными и клеточными функциями, генерируемыми IPA из GC-регулируемых miRNA и GC-регулируемых мРНК ( B ) Venn-диаграмма, которая представляет собой перекрестное сравнение списка GC-чувствительных miRNA, идентифицированных в MM1S, со списком miRNA, специфичных для пути GR (NR3C1), в соответствии с бесплатной программой прогнозирования MiRWalk.( C ) Проверка уровней транскрипции 9 общих miRNA, выбранных на фиг. 3B, в клетках MM1S и MM1R, обработанных в течение 24, 48 или 72 ч 1 мкМ Dex, в режиме реального времени. ( D ) ГХ дозозависимая регуляция уровней mir-150-5p в клетках MM1S, обработанных ГХ в течение 72 часов. Все валидационные исследования miRNA QPCR были нормализованы для микроРНК SNORD 95 и SNORD 96A в соответствии с инструкциями производителя и относительно необработанного состояния MM1S (S UT). Гистограммы представляют относительные уровни miRNA (среднее ± стандартная ошибка среднего) трех независимых экспериментов по сравнению с контрольными установками.Средние значения с ***, **, * значительно отличаются от контрольных установок (p <0,001, <0,01 или <0,05), как определено односторонним дисперсионным анализом (тест Dunnetts Post).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g003

Чтобы уменьшить количество Dex-чувствительных микроРНК для дальнейшей проверки и функциональных исследований, мы затем сравнили список GC-чувствительных miRNA, идентифицированных в MM1S, со списком микроРНК, предположительно регулирующих путь GR (NR3C1) (Biocarta) в соответствии с базой данных MiRWalk [34] (рис.3Б). Это сгенерировало короткий список из 11 miRNA, которые были отобраны для дальнейшей проверки QPCR. В том же духе корреляция IPA репрессированных мРНК Dex и 30 индуцибельных miРНК Dex выявила аналогичную специфическую роль GR для mir-150-5p, mir-146b-5p и mir-125a-5p в клеточном цикле и путях клеточного роста и пролиферации. (Таблица S1). Зависимые от времени GC-ответные изменения уровней транскрипции 11 выбранных микроРНК оценивали с помощью QPCR в клетках MM1S и MM1R, подвергнутых в разные моменты времени (6 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч) 1 мкМ Dex.Анализ QPCR может подтвердить время и специфическую индукцию GC 5 hsa-микроРНК, т.е. mir-26b, mir-125a-5p, mir-146-5p, mir-150-5p и mir-184 (рис. 3C). Наконец, hsa-mir-150-5p был выбран для дальнейших функциональных исследований из-за его стойкой GC-чувствительной транскрипции между 6 и 72 часами и зависимой от дозы GC регуляции mir-150-5p после 72-часовой обработки (рис. 3D). При перекрестном сравнении 1203 Dex-зависимых генов-мишеней из клеток MM1S с обработкой 1 мкМ Dex в течение 72 часов (выбор гена производился на основе значения p <0.05 и абсолютное кратное изменение> 1,5) и 3626 предсказали цели hsa-mir-150-5p через базу данных miRWalk (предсказание по крайней мере 4 из 10 доступных алгоритмов, то есть DIANAmT, miRanda, miRDB, miRWalk, RNAhybrid, PICTAR4, PICTAR5, PITA, RNA22 и Targetscan), 196 общих мРНК / генных мишеней (рис. 4A) были идентифицированы в MM1S, которые остаются незатронутыми в клетках MM1R (подробный список генов можно найти в таблице S2). При использовании анализа IPA, 196 мРНК предсказывали GC-чувствительные гены-мишени mir-150-5p, обогащенные по гибели клеток, морфологии клеток, клеточному циклу, путям клеточного роста и пролиферации (рис.4А). Особо следует отметить, что восходящий анализ IPA предсказывает, что гены-мишени гена mir-150-5p чувствительны к регуляции с помощью передачи сигналов GC (Dex) / NR3C1, PPAR или STAT / IFNγ (фиг. 4B).

Рисунок 4. Прогнозируемая роль mir-150-5p в регуляции гибели и выживания клеток, клеточного цикла, клеточного роста и пролиферации в клетках MM1S.

( A ) Диаграмма Венна, которая представляет собой перекрестное сравнение 3626 предсказанных целей hsa-mir-150-5p в соответствии с программным обеспечением miRWalk и 1203 чувствительных к дексаметазону генов-мишеней в клетках MM1S, которые остаются неизменными в клетках MM1R ( B ) IPA предварительный анализ предсказанных мРНК-мишеней микроРНК в клетках MM1S.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g004

Трансфекция миметика mir-150-5p запускает экспрессию специфического гена GR в MM1S, но не в клетках MM1R, без модуляции уровней белка GR

Чтобы проверить возможные эффекты mir-150-5p на предсказанные мишени мРНК и / или клеточный цикл или пути клеточной пролиферации, мы провели эксперименты по трансфекции в клетках MM1S и MM1R с синтетическим миметиком mir-150-5p по сравнению с лечением Dex. Примечательно, что хотя MM1S и MM1R демонстрируют сходные уровни транскрипции mir-150-5p при миметической трансфекции (рис.5A), мы могли наблюдать значительные изменения в мРНК, отвечающих за mir-150-5p, в MM1S, но не в клетках MM1R, после анализа профилей мРНК Illumina. Интересно, что при перекрестном сравнении обработанных Dex и трансфицированных миметиком mir-150-5p клеток MM1S / MM1R анализ IPA выявил заметное перекрытие в затронутых мРНК, связанных с пролиферацией клеточного цикла, репарацией ДНК и путями гибели клеток в MM1S, а также отсутствие эффекты для обеих установок в клетках MM1R (рис. 5B) (таблица 4 и 5). Чтобы оценить, может ли mir-150-5p изменять уровни мРНК GR / NR3C1 или стабильность белка, мы выполнили QPCR и вестерн-блот-анализ после трансфекции mir-150-5p в клетках MM1S.Из фиг. 5C и D можно наблюдать, что трансфекция mir-150-5p не изменяет уровни мРНК или белка GR / NR3C1 соответственно. Эти результаты согласуются с данными in silico, показывающими, что ни один из проверенных GC-индуцибельных miR не нацелен на мРНК GR-3’UTR (фиг. 5E и таблица S3). В целом, эти результаты предполагают, что mir-150-5p может опосредовать косвенные эффекты, подобные GR.

Рисунок 5. Трансфекция миметиком Mir-150-5p запускает экспрессию специфического гена GR в MM1S, но не в клетках MM1R, без модуляции уровней белка GR.

( A ) Количественная оценка синтетических уровней mir-150-5p на основе QPCR через 72 часа после трансфекции клеток MM1S и MM1R. Уровни экспрессии miRNA были нормализованы для микроРНК SNORD 95 и SNORD 96A и представлены относительно контроля MOCK. Гистограммы представляют относительные уровни miRNA (среднее ± стандартная ошибка среднего) трех независимых экспериментов. Средние значения с ***, **, * значительно отличаются (p <0,001, <0,01 или <0,05) от контрольных установок в соответствии с двухфакторным дисперсионным анализом ANOVA (пост-тесты Бонферрони).( B ) Сравнение верхних обогащенных путей (IPA) изменений мРНК в клетках MM1S, обработанных в течение 72 часов до 1 мкМ Dex, с изменениями в клетках MM1S и MM1R после 72 часов ложной трансфекции трансфекции синтетическим mir-150-5p. ( C ) Уровни белка NR3C1 / GRα, обнаруженные после 72-часовой трансфекции синтетического миметика mir-150-5p в клетки MM1S. ( D ) Диаграмма Венна, которая представляет собой перекрытие экспериментально подтвержденных GC-индуцибельных микроРНК в клетках MM1S со списком микроРНК, предположительно нацеленных на 3’UTR NR3C1.( E ) QPCR-анализ уровней мРНК NR3C1 / GRα, присутствующих в клетках MM1S после 72-часовой трансфекции синтетическим миметиком mir-150-5p (левая панель) или после 72-часовой обработки Dex (1 мкМ) (правая панель).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g005

Гены, участвующие в путях пролиферации клеточного цикла, репарации ДНК и гибели клеток, которые регулируются в обработанном Dex и трансфицированном миметиком mir-150-5p MM1S / Ячейки MM1R показаны на фиг. 6A и 6B или обобщены в таблице S4.Чтобы дополнительно охарактеризовать перекрестные помехи между обработкой GC и трансфекцией mir-150-5p, мы также выполнили микроматричный анализ комбинаций mir-150-5p с 1 нМ Dex, поскольку комбинации обработки 1 мкМ Dex не давали РНК качества матрицы из-за чрезмерной цитотоксичности . Как можно заметить из фиг. 6A и 6B, обработка 1 нМ Dex вызывает более слабые изменения экспрессии генов по сравнению с обработкой 1 мкМ Dex. Кроме того, поскольку уровни mir-150-5p после трансфекции увеличиваются в 30 раз (фиг. 6A) по сравнению с 3-кратной индукцией после обработки Dex (фиг.3D), сверхэкспрессия миметика mir-150-5p вызывает более сильные изменения экспрессии генов, чем обработка 1 нМ Dex. Таким образом, комбинирование трансфекции mir-150-5p с обработкой 1 нМ Dex не приводило к дальнейшему увеличению изменений экспрессии генов, вызванных одной трансфекцией mir-150-p (фиг. 7A и B). Дальнейшее подробное сравнение активации GC и mir-150-5p (т.е. GILZ и FKBP5) (рис. 7A) или репрессии (IL23A, SKP2, BUB, SREBF1) (рис. 7B) типичных генов-мишеней GR выявило аналогичные эффекты в MM1S, но отсутствие эффектов в MM1R.Например, трансактивация генов FKBP5 и GILZ может наблюдаться после трансфекции mir-150-5p и обработки GC в клетках MM1S, хотя эффекты mir-150-5p на экспрессию FKBP5 сильнее. Аналогичным образом репрессия генов-мишеней GR IL23A, SKP2, BUB или SREBF1 может наблюдаться при обработке Dex, а также после трансфекции mir-150-5p. Наконец, помимо общих регулируемых генов, можно было идентифицировать дополнительные гены-мишени GR, на которые более избирательно влияла трансфекция mir-150-5p (SCNN1G) или обработка GC (GILZ, DUSP1, SGK1), что указывает на сложную тонкую настройку регуляции GR (рис. .7C).

Рисунок 6. Специфические для Mir-150-5p изменения мРНК в MM1S связаны с путями, связанными с гибелью и выживанием клеток, клеточным циклом, клеточным ростом и пролиферацией (A – B)

mir-150-5p-специфическая регуляция мРНК генов участвует в (i) клеточном цикле, (ii) сборке и организации клеток, (iii) репликации, рекомбинации и репарации ДНК, (iv) росте и пролиферации клеток, (v) гибели и выживании клеток. Результаты матрицы экспрессии генов Illumina BeadChip представлены в виде гистограмм, отражающих среднее кратное изменение экспрессии генов из трех независимых экспериментов с клетками MM1S, обработанными в течение 72 часов 1 мкМ Dex, по сравнению с контрольными клетками (верхние панели A – B) или MM1S. клетки, трансфицированные в течение 72 часов синтетическим mir-150-5p по сравнению с ложной трансфекцией, обработанные в течение 72 часов 1 нМ Dex или их комбинацией по сравнению с контрольными образцами (нижние панели A – B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g006

Рис. 7. Трансфекция Mir-150-5p имитирует GR-подобный ответ на активацию и репрессию гена в MM1S и отсутствие ответа в клетках MM1R.

