Векторы 8 класс контрольная работа: Контрольная работа по геометрии «Векторы» 8 класс скачать

также будут описаны в части книги «Визуализация данных». Они обеспечивают более краткое изложение, чем гистограммы, но их легче сочетать с другими коробчатыми диаграммами. 6 total_gun_murders <- убийств $ всего участок (население_в_миллионах, общее_пушечное_ убийство)

Имейте в виду, что во многих штатах население составляет менее 5 миллионов человек, и они являются скученными.Мы можем получить больше информации, сделав этот график в логарифмической шкале. Преобразуйте переменные, используя преобразование log10 , а затем постройте их.

2. Создайте гистограмму населения штата.

3. Создание диаграмм населения штата по регионам.

параллельных векторов - объяснение и примеры

Скалярное умножение дает параллельных векторов. Это векторы, которые:

«имеют одинаковое или противоположное направление и являются скалярными кратными друг другу.”

В этом разделе мы обсудим следующие важные аспекты параллельных векторов:

• Что такое параллельные векторы?
• Как определить, параллельны ли два вектора.

Что такое параллельные векторы?

Обычно два параллельных вектора являются скалярными, кратными друг другу. Предположим, что два вектора a и b, определены как:

b = c * a

Где c - некоторое скалярное действительное число.В приведенном выше уравнении вектор b выражается как скалярное кратное векторам a, , и два вектора называются параллельными. Знак скаляра c будет определять направление вектора b. Если значение c положительное, c> 0, оба вектора будут иметь одинаковое направление. Если значение c отрицательное, то есть c <0, вектор b будет указывать в направлении, противоположном вектору a.

Аналогично, из приведенного выше уравнения вектор a может быть выражен как:

a = 1 / c * b

Таким образом, ясно, что они должны быть скалярными кратными друг другу для любые два вектора должны быть параллельны.Рассмотрим случай, когда значение c равно нулю. Тогда мы можем написать:

b = 0 * a

b = 0

Вектор b становится нулевым вектором в этом случае, и нулевой вектор считается параллельным каждому вектору .

Как определить, параллельны ли два вектора

Чтобы определить, параллельны ли два вектора или нет, мы проверяем, могут ли данные векторы быть выражены как скалярные кратные друг другу.Например, два вектора U и V параллельны, если существует действительное число t, такое, что:

U = t * V

Это число t может быть положительным, отрицательным, или ноль.

Примеры

В этом разделе мы обсудим примеры, связанные с параллельными векторами и их пошаговые решения. Это поможет глубже понять параллельные векторы.

Пример 1

Автомобиль движется с вектором скорости V1 = 30 м / с на север, а другой автомобиль движется на север с вектором скорости V2 = 60 м / с.Определите, параллельны два вектора скорости или нет.

Решение

У нас есть следующая информация:

V1 = 30 м / с, север

V2 = 60 м / с, север

Чтобы определить, параллельны ли заданные векторы или нет, мы проверяем, могут ли они быть кратными друг другу или нет. Мы можем связать два вектора следующим образом:

V2 = 2 * (30 м / с)

V2 = 2 * V1

V2 = 2 * (30 м / с)

Или,

V1 = 1/2 * V1

V1 = 1/2 * (60 м / с)

V1 = 30 м / с.

Поскольку данные векторы могут быть связаны друг с другом скалярным множителем 2 или 1/2, мы можем заключить, что два вектора скорости V1 и V2, параллельны друг другу.

Пример 2

Учитывая два вектора, S1 = (2, 3) и S2 = (10, 15), определите, параллельны два вектора или нет. Затем определите величину двух векторов.

Решение

Данные векторы S1 и S2 выражены в виде столбцов.Чтобы определить, являются ли они параллельными, мы можем проверить, могут ли их соответствующие компоненты быть выражены как скалярные кратные друг другу или нет.

S2 = (5 * 2, 5 * 3)

S2 = 5 * (2, 3)

S2 = 5 * S1

Или,

S1 = 1 / 5 * S2

Из приведенных выше уравнений очевидно, что векторы S1 и S2 являются скалярными кратными друг другу, а коэффициент масштабирования равен 5 или 1/5.2

| S2 | = √100 + 225

| S2 | = √325

| S2 | = √25 * 13

| S2 | = 5 * √13

Величины двух векторов также связаны коэффициентами масштабирования.

Пример 3

Учитывая два вектора, P = (4, 6) и Q = (-2, -3), определите, параллельны два вектора или нет.

Решение

Данные векторы P и Q выражаются в виде столбцов.Чтобы определить, являются ли они параллельными, мы можем проверить, могут ли их соответствующие компоненты быть выражены как скалярные кратные друг другу или нет.

P = (4, 6)

Q = (-2, -3)

P = -2 (-2, -3)

P = -2 * Q

Поскольку вектор P в 2 раза больше вектора Q , два вектора параллельны друг другу, а направление вектора Q противоположно направлению вектора P .

Пример 4

Обратитесь к изображению, приведенному ниже, и определите параллельные векторы.

Решение

Все четыре вектора, показанные на изображении, параллельны друг другу, поскольку их можно выразить как скалярное кратное другим.

Чтобы убедиться в этом, выразите векторы в их столбцах следующим образом:

A = (10,10) , вектор B = (-10, -10), C = (-5, -5) и D = (5, 5)

Сначала мы проверяем, параллельны ли векторы A и B .

Ясно, что вектор B может быть выражен как:

B = (-10, -10)

B = -1 * (10,10)

Или

B = -1 * A

Таким образом, векторы A и B параллельны друг другу.

Затем мы проверяем векторы C и D как:

D = (5, 5)

C = -1 * (5,5)

C = -1 * D

Векторы C и D также являются скалярными кратными друг другу.

Аналогично проверяем связи между оставшимися векторами:

B = 2 * C

B = - 2 * D

C = - 2 * A

D = 2 * A

Таким образом, из приведенных выше уравнений и данного изображения ясно, что все четыре вектора, A , B , C, и D, параллельны друг другу.

Пример 5

Учитывая, что векторы A = (-4, 6) и B = (x, 12) являются параллельными векторами, определите значение x.

Решение

Поскольку векторы параллельны, мы знаем, что:

B = c * A

Где c - некоторое скалярное значение. Подстановка значений векторов дает нам:

(x, 12) = c * (-4, 6)

(x, 12) = (-4c, 6c)

Установив значения отдельных компонентов, равные каждому другое, мы получаем:

x = -4c

12 = 6c

Упрощение приведенных выше уравнений дает нам:

c = 2

Если мы поместим значение c в другое уравнение и упростим, мы получим:

x = -4 * 2

x = -8

Таким образом, вектор B становится:

B = (-8, 12).