( A ) Проверка индукции мРНК GILZ (TSC22D3) и FKBP5 мРНК GILZ (TSC22D3) и FKBP5 в клетках MM1S и MM1R с помощью количественной ПЦР в реальном времени после 72-часовой обработки 1 нМ или 1 мкМ Dex (левая панель) или через 72 часа трансфекция синтетическим mir-150-5p, 72-часовая обработка 1 нМ Dex или их комбинацией (правая панель).Данные представляют собой значения (среднее ± стандартная ошибка среднего) трех независимых экспериментов, нормализованные для гена домашнего хозяйства РНК 28S и относительно соответствующих контрольных установок без обработки / растворителя (UT) или MOCK. Средние значения с ***, **, * значительно отличаются (p <0,001, <0,01 или <0,05) от контрольной установки, как определено с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (посттест Бонферрони). ( B ) Проверка уровней репрессии мРНК MYB, IL23A, SKP2, BUB1, SREBF1 в клетках MM1S или MM1R с помощью количественной ПЦР в реальном времени (QPCR) после 72-часовой обработки 1 нМ или 1 мкМ Dex или после 72-часовой трансфекции синтетическим mir-150-5p, 72-часовая обработка 1 нМ Dex или их комбинацией.Данные представляют собой значения (среднее ± стандартная ошибка среднего) трех независимых экспериментов, нормализованные для гена домашнего хозяйства РНК 28S и относительно соответствующих контрольных установок без обработки / растворителя (UT) или MOCK. Средние значения с ***, **, * значительно отличаются (p <0,001, <0,01 или <0,05) от контрольной установки, как определено с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (посттесты Бонферрони) ( C ), результаты матрицы экспрессии генов Illumina BeadChip выбранные гены представлены в виде гистограмм, отражающих среднее кратное изменение экспрессии генов из трех независимых экспериментов с клетками MM1S, обработанными в течение 72 часов 1 мкМ Dex, или же с клетками MM1S, трансфицированными в течение 72 часов синтетическим mir-150-5p по сравнению с ложной трансфекцией. , обработанные в течение 72 часов 1 нМ Dex или их комбинацией по сравнению с контрольными образцами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g007

GR-подобный генный ответ, запускаемый трансфекцией mir150-5p, связан со сложной регуляцией факторов транскрипции, шаперонов hsp, киназ, белков клеточного цикла, стресса развернутого белка (UPR), AMPK / mTOR и хемокин-специфичных сигнальных сетей

Из-за отсутствия прямых эффектов mir-150-5p на уровни мРНК GR (NR3C1) и белка, мы предположили, что GR-подобные нисходящие эффекты могут быть вызваны регуляцией mir-150-5p возможных партнеров по взаимодействию с GR (факторы транскрипции, шапероны). или альтернативные ядерные рецепторы гормонов (рис.8A – B). Хотя установки mir-150-5p и Dex снижают уровни мРНК MYB и ATF3, для факторов транскрипции FOS наблюдались противоположные ответы. Особый интерес представляет MYB — ключевой регулятор GR-зависимой экспрессии генов при лейкемии [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57] (рис. 8A).

Рисунок 8. Трансфекция Мир-150-5р связана со сложной регуляцией факторов транскрипции, рецепторов гормонов и шаперонов.

Illumina BeadChip Результаты экспрессии генов факторов транскрипции ( A ), рецепторов ядерных гормонов ( B ) и шаперонов ( C ) представлены в виде столбчатых диаграмм, отражающих среднее изменение кратности экспрессии генов из трех независимых экспериментов MM1S, обработанный в течение 72 часов 1 мкМ Dex по сравнению с контрольной установкой (UT), или клетки MM1S, трансфицированные в течение 72 часов синтетической трансфекцией mir-150-5p по сравнению с ложной трансфекцией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g008

Что касается рецепторов гормонов, большинство рецепторов гормонов оставались постоянными после трансфекции mir-150-5p (рис. 8B), хотя уровни NR3C2 ( MR) может быть обнаружен в установке с помощью mir-150-5p, тогда как уровни NR3C2 остаются стабильными в присутствии Dex. Интересно, что как следствие реципрокного перекрестного взаимодействия действий NR3C2 (MR) и NR3C1 (GR), подавление функции MR действительно может приводить к независимой от лиганда стимуляции действий GR [58].Затем мы оценили изменения уровней транскрипции молекул шаперонов рецепторов гормонов в присутствии mir-150-5p. Хотя большинство мРНК HSP остаются незатронутыми, значительные изменения в уровнях HSPA8 и HSP90AB1 могут быть обнаружены после трансфекции mir-150-5p, но не с обработкой Dex, что может дополнительно способствовать тонкой настройке базальной активности рецепторов ядерных гормонов (рис. 8C) [59 ], [60], [61]. Кроме того, mir-150-5p избирательно снижает уровни транскриптов ATF4, JUN, NFE2L1 (NRF1), CEBP / B и IRF4, но не NFE2L2, TP53 и RelA (рис.8А).

Наконец, мы также исследовали возможные восходящие эффекты mir-150-5p на пути передачи сигналов рецепторной киназы. Активация (не) лиганд-независимого рецептора гормона через киназы, хемокины и цитокины хорошо документирована в настоящее время [62], [63], [64], [65], [66]. Что касается передачи сигналов хемокинами, было обнаружено, что трансфекция mir-150-5p и обработка GC увеличивают уровни мРНК CXCR4 и CX3CR1 и снижают уровни CXCR3, CCL3, CCL5, тогда как другие члены остаются неизменными (фиг. 9A). Интересно, что различные сообщения демонстрируют положительную роль CXCR4 / CXCL12 в гормонально-независимой активации рецепторов [65], [66], [67], [68], [69].Неожиданно мы наблюдали значительное увеличение уровней CXCR4 после трансфекции mir-150-5p, в противоположность более ранним сообщениям, демонстрирующим подавление мРНК CXCR4 его 3′-UTR через mir-150-5p [68], [70]. Хотя различные исследования иллюстрируют опухолевые и прометастатические эффекты CXCR4 [71], [72], его экспрессия также играет ключевую роль в гематопоэзе [73] и недавно была описана как хороший прогностический индикатор при множественной миеломе [74]. Наконец, мы также выявили заметные эффекты на эффекторы клеточного цикла (CDKN1A) и пути передачи сигналов UPR / mTOR (DDIT3, DDIT4, TXNIP) и псевдокиназу Ser / Thr семейства Триббла (TRIB3) [75], которые в целом могут пересекаться с передачей сигналов рецептора глюкокортикоидов. ответ на терапию ГК в клетках ММ [76], [77], [78] (рис.9Б). Особо следует отметить, что участие C / EBP и ATF4 (Fig. 8A) было продемонстрировано в регуляции транскрипции UPR стрессовых белков DDIT3, DDIT4, TXNIP [79], [80], что дополнительно подтверждает наши результаты.

Рисунок 9. Трансфекция Mir-150-5p связана со сложной регуляцией хемокинов, клеточного цикла, передачи сигналов UPR / mTOR.

Illumina BeadChip Результаты экспрессии гена хемокиновых рецепторов или лигандов ( A ) или регуляторов клеточного цикла, развернутого белкового стресса (передача сигналов UPR / mTOR) ( B ) представлены в виде столбиков, отражающих среднее кратность экспрессии гена. изменение от трех независимых экспериментов MM1S, обработанных в течение 72 часов 1 мкМ Dex по сравнению с контрольной установкой (UT), или еще клеток MM1S, трансфицированных в течение 72 часов синтетической трансфекцией mir-150-5p по сравнению с ложной трансфекцией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g009

Слабая сенсибилизация ответа на терапию низкими дозами GC миметической трансфекцией mir-150-5p может быть отменена трансфекцией mir-150-5p-специфичного антагомира в клетки MM1S

Поскольку mir-150-5p модулирует различные гены, связанные с клеточным циклом, клеточной пролиферацией и путями гибели клеток, мы затем хотели измерить гибель клеток, вызванную эктопической трансфекцией mir-150-5p. Удивительно, но с помощью МТТ-анализа через 24, 48 и 72 часа после трансфекции клеток MM1S увеличением количества mir150-5p не наблюдалось существенной индукции гибели клеток (рис.10А). Последнее предполагает, что изменения экспрессии генов, вызванные mir-150-5p, недостаточны для запуска вызванной GC гибели клеток, и необходимы дополнительные действия GC для уничтожения клеток [15]. Затем мы оценили, может ли эктопическая трансфекция mir-150-5p сенсибилизировать к индуцированной GC гибели клеток. В этом отношении ложные и трансфицированные mir-150-5p клетки MM1S подвергали воздействию различных доз Dex в течение 72 часов, и выживаемость клеток снова оценивали с помощью МТТ-анализа. Из фиг. 10В можно наблюдать, что присутствие mir-150-5p слабо увеличивает индуцированную GC гибель клеток при наномолярных (нМ) концентрациях, хотя при микромолярных (мкМ) концентрациях обработки Dex не было выявлено никаких значительных эффектов.Более того, после обработки GC клеток MM1S, трансфицированных специфическим антагомиром mir-150-5p, чтобы обратить вспять эффекты mir-150-5p, гибель клеток может быть обращена вспять при низких дозах GC. Это побудило нас оценить соответствующие изменения в экспрессии генов после обработки GC клеток MM1S, трансфицированных антагомиром mir-150-5p. Хотя мы смогли подтвердить слабую GC-специфическую повышающую регуляцию mir150-5p и умеренное снижение уровней mir 150-5p при обработке GC клеток MM1S, трансфицированных mir-150-5p-специфическим антагомиром (рис.10C) подходы с использованием массивов казались недостаточно чувствительными, чтобы идентифицировать слабые изменения в репрессии или активации генов в обработанных GC клетках в присутствии или в отсутствие антагомира (фиг. 10D-E и данные не показаны).

Фигура 10. Слабая сенсибилизация ответа на терапию низкими дозами GC посредством трансфекции миметиком mir-150-5p может быть отменена трансфекцией mir-150-5p-специфичного антагомира в клетки MM1S.

( A ) Количественная оценка выживаемости клеток MM1S на основе МТТ после 24, 48 или 72 часов трансфекции увеличивающимися дозами синтетического миметика mir-150-5p по сравнению с имитационным контролем трансфекции ( B ) Количественная оценка на основе МТТ Выживаемость клеток MM1S после 72-часовой обработки увеличивающимися дозами Dex в сочетании либо с имитацией трансфекции, либо с трансфекцией синтетическим миметиком mir-150-5p или специфическим антагомиром mir-150-5p (как показано на рисунке).Представленные данные представляют собой относительные уровни выживаемости клеток (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) трех независимых экспериментов. Средние значения с ***, **, * значительно отличаются (p <0,001, <0,01 или <0,05) от контрольной установки, как определено с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (посттесты Бонферрони). ( C ) Количественная ПЦР в реальном времени (QPCR) количественная оценка уровней транскрипции mir-150-5p после 72-часовой обработки 1 нМ Dex в комбинации или без трансфекции антагомира, специфичного для mir-150-5p. ( D – E ) Результаты экспрессии гена Illumina BeadChip для подмножества генов представлены в виде гистограмм, отражающих среднее кратное изменение из трех независимых экспериментов с клетками MM1S, обработанными в течение 72 часов 1 нМ Dex vs.контрольная установка, либо в сочетании с трансфекцией специфическим антагомиром mir-150-5p, либо нет.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.g010

Обсуждение

Снижение пролиферации и индукция гибели клеток в результате апоптоза — два основных клеточных события, направленных на уменьшение роста и уничтожение раковых клеток. Известно, что ГК вызывают остановку клеточного цикла, предшествующую апоптозу. Лечение раковых клеток более высокими дозами Dex может дестабилизировать глюкокортикоидный рецептор (GR), что в конечном итоге приводит к устойчивости к GC [38], [81], [82], [83].Характеристика miRNA и их целевых мРНК, участвующих в регуляции ответа на терапию GC и / или резистентности, является областью интенсивных исследований, и относительно мало известно о регуляторных сетях GC-специфической miRNA. Комбинируя анализ транскриптома по всему геному и анализ пути изобретательности, мы предполагали раскрыть биологические эффекты GC-чувствительных miRNA и их предполагаемых мРНК-мишеней в терапии MM GC. Мы идентифицировали 30 GC-индуцибельных и 14 GC-репрессированных микроРНК, которые могут модулировать несколько аспектов ответа на GC-терапию при ММ, включая клеточный цикл, пролиферацию клеток, репликацию ДНК, экспрессию генов и пути гибели клеток.Сходным образом, исследование GC-чувствительных микроРНК в биоптатах слизистой оболочки пациентов с эозинофильным эзофагитом охарактеризовало 32 GC-индуцибельные и 4 GC репрессированные микроРНК, из которых 7 GC-индуцибельных микроРНК являются общими с нашим списком, независимо от клеточного контекста [84]. Затем мы выбрали mir-150-5p как наиболее интересную GC-индуцибельную микроРНК для дальнейшего исследования из-за его постоянной активации GC в клетках MM1S и его возможной опухолевой супрессорной функции при (злокачественном) гематопоэзе [26], [54], [85] ], [86], [87].Согласно анализу IPA, предсказанные мишени мРНК mir-150-5p были связаны с клеточным циклом и ответами клеточной пролиферации, предшествующими апоптозу. В соответствии с анализом IPA, эктопическая экспрессия mir-150-5p в присутствии низких концентраций GC, как было обнаружено, слабо сенсибилизирует индуцированную GC гибель клеток, тогда как антагомир mir-150-5p может обратить этот эффект. Примечательно, что при эктопической трансфекции mir-150-5p или обработке GC в клетках MM1S были идентифицированы различные мРНК, которые аналогично реагируют на повышенные уровни mir-150-5p или обработку GC (т.е.е. MYB, IL23A, SKP2, BUB1, SREBP1, FKBP5). Это говорит о том, что эффекты mir-150-5p тесно связаны с функцией GR. Более того, GR-специфические эффекты mir-150-5p полностью теряются в клетках MM1R, и mir-150-5p не может восстанавливать чувствительность GC в клетках MM1R, лишенных экспрессии белка GR. Поскольку сверхэкспрессия mir-150-5p существенно не изменила уровни экспрессии GR, мы полагаем, что GR-подобные эффекты могут быть вызваны сложной непрямой регуляцией факторов транскрипции, взаимодействующих с GR (MYB, C / EBP, JUN, FOS) или рецепторов гормонов (NR3C2 / MR), шапероны GR (FKBP5, HSPA8, HSP90AB1), а также различные эффекторы стресса развернутого белка (ATF4, DDIT3, DDIT4, TXNIP) и хемокин-специфическая передача сигналов (CXCR3, CCL3, CCL5, CXCR4).Особо следует отметить, что избирательное снижение уровня NR3C2 (MR) mir-150-5p может приводить к реципрокной стимуляции действий GR [58]. GR-зависимые эффекты mir-150-5p также предполагают, что GR-белок может вносить вклад в специфическую посттранскрипционную регуляцию mir-150-5p. Напр., Зависимая от NR3C1 (GR) посттранскрипционная регуляция CCL2 и CCL7, но не мРНК CCL5, была продемонстрирована при связывании РНК GR с мотивом, богатым GU в 5’UTR [88]. Альтернативно, mir-150-5p может модулировать связывание GR / ДНК по аналогии с длинной некодирующей РНК Gas5 [24].

В целом мы идентифицировали различные новые и ранее опубликованные GC-индуцибельные микроРНК. Кроме того, множественные мРНК, отвечающие за mir-150-5p, связаны с GC-индуцированной пролиферацией клеток и ответом на терапию гибелью клеток при множественной миеломе. Исследования функциональной выживаемости клеток в клетках MM1S подтвердили слабые сенсибилизирующие эффекты терапии ГК сверхэкспрессией mir-150-5p при низкой дозе GC, тогда как противоположные эффекты могли наблюдаться в присутствии специфического антагомира mir-150-5p. Однако, хотя анализы QPCR выявили обратное изменение уровней mir-150-5p, индуцированных Dex, после трансфекции антагомиром и ослабление индуцированной GC гибели клеток, последующий анализ микроматрицы не смог выявить значительных специфичных для mir-150-5p изменений уровней мРНК, регулируемых GC (рис.10D – E и данные не показаны). Мы полагаем, что массивному исследованию может не хватать чувствительности и статистической мощности для выявления значительных изменений мРНК при обращении 2-кратной зависящей от времени GC-специфической индукции уровней mir-150p его антагомиром, тогда как 30-кратная избыточная экспрессия на уровнях mir150-5p после трансфекция может вызывать более устойчивые эффекты в массивах экспрессии генов. В аналогичном исследовании неспособность антагомиров обратить вспять изменения экспрессии специфического гена mir-92, несмотря на сниженные уровни mir-92 в присутствии его антагомира, была объяснена возможной избыточностью в сетях мРНК, регулируемых mir-92 [89].В том же направлении, поскольку мы идентифицировали различные индуцируемые GC микроРНК, связанные с путем NR3C1, мы также не можем исключить избыточные регулируемые mir-150-5p сети мРНК, участвующие в регуляции NR3C1. Например, ранние GC-индуцируемые микроРНК, т.е. mir-26b, mir125-5p и mir184, могут быть ответственны за последующее повышение уровней mir150-5p для точной настройки активности GR (рис. 3C). Недавние отчеты также показывают связь mir150-5p с mir124- и mir155-сетями [90], [91]. Альтернативно, избыточные изомиры МИР-150-5р могут ускользать от контроля антагомира [91].Будущие исследования потребуются для дальнейшего раскрытия специфичности или избыточности mir-150-5p-специфичных сетей NR3C1 с помощью дополнительных транскриптомных и протеомных подходов. Наконец, недавние сообщения, демонстрирующие секрецию mir-150-5p в микровезикулы, могут позволить разработать диагностический биомаркер для отслеживания ответа на терапию GC, иначе комбинация низких доз GC с синтетическими везикулами mir-150-5p может повысить чувствительность ответа на терапию GC при лимфоидном раке [ 92], [93].

Дополнительная информация

Таблица S1.

IPA-прогнозирование микроРНК-мишеней на основе корреляции транскрипционных изменений конкретных микроРНК (вверх / вниз) с изменениями уровней мРНК (противоположное направление вниз / вверх) и соответствующих путей в клетках MM1S, обработанных в течение 72 часов Dex.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.s001

(XLSX)

Таблица S2.

Перекрестное сравнение 1203 Dex-зависимых генов-мишеней из клеток MM1S, подвергнутых воздействию в течение 72 часов, с 1 мкМ Dex (отбор генов производился на основе значения p <0.05 и абсолютное кратное изменение> 1,5) и 3626 предсказали цели hsa-mir-150-5p через базу данных miRWalk (предсказание по крайней мере 4 из 10 доступных алгоритмов, то есть DIANAmT, miRanda, miRDB, miRWalk, RNAhybrid, PICTAR4, PICTAR5, PITA, RNA22 и Targetscan) 196 общих мРНК / генных мишеней были идентифицированы в MM1S, которые остаются неизменными в клетках MM1R.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.s002

(XLSX)

Таблица S4.

Подробный список генов, участвующих в путях пролиферации клеточного цикла, репарации ДНК и гибели клеток, которые аналогичным образом регулируются в обработанных Dex и трансфицированных миметиком mir-150-5p клетках MM1S, но которые остаются неизменными в клетках MM1R (значения представляют (кратное изменение по сравнению с контрольными клетками)).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113842.s004

(XLSX)

Благодарности

Авторы благодарят всех сотрудников лаборатории за ценные научные обсуждения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AP KH SG PM JV WVB. Проведены эксперименты: AP KODB JD CSC GVC KH PM JV WVB. Проанализированы данные: АП КОДБ СН КЛ WVB. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: AP KODB GVC KH SG PM JV WVB. Участвовал в написании рукописи: AP KH SG WVB.