Пример 6

Учитывая вектор m = 5i + 6j +3 в ортогональной системе, определите вектор, параллельный этому вектору, и укажите в противоположном направлении.

Решение

Давайте рассмотрим вектор n , который является вектором, параллельным данному вектору m. Вектор n может быть выражен как:

n = k * m

n = k * (5i + 6j +3)

Где k - скалярное кратное вектора m . Кроме того, k может быть положительным, отрицательным или нулевым. Поскольку было указано, что данный вектор должен указывать в направлении, противоположном направлению м , k не должно быть положительным. То есть k <0. Если k = -3 и мы получаем:

n = -3 * (5i + 6j +3)

n = ((-3 * 5i + (-3 * 6j ) + (-3 * 3))

n = -15i -18j -9

Результирующий вектор n параллелен данному вектору и противоположен по направлению, хотя существует бесконечно много векторов, которые удовлетворяют этому критерию .

1. Дан вектор M = 10 м, восток и второй вектор, 3 M, запад . Определите, параллельны два вектора или нет.
2. Для данного вектора N = 15 м северной широты, определите результирующий вектор, полученный умножением данного вектора на -4. Затем проверьте, параллельны ли два вектора друг другу или нет.
3. Пусть u = (-1, 4) и v = (n, 20) - два параллельных вектора.Определите значение n.
4. Пусть v = (3, 9). Найдите 1/3 v и проверьте, параллельны ли два вектора или нет.
5. Для вектора b = -3i + 2j +2 в ортогональной системе найдите параллельный вектор.
6. Пусть a = (1, 2), b = (2, 3) и c = (2,4). Определите, параллельны ли данные векторы друг другу или нет.

Ответы

1. 3 M = 30 м, и направление - запад.Ясно, что новый вектор параллелен вектору M , но его направление противоположно направлению вектора M .
2. -4 N = -60 м. Направление - юг. Два вектора действительно параллельны друг другу.
3. u = k * v , где k = 1/5 и n = -5, v = (-5, 20). Направление u и v остается прежним.
4. 1/3 v = (1, 3), | v | = 3 * √10, | 1/3 v | = √10.Направление вектора 1/3 v такое же, как направление вектора v, , и два вектора параллельны друг другу.
5. 5 b = -15i + 10j + 10 - один из бесконечного множества векторов, параллельных b .
6. Векторы a и c параллельны друг другу, но вектор b не параллелен ни одному из двух других.

т.функция тестирования - RDocumentation

Описание

Выполняет одно- и двухвыборочные t-тесты векторов данных.

Использование

 t.test (x,…) 
 # Метод S3 по умолчанию
t.test (x, y = NULL,
       альтернатива = c («двусторонний», «меньше», «больше»),
       mu = 0, пара = FALSE, var.equal = FALSE,
       conf.level = 0,95,…) 
 
 # Метод S3 для формулы
t.test (формула, данные, подмножество, na.action,…) 
 

Аргументы

x

(непустой) числовой вектор значений данных.

y

необязательный (непустой) числовой вектор значений данных.

альтернатива

символьная строка, определяющая альтернативу гипотеза, должно быть одним из "двусторонний" (по умолчанию), «больше» или «меньше» . Вы можете указать только начальные письмо.

mu

число, указывающее истинное значение среднего (или разница в средних значениях, если вы выполняете тест из двух выборок).

парный

логический указатель, хотите ли вы парный t-тест.

var.equal

логическая переменная, указывающая, следует ли обрабатывать две дисперсии как равные. Если ИСТИНА , то объединенный дисперсия используется для оценки дисперсии, в противном случае (или Satterthwaite) приближение к степеням свободы.

conf.level

доверительный уровень интервала.

формула

формула вида lhs ~ rhs где lhs - числовая переменная, задающая значения данных, а rhs - коэффициент с двумя уровнями, дающими соответствующие группы.

данные

дополнительная матрица или фрейм данных (или аналогичный: см. model.frame ), содержащий переменные в формула формула . По умолчанию переменные берутся из среда (формула) .

подмножество

необязательный вектор, определяющий подмножество наблюдений использоваться.

na.action

функция, которая указывает, что должно произойти, когда данные содержат NA с. По умолчанию getOption ("на.действие ") .

…

дополнительные аргументы, передаваемые в методы или из них.

Значение

Список с классом " htest ", содержащий следующие компоненты:

Подробности

Интерфейс формулы применим только для тестов с двумя выборками.

альтернатива = "больше" - альтернатива тому, что x имеет больше среднего, чем y .

Если парный равен ИСТИНА , то должны быть и x , и y . должны быть указаны, и они должны быть одинаковой длины. Отсутствующие значения тихо удаляется (попарно, если парный равен ИСТИНА ). Если var.equal равно TRUE , тогда объединенная оценка используется дисперсия. По умолчанию, если var.equal равно FALSE тогда дисперсия оценивается отдельно для обеих групп и Используется модификация Уэлча для степеней свободы.

Если входные данные фактически постоянны (по сравнению с большим из два означает) возникает ошибка.

См. Также

prop.test

Примеры

 # NOT RUN {
требуется (графика)

t.test (1:10, y = c (7:20)) # P = .00001855
t.test (1:10, y = c (7:20, 200)) # P = .1245 - больше НЕ имеет значения

## Классический пример: данные о сне студента
сюжет (дополнительная ~ группа, данные = сон)
## Традиционный интерфейс
с (сна, t.test (extra [group == 1], extra [group == 2]))
## Интерфейс формулы
т.тест (дополнительная ~ группа, данные = сон)
#}
 

Вакцины на основе некомпетентных к репликации вирусных векторов Ad26: стандартизованный шаблон с ключевыми соображениями для оценки риска / пользы

Аденовирусные векторы, неспособные к репликации, изучаются в качестве платформы для переноса различных трансгенов и их экспрессии в качестве основы для разработка вакцины. Неспособный к репликации аденовирусный вектор на основе аденовируса человека типа 26 (Ad26) был оценен в нескольких клинических испытаниях.

Для оценки безопасности и свойств рекомбинантных вирусных векторных вакцин была создана рабочая группа по безопасности вирусных векторных вакцин Брайтонского сотрудничества (V3SWG). В этой статье рассматриваются особенности векторов Ad26, включая табулирование характеристик безопасности и оценки риска вакцин на основе Ad26.

В векторе Ad26 делеция гена E1, делающая вектор неспособным к репликации, сочетается с дополнительной генной инженерией для производства вакцины и оптимизации экспрессии трансгена.Эти вакцины можно производить на клеточных линиях млекопитающих в больших масштабах, обеспечивая эффективную и гибкую систему для производства с высоким выходом. Векторные вакцины Ad26 обладают благоприятными профилями термостабильности, совместимыми с цепочками поставок вакцин.

Данные по безопасности собраны в базе данных по безопасности вакцин Ad26 версии 4.0, включая неослепленные данные 23 текущих и завершенных клинических исследований с участием 3912 участников в пяти различных программах вакцинации на основе Ad26. В целом вакцины на основе Ad26 хорошо переносятся без каких-либо серьезных проблем с безопасностью.Оценка вакцин на основе Ad26 продолжается, по состоянию на 4 сентября 2020 года вакцинировано> 114 000 участников.

Обширная оценка иммуногенности у людей показывает сильные, стойкие гуморальные и клеточные иммунные ответы. Клинические испытания не выявили влияния ранее существовавшего иммунитета к Ad26 на иммуногенность вакцины, даже при наличии титров нейтрализующих антител Ad26 или нацеленных на Ad26 ответов Т-клеток на исходном уровне.

Первая вакцина против вируса Эбола на основе Ad26 получила разрешение на продажу от ЕС 1 июля 2020 года в рамках Ad26.ЗЕБОВ, Схема вакцинации MVA-BN-Filo. В настоящее время разрабатываются новые разработки на основе векторов Ad26, в том числе вакцина против COVID-19, которая в настоящее время проходит 3 фазу клинической оценки.

Производство аденоассоциированных вирусных векторов для приложений in vitro и in vivo

Производство лентивирусных векторов класса CGMP

Bioprocess Int. Авторская рукопись; доступно в PMC 2012 13 июня.

Опубликован в окончательной редакции как:

Bioprocess Int. 2012 фев; 10 (2): 32–43.

PMCID: PMC3374843

NIHMSID: NIHMS377711

; 1-626-471-7201, факс 1-626-301-8175; мок.Оохай @ lebusual

Ключевые слова: Вирусные векторы, титр, культура клеток, масштабирование, одноразовые материалы, генная инженерия, фильтрация, выход

Лентивирусные векторы являются важными инструментами для переноса генов из-за их способности трансдуцировать ряд типов клеток без необходимости деления клеток-хозяев (1, 2). В результате исследователи используют их в качестве средств доставки генов в клинических приложениях (3–6). Хотя эти векторы регулярно используются во многих исследовательских лабораториях, крупномасштабное производство с использованием современных методов надлежащей производственной практики (CGMP) сопряжено с рядом проблем, которые необходимо учитывать, поскольку дополнительные клинические испытания с использованием лентивирусных векторов получают одобрение регулирующих органов (7).

Одним из важных соображений при разработке CGMP-совместимого процесса является необходимость иметь производственный протокол, который производит согласованный лентивирус для нескольких производств CGMP. Для трансфекции клеток лентивирусами обычно используются несколько методов: например, липофекция, электропорация и трансфекция фосфатом кальция. Выбранный метод должен постоянно производить вирус с высоким титром. Хотя несколько лабораторий создали стабильные линии упаковывающих клеток, содержащие определенные вирусные гены (8–13), разработка таких линий занимает много времени.Кроме того, использование стабильных линий не позволяет гибко изменять оболочечные и вспомогательные гены или легко изменять соотношение экспрессируемых вспомогательных генов.

Стремясь создать гибкий процесс получения лентивируса для ряда клинических протоколов, мы решили использовать систему из четырех плазмид. Используя самоинактивирующиеся (SIN) псевдотипированные лентивирусные векторы вируса везикуло-стоматита G (VSV-G) для генерации лентивирусных частиц (14), некомпетентные к репликации частицы получают путем котрансфекции трех вспомогательных плазмид, кодирующих отдельные функции упаковки, а также отдельной плазмиды для переноса. содержащий векторную основу.Плазмиды-помощники кодируют gag / pol и rev -чувствительный элемент ( pCgp ), белок rev ( pCMV-rev2 ) и гетерологичный белок оболочки VSV-G ( pCMV-G ) (15) .

Для получения лентивируса, пригодного для трансдукции ряда специфичных для пациента клеток в различных клинических испытаниях, необходимо оптимизировать условия для получения самых высоких титров вируса. Мы сосредоточились на максимальном увеличении титра и количества вируса, продуцируемого выше по потоку, при сохранении последовательного последующего процесса концентрирования и очистки.Хотя многие параметры, участвующие в лентивирусной трансфекции, оценивались другими специалистами в исследовательском масштабе с использованием Т-колб, мы разработали масштабируемый метод для эффективной трансфекции в многолитровом масштабе с использованием 10-слойных лотков Corning CellStack. Этот процесс позволяет производить большие количества лентивируса, необходимые для клинических испытаний 1-2 фазы (16).

Использование антибиотиков при производстве материалов для клинических испытаний на людях нежелательно. В результате многие клинические биопрепараты фильтруются на заключительном этапе производственного процесса.Однако мы и другие исследователи наблюдали, что стерильная фильтрация лентивируса (размер пор 0,2 мкм) снижает титр вируса (17). Таким образом, мы предпочли не использовать этот метод стерилизации в нашем процессе. В результате было необходимо принять все меры для обеспечения стерильности продукта на всех этапах производственного процесса. Чтобы решить эти проблемы, связанные с поддержанием стерильности лентивирусного продукта, а также с безопасностью производственного персонала, мы разработали полузамкнутый производственный процесс, который содержит вирус во время первичного производства.

Наша полузамкнутая система может использоваться как часть модульного производственного процесса, включающего субпартии лентивирусного супернатанта. Эта система с несколькими субпартийными партиями особенно полезна при решении проблем безопасности, связанных с производством больших объемов лентивирусного материала (100 л), поскольку позволяет объединять несколько субпартий по 10 л, приготовленных в течение нескольких недель. Тем не менее, крайне важно продемонстрировать стабильную вирусную продукцию в этих субпакетах. Оптимизируя исходные параметры, мы разработали процесс, который позволяет масштабировать безопасную, стерильную и воспроизводимую систему для получения лентивируса клинического уровня.В результате нашего производственного процесса было произведено несколько партий лентивирусов, которые использовались или в настоящее время используются в испытаниях генной терапии ex vivo.