Ссылки

1. 1. Фонсека Р., Барлоги Б., Батай Р., Ублюдок С., Бергсагель П. Л. и др. (2004) Генетика и цитогенетика множественной миеломы: отчет семинара. Cancer Res 64: 1546–1558.
2. 2. Bommert K, Bargou RC, Stuhmer T (2006) Пути передачи сигналов и выживания при множественной миеломе. Eur J Cancer 42: 1574–1580.
3. 3. Кастринакис Н.Г., Горгулис В.Г., Фукас П.Г., Димопулос М.А., Киттас С. (2000) Молекулярные аспекты множественной миеломы.Энн Онкол 11: 1217–1228.
4. 4. Кайл Р.А., Раджкумар С.В. (2008) Множественная миелома. Кровь 111: 2962–2972.
5. 5. Несвицкий Р., Джаябалан Д.С., Христос П.Дж., Фурст Дж. Р., Наиб Т. и др. (2008) Комбинированная терапия BiRD (биаксин [кларитромицин] / ревлимид [леналидомид] / дексаметазон) приводит к высоким показателям полного и общего ответа при не получавшей лечения симптоматической множественной миеломе. Кровь 111: 1101–1109.
6. 6. Гей Ф., Раджкумар С.В., Коулман М., Кумар С., Марк Т. и др.(2010) Кларитромицин (Биаксин) -леналидомид в низких дозах дексаметазона (BiRd) по сравнению с леналидомидом в низких дозах дексаметазона (Rd) при недавно диагностированной миеломе. Am J Hematol 85: 664–669.
7. 7. Росси А., Марк Т., Джаябалан Д., Христос П., Зафар Ф. и др. (2013) BiRd (кларитромицин, леналидомид, дексаметазон): обновленная информация о долгосрочной терапии леналидомидом у ранее нелеченных пациентов с множественной миеломой. Кровь 121: 1982–1985.
8. 8. Korde N, Kristinsson SY, Landgren O (2011) Моноклональная гаммопатия неопределенного значения (MGUS) и тлеющая множественная миелома (SMM): новые биологические идеи и разработка стратегий раннего лечения.Кровь 117: 5573–5581.
9. 9. Piovan E, Yu J, Tosello V, Herranz D, Ambesi-Impiombato A, et al. (2013) Прямая реверсия устойчивости к глюкокортикоидам путем ингибирования AKT при остром лимфобластном лейкозе. Cancer Cell 24: 766–776.
10. 10. Тернер Дж. Д., Мюллер С. П. (2005) Структура 5 ‘нетранслируемой области гена глюкокортикоидного рецептора (NR3C1): идентификация и распределение в тканях множества новых экзонов человека 1. J Mol Endocrinol 35: 283–292.
11. 11. Шмидт С., Райнер Дж., Плонер С., Пресул Е., Римл С. и др.(2004) Апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами, и резистентность к глюкокортикоидам: молекулярные механизмы и клиническое значение. Cell Death Differ 11 Приложение 1: S45–55.
12. 12. Де Босшер К. (2010) Селективные модуляторы рецепторов глюкокортикоидов. Дж. Стероид Биохим Мол Биол 120: 96–104.
13. 13. Kumar R, Thompson EB (2005) Регулирование генов глюкокортикоидным рецептором: структура: взаимосвязь функций. Дж. Стероид Биохим Мол Биол 94: 383–394.
14. 14. Де Босчер К., Бек И.М., Хегеман Г. (2010) Классические глюкокортикоиды против нестероидных модуляторов глюкокортикоидных рецепторов: выживаемость наиболее приспособленного регулятора иммунной системы? Иммунное поведение мозга 24: 1035–1042.
15. 15. Kfir-Erenfeld S, Yefenof E (2014) Негеномные события, определяющие чувствительность гемопоэтических злокачественных новообразований к апоптозу, индуцированному глюкокортикоидами. Cancer Immunol Immunother 63: 37–43.
16. 16. Kfir-Erenfeld S, Sionov RV, Spokoini R, Cohen O, Yefenof E (2010) Сети протеинкиназ, регулирующие индуцированный глюкокортикоидами апоптоз кроветворных раковых клеток: фундаментальные аспекты и практические соображения. Лимфома Лейка 51: 1968–2005.
17. 17.De Iudicibus S, Franca R, Martelossi S, Ventura A, Decorti G (2011) Молекулярный механизм устойчивости к глюкокортикоидам при воспалительном заболевании кишечника. World J Gastroenterol 17: 1095–1108.
18. 18. Барнс П.Дж., Адкок И.М. (2009) Устойчивость к глюкокортикоидам при воспалительных заболеваниях. Ланцет 373: 1905–1917.
19. 19. Чжан Дж., Яо Й, Сяо Ф, Лань Х, Ю Ц и др. (2013) Введение дексаметазона защищает мышей от повреждения почек, вызванного ишемией / реперфузией, путем подавления передачи сигналов PI3K / AKT.Int J Clin Exp Pathol 6: 2366–2375.
20. 20. Schlossmacher G, Stevens A, White A (2011) Апоптоз, опосредованный глюкокортикоидными рецепторами: механизмы устойчивости в раковых клетках. J Endocrinol 211: 17-25.
21. 21. Ли XJ, Luo XQ, Han BW, Duan FT, Wei PP и др. (2013) MicroRNA-100 / 99a, дерегулированная при остром лимфобластном лейкозе, подавляет пролиферацию и способствует апоптозу, регулируя пути передачи сигналов FKBP51 и IGF1R / mTOR. Br J Рак.
22. 22.Хун И, Ву Дж, Чжао Дж, Ван Х, Лю И и др. (2013) miR-29b и miR-29c участвуют в контроле толл-подобных рецепторов индуцированного глюкокортикоидами апоптоза в плазматических дендритных клетках человека. PLoS One 8: e69926.
23. 23. Pore ​​SK, Choudhary A, Rathore B, Ganguly A, Sujitha P и др. (2013) Липосомный препарат миРНК, нацеленный на Hsp90, для системного противоопухолевого действия. Биоматериалы 34: 6804–6817.
24. 24. Kino T, Hurt DE, Ichijo T, Nader N, Chrousos GP (2010) Некодирующая РНК gas5 является репрессором глюкокортикоидного рецептора, связанным с остановкой роста и голоданием.Научный сигнал 3: ra8.
25. 25. Ambros V (2003) Пути микроРНК у мух и червей: рост, смерть, жир, стресс и время. Cell 113: 673–676.
26. 26. Моррис В.А., Чжан А., Ян Т., Стируолт Д.Л., Рамамурти Р. и др. (2013) Экспрессия MicroRNA-150 индуцирует миелоидную дифференцировку клеток острого лейкоза человека и нормальных гематопоэтических клеток-предшественников. PLoS One 8: e75815.
27. 27. Kong YW, Ferland-McCollough D, Jackson TJ, Bushell M (2012) микроРНК в лечении рака.Ланцет Онкол 13: e249–258.
28. 28. Гринштейн С., Кретт Н.Л., Куросава Ю., Ма С., Чаухан Д. и др. (2003) Характеристика линий клеток множественной миеломы человека (ММ) MM.1. Экспериментальная гематология 31: 271–282.
29. 29. Суттана В., Манхеткорн С., Поомпимон В., Палагани А., Жохов С. и др. (2010) Дифференциальная хемосенсибилизация Р-гликопротеина, сверхэкспрессирующего клетки K562 / Adr, с помощью витаферина А и полифенолов Сиамуа. Молочный рак 9:99.
30. 30. Dunning MJ, Smith ML, Ritchie ME, Tavare S (2007) beadarray: классы R и методы для данных на основе шариков Illumina.Биоинформатика 23: 2183–2184.
31. 31. Саид А.И., Шаров В., Уайт Дж., Ли Дж., Лян В. и др. (2003) TM4: бесплатная система с открытым исходным кодом для управления и анализа данных микрочипов. Биотехники 34: 374–378.
32. 32. Местдаг П., Ван Влиерберг П., Де Веер А., Мут Д., Вестерманн Ф. и др. (2009) Новый и универсальный метод нормализации данных микроРНК RT-qPCR. Геном Биол 10: R64.
33. 33. Местдаг П., Фейс Т., Бернард Н., Гюнтер С., Чен С. и др.(2008) Профилирование экспрессии miRNA в режиме «ствол-петля» RT-qPCR с высокой пропускной способностью с использованием минимальных количеств входной РНК. Нуклеиновые кислоты Res 36: e143.
34. 34. Dweep H, Sticht C, Pandey P, Gretz N (2011) miRWalk – база данных: предсказание возможных сайтов связывания miRNA путем «прогулок» по генам трех геномов. Дж. Биомед Информ, 44: 839–847.
35. 35. Tessel MA, Benham AL, Krett NL, Rosen ST, Gunaratne PH (2011) Роль микроРНК в регулировании глюкокортикоидного ответа и устойчивости при множественной миеломе.Гормональный рак 2: 182–189.
36. 36. Murray MY, Rushworth SA, Zaitseva L, Bowles KM, Macewan DJ (2013) Ослабление индуцированной дексаметазоном гибели клеток при множественной миеломе опосредуется экспрессией miR-125b. Клеточный цикл 12: 2144–2153.
37. 37. Grugan KD, Ma C, Singhal S, Krett NL, Rosen ST (2008) Двойная регуляция индуцированной глюкокортикоидами лейциновой молнии (GILZ) рецептором глюкокортикоидов и путями PI3-киназы / AKT при множественной миеломе. Дж. Стероид Биохим. Мол Биол 110: 244–254.
38. 38. Gross KL, Oakley RH, Scoltock AB, Jewell CM, Cidlowski JA (2011) Селективная регуляция альфа-изоформы глюкокортикоидного рецептора антиапоптотических генов в клетках остеосаркомы: новый механизм устойчивости к глюкокортикоидам. Мол эндокринол 25: 1087–1099.
39. 39. Sanchez-Vega B, Krett N, Rosen ST, Gandhi V (2006) Изоформы транскрипции глюкокортикоидного рецептора и резистентность в клетках множественной миеломы. Mol Cancer Ther 5: 3062–3070.
40. 40. Джентльмен Р. (2005) Решения в области биоинформатики и вычислительной биологии с использованием R и Bioconductor.Нью-Йорк: Springer Science + Business Media. XIX, 473 с.
41. 41. Смит Г.К. (2004) Линейные модели и эмпирические байесовские методы для оценки дифференциальной экспрессии в экспериментах с микрочипами. Stat Appl Genet Mol Biol 3: Статья3.
42. 42. Itani OA, Liu KZ, Cornish KL, Campbell JR, Thomas CP (2002) Глюкокортикоиды стимулируют экспрессию гена sgk1 человека путем активации GRE в его 5′-фланкирующей области. Am J Physiol Endocrinol Metab 283: E971–979.
43. 43. Granes F, Roig MB, Brady HJ, Gil-Gomez G (2004) Активация Cdk2 действует выше митохондрии во время индуцированного глюкокортикоидами апоптоза тимоцитов.Eur J Immunol 34: 2781–2790.
44. 44. Kullmann MK, Grubbauer C, Goetsch K, Jakel H, Podmirseg SR, et al. (2013) Ось p27-Skp2 опосредует вызванную глюкокортикоидами остановку клеточного цикла в клетках Т-лимфомы. Клеточный цикл 12: 2625–2635.
45. 45. Крамер А., Грин Дж., Поллард Дж. Младший, Тугендрайх С. (2014) Подходы к причинно-следственному анализу в анализе пути изобретательности. Биоинформатика 30: 523–530.
46. 46. Ли Х, Цянь В., Вен Х, Ву З., Чжуан К. и др. (2012) Глюкокортикоидный рецептор и последовательная активация P53 дексаметазоном опосредуют апоптоз и остановку клеточного цикла остеобластных клеток MC3T3-E1.PLoS One 7: e37030.
47. 47. Обексер П., Хагенбухнер Дж., Рупп М., Сальвадор С., Хольцнер М. и др. (2009) p16INK4A сенсибилизирует клетки лейкемии человека к апоптозу, индуцированному FAS и глюкокортикоидами, посредством индукции BBC3 / Puma и репрессии MCL1 и BCL2. J Biol Chem 284: 30933–30940.