Материалы и методы

Плазмиды

Для трансфекции клеток HEK 293T мы использовали три лентивирусные вспомогательные плазмиды (любезно предоставленные JK Yee), полученные в условиях CGMP в Центре биомедицины и генетики. Для каждой плазмиды был создан банк бактериальных клеток-хозяев (bMCB) и исследован высвобождение (включая секвенирование плазмидной ДНК).Один флакон с bMCB использовали для получения посевной культуры для инокуляции либо волнового биореактора (GE Healthcare), либо биореактора Bioflo 3000 (New Brunswick Scientific).

Собранные бактерии лизировали модифицированным методом щелочного лизиса (18). Мы осветлили лизат с помощью центрифугирования и глубинной фильтрации, а затем подвергли его ультрафильтрации в 10-15 раз с использованием картриджа с полыми волокнами (GE Healthcare) с отсечкой номинальной молекулярной массы 30 кДа (NMWC). Мы сконцентрировали полученный супернатант и пропустили его через слой диатомитовой земли Celite класса USP от Celpure (Sigma Aldrich) для снижения содержания эндотоксина.

Мы отделили пДНК от бактериальной РНК и других примесей с помощью эксклюзионной колоночной хроматографии со смолой Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) в присутствии 2M сульфата аммония (JT Baker). После сбора первого пика, содержащего пДНК, мы пропустили его через второй слой целита для дальнейшего снижения эндотоксина. Материал, очищенный на колонке, подвергали ультрафильтрации и диафильтрации в буфере Tris-EDTA (Fisher Scientific), получая очищенную объемную пДНК.

Главный банк клеток HEK 293T и культура клеток 293T

Клетки 293T, которые мы использовали для производства лентивирусных векторов, размножаются из основного банка клеток (MCB), созданного в нашем центре.Этот банк был полностью протестирован в соответствии с рекомендациями FDA по выпуску банков клеток и продуктов (19). Клетки росли в культуре при ~ 2 × 10 ⁴ клеток / см ² в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 4,5 г / л глюкозы, 1% пирувата натрия и 1% глутамина (Biowhittaker) с добавлением 10% гиклона. фетальная бычья сыворотка (FBS) (Thermo Fisher). Мы использовали инкубатор 37 ° C с 5% CO ₂ .

Каждые три-четыре дня мы трипсинизировали и подсчитывали клетки перед пересевом их при 2 × 10 ⁴ клеток / см ² .После удаления среды из колб для культивирования клеток мы промыли их фосфатно-солевым буфером (PBS) от Mediatech, а затем удалили его как отходы. Трипсин (Irvine Scientific) разбавляли 1:10 в PBS до конечной концентрации 0,05% и затем добавляли во флаконы для клеточных культур, которые возвращали в инкубатор при 37 ° C на 3-15 минут. После удаления клеток мы собрали клеточную суспензию и инактивировали трипсин, добавив среду 293Т (примерно равные объемы клеточной суспензии и среды), затем собрали клетки с помощью центрифугирования.Эти клетки увеличивали до тех пор, пока у нас не было достаточного количества для трансфекции.

Лентивирусная трансфекция для исследований по оптимизации процесса

Для экспериментов по оптимизации условий культивирования клеток мы высевали клетки 293T в сосуд подходящего размера при 0,5–1,5 × 10 ⁵ клеток / см % FBS, 1% пирувата натрия и 1% глутамина). Два дня спустя мы трансфицировали эти клетки четырьмя лентивирусными плазмидами: плазмидой pCgp , содержащей ген gag / pol , плазмидой pCMV-Rev 2 , содержащей ген rev, и плазмидой pCMV-G , содержащей ген VSV-G ген - все под контролем промоторов цитомегаловируса (CMV) - и плазмида-переносчик ( HIV-CMV-EGFP ) в соотношении 20: 13: 5: 20 соответственно с 0.8 мкг ДНК / см ² .

Чтобы приготовить около литра смеси для трансфекции (для трансфекции 10-слойной лотковой системы), мы смешали ДНК из трех вспомогательных плазмид и плазмиды для переноса с буфером ТЕ при pH 7,9 (~ 50 мл). Мы добавили 2 M CaCl ₂ (7 мл) от Fluka (Sigma) и 2 × HEPES-буферный солевой раствор (HBS) при pH 7,2 (58 мл) в последовательном порядке перед смешиванием (HEPES от Roche; NaCl и Na ₂ ). HPO ₄ от Sigma). Эти объемы были уменьшены для экспериментов меньшего масштаба.Сразу после этого мы удалили среду из каждого сосуда и заменили ее смесью ДНК в среде для выращивания с 1 л 2% FBS. Клетки возвращали в инкубатор при 37 ° C с 5% CO ₂ . Через три-пять часов мы удалили раствор для трансфекции и добавили свежую 2% FBS-среду с 6 мкМ бутирата натрия от Fluka (Sigma) в лотки Cell Factory. Примерно через 72 часа после трансфекции собирали неочищенный вирусный супернатант.

Производство лентивирусов CGMP с использованием «полузамкнутой» системы коллектора

Клетки HEK 293T размножаются в культуре и трансфицируются в субпартии по 10 10-слойных лотков Corning CELLbind CellStack каждая.В частности, мы размораживаем флакон с клетками 293T и помещаем их в колбу Nunc T-75. Эти клетки пассируют каждые три-четыре дня во флаконы Nunc T-500, а затем переносят в 10-слойные лотки Nunc Cell Factory по мере продолжения размножения. Мы расширяем клетки до тех пор, пока не будет получено достаточное количество лотков, необходимых для производства предполагаемого вектора, и сосудов, необходимых для обслуживания клеточного поезда.

Ячейки 293T помещены в каждый 10-слойный лоток с плотностью 1,0 × 10 ⁵ ячеек / см ² .Через два дня после посева клеток 293T мы трансфицировали клетки четырьмя лентивирусными плазмидами, используя кальций-фосфатный метод. Мы часто изменяем соотношение ДНК вспомогательной плазмиды для каждой плазмиды переноса, чтобы оптимизировать титр для отдельного продукта, хотя мы обнаружили, что соотношение 20: 6,3: 3,2: 20 ( pCgp: pCMV-Rev2: pCMV-G: перенос плазмиды) в целом работает хорошо. ДНК для переноса, которая является специфической для каждого производимого продукта, сначала смешивается с буфером ТЕ при pH 7,9. Затем 2М CaCl и 2 × HBS (pH 7.2) добавляют в последовательном порядке (0,018 мл / см ² ), и раствор хорошо перемешивают. Мы удаляем существующую среду из лотков перед добавлением смеси для трансфекции к клеткам 293T, используя первый из трех коллекторов, которые позволяют удалять или добавлять реагенты как часть нашей полузамкнутой системы.

Коллекторы соединяют лотки CellStack с мешками, содержащими среду и реагенты, а также мешками для отходов. Камеры для культивирования инкубируют в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение трех-пяти часов.Среду для трансфекции удаляют в конце этой инкубации и заменяют ростовой средой с сывороткой (2%) и 6 мкМ бутирата натрия, используя второй коллектор. Затем камеры возвращаются в инкубатор. На 3-й день после трансфекции мы собираем супернатант, содержащий секретированные лентивирусные векторы, с использованием третьего коллектора.

Непосредственно после сбора неочищенный супернатант культуры сначала очищают глубинной фильтрацией с использованием либо капсульного фильтра 0,45 мкм (Sartorius), либо капсульного фильтра 0,5 мкм (Millipore) с площадью поверхности 3000 см ² .Мы добавляем нуклеазу бензоназы в концентрации 50 Ед / мл в присутствии 2 мМ Mg в течение шести часов при 37 ° C. Осветленный вирусный супернатант, обработанный бензоназой, подвергают ультрафильтрации от 10 до 2 л с использованием картриджа из полых волокон с NMWC 500 кДа (GE Healthcare). Вирусный супернатант дополнительно подвергается ультрафильтрации (UF) до ~ 500 мл при одновременной диафильтрации (DF) с 8 л охлажденного буфера DF (4 г / 100 мл лактозы от JT Baker в DPBS от MediaTech). Поддерживая объем ~ 500 мл, мы диафильтруем вирусный супернатант с дополнительными 2 л буфера DF.После УФ / ДФ суспензию вируса центрифугируют в течение 16–20 часов при 6 000 г . Полученный вирусный осадок ресуспендируют и затем центрифугируют при 1000 об / мин в течение одной-двух минут для осаждения и удаления нерастворимого материала. Затем мы собираем супернатант и держим концентрированный вирусный векторный материал при -80 ° C до объединения всех субпартий.

Transduction Unit Titer Assay

Для эффективного и точного определения вирусного титра мы использовали лентивирусный вектор, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) в наших исследованиях по оптимизации.Каждый лентивирусный образец титровали путем трансдукции клеток HT-1080, и экспрессию GFP измеряли с помощью анализа сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) для определения титра вируса.

Вкратце, 5 × 10 ⁴ клеток HT-1080 (из ATCC) высевали в каждую лунку 12-луночного планшета, используя стандартную питательную среду (DMEM с добавлением 10% FBS) и инкубировали в течение ~ 24 часов в инкубатор для тканевых культур при 37 ° C с 5% CO ₂ . Подсчитывали количество клеток в одной лунке, чтобы приблизительно определить количество клеток, трансдуцированных в каждой лунке.Клетки трансдуцировали различными количествами тестируемых образцов в присутствии 4 мкг / мл полибрена (Sigma). Ранее титрованный вирусный образец лентивируса ВИЧ-CMV-EGFP служил стандартом для контроля вариаций анализа. Чтобы количественно определить количество клеток, трансдуцированных вектором, мы удалили клетки HT-1080 из их планшетов примерно через 48 часов после трансдукции и зафиксировали их 3,7% формальдегидом (Sigma). Мы дополнительно проанализировали эти фиксированные клетки с помощью проточного цитометра EPICS XL-MCL (Beckman Coulter) для обнаружения экспрессии GFP.Основываясь на следующей формуле, мы определили титры лентивирусов:

Титр (единиц трансдукции / мл) =% GFP-положительных клеток × количество трансдуцированных клеток ÷ объем (мл) образца, использованного для трансдукции.

Мы провели анализ титра p24 с использованием набора ELISA для ВИЧ-1 p24 от PerkinElmer (каталожный № NEK050). Вкратце, тестируемое изделие инкубируют в лунках микропланшета, покрытых высокоспецифичным мышиным моноклональным антителом к ​​p24 ВИЧ-1. Захваченный антиген образует комплекс с биотинилированным поликлональным антителом к ​​р24 ВИЧ-1, за которым следует конъюгат стрептавидин-HRP (пероксидаза хрена).Полученный комплекс обнаруживается после инкубации с орто-фенилендиамин-HCl (OPD), который дает желтый оттенок, который прямо пропорционален количеству захваченного p24 ВИЧ-1. Поглощение (490 нм) каждой лунки микропланшета определяют с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Мы рассчитали концентрацию p24 на основе стандартной кривой, построенной для стандартов p24 с известной концентрацией.

Анализ концевых меток для определения распределения размеров фрагментов ДНК

Мы радиоактивно пометили нуклеиновые кислоты (включая остаточную плазмидную ДНК, загрязняющую ДНК хозяина, РНК и любые другие свободные нуклеиновые кислоты), содержащиеся в нашем лентивирусном продукте, инкубируя его с альфа-32P -дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP) от MP Biomedicals и фрагмент ДНК-полимеразы Кленова от New England Biolabs при комнатной температуре в течение 30 минут.Невключенные нуклеотиды удаляли с помощью колонки для микроспин G-50 (GE Healthcare). Мы проанализировали меченые по концам фрагменты ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле и визуализировали их с помощью рентгеновской пленки. Мы оценили размер присутствующих фрагментов ДНК хозяина, сравнивая образцы с маркерами молекулярной массы ДНК, меченными концами, запускаемыми параллельно во время электрофореза.

Статистический анализ

Мы определили статистическую значимость, используя непарный, двусторонний критерий Стьюдента p со значением p со значением p <0.05 считается значительным.

Результаты

Сравнение клеток 293 и 293T

Нашим первым шагом в оптимизации предшествующего производственного процесса потребовалось определить линию клеток, продуцирующих лентивирус. Банки основных клеток HEK 293 и HEK 293T были созданы и протестированы на стерильность и микоплазму, а также панель дополнительных агентов в соответствии с руководящими принципами FDA (19). Обе линии ранее использовались для получения лентивирусных векторов с временной трансфекцией (20, 21).Мы сравнили их по их способности постоянно продуцировать лентивирус с высоким титром.

Клеточная линия 293 (родительская клеточная линия 293T) была разработана в 1977 году как трансформированная клеточная линия путем трансфекции первичных эмбриональных клеток почек человека срезанной ДНК аденовируса типа 5 (22). Ген, кодирующий Т-антиген SV40, позже был введен в клеточную линию 293 для создания клеточной линии 293Т (Stanford Line, SD-3515). Последние, как известно, экспрессируют гены E1A и E1B ранней области аденовируса и дополняют E1-удаленные, дефектные по репликации аденовирусные векторы.В дополнение к их способности поддерживать аденовирусные векторы, эти линии распознаются по благоприятным характеристикам культивирования тканей, трансфекции, экзогенной репликации ДНК, экспрессии генов и продукции белка.