48. 48. Багдассарян Н., Каталло Р., Махли М.А., Френч П., Чизат Ф. и др. (1998) Глюкокортикоиды индуцируют удлинение G1, а также S-фазы в нормальных стимулированных лимфоцитах человека: дифференциальные эффекты на регуляторные белки клеточного цикла.Exp Cell Res 240: 263–273.
49. 49. Николсон Л., Холл А.Г., Редферн С.П., Ирвинг Дж. (2010) Модуляторы NFkappaB в модели устойчивого к глюкокортикоидам острого лимфобластного лейкоза у детей. Leuk Res 34: 1366–1373.
50. 50. Блад Л.Г., Лиден Дж., Пазиранде А., Стропила I, Дальман-Райт К. и др. (2005) Идентификация генов-мишеней, участвующих в антипролиферативном эффекте глюкокортикоидов, раскрывает роль репрессии ядерного фактора (каппа) B. Мол эндокринол 19: 632–643.
51. 51. Бянь З., Ли Л., Цуй Дж., Чжан Х., Лю Й. и др. (2011) Роль c-Myb, нацеленного на miR-150, в разрушении эпителия толстой кишки во время экспериментального колита мышей, индуцированного декстрансульфатом натрия, и язвенного колита человека. Дж. Патол 225: 544–553.
52. 52. Chen S, Wang Z, Dai X, Pan J, Ge J и др. (2013) Повторная экспрессия микроРНК-150 индуцирует ВЭБ-положительную дифференцировку лимфомы Беркитта путем модуляции c-Myb in vitro. Cancer Sci 104: 826–834.
53. 53.Цзян Х, Хуанг Х, Ли З, Ли И, Ван Х и др. (2012) Блокада созревания miR-150 за счет слияния MLL / MYC / LIN-28 необходима для MLL-ассоциированного лейкоза. Cancer Cell 22: 524–535.
54. 54. Adams BD, Guo S, Bai H, Guo Y, Megyola CM и др. (2012) Функциональный скрининг in vivo раскрывает опосредованную miR-150 регуляцию реакции кроветворения на повреждение. Cell Rep 2: 1048–1060.
55. 55. Zheng Q, Zhou L, Mi QS (2012) МикроРНК miR-150 участвует в развитии и функционировании Valpha14-инвариантных NKT-клеток.J Immunol 188: 2118–2126.
56. 56. Sarvaiya PJ, Schwartz JR, Geng CD, Vedeckis WV (2012) c-Myb взаимодействует с рецептором глюкокортикоидов и регулирует его уровень в клетках пред-B-острой лимфобластной лейкемии. Эндокринол клеток Mol 361: 124–132.
57. 57. Geng CD, Vedeckis WV (2011) Новый, специфичный для клонов, механизм ауторегуляции экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов человека в 697 клетках пре-B-острого лимфобластного лейкоза. Мол эндокринол 25: 44–57.
58. 58.Хаттори Т., Мурасе Т., Ивасе Э, Такахаши К., Отаке М. и др. (2013) Глюкокортикоид-индуцированная гипертензия и сердечное повреждение: эффекты антагонизма минералокортикоидных и глюкокортикоидных рецепторов. Nagoya J Med Sci 75: 81–92.
59. 59. Jaaskelainen T, Makkonen H, Palvimo JJ (2011) Стероидная регуляция FKBP51 и его роль в передаче сигналов гормона. Curr Opin Pharmacol 11: 326–331.
60. 60. Tatro ET, Eshops IP, Kaul M, Achim CL (2009) Модуляция ядерной транслокации глюкокортикоидных рецепторов в нейронах с помощью иммунофилинов FKBP51 и FKBP52: последствия для большого депрессивного расстройства.Brain Res 1286: 1–12.
61. 61. Бек И.М., Дреберт З.Дж., Хойя-Ариас Р., Бахар А.А., Девос М. и др. (2013) Соединение А, селективный модулятор рецептора глюкокортикоидов, усиливает активацию промотора гена белка теплового шока Hsp70. PLoS One 8: e69115.
62. 62. Robertson S, Hapgood JP, Louw A (2013) Концентрация глюкокортикоидных рецепторов и способность димеризоваться влияют на ядерную транслокацию и распределение. Стероиды 78: 182–194.
63. 63. Ху А., Джозефсон МБ, Динер Б.Л., Нино Г., Сюй С. и др.(2013) Проастматические цитокины регулируют нелигандзависимую и зависимую от лиганда передачу сигналов глюкокортикоидных рецепторов в гладких мышцах дыхательных путей. PLoS One 8: e60452.
64. 64. Эйкельберг О., Рот М., Лоркс Р., Брюс В., Рудигер Дж. И др. (1999) Лиганд-независимая активация глюкокортикоидного рецептора агонистами бета2-адренергического рецептора в первичных фибробластах легких человека и гладкомышечных клетках сосудов. J Biol Chem 274: 1005–1010.
65. 65. Kasina S, Macoska JA (2012) Ось CXCL12 / CXCR4 способствует лиганд-независимой активации рецептора андрогена.Mol Cell Endocrinol 351: 249–263.
66. 66. Sauve K, Lepage J, Sanchez M, Heveker N, Tremblay A (2009) Активация рецепторов эстрогена с положительной обратной связью по пути CXCL12-CXCR4. Cancer Res 69: 5793–5800.
67. 67. Boudot A, Kerdivel G, Habauzit D, Eeckhoute J, Le Dily F и др. (2011) Дифференциальная эстрогеновая регуляция хемокиновых рецепторов CXCL12, CXCR4 и CXCR7, способствует росту эстрогенов в клетках рака груди. PLoS One 6: e20898.
68. 68.Роллан-Тернер М., Горетти Э., Бускено М., Леонард Ф., Николя С. и др. (2013) Аденозин стимулирует миграцию эндотелиальных клеток-предшественников человека. Роль CXCR4 и микроРНК-150. PLoS One 8: e54135.
69. 69. Родс Л.В., Шорт С.П., Нил Н.Ф., Сальво В.А., Чжу Ю.и др. (2011) Цитокиновый рецептор CXCR4 опосредует эстроген-независимый туморогенез, метастазирование и устойчивость к эндокринной терапии при раке груди человека. Cancer Res 71: 603–613.
70. 70. Tano N, Kim HW, Ashraf M (2011) microRNA-150 регулирует мобилизацию и миграцию мононуклеарных клеток костного мозга путем нацеливания на Cxcr4.PLoS One 6: e23114.
71. 71. Cojoc M, Peitzsch C, Trautmann F, Polishchuk L, Telegeev GD, et al. (2013) Новые цели в лечении рака: роль оси CXCL12 / CXCR4. Onco Targets Ther 6: 1347–1361.
72. 72. Han TT, Fan L, Li JY, Xu W (2014) Роль хемокинов и их рецепторов в хроническом лимфоцитарном лейкозе: функция в микросреде и таргетная терапия. Рак Biol Ther 15: 3–9.
73. 73. Zou YR, Kottmann AH, Kuroda M, Taniuchi I, Littman DR (1998) Функция хемокинового рецептора CXCR4 в гематопоэзе и развитии мозжечка.Nature 393: 595–599.
74. 74. Бао Л, Лай И, Лю И, Цинь И, Чжао Х и др. (2013) CXCR4 является хорошим прогностическим показателем выживаемости у пациентов с множественной миеломой. Leuk Res 37: 1083–1088.
75. 75. Лян К.Л., Риши Л., Кишан К. (2013) Tribbles при остром лейкозе. Кровь 121: 4265–4270.
76. 76. Das I, Png CW, Oancea I, Hasnain SZ, Lourie R и др. (2013) Глюкокортикоиды снижают стресс ER кишечника за счет усиления сворачивания белков и деградации неправильно свернутых белков.J Exp Med 210: 1201–1216.
77. 77. Гавами С., Эшраги М., Анде С.Р., Чазин В.Дж., Клониш Т. и др. (2010) S100A8 / A9 индуцирует аутофагию и апоптоз посредством АФК-опосредованного перекрестного взаимодействия между митохондриями и лизосомами, в котором участвует BNIP3. Cell Res 20: 314–331.
78. 78. Ли С, Чен Х, Дин Ф, Чжан И, Ло А и др. (2009) Новый ген-мишень p53, S100A9, индуцирует p53-зависимый клеточный апоптоз и опосредует путь апоптоза p53. Biochem J 422: 363–372.
79. 79.Полман Я.А., Хантер Р.Г., Спекснейдер Н., ван ден Овер Я.М., Коробко О.Б. и др. (2012) Глюкокортикоиды модулируют путь mTOR в гиппокампе: разные эффекты в зависимости от стресса в анамнезе. Эндокринология 153: 4317–4327.
80. 80. Protiva P, Hopkins ME, Baggett S, Yang H, Lipkin M, et al. (2008) Подавление роста клеток рака толстой кишки полиизопренилированными бензофенонами связано с индукцией ответа эндоплазматического ретикулума. Int J Cancer 123: 687–694.
81. 81.Ramamoorthy S, Cidlowski JA (2013) Изучение молекулярных механизмов действия рецепторов глюкокортикоидов от чувствительности к сопротивлению. Endocr Dev 24: 41–56.
82. 82. Barnes PJ (2013) Устойчивость к кортикостероидам у пациентов с астмой и хронической обструктивной болезнью легких. J Allergy Clin Immunol 131: 636–645.
83. 83. Gross KL, Lu NZ, Cidlowski JA (2009) Молекулярные механизмы, регулирующие чувствительность и устойчивость к глюкокортикоидам. Клеточный эндокринол 300: 7–16.
84. 84. Лу С., Муккада В.А., Мангрей С., Кливленд К., Шиллингфорд Н. и др. (2012) Профилирование микроРНК в биоптатах слизистой оболочки пациентов с эозинофильным эзофагитом до и после лечения стероидами и взаимосвязь с мишенями мРНК. PLoS One 7: e40676.
85. 85. He Y, Jiang X, Chen J (2013) Роль miR-150 в нормальном и злокачественном гематопоэзе. Онкоген.
86. 86. Xiao C, Calado DP, Galler G, Thai TH, Patterson HC, et al. (2007) MiR-150 контролирует дифференцировку В-клеток, воздействуя на фактор транскрипции c-Myb.Ячейка 131: 146–159.
87. 87. He Y, Jiang X, Chen J (2014) Роль miR-150 в нормальном и злокачественном гематопоэзе. Онкоген 33: 3887–3893.
88. 88. Ishmael FT, Fang X, Houser KR, Pearce K, Abdelmohsen K и др. (2011) Глюкокортикоидный рецептор человека как РНК-связывающий белок: глобальный анализ транскриптов, связанных с глюкокортикоидным рецептором, и идентификация целевого РНК-мотива. J Immunol 186: 1189–1198.
89. 89. Sengul A, Santisuk R, Xing W, Kesavan C (2013) Системное введение антагомира, предназначенного для ингибирования miR-92, регулятора ангиогенеза, не смогло модулировать анаболический ответ скелета на механическую нагрузку.Physiol Res 62: 221–226.
90. 90. Manoharan P, Basford JE, Pilcher-Roberts R, Neumann J, Hui DY et al. (2014) Пониженные уровни miR-124a и miR-150 связаны с повышенной экспрессией провоспалительного медиатора в KLF2-дефицитных макрофагах. J Biol Chem.
91. 91. Ван М., Тан Л.П., Дейкстра М.К., ван Лом К., Робертус Дж.Л. и др. (2008) анализ miRNA при B-клеточном хроническом лимфоцитарном лейкозе: центры пролиферации, характеризующиеся низкой экспрессией miR-150 и высокой экспрессией BIC / miR-155.Дж. Патол 215: 13–20.
92. 92. Ли Дж, Чжан И, Лю И, Дай Х, Ли В. и др. (2013) Опосредованный микровезикулами перенос микроРНК-150 от моноцитов к эндотелиальным клеткам способствует ангиогенезу. J Biol Chem 288: 23586–23596.
93. 93. Almanza G, Anufreichik V, Rodvold JJ, Chiu KT, DeLaney A, et al. (2013) Синтез и доставка короткой некодирующей РНК B-лимфоцитами. Proc Natl Acad Sci U S A 110: 20182–20187.