Мы обнаружили, что титры лентивирусов, полученные от клеток 293T, были значительно лучше ( p <0,01), чем титры, полученные от клеток 293 (). Кроме того, мы обнаружили, что можем выращивать клетки 293T за несколько пассажей (~ 15 пассажей) без заметного воздействия на продуцируемые титры вирусов.В результате одну серию клеток 293T можно использовать для производства нескольких партий лентивируса в течение нескольких месяцев без необходимости постоянно размораживать новые флаконы с клетками. Это не всегда имело место в случае длительного культивирования линии клеток 293 с гораздо более вариабельными вирусными титрами, когда трансфецировались клетки с увеличивающимся числом пассажей (данные не показаны).

Оптимизация восходящего процесса производства лентивирусов: линии клеток HEK 293 или 293T высевали при концентрации 1,25 × 10 ⁵ клеток / см ² в 10-слойные лотки CellStack (a) или при 1 × 10 ⁵ клеток / см ² в колбах Т-75 (б – г).Двумя днями позже клетки трансфицировали тремя вспомогательными плазмидами ( pCgp, pCMV-Rev2, и pCMV-G ) и лентивирусной конструкцией, экспрессирующей EGFP в соотношении 20: 13: 5: 20 соответственно с 0,8 мкг ДНК / см ² . После трехчасовой инкубации реагенты для трансфекции удаляли и заменяли свежей средой, содержащей 2% сыворотки (a – d) или 0%, 2% или 10% сыворотки (b) с (a – d) или без (c ) бутират натрия. Сырой супернатант собирали через 72 часа (а – в) или через два, три или четыре дня (г).Для колб с супернатантом, удаленным на 2-й день, эквивалентный объем среды был добавлен обратно для инкубации до 3-го дня (день образца 2–3) (d). Супернатант от каждого образца использовали для трансдукции клеток HT-1080, а экспрессию GFP измеряли с помощью анализа FACS для оценки титра вируса. Панель а показывает среднее значение ± стандартное отклонение (SD) четырех экспериментов; панели b – d показывают среднее значение ± стандартное отклонение трех экспериментов.

Использование сыворотки во время трансфекции

В большинстве базовых исследовательских лабораторий клеточная линия 293T размножается в культуре в присутствии питательной среды с добавлением 10% сыворотки.При разработке производственного протокола, соответствующего CGMP, с минимальным количеством реагентов для животных в процессе трансфекции, мы хотели свести к минимуму примеси (например, сывороточные белки) на стадии трансфекции и производства вирусов. Таким образом, мы оценили эффекты добавления сыворотки с низким содержанием (2%) или без сыворотки (0%) во время трансфекции и продуцирования вируса. Мы полностью протестировали нашу сыворотку на наличие посторонних агентов и получили большое количество одной и той же партии для обеспечения надежного и последовательного процесса. Добавление 2% сыворотки во время трансфекции и продуцирования вируса было полезным для получения лентивируса с высоким титром ().Дополнительная сыворотка (10%) не давала более высоких титров. В результате мы используем 2% сыворотки во всех производственных циклах, чтобы оптимизировать выход вируса.

Использование бутирата натрия при продуцировании вирусов

Бутират натрия увеличивает производство вирусов во время трансфекции (23, 24), и мы определили его влияние на титр вируса. Клетки НЕК 293Т трансфицировали четырьмя лентивирусными плазмидами. Примерно через три часа после трансфекции клеточную среду удаляли и добавляли свежую среду (с 6 мкМ бутирата натрия или без нее).Добавление бутирата натрия примерно через три часа после плазмиды было полезным ( p <0,01) в производстве лентивируса с высоким титром ().

Время сбора

Используя параметры, определенные выше (добавление 2% сыворотки во время трансфекции и продуцирования вируса, и добавление бутирата натрия примерно через три часа после трансфекции), мы проверили оптимальное время для сбора лентивируса после трансфекции. Клетки HEK 293T трансфицировали лентивирусом (день 0) в Т-колбах, и вирусный супернатант собирали на день 2, день 3 или день 4.Собирая лентивирусный супернатант на 2-й день, заменяя собранную среду, а затем собирая лентивирусный супернатант, образовавшийся в течение последующих 24 часов (образец «2-3 дня»), мы также проверили, увеличивают ли несколько сборов одной и той же культуры количество лентивируса. Единичный сбор вирусного супернатанта на 3-й день давал наивысший средний титр лентивируса (). Кроме того, многократные повторные подачи и сборы между 48 и 96 часами после трансфекции, по-видимому, не привели к значительному увеличению общего выхода вируса ( p > 0.05). Таким образом, мы регулярно собираем вирус в один момент времени на третий день, что хорошо согласуется с нашей схемой производственного процесса. Клетки можно трансфицировать в пятницу, а затем собирать культуры в понедельник утром.

Масштабируемость процесса

Чтобы гарантировать, что оптимальные условия будут производить вирус с высоким титром при расширении нашего процесса, мы оценили влияние увеличения площади поверхности на титр вируса. Мы высевали клетки 293T в сосуды увеличивающегося размера: от колб Т-75 до больших Т-образных колб (Т-225), а затем в лотки либо в один слой (636 см, ² ), либо в 10 слоев (6360 см ² ). .Мы не обнаружили статистически значимой разницы в титрах, полученных для любого из протестированных сосудов (). В результате мы подтвердили, что 10-слойный лоток подходит для крупномасштабного расширения нашего производственного процесса из-за связанной с этим простоты использования.

Определение условий для крупномасштабного производства, как описано в тексте; панель а показывает среднее значение ± стандартное отклонение трех экспериментов. Данные «открытой системы» усредняются из двух блоков CellStack с указанием среднего значения ± диапазон; Данные «полузамкнутой системы» усредняются из семи блоков CellStack с указанным средним значением ± стандартное отклонение (b).