Безопасность и фармакокинетика витаферина-А при остеосаркоме высокой степени злокачественности: испытание фазы I

Списки содержания доступны на ScienceDirect

Домашняя страница журнала аюрведы и интегративной медицины: http: // elsevier.com / locate / jaim

Оригинальная статья исследования

Безопасность и фармакокинетика витаферина-A при остеосаркоме высокой степени злокачественности: испытание фазы I Нишель Пирес a, Викрам Гота a, Ашиш Гулия b, Лал Хингорани c, Маниш Агарвал b, Ajay Puri b, * abc

Отдел клинической фармакологии, ACTREC, Мемориальный центр Тата, Харгар, Нави Мумбаи, 410210, Отделение костей и мягких тканей Индии, Мемориальный центр Тата, Парел, Мумбаи, 400012, Индия Pharmanza Herbal Pvt Ltd., Ананд, Гуджарат, Индия

articleinfo

аннотация

История статьи: Получено 31 августа 2018 г. Получено в пересмотренной форме 24 октября 2018 г. Принято 26 декабря 2018 г. Доступно онлайн xxx

Введение: Withaferin-A (WA), получено активное начало из традиционной индийской травы, известной как ашваганда или индийский женьшень, было показано, что она предотвращает и излечивает уретановые опухоли легких у мышей, а также подавляет рост пересаженной саркомы у мышей.Цели: в этом исследовании мы оценили безопасность и фармакокинетику WA у пациентов с запущенной стадией остеосаркомы высокой степени злокачественности. Методы. Исследование увеличения дозы I фазы было запланировано с использованием классического дизайна 3 × 3 (C33D). Когорты увеличения дозы включали 72, 108, 144 и 216 мг WA, вводимых в виде двух-четырех разделенных доз в день. В каждую когорту были включены по три пациента, и последний пациент наблюдался в течение не менее 30 дней на предмет любой ограничивающей дозу токсичности, прежде чем перейти в более высокую когорту.Фармакокинетические исследования проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с чувствительностью до 50 нг / мл. При каждом посещении проводилась оценка безопасности, включая клиническое обследование, подробную историю нежелательных явлений, тесты функции печени, тесты функции почек и полный анализ крови. WA вводили ежедневно до прогрессирования. Общие критерии терминологии для нежелательных явлений (CTCAE) версии 3.0 использовались для классификации нежелательных явлений. Результаты: Используемый состав обычно хорошо переносился.Наблюдалось одиннадцать нежелательных явлений 1 или 2 степени тяжести. Побочных эффектов 3 или 4 степени не наблюдалось. Наиболее частыми побочными эффектами были повышение ферментов печени (5/11) и кожная сыпь (2/11). Другие побочные эффекты включают усталость, жар, отек и диарею (по одному). Ни у одного из пациентов не было обнаруживаемых уровней WA в кровотоке. Заключение: препарат хорошо переносился. Однако, по-видимому, WA имеет низкую пероральную биодоступность. Необходимы дальнейшие исследования с улучшенными составами.© 2019 Трансдисциплинарный университет, Бангалор и Всемирный фонд аюрведы. Издательские услуги Elsevier B.V. Это статья в открытом доступе под лицензией CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses / by-nc-nd / 4.0 /).

Ключевые слова: Витхаферин-А Ашваганда Остеосаркома Фармакокинетика безопасности

1. Введение Существует растущая потребность в новых методах лечения рака, особенно на поздних стадиях. Большой интерес вызывают соединения природного происхождения как мишени для потенциального лечения рака.Многие ингредиенты, полученные из растений, в прошлом показали отличную противораковую активность. Противораковые препараты, такие как этопозид, винкристин и таксаны, и многие другие были получены из растений.

* Автор, ответственный за переписку. Отделение хирургии, Мемориальная больница Тата, Парел, Мумбаи, 400012, Индия. Факс: þ91 22 27405061. Адрес электронной почты: [электронная почта защищена] (А. Пури). Рецензирование проводится Трансдисциплинарным университетом, Бангалор.

Withania somnifera (Ашваганда) или индийский женьшень веками использовался в Аюрведе для лечения ряда заболеваний.Он обладает многочисленными фармакологическими свойствами, включая нейрозащиту, противовоспалительное действие, афродизиак, ревматизм, бессонницу и зоб среди других [1]. Экстракт корней содержит группу биологически активных компонентов, известных как витанолиды. Химическая структура витанолидов изучена, и они широко распространены в семействе Solanaceae. Витаферин-A (WA) является терапевтически активным витанолидом, который, как сообщается, присутствует в корнях и листьях растения. В нескольких доклинических исследованиях он показал значительную противораковую активность.Структура WA показана на рис. 1. Было показано, что WA предотвращает и излечивает уретановые опухоли легких у мышей, а также ингибирует

https://doi.org/10.1016/j.jaim.2018.12.008 0975 -9476 / © 2019 Трансдисциплинарный университет, Бангалор и Всемирный фонд аюрведы. Издательские услуги Elsevier B.V. Это статья в открытом доступе под лицензией CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Цитируйте эту статью как: Пирес Н. и др., Безопасность и фармакокинетика витаферина-А при поздней стадии остеосаркомы высокой степени: испытание фазы I, J Ayurveda Integr Med, https: // doi.org / 10.1016 / j.jaim.2018.12.008

2

N. Pires et al. / Journal of Ayurveda and Integrative Medicine xxx (xxxx) xxx

Рост пересаженной саркомы у мышей. Корни ашваганды обладают активностью, способствующей укреплению здоровья, некоторые из действий экстракта корня и его компонентов включают ингибирование факторов транскрипции NF-kappaB и AP-1 [2], индукцию апоптоза через опосредованное митохондриями высвобождение цитохрома с и активацию каспазы [3] , выявление гуморальных и клеточно-опосредованных иммунных ответов за счет усиления Th2-доминантной поляризации [4] и противоопухолевых эффектов за счет подавления экспрессии p34cdc2 [5].Экстракт листьев ашваганды продемонстрировал противоопухолевую активность, которая в основном была связана с его компонентом витаноном, который избирательно активировал путь p53 в опухолевых клетках [6,7]. WA испытывали на солидных и асцитных опухолевых клетках саркомы 180 (S-180) мышей, которые лечили in vivo и in vitro. При наблюдении под электронным микроскопом было обнаружено, что соединение влияет на эти веретенообразные микротрубочки клеток в метафазе [8]. WA продемонстрировал коэффициент усиления сенсибилизатора 1,5 для in vitro уничтожения клеток китайского хомячка V79 при нетоксичной концентрации примерно 2 мМ [9].WA может ингибировать активацию и пролиферацию Т-и В-клеток, не вызывая гибели клеток. Таким образом, демонстрируется потенциал в качестве противовоспалительного агента [10]. WA демонстрирует цитотоксичность для различных линий опухолевых клеток. В своем исследовании они показали, что он в первую очередь вызывает окислительный стресс в клетках HL-60 лейкемии человека и в некоторых других линиях раковых клеток [11]. Генетические исследования показывают, что он может быть привлекательным вариантом лечения тройного отрицательного рака груди (TNBC) с плохим прогнозом [12].В доклинических данных, WA продемонстрировал антипролиферативный потенциал и привел к апоптозу в клеточных линиях остеосаркомы человека MG-63 и U2OS, индуцируя ROS-опосредованное снижение митохондриального мембранного потенциала и ингибируя белки контрольной точки G2 / M, тем самым способствуя остановке клеточного цикла [13,14 ]. Возможности лечения запущенной остеосаркомы ограничены. Метастатическое заболевание представляет собой проблему лечения, и у пациентов часто плохой прогноз. Тем самым указывается на необходимость новых методов лечения и вариантов лечения запущенной стадии болезни.Некоторые из проблем, которые необходимо преодолеть на клиническом уровне перед использованием WA в качестве противоопухолевого средства, — это его эффективность, эффективность и побочные эффекты, т.е. создание безопасного и эффективного протокола дозирования [15]. Несмотря на то, что он является сильным кандидатом, клинических испытаний этого продукта при раке не проводилось. Чтобы определить установленную пользу в клинических условиях, мы провели фазу I исследования у пациентов с остеосаркомой. Мы выбрали стандартизованный экстракт корней W. somnifera, содержащий 4,5% WA (вес / вес) для исследования фазы I.W. somnifera принимается с топленым маслом в Аюрведе, традиционной индийской медицине. Мы использовали формулу, в которой экстракт был обработан в соответствии с текстом Аюрведы в топленом масле. Наши цели в этом исследовании состояли в том, чтобы определить наличие какой-либо ограничивающей дозу токсичности (DLT)

Рис. 1. Структура витхаферина А.

на 30-й день и оценить безопасность и фармакокинетику препарата, содержащего WA, у пациентов с продвинутой стадией. остеосаркома высокой степени злокачественности. 2. Материалы и методы. Исследование было одобрено нашим комитетом по институциональной этике, который в настоящее время зарегистрирован Генеральным контролером по лекарственным средствам Индии (регистрационный номер IEC: ECR / 170 / Inst / MH / 2013).Исследование было зарегистрировано на сайте clinictrials.gov (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT00689195). 2.1. Пациенты и условия Это было одноцентровое исследование фазы I повышения дозы, проведенное в онкологической больнице третичного уровня в западной Индии. Мы набрали 13 пациентов, которые были готовы участвовать и соответствовали критериям отбора, включенные пациенты предоставили письменное информированное согласие на участие в исследовании. Критерии отбора для исследования включали: 1) Дети и взрослые в возрасте от 8 до 65 лет 2) Гистологически подтвержденная остеосаркома конечности высокой степени злокачественности и 3) Рецидив заболевания после первичного лечения, которые не подходят или отказываются от вторичной химиотерапии.Критерии исключения включали: 1) беременных / кормящих женщин, 2) женщин, которым требуется сопутствующее лечение индукторами или ингибиторами CYP, и 3) женщин без хорошего венозного доступа. 2.2. Вмешательство в исследование Для этого исследования использовался стандартизированный экстракт корня W. somnifera, содержащий 4,5% WA (вес / вес) (AshwaMAX 400, Pharmanza Herbal Pvt Ltd., Гуджарат, Индия). Каждая 400 мг капсула AshwaMAX содержала 18 мг WA. Экстракт был обработан в топленом масле, как предписано в традиционных текстах Аюрведы.2.3. Дизайн исследования Дизайн нашего исследования представлял собой классический подход к увеличению дозы в 3 × 3, как показано на рис. 2. Целью испытаний фазы 1 является определение максимально переносимой дозы (МПД). Конструкции 3 3 просты в эксплуатации и идентифицируют МПД с приемлемым уровнем точности. Основным ограничением дизайна 3 3 является то, что он включает значительную часть пациентов при субтерапевтических дозах [16]. Однако его консервативная стратегия повышения дозы сводит к минимуму риск воздействия токсичных доз исследуемого продукта.Ранее мы провели 28-дневное исследование токсичности повторных доз на крысах, в котором использовали стандартизированный экстракт W. somnifera, содержащий 4,5% WA. Уровень отсутствия наблюдаемых побочных эффектов (NOAEL), обнаруженный в исследовании, составил 2000 мг / кг. Соответствующая эквивалентная доза для человека (HED) составляет приблизительно 325 мг / кг / день. Для получения максимальной рекомендованной начальной дозы (MRSD) 65 мг / кг / день формулы для человека был применен коэффициент безопасности пять [17]. Учитывая, что средний вес человека составляет 60 кг, мы пришли к MRSD 3900 мг / день.В настоящем исследовании начальная доза используемого экстракта W. somnifera составляет 1600 мг, которую постепенно увеличивают до 4800 мг / день. Наивысшая доза WA, при которой у 1 из 6 пациентов наблюдалась ограничивающая дозу токсичность (DLT), была определена как максимальная переносимая доза (MTD). Ограничивающая дозу токсичность определялась как любое негематологическое событие 3 степени или гематологическое событие 4 степени, связанное с Витаферином-А, на основании Общих критериев терминологии для нежелательных явлений Национального института рака (CTCAE) версии 3.0. Когорты увеличения дозы включали 2 капсулы BID, 3 капсулы BID, 4 капсулы BID и 4 капсулы TID, соответствующие суточным дозам 72, 108, 144 и 216 мг WA.По три пациента были включены в каждую группу

. Процитируйте эту статью как: Pires N et al., Безопасность и фармакокинетика витхаферина-A при остеосаркоме высокой степени злокачественности: испытание фазы I, J Ayurveda Integr Med, https: // doi. org / 10.1016 / j.jaim.2018.12.008

N. Pires et al. / Журнал аюрведы и интегративной медицины xxx (xxxx) xxx

3

Таблица 1 Исходные характеристики исследуемой популяции. ALP e Щелочная фосфатаза. Характеристики пациентов Число пациентов Мужчины / женщины Средний возраст (лет) Средний гемоглобин (± SD) a (г / дл) Среднее значение Sr.Креатинин (± SD) a (мг / дл) Среднее значение Sr. ALPa (МЕ / л)

13 10/3 16 (13e43) 10,62 (± 2,53) 0,9 (± 0,14) 597,5 (± 849,5)

a Значения гемоглобина в г / дл, значения креатинина сыворотки в мг / дл и значения ЩФ в МЕ / л — это значения, измеренные на исходном уровне.

3.1. Результаты лабораторных исследований по безопасности У одного пациента в когорте 1 развилось обострение анемии с понижением уровня гемоглобина до 6,9 г / дл в течение 3 месяцев наблюдения по сравнению с 7,7 г / дл на исходном уровне. У пяти субъектов (38,46%) отмечалось повышение уровня печеночных ферментов — аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ).Все повышения уровня ферментов печени были 1 степени тяжести. Только АСТ был повышен у одного пациента, только АЛТ — у одного пациента, в то время как у 3 пациентов было совместное повышение АЛТ и АСТ (таблица 2). 3.2. Неблагоприятные события

Рис. 2. 3 þ 3 Дизайн исследования с увеличением дозы для фазы I клинических испытаний. DLT ¼ Токсичность, ограничивающая дозу; MTD ¼ максимально переносимая доза. Все DLT оценивали на 30-е сутки.

и последний пациент наблюдались в течение не менее 30 дней на предмет токсичности, ограничивающей дозу, перед переходом в более высокую когорту.

Одиннадцать побочных эффектов произошли у 8 субъектов в ходе исследования. По два события произошли в когорте 1 и когорте 3, в то время как четыре события наблюдались в когорте 2 и три в когорте 4. Нежелательные явления делятся на 6 основных категорий: усталость (1), лихорадка (1), сыпь (2), диарея. (1), отек (1) и аномальные LFT (5). События были либо 1-й, либо 2-й степени. Неблагоприятные события, которые произошли во время исследования в 4 когортах, показаны выше в (Таблица 2).

2.4. Отбор проб и анализ безопасности и фармакокинетики

3.3. Фармакокинетические данные

Фармакокинетические образцы были собраны в день 1 в следующие моменты времени: е 0,0 (до введения дозы), 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 10, 12,0 и Через 24,0 часа после введения уровни в плазме измеряли с использованием утвержденной методики высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как описано Patial et al. имеющий предел количественного определения 50 нг / мл [18]. В хроматографической системе использовалась колонка C18 с обращенной фазой с УФ-детектированием при 225 нм.Подвижная фаза состояла из воды и ацетонитрила, нанесенных градиентным потоком. Витаферин-A экстрагировали простым методом осаждения белков. Градуировочная кривая была линейной в диапазоне концентраций 0,05–1,6 мг / мл. Этот метод имеет желаемую чувствительность для определения диапазона концентраций витаферина-А в плазме, который может проявлять биологическую активность на основании данных in vitro. Пациенты наблюдались каждые 3 месяца. При каждом посещении проводилась оценка безопасности, включая клиническое обследование, подробный анамнез нежелательных явлений, функциональные тесты печени, функциональные тесты почек и общий анализ крови.WA вводили ежедневно до прогрессирования. CTCAE версии 3.0 использовался для классификации нежелательных явлений.

Все пациенты (N 13), включенные в исследование, предоставили образцы для фармакокинетического анализа WA. Ни в одном из отобранных образцов не было обнаружено обнаруживаемых уровней витаферина-А.

3. Результаты. Тринадцать пациентов, удовлетворяющих критериям отбора, были включены в исследование с увеличением дозы. Обобщены исходные характеристики участников исследования (Таблица 1). Блок-схема, изображающая процедуру включения и распределения пациентов, которой следовали в этом исследовании, а также количество пациентов, начинающих терапию при каждой дозе, показана на рис.3.

4. Обсуждение W. somnifera (WS) изучалась для лечения нескольких состояний. В одном исследовании субъекты со снижением когнитивных способностей были рандомизированы для приема либо WS 300 мг перорально два раза в день, либо плацебо в течение 8 недель. Исследование показало, что WS был эффективен в улучшении

зарегистрированных N = 13 последующих наблюдений N = 1 потерянных для наблюдения в когорте №. 3 до 30 дня, следовательно, заменено

Когорта 1 (2 капсулы два раза в день или 72 мг WA / день) (N = 3) Когорта 2 (3 капсулы BID или 108 мг WA / день) (N = 3) Когорта 3 (4 капсулы BID или 144 мг WA / день) (N = 4) Когорта 4 (4 капсулы 3 раза в день или 216 мг WA / день) (N = 3)

Оценка

N = 13 для PK N = 12 для безопасности

Рис.3. Блок-схема, отображающая регистрацию, распределение, наблюдение и оценку пациентов. WA Withaferin-A, PK ¼ Фармакокинетика.

Цитируйте эту статью как: Пирес Н. и др., Безопасность и фармакокинетика витаферина-А при поздней стадии остеосаркомы высокой степени: испытание фазы I, J Ayurveda Integr Med, https://doi.org/10.1016/j. jaim.2018.12.008

4

N. Pires et al. / Journal of Ayurveda and Integrative Medicine xxx (xxxx) xxx

Таблица 2 Показана частота нежелательных явлений в разных когортах.Неблагоприятное событие

72 мг (n 3)

108 мг (n 3)

144 мг (n 4)

216 мг (n 3)

Всего (n 13)

Количество неблагоприятные аномальные LFT Усталость Лихорадка Сыпь Диарея Отек DLT

события 1 1 eeeee

2 e 1 1 eee

eee 1 1 ee

2 eeee 1 e

5 1 1 2 1 1 e

AE- Неблагоприятное событие DLT — ограничивающая дозу токсичность, LFT — тесты функции печени.

немедленная и общая память у пациентов с умеренными когнитивными нарушениями, а также улучшение управляющих функций, внимания и скорости обработки информации [19].Другое исследование показало, что лечение экстрактом корня Ашваганды у взрослых с хроническим стрессом помогло контролировать массу тела и привело к значительному снижению массы тела, уровня кортизола в сыворотке и индекса массы тела (ИМТ) [20]. WA, компонент Ашваганды, был изучен на предмет его противораковой активности на многих доклинических моделях in vitro, а также на доклинических моделях in vivo. Однако на сегодняшний день клинических исследований WA при раке не проводилось. При запущенной остеосаркоме варианты лечения ограничены, а фитохимические препараты продемонстрировали полезную противоопухолевую активность в прошлом.Фитохимический WA — многообещающий противораковый агент. На молекулярном уровне было показано, что он нацелен на множество киназных путей выживания клеток, включая NF-kB, киназу PI3, протеинкиназу, протеинкиназу, активированную митогеном, среди других. Сообщалось, что WA индуцирует апоптоз через внутренние и внешние пути в человеческих раковых клетках простаты, груди и лейкемии среди других. Он также продемонстрировал свою способность вносить свой вклад в противоопухолевый эффект как in vitro, так и in vivo [21]. Доклинические исследования с использованием ортотропных моделей на мышах продемонстрировали, что пероральное введение витаферина-A эффективно против мультиформной глиобластомы (GBM), агрессивного злокачественного новообразования [22].Он также показал способность индуцировать апоптоз в клеточных линиях остеосаркомы U2OS путем генерации ROS, что также вызывает остановку клеточного цикла в клеточных линиях остеосаркомы за счет ингибирования белков контрольных точек G2 / M [13,14]. В этом исследовании нашей целью было оценить безопасность и фармакокинетику WA на запущенной стадии остеосаркомы высокой степени. Результаты показали, что препарат хорошо переносился пациентами до дозы 4800 мг, что эквивалентно 216 мг WA в день, без какой-либо токсичности, ограничивающей дозу.Это была самая высокая доза, которую можно было вводить при разумной переносимости и соблюдении пациентом режима лечения, поскольку пациенты в группе с самой высокой дозой (216 мг) получали 4 капсулы WA 3 раза в сутки. Никаких DLT не наблюдалось даже при самой высокой дозе, что указывает на то, что пациентам можно попробовать более высокие дозы, но общая доза ограничена количеством капсул, которые пациент может разумно потреблять в день. Стандартизованный экстракт с более высоким содержанием WA может обойти эту проблему, что приведет к введению более высоких доз в день при приемлемом количестве капсул и частоте приема.Общие наблюдаемые побочные эффекты включают повышение уровня ферментов печени (степень 1) у 5 из 11 пациентов и кожную сыпь у 2 из 11 пациентов. Другие наблюдаемые побочные эффекты включают жар, усталость, отек и диарею (по одному событию). Побочных эффектов 3 или 4 степени не наблюдалось. WA не был обнаружен ни в одной из исследуемых выборок. Используемый метод представлял собой анализ ВЭЖХ с чувствительностью 50 нг / мл. На момент исследования была доступна только система ВЭЖХ, способная определять 50 нг / мл. Биодоступность витанолидов зависит от степени их абсорбции и транспортировки через эпителий кишечника.Исследование, проведенное для оценки биодоступности витанолидов с использованием модели абсорбции in vitro, то есть системы почек Mandin Darby Canine, обнаружило, что WA непроницаема или метаболизируется при прохождении через клеточный слой [23]. Однако другое исследование, в котором пытались проанализировать PK WA и витанолида A (WEA) в плазме мышей после перорального приема, показало, что пероральное всасывание витанолидов было быстрым. Он также продемонстрировал, что относительная биодоступность WA была в полтора раза больше, чем WEA.В исследовании использовался анализ HPLC-ESI-MS / MS, чувствительность которого составила 0,484 нг / мл [24], что позволяет предположить, что для характеристики PK WA у людей требуются более чувствительные аналитические методы. Мы не смогли установить биодоступность WA по указанным выше причинам. IC50 WA находится на субмикромолярном уровне, что соответствует концентрации приблизительно 470 нг / мл. Однако вряд ли WA будет использоваться как отдельный агент. Лучше всего использовать WA в сочетании со стандартной химиотерапией.Синергетические эффекты витаферина А были продемонстрированы в исследовании, в котором WA в сочетании с цисплатином действовал синергетически и, как было обнаружено, усиливал противоопухолевые эффекты на клеточные линии яичников, подавляя пролиферацию клеток, генерацию ROS и вызывая повреждение ДНК, ведущее к апоптозу [25]. . Другое исследование показывает потенциал WA в качестве радиосенсибилизатора. Исследование проводилось на опухоли меланомы мыши, которую предварительно лечили WA с последующим местным гамма-излучением. WA вызывает дозозависимое увеличение задержки роста и времени удвоения объема [26].Фактор транскрипции NFkB, который регулирует воспаление, выживаемость клеток и экспрессию P-гликопротеина, играет важную роль в индукции устойчивости к противораковым препаратам [27]. Наблюдается, что WA ингибирует NFkB в резистентных к доксорубицину клетках K562 / Adr и может ослаблять активацию ослабленных каспаз и вызывать апоптоз [27]. Это делает WA привлекательным соединением для хемосенсибилизации и для индукции гибели клеток в химиорезистентных типах клеток. Таким образом, WA может взаимодействовать с другими противоопухолевыми средствами, а его активность, модулирующая Р-гликопротеин, может быть использована для улучшения пероральной биодоступности и внутриопухолевых концентраций совместно вводимых противоопухолевых препаратов [27].Необходимы дальнейшие клинические исследования WA в качестве дополнения к химиотерапии при остеосаркоме. Есть также предварительные данные, касающиеся активности WA при раке желудка, щитовидной железы и яичников. Здесь снова можно оценить полезность WA в качестве дополнительного лечения к стандартным модальностям. Другие преимущества WA, включая иммуномодулирующие эффекты, предполагают, что он может смягчать / защищать от токсичности и побочных эффектов химиотерапии. Будучи экономичным, а также природным фитохимическим веществом, разработка улучшенной рецептуры витхаферина-А может оказаться привлекательным вариантом противоопухолевого лечения как в развитых, так и в развивающихся странах.4.1. Ограничение Одним из ограничений этого исследования является то, что максимальная переносимая доза (МПД) не была достигнута. Максимальная доза, использованная в этом исследовании, составляла 216 мг, что, вероятно, является заниженной оценкой возможной MTD. Могут быть введены более высокие дозы. WA имеет улучшенный состав более высокой силы, который позволяет упростить режим дозирования и уменьшить частоту введения. Биоаналитический метод, использованный в этом исследовании, имел чувствительность 50 нг / мл. Чувствительность и конкретность аналитического метода были ограничением нашего исследования.В последующих исследованиях рекомендуются биоаналитические методы с более высокой чувствительностью. 5. Заключение Наше исследование фазы I показало, что пероральный витаферин-А у пациентов с запущенной стадией остеосаркомы высокой степени имеет хороший профиль безопасности.