Система полузамкнутой трансфекции

Мы разработали закрытую систему, включающую три индивидуально разработанных коллектора, чтобы поддерживать стерильную среду для нашего продукта во время трансфекции и сбора неочищенного вирусного супернатанта. Коллекторы позволяют перекачивать среду и реагенты для трансфекции непосредственно в лотки, а вирусный урожай перекачивать непосредственно в пакеты для дальнейшей обработки. Мы сравнили титры вирусов, полученные с помощью такой системы, с титрами, полученными с открытой системой, включающей флаконы с аспиратором.Как видно, разница не была статистически значимой ( p > 0,1). Учитывая преимущества безопасности для производственного персонала и снижение риска заражения продукта, закрытая система в настоящее время регулярно используется в наших крупномасштабных кампаниях по производству лентивирусов.

Предварительное производство лентивирусов класса CGMP

Мы разработали процесс пилотного производства лентивируса с использованием окончательных оптимизированных условий. Как указано, клетки 293T размножаются в культуре и трансфицируются в подпартии по 10 10-слойных лотков в каждой.В частности, флакон с клетками 293Т размораживают и помещают в колбу Т-75. Их пересаживают каждые три-четыре дня в колбы Т-500, а затем переносят в 10-слойные лотки по мере продолжения размножения клеток. Клетки размножаются до тех пор, пока не будет получено достаточное количество для пластин 10-слойных лотков, необходимых для продуцирования намеченного вектора, а также для внесения количества сосудов, необходимых для поддержания последовательности клеток. Две подгруппы, содержащие до десяти 10-слойных лотков каждая, могут быть изготовлены за одну неделю (по 1 л вирусного супернатанта из каждой), что приводит к производству ~ 20 л лентивирусного супернатанта каждую неделю.обобщает репрезентативную клеточную экспансию, включающую несколько недель трансфекции и сбора вирусов.

Репрезентативный ряд клеток для производства лентивируса объемом 60 л; во время размножения клеток флакон с клетками 293Т размораживается, и эти клетки размножаются в сосудах для тканевых культур увеличивающегося размера до 10-слойных лотков. Когда продуцируется достаточное количество клеток для начала трансфекции, начинается фаза продуцирования вируса. Вирус продуцируется субпакетами по 10 10-слойных лотков, по две субпартии высевают каждую неделю (день 0).Клетки трансфицируют на 2-й день, а супернатант собирают на 5-й день.

Мы помещали клетки 293T на каждый лоток с плотностью 1,0 × 10 ⁵ клеток / см ² . Эта плотность находится в пределах диапазона (0,5–1,5 × 10 ⁵ клеток / см ² ), который мы определили для получения вируса с высоким титром (). Через два дня после посева клетки трансфицируют четырьмя лентивирусными плазмидами с использованием кальций-фосфатного метода (25). Количественное соотношение четырех плазмид (а также общее количество используемой ДНК) часто тестируется в ходе оценки для каждой переносимой плазмиды, чтобы оптимизировать титр для каждого отдельного продукта, но мы обнаружили, что это 20: 6.3: 3,2: 20 для pCgp: pCMV-Rev2: pCMV-G : переносимая плазмида с общим количеством 0,53 мкг / см ² обычно работает хорошо. Это соотношение плазмид основано на дальнейшей оптимизации ранее опубликованных соотношений (26) (данные не показаны).

Плотность посева клеток из двух флаконов основного банка клеток 293T (выделенных полосами разного цвета) для продуцирования вирусов, как описано в тексте; показано среднее ± стандартное отклонение трех экспериментов.

ДНК сначала смешивают с буфером ТЕ при pH 7.9. Мы добавляем 2M CaCl и 2 × HBS (pH 7,2) в последовательном порядке и хорошо перемешиваем раствор, чтобы обеспечить преципитацию ДНК. Существующая среда удаляется, и смесь для трансфекции добавляется с использованием первого из трех коллекторов (). Подносы инкубируют в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение трех-пяти часов. Среду для трансфекции удаляют в конце этого периода и заменяют ростовой средой с сывороткой (2%) и 6 мкМ бутирата натрия через второй коллектор (). Затем лотки возвращаются в инкубатор.На 3 день после трансфекции супернатант, содержащий секретированный лентивирусный вектор, собирают с помощью третьего коллектора (). Этот коллектор позволяет собирать стерильные образцы неочищенного лизата, а также клетки с конечной продукцией (EOP), необходимые для выпуска продукта QC. В конце каждой недели производства полученный неочищенный супернатант обрабатывают, как описано ниже.

Полузамкнутая система для трансфекции лентивирусного продукта GMP-класса; Системы Corning CellStack, пакеты для носителей, флаконы для трансфекции и другие компоненты являются частями коллектора, соединенными одноразовыми трубками и соединителями.После образования преципитатов ДНК существующие среды удаляют путем подключения 10-слойных лотков к коллектору для трансфекции (а). Среду для трансфекции удаляют после инкубации с помощью перистальтического насоса с использованием второго трубчатого коллектора (b). На 3 день после трансфекции супернатант, содержащий секретированные лентивирусные векторы, собирают с помощью третьего коллектора (с). Стерильные образцы неочищенного супернатанта и клеток собирают для анализов контроля качества.

Последующая обработка лентивируса CGMP-Grade

Непосредственно после сбора неочищенный супернатант культуры сначала очищается с использованием глубинной фильтрации с 0.Капсульный фильтр Sartoclean 45 мкм (Sartorius) или капсульный фильтр Opticap XL 0,5 мкм (Millipore). Для партии надосадочной жидкости объемом 10 л мы используем 3000 см ² площади поверхности для процесса фильтрации. Мы добавляем нуклеазу бензоназы к осветленному супернатанту в концентрации 50 Ед / мл в присутствии 2 мМ Mg в течение шести часов при 37 ° C. В этих условиях большинство остаточных нуклеиновых кислот (загрязняющая ДНК хозяина, остаточная плазмидная ДНК, РНК и свободные нуклеиновые кислоты) распадаются на фрагменты размером менее 500 п.н., как определено с помощью анализа радиоактивного мечения концов ().Эти загрязнения следует удалять на последующих этапах процесса.

Анализ размера остаточной ДНК хозяина, присутствующей в лентивирусном продукте CGMP, выполняемый, как описано в тексте

Осветленный и обработанный бензоназой вирусный супернатант ультрафильтровали от 10 л до 2 л с использованием картриджа с полыми волокнами NMWC 500 кДа от GE Healthcare . Вирусный супернатант дополнительно подвергается ультрафильтрации (UF) до ~ 500 мл при одновременной диафильтрации (DF) с 8 л охлажденного буфера DF (4 г / 100 мл лактозы от JT Baker в DPBS от MediaTech).Поддерживая объем ~ 500 мл, мы диафильтруем вирусный супернатант с дополнительными 2 л буфера DF. После УФ / ДФ суспензию вируса центрифугируют в течение 16–20 часов при 6 000 г . Полученный вирусный осадок восстанавливают в буфере DF и затем центрифугируют при 1000 об / мин в течение одной-двух минут для удаления нерастворимого материала.