Цитируйте эту статью как: Пирес Н. и др., Безопасность и фармакокинетика витаферина-А при поздней стадии остеосаркомы высокой степени: испытание фазы I, J Ayurveda Integr Med, https://doi.org/10.1016/j. jaim.2018.12.008

N. Pires et al. / Журнал аюрведы и интегративной медицины xxx (xxxx) xxx

Дальнейшие исследования фазы II WA можно проводить в дозе 216 мг / день.

[11]

Конфликт интересов Нет. Финансирование Исследование финансировалось через внутренний грант Мемориального центра Тата, Индия (номер гранта: 381/07).

[12]

[13]

[14]

Благодарности [15]

Авторы выражают признательность за финансовую поддержку внутреннему гранту Мемориального центра Тата за проведение этого исследования. Ссылки [1] Дар Н.Дж., Хамид А., Ахмад М. Фармакологический обзор Withania somnifera, индийского женьшеня. Cell Mol Life Sci 2015; 72: 4445e60.https://doi.org/ 10.1007 / s00018-015-2012-1. [2] Сингх Д., Аггарвал А., Маурья Р., Наик С. Withania somnifera ингибирует факторы транскрипции NF-kB и AP-1 в периферической крови человека и мононуклеарных клетках синовиальной жидкости. Phyther Res 2007; 21: 905e13. https://doi.org/10.1002/ ptr.2180. [3] Сентил В., Рамадеви С., Венкатакришнан В., Гиридхаран П., Лакшми Б.С., Вишвакарма Р.А. и др. Витанолид вызывает апоптоз в лейкозных клетках HL-60 через митохондриально-опосредованное высвобождение цитохрома с и активацию каспазы. Chem Biol Interact 2007; 167: 19e30.https://doi.org/10.1016/ j.cbi.2007.01.004. [4] Малик Ф., Сингх Дж., Кхаджурия А., Сури К.А., Сатти Н.К., Сингх С. и др. Стандартизированный экстракт корня Withania somnifera и его основной компонент витанолид-A вызывают гуморальные и клеточно-опосредованные иммунные ответы за счет усиления регуляции Th2-доминантной поляризации у мышей BALB / c. Life Sci 2007; 80: 1525e38. https: // doi.org/10.1016/j.lfs.2007.01.029. [5] Сингх Д. Подавление экспрессии p34cdc2 водной фракцией из-за возможного молекулярного механизма противоопухолевого и других фармакологических эффектов.Фитомедицина 2001; 8: 492e4. https://doi.org/10.1078/S09447113(04)70072-0. [6] Каур К., Рани Дж., Видодо Н., Нагпал А., Тайра К., Каул С. К. и др. Оценка антипролиферативной и антиоксидантной активности экстракта листьев in vivo и in vitro, выращенных ашвагандхой. Food Chem Toxicol 2004; 42: 2015e20. https: // doi.org/10.1016/j.fct.2004.07.015. [7] Видодо Н., Каур К., Шреста Б.Г., Такаги Й., Исии Т., Вадхва Р. и др. Селективное уничтожение раковых клеток экстрактом листьев ашваганды: идентификация фактора, ингибирующего опухоль, и первые молекулярные исследования его эффекта.Clin Cancer Res 2007; 13: 2298e306. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-060948. [8] Шохат Б., Шалтиэль А., Бен-Бассат М., Джошуа Х. Влияние витаферина А, природного стероидного лактона, на тонкую структуру опухолевых клеток S-180. Cancer Lett 1976; 2: 71e7. https://doi.org/10.1016/S0304-3835(76)80014-6. [9] Деви ПУ. Withania somnifera Dunal (Ашваганда): потенциальный растительный источник многообещающего лекарства для химиотерапии рака и радиосенсибилизации. Индийский журнал J Exp Biol 1996; 34: 927e32. [10] Гамбхир Л., Чекер Р., Шарма Д., Тхох М., Патил А., Дегани М. и др.Тиол-зависимое подавление NF-kB и ингибирование адаптивных иммунных ответов, опосредованных Т-клетками, с помощью природного стероидного лактона витхаферина А.

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

[26] [27]

5

Toxicol Appl Pharmacol 2015; 289: 297e312. https://doi.org/10.1016/ j.taap.2015.09.014. Малик Ф., Кумар А., Бхушан С., Хан С., Бхатиа А., Сури К.А. и др.Генерация активных форм кислорода и митохондриальная дисфункция при апоптотической гибели клеток HL-60 миелоидной лейкемии человека диетическим соединением с гаферином А с сопутствующей защитой N-ацетилцистеином. Апоптоз 2007; 12: 2115e33. https://doi.org/10.1007/s10495-007-0129-x. Сарк Вел Шич К., Деклерк К., Кранс РАДЖ, Дидденс Дж., Шерф Д. Б., Герхаузер К. и др. Эпигенетическое подавление тройных отрицательных признаков рака молочной железы, Витхаферин А. Oncotarget, 2017; 8: 40434e53. https://doi.org/10.18632 / oncotarget.17107. Lv T-Z, Wang G-S. Потенциал антипролиферации витаферина А на клетках остеосаркомы человека посредством ингибирования белков контрольной точки G2 / M. Exp Ther Med 2015; 10: 323e9. https://doi.org/10.3892/etm.2015.2480. Li A-X, Sun M, Li X. Витаферин-A индуцирует апоптоз в клеточной линии остеосаркомы U2OS посредством генерации ROS и нарушения потенциала митохондриальной мембраны. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2017; 21: 1368e74. http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/28387888. по состоянию на 11 июля 2017 г. Palliyaguru DL, Singh SV, Kensler TW.Withania somnifera: от профилактики к лечению рака. Mol Nutr Food Res 2016; 60: 1342e53. https://doi.org/ 10.1002 / mnfr.201500756. Хансен А., Грэм Д., Понд Дж., Сиу Л. Дизайн испытания фазы I: является ли 3þ3 лучшим? Cancer Contr 2014; 21: 200e8. https://doi.org/10.1177/107327481402 100304. Патель С., Рао Н., Хингорани Л. Оценка безопасности экстракта Withania somnifera, стандартизированного для Withaferin A: исследование острой и подострой токсичности. J Ayurveda Integr Med 2016: 30e7. https://doi.org/10.1016/j.jaim.2015.08.001. Патиал П., Гота В. Быстрый и чувствительный метод определения витаферина-А в плазме человека с помощью ВЭЖХ. Биоанализ 2011; 3: 285e9. https://doi.org/ 10.4155 / bio.10.207. Чоудхари Д., Бхаттачарья С., Бозе С. Эффективность и безопасность экстракта корня ашваганды (Withania somnifera (L.) Dunal) для улучшения памяти и когнитивных функций. J Diet Suppl 2017; 14: 599e612. https://doi.org/10.1080/ 193.2017.1284970. Чоудхари Д., Бхаттачарья С., Джоши К. Управление массой тела у взрослых в условиях хронического стресса с помощью лечения экстрактом корня Ашваганды.Дж. Эвид на основе дополнительной альтернативной медицины 2017; 22: 96e106. https://doi.org/ 10.1177/2156587216641830. rez-Novo C, Van Ostade X, Vanden Berghe W. Molecular Chirumamilla CS, Pe анализ терапевтических эффектов диетического лекарственного фитохимического вещества Withaferin A. Proc Nutr Soc 2017; 76: 96e105. https://doi.org/10.1017/ S0029665116002937. Чанг Э., Полинг С., Натараджан А., Уитни Т.Х., Каур Дж., Сюй Л. и др. AshwaMAX и Withaferin A подавляют глиомы на клеточных и мышиных ортотопических моделях. Журнал Neurooncol 2016; 126: 253e64.https://doi.org/10.1007/s11060-015-1972-1. Devkar S, Kandhare A, Sloley B, Jagtap S, Lin J, Tam Y и др. Оценка биодоступности основных витанолидов Withania somnifera с использованием модельной системы абсорбции in vitro. J Adv Pharm Educ Res 2015; 6: 159e64. https: // doi.org/10.4103/2231-4040.165023. Патил Д., Гаутам М., Мишра С., Карупотула С., Гайрола С., Джадхав С. и др. Определение витаферина А и витанолида А в плазме мышей с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии: применение к фармакокинетике после перорального введения водного экстракта Withania somnifera.Дж. Фармацевтика Биомед Анал 2013; 80: 203e12. https://doi.org/ 10.1016 / j.jpba.2013.03.001. Какар СС, Джала В.Р., Фонг М.Ю. Синергетическое цитотоксическое действие цисплатина и витаферина А на клеточные линии рака яичников. Biochem Biophys Res Commun 2012; 423: 819e25. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.06.047. Деви ПУ, Камат Р., Рао Б.С. Радиосенсибилизация меланомы мыши витаферином А: исследования in vivo. Индийский журнал J Exp Biol 2000; 38: 432e7. Суттана В., Манхеткорн С., Поопимон В., Палагани А., Жохов С., Герло С. и др.Дифференциальная хемосенсибилизация Р-гликопротеина, сверхэкспрессирующего клетки K562 / Adr, с помощью витаферина А и полифенолов сиамоза.