Поскольку окончательная стерильная фильтрация не проводится, супернатант собирают и концентрированный вирусный векторный материал хранят при температуре –80 ° C, в то время как образцы из каждой подпартии проверяют на стерильность в процессе.После подтверждения стерильности каждой субпартии эти субпартии быстро размораживают при 37 ° C, а затем объединяют для аликвотирования во флаконы для завершения производства. Основываясь на нескольких экспериментах по разработке, общий выход лентивируса при последующем производстве составил ~ 31% ().

Общий выход лентивируса в процессе производства определяется, как описано в тексте.

Обсуждение

Поскольку лентивирусные векторы являются важными инструментами в генной терапии, их необходимо производить в больших масштабах для ранней фазы клинических испытаний.На сегодняшний день регулирующими органами одобрено не менее девяти протоколов клинических испытаний с использованием лентивирусных векторов (27). Данные о безопасности первых испытаний обнадеживают, поэтому мы можем ожидать, что количество одобренных протоколов будет продолжать расти. Мы решили сконцентрировать наши усилия на оптимизации процесса производства вирусов, чтобы разработать процедуру производства лентивирусных векторов, совместимых с CGMP, которые можно использовать для создания различных лентивирусных векторов. Чтобы определить наилучшие условия для масштабирования, мы оптимизировали несколько параметров, включая выбор линии клеток-продуцентов, плотности посева клеток и условий трансфекции.Затем мы определили процедуру масштабирования с использованием полузамкнутой системы для разработки производственного процесса, который может безопасно производить лентивирус в многопакетной системе в масштабе 100 л.

Мы сравнили клетки HEK 293 и 293T на предмет продуцирования лентивируса и обнаружили, что временная трансфекция клеток 293T постоянно приводит к образованию вируса с более высоким титром в течение многих пассажей. Уровень согласованности, наблюдаемый с этими клетками, важен для крупномасштабного производства лентивирусов, поскольку один и тот же флакон с клетками способен продуцировать вирус с высоким титром в течение нескольких месяцев в культуре, чтобы приспособиться к крупным производственным кампаниям.Когда несколько кампаний планируются последовательно, перекрывающиеся последовательности клеток могут поддерживаться, чтобы обеспечить постоянный запас клеток, необходимых для производства вируса.

Мы оптимизировали несколько других параметров нашего предшествующего производственного процесса: концентрацию сыворотки в среде для трансфекции и продуцирования вируса, добавление бутирата натрия во время продуцирования вируса и время сбора урожая. Интересно, что мы обнаружили, что изготовление реагентов для трансфекции собственными силами обеспечивает более последовательные и более высокие титры вирусных продуктов, чем покупка готовых реагентов из коммерческих источников, которые мы оценили (данные не показаны).Чтобы гарантировать стабильные результаты, наши реагенты проходят квалификацию перед использованием в производственной кампании. резюмирует наш полный производственный процесс.

В процессе производства лентивируса класса CGMP клетки трансфицируют в 10-слойных лотках. Неочищенный урожай очищают через фильтр 0,45 мкм, затем обрабатывают нуклеазой бензоназы перед тем, как подвергнуть ультрафильтрации и диафильтрации. Вирус осаждают с помощью высокоскоростного центрифугирования, а затем ресуспендируют в буфере для конечной композиции перед окончательным аликвотированием.

Используя этот процесс, мы произвели и протестировали как минимум шесть партий лентивируса класса CGMP для нескольких клинических испытаний фазы 1, по крайней мере одно из которых завершено (28). Эти объемы производства варьировались от 20 л до> 100 л (). Все наши вирусные продукты были полностью выпущены для испытаний генной терапии ex vivo и представляют собой образцы наших тестов на выпуск для одной клинической партии. Титры конечного продукта составляли от 5 × 10 ⁷ до 3 × 10 ⁸ TU / мл. Количество конечного продукта варьировалось от 10 мл до> 500 мл в зависимости от количества произведенных субпартий.

Таблица 1

Производство лентивируса CGMP с использованием систем для лотков

Таблица 2

клиническая партия

Другие недавно сообщили о способности производить крупномасштабный лентивирус с использованием многослойных лотковых систем (29– 31).Одним из преимуществ нашего процесса является возможность производить вирус в полузамкнутой системе с несколькими субпакетами, что позволяет производить> 100 л вирусного супернатанта. Полузакрытая система, разработанная для трансфекции и сбора вирусного супернатанта, обеспечивает безопасность нашего производственного персонала и стерильность продукта во время производства. Многоподпартийный процесс позволяет производить большие количества лентивируса, обеспечивая при этом безопасность нашего производственного персонала, ограничивая объем лентивируса, обрабатываемого за один раз, до 10 л.

Этот производственный процесс обеспечивает чрезвычайно стабильное вирусное производство среди субпартий данной продукции (). Это очень важно, потому что затраты на производство слишком велики, чтобы учесть значительный процент суб-партий с низким титром, которые могут снизить общий выход конечного продукта. Как видно на фиг.3, все подгруппы демонстрируют чрезвычайно стабильную продукцию вирусов (за исключением № 4 партии продукта CBG-0103.0, в которой возникла проблема на этапе концентрирования полых волокон).

Таблица 3

Воспроизводимость вирусных титров среди подгрупп

Гибкий этап конечной рецептуры позволяет формулировать отдельные продукты таким образом, чтобы они наилучшим образом соответствовали требованиям конкретного проекта, и позволяет непрерывно разрабатывать отдельные этапы процесса. Этот производственный процесс очень эффективен и может выполняться минимальным персоналом (два оператора для производства каждой партии). Он обеспечивает широкие возможности для масштабирования, необходимые для производства лентивируса CGMP-класса, и он успешно использовался в нескольких завершенных и продолжающихся фазах 1-2 клинических испытаний генной терапии ex-vivo.

Дополнительные материалы

Подписанное соглашение об авторских правах

Благодарности

Авторы благодарят Цзин-Куан Йи за предоставление вспомогательных плазмид, Минцзе Ли за многие начальные исследования и Робина Весселшмидта за помощь в редактировании этой рукописи. Наша работа была поддержана «Городом надежды» и грантом № P-30-CA033572 Национального института рака. Это исключительная ответственность авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института рака или Национальных институтов здравоохранения.

Сноски

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки