Лекарство от контрольной марина дружинина: Книга: «Лекарство от контрольной» — Марина Дружинина. Купить книгу, читать рецензии | ISBN 978-5-4471-4303-9

Манн, М. (2003). Протеомная характеристика центросомы человека по профилированию корреляции белков

. Nature 426, 570-574.

Ансьо, С. и Лейтц, А.(2002). Консервативный домен Mynd BS69 связывает

клеточных и онковирусных белков через общий мотив PXLXP. J. Biol. Chem.

277, 4906-4910.

Аша, Х., Надь, И., Ковач, Г., Стетсон, Д., Андо, И. и Дирольф, К. Р. (2003).

Анализ Ras-индуцированной гиперпролиферации в гемоцитах дрозофилы. Генетика

163, 203-215.

Барбоса В., Ямамото Р. Р., Хендерсон Д. С. и Гловер Д. М. (2000).

Мутация субъединицы кольцевого комплекса гамма-тубулина дрозофилы, кодируемая дисками

degenerate-4, дифференциально нарушает локализацию центросомного белка.Genes Dev.

14, 3126-3139.

Чен, К., Цянь, К. и Янь, К. (2005). Клонирование кДНК с доменом PDCD2 (C)

и их экспрессия при апоптозе клеток HEK293T. Мол. Клетка. Biochem.

280, 185-191.

Чу, С. К., Акдемир, Ф., Чен, П., Лу, В. Дж., Миллс, К., Дайш, Т., Кумар, С.,

Родригес, А. и Абрамс, Дж. М. (2004). Апикальный каспазный дрон управляет

запрограммированной и незапрограммированной гибелью клеток у дрозофилы. Dev. Cell 7, 897-907.

Чиу, Х. и Говинд, С. (2002). Естественное инфицирование D. melanogaster вирулентными паразитическими осами

вызывает апоптотическое истощение гемопоэтических предшественников. Cell

Death Differ. 9, 1379–1381.

Коломби, Н., Вероле, К., Сампайо, П., Мойзанд, А., Сункель, К., Бурбон, Х.

М., Райт, М. и Рейно-Мессина, Б. (2006) . Субъединица малого комплекса тубулина Dgrip84 Drosophila gamma-

необходима для структурной и функциональной целостности аппарата веретена.Мол. Биол. Cell 17, 272-282.

Дага А., Карлович К. А., Думстрей К. и Банерджи У. (1996). Формирование паттерна

клеток в глазу дрозофилы с помощью леденцов, которые имеют общие гомологичные домены с

AML1. Genes Dev. 10, 1194–1205.

Дебек А. и Монмори К. (1992). Циклин B связан с центросомами в

митотических клетках дрозофилы. Биол. Cell 75, 121-126.

Докси, С., Циммерман, В. и Микуле, К. (2005). Центросомный контроль клеточного цикла

.Trends Cell Biol. 15, 303-311.

Эванс, К. Дж., Хартенштейн, В. и Банерджи, У. (2003). Толще крови:

консервативных механизмов кроветворения у дрозофилы и позвоночных. Dev. Ячейка 5,

673-690.

Фан, К. В., Чан, К. К., Чао, К. К., Фан, Х. А., Шеу, Д. Л. и Чан, Е. С.

(2004). Паттерны экспрессии клеточного цикла и генов, связанных с апоптозом, в линии клеток карциномы толстой кишки человека с множественной лекарственной устойчивостью

. Сканд. J. Gastroenterol.39,

464-469.

Фудзивара Ю., Чанг А. Н., Уильямс А. М. и Оркин С. Х. (2004). Функциональное перекрытие

GATA-1 и GATA-2 в примитивном гемопоэтическом развитии. Кровь

103, 583-585.

Говинд, С. (1996). Сигнальный путь Rel и фенотип меланотической опухоли

Drosophila. Biochem. Soc. Пер. 24, 39-44.

Гросс, К. Т. и МакГиннис, В. (1996). DEAF-1, новый белок, который связывает существенную область

в деформированном ответном элементе.EMBO J. 15, 1961-1970.

Хартенштейн, В. (2006). Кровяные клетки и развитие клеток крови в царстве животных

. Анну. Rev. Cell Dev. Биол. 22, 677-712.

Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W. and Klapper, R. (2003). У

два источника гемоцитов у дрозофилы. Разработка 130, 4955-4962.

Хсу, Л. К. и Уайт, Р. Л. (1998). BRCA1 связан с центросомой

во время митоза. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 95, 12983-12988.

Хуанг Дж. И Рафф Дж. У. (1999). Исчезновение циклина B в конце митоза

пространственно регулируется в клетках дрозофилы. EMBO J. 18, 2184-2195.

Ибанез, В., Шарма, А., Буонамичи, С., Верма, А., Калаконда, С., Ван, Дж.,

Кадкол, С. и Саунтарараджах, Ю. (2004). AML1-ETO снижает взаимодействия ETO-2

(MTG16) с корепрессором ядерного рецептора, эффект, который ухудшает дифференцировку гранулоцитов

. Cancer Res. 64, 4547-4554.

Джекман, М., Линдон, К., Нигг, Э. А. и Пайнс, Дж. (2003). Активный циклин B1-Cdk1

сначала появляется на центросомах в профазе. Nat. Cell Biol. 5, 143–148.

Йенсик П. Дж., Хуггенвик Дж. И. и Коллард М. В. (2004). Идентификация

ядерных экспортных сигналов и доменов взаимодействия белков в деформированном эпидермальном

ауторегуляторном факторе-1 (DEAF-1). J. Biol. Chem. 279, 32692-32699.

Юнг, С. Х., Эванс, К. Дж., Уэмура, К. и Банерджи, У.(2005). Лимфатическая железа Drosophila

как модель развития кроветворения. Развитие 132,

2521-2533.

Кавагути, С., Чжэн, Ю. (2004). Характеристика центросомного белка CP309 Drosophila

, который имеет гомологию с кендрином и CG-NAP.

Мол. Биол. Cell 15, 37-45.

Каваками Т., Фурукава Ю., Судо К., Сайто Х., Таками С., Такахаши Е.

и Накамура Ю. (1995). Выделение и картирование гена человека (PDCD2)

, который высоко гомологичен Rp8, гену крысы, связанному с запрограммированной смертью клетки

.Cytogenet. Cell Genet. 71, 41-43.

Крамер, А., Майланд, Н., Лукас, К., Сильюасен, Р. Г., Уилкинсон, К. Дж., Нигг, Е.

А., Бартек, Дж. И Лукас, Дж. (2004). Связанный с центросомой Chk1 предотвращает

преждевременной активации киназы циклин-B-Cdk1. Nat. Cell Biol. 6, 884-891.

Krzemien, J., Dubois, L., Makki, R., Meister, M., Vincent, A. and Crozatier,

M. (2007). Контроль гомеостаза клеток крови у личинок дрозофилы с помощью заднего сигнального центра

.Nature 446, 325-328.

Куруц, Э., Зеттервалл, К. Дж., Синка, Р., Вильмос, П., Пиварчи, А., Экенгрен, С.

Хегедус, З., Андо, И. и Халтмарк, Д. (2003). Hemese, специфический для гемоцитов трансмембранный белок

, влияет на клеточный иммунный ответ у дрозофилы.

Proc. Natl. Акад. Sci. USA 100, 2622-2627.

Ланот Р., Захари Д., Холдер Ф. и Мейстер М. (2001). Постэмбриональный

гемопоэз у дрозофилы. Dev. Биол. 230, 243-257.

Лавин, М.Д. и Стрэнд М. Р. (2002). Гемоциты насекомых и их роль в иммунитете

. Насекомое Biochem. Мол. Биол. 32, 1295-1309.

Лебестки Т., Юнг С. Х. и Банерджи У. (2003). A Serrate-expressing signaling

center контролирует гематопоэз Drosophila. Genes Dev. 17, 348-353.

Луо, Х., Роуз, П. Э., Робертс, Т. М. и Дирольф, К. Р. (2002). Киназа Hopscotch Jak

требует, чтобы путь Raf способствовал активации клеток крови и дифференцировке

у Drosophila.Мол. Genet. Геномика 267, 57-63.

Lutterbach, B., Sun, D., Schuetz, J. and Hiebert, S. W. (1998). Мотив MYND

необходим для репрессии базовой транскрипции с промотора множественной лекарственной устойчивости

1 слитым белком t (8; 21). Мол. Клетка. Биол. 18, 3604-

3611.

Махаджан С.С. и Уилсон А.С. (2000). Мутации фактора 1 клетки-хозяина отделяют

его роль в пролиферации клеток от рекрутирования VP16 и LZIP. Мол. Клетка.Биол. 20,

919-928.

Мандал, Л., Банерджи, У. и Хартенштейн, В. (2004). Доказательства наличия у плодовой мухи

гемангиобласта и сходства между гемопоэзом лимфатических узлов у плодовой мухи

и мезодермы аорты-гонад-мезонефроса млекопитающих. Nat. Genet. 36, 1019-

1023.

Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C.J., Hartenstein, V. и

Banerjee, U. (2007). Hedgehog- и Antennapedia-зависимая ниша

поддерживает гематопоэтических предшественников Drosophila.Природа 446, 320-324.

Майстер, М. (2004). Клетки крови дрозофилы: клоны клеток и роль в защите хозяина

. Curr. Opin. Иммунол. 16, 10-15.

2395ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯPDCD2 / Zfrp8 в развитии лимфатических узлов

Агрономия | Бесплатный полнотекстовый | Защитное и лечебное действие Trichoderma asperelloides Ta41 на корневую гниль томатов, вызванную Rhizoctonia solani Rs33

1. Введение

4. Обсуждение

границ | Новые биоразлагаемые полимерные микрочастицы способствуют заживлению ран без рубцов, способствуя реэпителизации и ингибируя фиброз

Введение

Заживление кожных ран — сложный процесс, который включает начальную коагуляцию и быструю инфильтрацию миелоидных клеток, что приводит к воспалительной реакции, за которой следуют фазы пролиферации и реэпителизации (1). Баланс между этими процессами определяет динамику регенерации, а также исход заживления ран, в частности фиброз, образование рубцов и эффективное восстановление придатков кожи (2).Воспалительная фаза, которая, по-видимому, является триггером и решающим регулятором регенерации кожи, включает активацию множества провоспалительных цитокинов (3, 4). Среди них TNF и IL-6 демонстрируют наибольшее влияние на заживление ран, однако их роль в этом процессе остается спорной. Первоначально было показано, что передача сигналов TNF вредна для регенерации кожи, поскольку дефицит TNFRp55 (TNFRI) привел к ускоренному заживлению ран и усилению реэпителизации у мышей (5). В то же время это было связано с накоплением коллагена в ложе раны, что могло указывать на фиброз (6) и образование рубца.Дальнейшие исследования показали, что TNF важен для индукции миграции ILC3 к месту раны и для запуска процесса регенерации (7). В частности, введение рекомбинантного TNF в кожные раны ускоряет заживление, тогда как местная блокада TNF приводит к замедленной регенерации. Важно отметить, что TNF, продуцируемый миелоидными клетками, имеет решающее значение для качества регенерации кожи, поскольку у TNF-дефицитных мышей, а также у мышей с ограниченным миелоидными клетками TNF обнаружен нарушенный индуцированный раной неогенез волос (WIHN) (8 ).Роль IL-6, другого провоспалительного цитокина, в заживлении кожных ран также была исследована с использованием обратной генетики. Интересно, что животные с дефицитом IL-6, но не с дефицитом IL-6R, характеризовались задержкой регенерации (9-11) и нарушением регенерации волос (12-14). Поскольку было показано, что активация STAT3 имеет решающее значение для заживления ран (15, 16), следует учитывать возможность участия других цитокинов семейства IL-6 в процессе регенерации кожи.

В то же время, когда были выяснены ключевые воспалительные факторы, влияющие на заживление кожных ран, возникла тенденция к получению микро- и наночастиц (MP и NP), которые могут использоваться в качестве носителей для введения определенных типов клеток или лекарств в пострадавших. кожа для быстрого заживления ран без рубцов (17–19).Хотя эти предварительные результаты подтверждают продолжение исследований частиц, полученных из биоматериала, для восстановления тканей, прорегенеративный потенциал in vivo МП вне зависимости от введенных клеток или факторов роста не исследовался. В этой работе мы стремились выяснить (а) вклад перенесенных микрочастиц в заживление раны; (б) влияние этих биополимерных каркасов на провоспалительные медиаторы заживления ран; и (c) степень сходства и различий в механизме действия различных каркасов, полученных из биоматериалов.

Чтобы ответить на эти вопросы, мы оценили два типа ранее описанных МП на основе шелка, полученных из фиброин / желатиновых (20, 21) каркасов или спидроиновых (22–24) гидрогелей, и охарактеризовали их регенеративный и воспалительный потенциал in vivo in модель глубоких кожных ран у мышей, а также прямые эффекты на экспрессию воспалительных и профибротических генов в нескольких типах клеток, участвующих в регенерации кожи in vitro . Мы продемонстрировали, что, обладая сходным прорегенеративным потенциалом, эти носители заметно различаются по своему взаимодействию с иммунной системой хозяина.Этот неожиданный результат предполагает, что возможная адаптация биополимерного носителя к типу излечиваемого повреждения позволит оптимизировать свойства лекарства, доставляемого таким носителем, «на месте».

Материалы и методы

Мыши

мышей C57Bl / 6 были выведены в Пущинском животноводческом комплексе (филиал Института биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова РАН) в специальных условиях, свободных от патогенов, с 12-часовым циклом свет / темнота при комнатной температуре.Для опытов с МП использовали животных в возрасте 7–9 недель. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (NRC 2011), Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, Совета Европы (ETS 123 ) и «Методические указания по манипуляциям с экспериментальными животными» (постановление Президиума РАН от 2 апреля 1980 г., №12000-496). Все процедуры на животных были одобрены Ученым советом Института молекулярной биологии им. Энгельгардта.

Генерация микрочастиц

Микрочастицы фиброин-желатин были получены путем криодеструкции фиброиновых композитных губчатых каркасов, замещенных 30% желатином, как описано ранее (20). Полученные микрочастицы последовательно пропускали через лабораторные фильтры с размером пор 500, 250, а затем 100 мкм. Целевая фракция была представлена ​​микрочастицами, которые прошли через поры размером 500 и 250 мкм, но не прошли через поры размером 100 мкм.Микрочастицы рекомбинантного спидроина rS1 / 9 получали физическим измельчением гидрогелей, приготовленных из 3% раствора rS1 / 9 в 10% растворе хлорида лития в 90% муравьиной кислоте с последующим диализом против дистиллированной воды (25), и имели диапазон размеров от 100 до 300 мкм. Оба типа МП хранили в 70% этаноле и 3 раза промывали PBS перед использованием. Для in vivo экспериментов были созданы раны, а затем микрочастицы были подкожно. вводили в виде 50% суспензии в PBS тремя инъекциями на участок кожи по 20 мкл на каждую инъекцию (всего 60 мкл на участок), для экспериментов in vitro 50% суспензию микрочастиц добавляли к равному объему клеточной суспензии.Растворимый фиброин (sF) и спидроин (sSp) использовали в качестве контролей in vitro при концентрации 1 мг / мл в среде для культивирования клеток.

Анализ морфологии поверхности

Структуру поверхности микрочастиц анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Полимер конъюгировали с TRITC в соответствии со следующей процедурой: микрочастицы замачивали в растворе, содержащем 2,5 мг / мл TRITC в 0,1 М бикарбонатном буфере, реакцию останавливали, погружая микрочастицы в 0.1 М раствор ТРИТЦ на 20 мин. Затем микрочастицы переносили в буферный раствор фосфата калия на 15 мин для удаления остаточного TRITC. Для получения трехмерной реконструкции была создана серия оптических срезов с использованием микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем A1 (Nikon Corporation, Япония) и объективом CFI Plan Apo VC 20 × /0,75. Подготовка микрочастиц для SEM проводилась по стандартному протоколу. Вкратце, MP фиксировали в течение ночи с использованием 2,5% глутарового альдегида в 0.1 M какодилатный буфер при + 4 ° C. Затем образцы промывали трижды в 0,1 М какодилатном буфере с pH = 7,2 в течение 5 мин с последующей дегидратацией сериями растворов этанола с возрастающими концентрациями и ацетона (Химмед, Россия). После сушки до критической точки с использованием сушилки Hitachi для критической точки HCP-2 (Hitachi, Ltd., Япония) MP были металлизированы слоем платины толщиной 20 нм с использованием Ion Coater IB3 (Eiko Engineering Co., Япония). Полученные образцы анализировали с помощью микроскопа Camscan S2 (Cambridge Instruments, UK) при разрешении 10 нм и рабочем напряжении -20 кВ.Изображения получали с помощью программы MicroCapture (SMA, Россия).

Клеточные культуры

Первичные эмбриональные фибробласты мыши (MEF) были созданы, как описано ранее (26). Первичные макрофаги, происходящие из костного мозга мыши (BMDM), были созданы промыванием бедренных костей и культивированием клеток костного мозга в течение 10 дней в соответствии со стандартным протоколом (27, 28) в DMEM с добавлением 30% кондиционированной среды из клеток L929 (источник M -CSF) и 20% лошадиной сыворотки (Biological Industries, Kibbutz, Israel, lot No.1630708). Первичные кератиноциты мышей выделяли и культивировали в соответствии с ранее опубликованным протоколом (29). Были приготовлены по крайней мере два независимых изолята для всех первичных культур клеток. Для экспериментов MEF и BMDM культивировали на пластиковых чашках в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco) и пенициллина / стрептамицина / L-глутамина (Gibco). Кератиноциты культивировали в среде DMEM / Ham’s F12 (3,5: 1,1) с добавлением 0,05 мМ Ca ²⁺ , 10% FCS (FCS Gold, PAA), 0.18 мМ аденин (Sigma Aldrich), 0,5 мкг / мл гидрокортизона (Sigma Aldrich), 5 мкг / мл инсулина (Invitrogen), 10 ^-10 M холерный токсин (Sigma Aldrich), 10 нг / мл EGF, 2 мМ глутамин, 1 мМ пируват. Для определения уровней мРНК цитокинов и других воспалительных генов 4 × 10 ⁵ клеток на лунку высевали на частицы фиброина / желатина или спидроина (100 мкл 50% суспензии на лунку) в 24-луночный планшет и инкубировали при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение 6 и 24 часов. Для оценки продукции цитокинов супернатанты собирали через 24 часа после культивирования клеток в присутствии микрочастиц.Культуры клеток без микрочастиц использовали в качестве контроля. Для измерения адгезионной способности клеток к F / G или Sp MP 1 × 10 ⁶ клеток инкубировали с 250 мкл 50% суспензии MP в течение 1 ч при 37 ° C, 5% CO ₂ . Затем суспензии фильтровали через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм (Miltenyi Biotec) для отделения неприкрепленных клеток. Затем подсчитывали количество клеток в проточном потоке и рассчитывали результирующую эффективность адгезии как (N _{клеток начальное} — N _{клеток начальное} ) / N _{клеток начальное} * 100%.

Иммунофлуоресценция клеток на микрочастицах

использовали для визуализации MEF, выращенного на микрочастицах в течение 7 дней, а также для анализа инфильтрации микрочастиц in vivo иммунными клетками через 24 часа после подкожной инъекции. В обоих случаях MP фиксировали 4% параформальдегидом и обрабатывали 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 10 мин. Для обнаружения актинового цитоскелета использовали фаллоидин, конъюгированный с Alexa488. Для обнаружения воспалительных клеток Ly6C ⁺ использовали антитело против Ly6C, конъюгированное с PE-Cy7 (таблица 1).Ядра клеток визуализировали с помощью Hoechst 33342. Изображения получали с использованием микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем A1 (Nikon Corporation, Япония) и объективом CFI Plan Apo VC 20 × /0,75.

Таблица 1 . Антитела для анализа проточной цитометрией.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность кератиноцитов, MEF и BMDM после 1, 3 и 7 дней культивирования in vitro на фиброине / желатине и рекомбинантных MP спидроина определяли с помощью набора LIVE / DEAD ™ Viability / Cytotoxicity Kit для клеток млекопитающих (ThermoFisher) в соответствии с инструкции производителя.Окрашенные клетки наблюдали с помощью микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем A1 (Nikon Corporation, Япония) и объективом CFI Plan Apo VC 20 × / 0,75.

МТТ-Тест

Клеточные культуры были созданы на MP фиброина / желатина и рекомбинантного спидроина, как описано выше. Через 1, 3 и 7 дней добавляли 200 мкл раствора МТТ (5 мг / мл в PBS) и инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Клеточную суспензию с микрочастицами собирали и центрифугировали при 14 500 g, осадок растворяли в ДМСО и колориметрические измерения проводили при 540 нм.

Глубокие кожные раны

Глубокие кожные раны были внесены в соответствии с ранее опубликованным протоколом (21). Вкратце, мышей анестезировали i.p. инъекция 100 мкл смеси Золетил 100 (Вирбак) и Рометар (Биовета) в стерильном PBS в концентрации 10 и 20% соответственно. Во избежание обезвоживания сетчатки глазные капли постоянно наносили на область вокруг глаз. После исчезновения всех рефлексов область спины мышей депилировали с помощью крема для депиляции (Veet), а затем на спине мышей наносили две полные раны кожи с помощью 4-миллиметровых перфораторов для биопсии (Medex).Мышей держали на грелке до полного выздоровления от анестетика. День операции обозначили как день 0. Для морфометрии раны мышей фотографировали в дни 0, 1, 7, 10 и 21 с помощью цифровой камеры (Nikon D810 с объективом AF Micro-Nikkor ED 200 мм f / 4 D IF). Каждый день площадь раны измеряли по фотографиям с использованием программного обеспечения ImageJ и рассчитывали как процент от начальной площади раны в день 0. Площадь рубца измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ на 21 день после ранения.

Проточная цитометрия

Для анализа проточной цитометрии вырезали образцы кожи размером 10 мм × 10 мм и хранили в PBS на льду.Затем образцы разрезали ножницами и расщепляли в 1 мл среды для переваривания, состоящей из RPMI1640 (Gibco), 0,5 мг / мл ДНКазы I, 1 мг / мл коллагеназы D и 0,1 мг / мл либеразы TL (все ферменты от Sigma Aldrich). Расщепление выполняли с использованием мягкого MACS Octo Dissociator с нагревателями в C-пробирках (Miltenyi Biotec) в течение 1 ч при 37 ° C. После переваривания клетки пропускали через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм (Miltenyi Biotec) и промывали 9 мл PBS. Затем клетки блокировали Fcγ-блокирующим антителом (ThermoFisher) и окрашивали на поверхностные маркеры (таблица 1).Данные были получены на BD FACS Canto II и проанализированы с помощью FlowJo. Для оценки количества клеток использовали счетные шарики (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя.

Выделение РНК и анализ экспрессии генов

РНК из образцов выделяли с использованием TriZol (Sigma Aldrich), следуя инструкциям производителя. Для выделения РНК образцы кожи быстро замораживали в жидком азоте, гомогенизировали с помощью ступки и пестика, а затем ресуспендировали в TriZol. Количество РНК оценивали с помощью Nanodrop 1000 (ThermoFisher).Затем образцы РНК обрабатывали ДНКазой (ThermoFisher) и использовали для обратной транскрипции (ThermoFisher) с олиго (dT) праймерами в соответствии с протоколом производителя. Сгенерированную кДНК затем использовали для RT-PCR в Applied Biosystems (AB7500 Real Time PCR System) с использованием предварительно смешанного буфера для RT-PCR (Eurogene) и специфичных для генов праймеров (Eurogene, последовательности праймеров суммированы в таблице 2). Относительную экспрессию гена рассчитывали согласно ΔΔCt с эталонным геном Actb .

Таблица 2 .Праймеры для анализа КПЦР.

ELISA

IL-6, TNF и IL-1beta в супернатантах клеточных культур определяли с использованием ELISA Ready-SET-Go мышиного IL-6, ELISA Ready-SET-Go мышиного TNF alpha и готового ELISA ELISA мыши IL-1b. -Идите наборы (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Гистология

Через пять дней после индукции глубоких кожных ран мышам вводили анестезию, вырезали два образца кожи размером 15 мм × 15 мм, окружающие место повреждения, и затем фиксировали один в 4% растворе PFA, а другой — в растворе Буэна (насыщенный водный пикриновый раствор). кислоты, формалина и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15: 5: 1) и гистологический анализ ткани был проведен, как описано ранее (21).Для измерения реэпителизации образцы кожи окрашивали красителем по Мэллори и исследовали с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Германия) и камеры AxioCam MRC 5 (Carl Zeiss, Германия). Длину ложа раны оценивали на гистологических слайдах с помощью программного обеспечения ImageJ. Инфильтрацию иммунных клеток внутри имплантированных микрочастиц анализировали путем окрашивания гематоксилином / эозином.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 6, Сан-Диего, Калифорния, США).Односторонний и двусторонний дисперсионный анализ с пост-тестом Холма-Сидака использовался для множественных попарных сравнений. Данные были получены как минимум в трех независимых экспериментах и ​​представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. p <0,05 считали показателем статистической значимости.

Результаты

Биофизические свойства MPs фиброина / желатина и спидроина

В экспериментах использовались рекомбинантные микрочастицы на основе спидроина rS1 / 9 (Sp) и фиброина / желатина (F / G) (соответственно, Sp MP и F / G MP) (рис. 1).Размер частиц составлял от 100 до 300 мкм для Sp MP и 100–250 мкм для F / G MP. Sp MP были получены в результате физического измельчения гидрогеля и представляют собой частицы микрогеля со сложной поверхностью. Элементы поверхности включают наноструктуры диаметром 100–300 нм и микроструктуры размером 10–30 мкм (рис. 1С). Одним из важных свойств спидроина rS1 / 9 является ярко выраженный положительный заряд молекул, что связано с наличием 29 остатков Arg в отсутствие отрицательно заряженных остатков (теоретическая pI: 10.49) (22, 30). Для рекомбинантного спидроина характерно чередование коротких гидрофобных и гидрофильных участков, что позволяет поверхности микрогеля проявлять либо гидрофобные, либо гидрофильные свойства в зависимости от окружающей среды. F / G MP были получены путем криодеструкции губчатых каркасов (21, 31). Получающиеся в результате F / G MP представляют собой фрагменты каркаса со сложной поверхностью, обеспечивающие большую площадь поверхности для клеточной адгезии и пролиферации. При физиологическом pH фиброин имеет отрицательный заряд (pI = 4.2), что увеличивает сорбцию биологически активных молекул и улучшает миграцию клеток (32). Для улучшения адгезии клеток к поверхности F / G MP в биополимер был введен желатин, биосовместимый продукт частичного гидролиза коллагена, содержащий интегрин-связывающие аминокислотные последовательности RGD (Arg-Gly-Asp). Присутствие желатина положительно влияет на адгезию, пролиферацию, миграцию и жизнеспособность различных типов клеток (33–36).

Рисунок 1 .Структура микрочастиц фиброина / желатина и спидроина. (A) CLSM-изображения микрочастиц фиброина / желатина или спидроина, визуализированные с помощью TRITC. Шкала шкалы −100 мкм. (B) СЭМ-изображения микрочастиц фиброина / желатина или спидроина. Шкала шкалы −100 мкм. Черный квадрат указывает область, увеличенную на (C) .

MPs фиброин / желатин и спидроин способствуют реэпителизации раны и ингибируют образование рубцов

Чтобы исследовать прорегенеративный потенциал МП на основе шелка, мы сначала сравнили способность двух типов МП (рис. 1) способствовать заживлению глубоких кожных ран после подкожной инъекции.Интересно, что введение МП фиброин / желатин приводило к замедленному сокращению раны в день 1 по сравнению с ранами, обработанными PBS и спидроином (Фигуры 2A, B). Однако на 7 день не было обнаружено разницы в размере раны (фигура 2B, день 7), а полное закрытие раны наблюдалось на 10 день во всех трех группах (фигура 2B, день 10). Поскольку фиброз кожи является важным показателем качества заживления раны, мы измерили поверхность рубца, формирующуюся на участке раны на 21 день после заживления раны (рис. 2B, день 21), и наблюдали значительное уменьшение образования рубцов после лечения MP как по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS (рис. 2C).Кроме того, анализ гистологических срезов раненой ткани выявил значительное улучшение скорости реэпителизации после лечения обоими типами МП по сравнению с контролем (рисунки 2D, E). Интересно, что на 5-й день после п / к инъекции MPs, F / G, но не Sp MPs, были окружены иммунными клетками, как выявлено гистологическим окрашиванием (рис. 2F). Таким образом, как фиброин / желатин, так и спидроиновые МП продемонстрировали сравнимую способность способствовать реэпителизации кожной раны и предотвращать фиброз.

Рисунок 2 . Микрочастицы фиброина / желатина (F / G) и спидроина (Sp) способствуют реэпителизации раны и ингибируют образование рубцов. (A) Типичные фотографии глубоких кожных ран после подкожной инъекции MP фиброина / желатина или спидроина по сравнению с контрольной обработкой (PBS). (B) Размер раны в% от начальной площади в указанные моменты времени, рассчитанный по фотографиям раны ( n = 6). (C) Размер рубца в мм ² на 21 день, рассчитанный по фотографиям раны ( n = 7). (D) Репрезентативные гистологические срезы ран на 5 день, окрашенные красителем по Мэллори. Стрелками обозначены края ложа раны. Шкала шкалы −500 мкм. (E) Размер раневого ложа рассчитан на основе гистологических срезов на 5-й день после ранения ( n = 5). (F) MPs фиброин / желатин и спидроин, выявленные окрашиванием H&E образцов ран на 5-й день. Стрелки указывают на инфильтрацию иммунных клеток. Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. **** п <0.0001.

Только MP фиброина / желатина индуцируют экспрессию провоспалительных цитокинов в MEF и BMDM, тогда как MPs фиброина / желатина и спидроина подавляют экспрессию профибротического фактора роста в MEF

Поскольку только MP фиброин / желатин задерживают сокращение раны (рисунки 2B, C), мы решили дополнительно охарактеризовать in vitro прямое воздействие обоих типов носителей на клетки, участвующие в заживлении ран, такие как фибробласты, кератиноциты и макрофаги. Мы создали первичные культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEF), кератиноцитов и макрофагов, полученных из костного мозга (BMDM), и культивировали их на двух типах MPs, а также в обычных условиях 2D культивирования в качестве контроля.Оба типа МП поддерживали рост клеток (рисунок 3A, дополнительный рисунок 1A) и были связаны с высокой жизнеспособностью клеток в течение по крайней мере 1 недели культивирования (данные не показаны). Интересно, что два типа МП различаются по своей способности способствовать адгезии фибробластов и макрофагов, которые представляют два основных типа клеток, взаимодействующих с МП при их подкожной инъекции. MP F / G поддерживали адгезию BMDM, в то время как MEF проявляли высокую адгезию к Sp MP через 1 час инкубации (рис. 3B). В меньшей степени кератиноциты также лучше прилипали к Sp MPs (дополнительный рисунок 1B).Затем мы проанализировали экспрессию провоспалительных генов в клетках, культивируемых на двух типах МП. Неожиданно мы наблюдали значительную индукцию провоспалительных цитокинов TNF и IL-6 как на уровне мРНК, так и на уровне белка в MEF и BMDM, культивируемых на фиброине / желатине, но не на MPs спидроина (Фигуры 3C, D). Интересно, что MEF оказался основным источником IL-6, тогда как BMDM продуцировал в основном TNF в ответ на MP фиброин / желатин. Однако экспрессия провоспалительных генов была временной и исчезла через 24 часа культивирования (дополнительный рисунок 1D).Кератиноциты не изменяли уровни экспрессии провоспалительных генов в ответ на любой тип MPs, однако они усиливали экспрессию молекулы адгезии Vcam1 при культивировании на спидроиновых MP (дополнительный рисунок 1C). Кроме того, мы обнаружили значительное подавление экспрессии генов Ctgf и Fgf2 в MEF, культивируемых на любом типе MP, по сравнению с контролем (рис. 3E). Известно, что эти факторы роста способствуют фиброзу во время заживления кожных ран (37).Чтобы отличить вклад биоматериала от влияния каркаса на клетки, мы проанализировали экспрессию генов в MEF, культивируемых в присутствии растворимых белков фиброина или спидроина. Важно отметить, что ни растворимый фиброин, ни спидроин (sF или sSp соответственно) не индуцировали экспрессию провоспалительных цитокинов в MEF (дополнительный рисунок 1E). Однако оба белка индуцировали подавление экспрессии Ctgf и Fgf2 в MEF, что позволяет предположить, что и фиброин, и спидроин обладают антифиброзными свойствами (рис. 3E).Таким образом, оба типа МП показали антифиброзный потенциал in vitro , в то время как только МП фиброин / желатин индуцировали временный воспалительный ответ в фибробластах и ​​макрофагах.

Рисунок 3 . Только MP фиброин / желатин индуцируют экспрессию провоспалительных цитокинов в MEF и BMDM, тогда как MP как фиброин / желатин, так и спидроин подавляют экспрессию факторов профибротического роста в MEF. (A) Монослой MEF после 1 недели культивирования на микрочастицах фиброин-желатин (F / G) или спидроин (Sp).Актиновый цитоскелет окрашивается фаллоидином-Alexa488 (зеленый), ядра окрашиваются Hoechst 33342. Шкала шкалы — 50 мкм. (B) Эффективность адгезии MEF и BMDM к MP фиброина / желатина и спидроина ( n = 4). (C, D) Экспрессия TNF (C) и IL-6 (D) тремя типами клеток, культивируемых на фиброин / желатиновых или спидроиновых МП, по сравнению с обычными 2D-культурами (контроль), как выявлено с помощью кПЦР через 6 часов (слева) и с помощью ELISA в супернатантах через 24 часа (справа). (E) Экспрессия генов факторов роста фибробластов, Ctgf и Fgf2 , с помощью MEF, культивированных в течение 6 часов на фиброин / желатиновых или спидроиновых МП, по сравнению с растворимым фиброином или спидроином (sF или sSp) и обычным 2D культур (контроль), выявленных анализом кПЦР ( n = 3). Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. * р <0,05; ** p <0,01; *** р <0,001; **** п <0.0001.

Подкожная инъекция микрочастиц фиброина / желатина способствует умеренному воспалению и проникновению миелоидных клеток в кожу мыши

Затем мы исследовали краткосрочные эффекты введения МП на гомеостаз кожи после подкожной инъекции. Основываясь на наших данных in vitro (рис. 3), мы ожидали увеличения воспалительного ответа и увеличения инфильтрации кожи иммунными клетками (дополнительный рис. 2) после инъекции МП фиброина / желатина по сравнению с МП спидроина.Интересно, что инъекция МП фиброина / желатина или спидроина приводила к увеличению инфильтрации кожи миелоидными клетками CD11b ⁺ на 1-й день после инъекции по сравнению с контрольной группой, которым вводили PBS, хотя разница не достигла статистической значимости из-за высокая вариабельность между образцами (Рисунки 4A, B). Проникающие миелоидные клетки дополнительно характеризовались их провоспалительной способностью в соответствии с экспрессией поверхностной молекулы Ly6C. В частности, было показано, что клетки Ly6C ^hi обладают провоспалительным действием, а клетки Ly6C ^low обладают противовоспалительным и прорегенеративным действием (38).В соответствии с нашими данными in vitro , мы наблюдали значительное увеличение процента сильно воспалительных миелоидных клеток Ly6C ^hi после инъекции МП фиброина / желатина по сравнению с МП спидроина и контрольной группой (рисунки 4A, C). . Это коррелировало со слегка уменьшенной долей невоспалительных клеток Ly6C ^low после инъекции MPs фиброина / желатина по сравнению с MPs спидроина и контрольной группой (рис. 4C). Более того, воспалительные клетки Ly6C ^hi , которые мигрировали в ответ на MP фиброина / желатина, показали значительное увеличение экспрессии Ly6C, как показано MFI (фиг. 4D).Чтобы определить, взаимодействуют ли эти клетки с введенными МП, мы выполнили иммунофлуоресцентный анализ ex vivo (рис. 4E). Действительно, мы наблюдали ряд воспалительных клеток Ly6C ^hi , непосредственно прикрепленных к фиброину / желатину, но не к MP спидроина, в соответствии с нашими данными in vitro , которые показали повышенную адгезию макрофагов к MP фиброина / желатина (Рисунок 3B). . Следует отметить, что мы не наблюдали каких-либо значительных изменений количества нейтрофилов Ly6G ⁺ в ответ на введение MPs (данные не показаны).Таким образом, МП фиброин / желатин, но не спидроин, вызывают инфильтрацию кожи провоспалительными миелоидными клетками после подкожной инъекции.

Рисунок 4 . Подкожная инъекция фиброина / желатина и спидроина MP влияет на инфильтрацию миелоидных клеток и снижает экспрессию факторов профибротического роста. (A) Типичные точечные графики, показывающие экспрессию Ly6C и Ly6G миелоидными клетками, выделенными из кожи через 1 день после инъекции с PBS, фиброин / желатин или спидроиновые МП (стратегия гейтирования — дополнительный рисунок 2). (B) Общее количество миелоидных клеток CD11b ⁺ в образцах кожи. (C) Доля миелоидных клеток Ly6C ^hi и Ly6C ^— в образцах кожи. (D) MFI окрашивания Ly6C среди Ly6G ^— Ly6C ^hi популяции миелоидных клеток. Все ячейки имеют VD ^— CD45 ⁺ CD11b ⁺ . (E) Иммунофлуоресцентное окрашивание MP фиброина / желатина и спидроина анти-Ly6C-антителом через 24 часа после подкожной инъекции.Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342. (F – H) Экспрессия провоспалительных цитокинов (F) , хемокинов (G) и профибротических факторов роста (H) в коже через 1 день после инъекции PBS, фиброин / желатин или спидроиновые МП. Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. * р <0,05; ** p <0,01; *** р <0,001.

Затем мы проанализировали экспрессию основных провоспалительных и прорегенеративных генов в образцах кожи после инъекции МП.В соответствии с нашими данными in vitro мы смогли обнаружить только незначительное увеличение экспрессии генов Tnf и Il6 в коже через 24 часа после введения фиброин / желатиновых МП (рис. 4F). Однако инъекция обоих типов МП приводила к значительному увеличению экспрессии хемокина Ccl2 , который, как известно, способствует инфильтрации иммунных клеток во время заживления ран и воспаления кожи (фиг. 4G). Это коррелирует с повышенной инфильтрацией миелоидных клеток в кожу после инъекции обоих типов МП по сравнению с контролем (рис. 4В).Среди генов, кодирующих факторы роста, в соответствии с нашими результатами in vitro , мы наблюдали значительное снижение экспрессии гена Fgf2 в ответ на оба типа МП по сравнению с контрольной группой, инъецированной PBS (фиг. 4H). Этот результат указывает на то, что прорегенеративный потенциал MP фиброина / желатина и спидроина может быть обусловлен их ингибирующим действием на фиброз кожи.

Обсуждение

Долгое время считалось, что биоинженерные МП проявляют свой прорегенеративный потенциал в основном за счет обеспечения основы для роста клеток и тканей, что, в свою очередь, способствует регенерации тканей (39, 40).Однако влияние биоматериалов на определенные типы клеток и их транскрипционную программу было в значительной степени недооценено, поскольку трудно различить эффекты, основанные на каркасе и биоматериалах. Сравнительные исследования нескольких типов биоматериалов могут дать новое представление об их различном влиянии на фенотип клеток. Действительно, наши данные решительно подтверждают идею о том, что, помимо того, что они служат клеточным каркасом, биоинженерные МП могут стимулировать определенный паттерн экспрессии воспалительных генов в зависимости от используемого материала.Мы наблюдали значительную экспрессию провоспалительных генов в MEF и BMDM, культивируемых на фиброин / желатине, но не на спидроиновых MP (Фигуры 3C, D), доказывая, что композитные MP фиброин / желатин могут специфически вызывать временное воспаление. Эти данные полностью согласуются с недавно опубликованными наблюдениями, предполагающими, что фиброин обладает провоспалительными свойствами (41–43). Однако в нашей работе мы не обнаружили какого-либо увеличения провоспалительных признаков в культивируемых клетках в ответ на растворимый фиброин (дополнительный рисунок 1E и данные не показаны), что указывает на то, что полимерный фиброин обладает уникальными свойствами активации клеток.Это дополнительно подтверждается опубликованной работой, показывающей, что только определенная конфигурация фиброиновых каркасов вызывает воспалительную реакцию в моноцитах (44). Кроме того, модификация желатина, используемая в этой работе для увеличения биосовместимости фиброиновых каркасов, может дополнительно модулировать влияние MP на культивируемые клетки, хотя в предыдущих исследованиях мы не наблюдали какого-либо влияния модифицированных желатином фиброиновых каркасов на экспрессию генов в MEF (45).

Важно отметить, что этот провоспалительный эффект различается для различных типов клеток, изучаемых здесь, поскольку MEF, культивируемые на MP фиброина / желатина, являются основным источником IL-6, BMDM в основном продуцирует TNF, в то время как первичные кератиноциты не сверхэкспрессируют ни TNF, ни IL-6 в ответ. депутатам (Рисунки 3C, D).Этот умеренный воспалительный ответ приводит к более высокой инфильтрации кожи воспалительными миелоидными клетками после инъекции MPs фиброин / желатин (рисунки 2F, 4A – E), что может быть важно для быстрого заживления ран (46). Действительно, несмотря на замедленное сокращение раны (Рисунки 2A, B), мы наблюдали значительное увеличение скорости реэпителизации глубоких кожных ран после инъекции MPs фиброин / желатин (Рисунки 2C-E). Интересно, что хотя MP спидроина не проявляли никаких провоспалительных свойств, они также вызывали сверхэкспрессию Ccl2 (Рисунок 4G), что приводило к усилению инфильтрации миелоидных клеток (Рисунок 4B) и индуцировало быструю реэпителизацию раны при подкожной инъекции (Рисунки 2D). , E), не влияя на сокращение раны (рисунки 2A, B).Это указывает на то, что MP спидроина обладают своими прорегенеративными свойствами посредством другого механизма. Мы также установили, что MP спидроина сильно индуцируют адгезию фибробластов и кератиноцитов in vitro (рис. 3В). Кроме того, мы обнаружили повышенную экспрессию молекулы адгезии Vcam1 в кератиноцитах, культивируемых на спидроиновых МП, по сравнению с фиброин / желатиновыми МП (дополнительный рисунок 1С), что может быть полезно для их миграции во время заживления ран.

Кроме того, мы наблюдали значительный антифиброзный эффект, индуцированный носителями, о чем свидетельствует снижение уровней экспрессии генов, кодирующих ключевые факторы роста Ctgf и Fgf2 , после культивирования MEF на обоих типах MP (рис. 3E).Важно отметить, что тот же эффект был вызван растворимым фиброином и спидроином, что позволяет предположить, что выбор биоматериала может иметь решающее значение для антифиброзных свойств биоинженерных частиц (рис. 3E). Более того, экспрессия Fgf2 значительно подавлялась после подкожной инъекции MP (фиг. 4H). Это привело к уменьшению образования рубцов во время регенерации кожи, что указывает на улучшение качества заживления ран (Рисунок 2C). Антифиброзные свойства этих каркасов представляют особый интерес для разработки соединений, направленных на лечение фиброзных осложнений гепатита, аутоиммунных и метаболических заболеваний, для которых степень фиброза определяет скорость прогрессирования заболевания и возможные исходы.В соответствии с нашей первоначальной гипотезой, мы предоставляем доказательства того, что некоторые эффекты лечения на основе MP (например, антифиброзные свойства) обусловлены внутренними свойствами биоматериала, в то время как другие (например, провоспалительные свойства F / G MP), по-видимому, зависят в большей степени. на конструкции строительных лесов. Мы считаем, что этот аспект следует учитывать при оценке новых биоинженерных повязок для клинического использования.

В целом, наши результаты подчеркивают значительные возможности в оптимизации транспортных средств-носителей, которые ранее считались инертными, и открывают новые возможности для быстрой адаптации терапевтических свойств системы лекарственное средство / носитель с помощью методов изменения состава.

Выводы и перспективы на будущее

Мы показываем, что MP фиброин / желатин и спидроин оказывают два основных эффекта на заживление ран in vivo : они увеличивают скорость реэпителизации и ингибируют образование рубцов. Однако депутаты используют разные механизмы для выполнения этих задач. MPs фиброин / желатин вызывают временный воспалительный ответ в MEF и BMDM in vitro и in vivo после их подкожной инъекции, что приводит к замедленному сокращению раны, в то время как MP спидроина не проявляют никаких провоспалительных свойств, а скорее поддерживают адгезию фибробластов и кератиноциты in vitro .Оба типа биоматериалов подавляют экспрессию профибротических факторов в MEF и предотвращают фиброз кожи во время заживления ран. Мы продемонстрировали, что, обладая сходным прорегенеративным потенциалом, эти носители заметно различаются во взаимодействии с иммунной системой хозяина. Этот неожиданный результат предполагает, что в контексте терапии микрочастицами можно резко изменить ее результат, заменив биополимерный носитель. Мы надеемся, что это позволит быстро оптимизировать терапию микроносителями в зависимости от типа раны, которую необходимо заживить (например,(например, травматические, послеоперационные, кардиометаболические и т. д.), что привело к появлению разнообразного набора более эффективных лекарств и устройств.

Авторские взносы

MN, AM, RZ, AA, AZ, TV и MD проводили эксперименты. VB, VD и MM предоставили важные материалы и технологии. MN, MM, IA, SN и MD разработали эксперименты и обсудили результаты. Рукопись написали MN, MD, MM и SN.

Финансирование

Работа поддержана РФФИ (грант № 15-29-04903), Программой фундаментальных исследований биомедицинских технологий РАН, Российским научным фондом (грант №14-25-00160).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Лабораторные животные, использованные в исследовании, предоставлены коллекциями биоресурсов ИБХ РАН при поддержке программы Федерального агентства научных организаций по поддержке коллекций биоресурсов. Мы благодарим Dr.Давыдовой Л.И. за получение рекомбинантного спидроина rS1 / 9 и спидроиновых МП. Мы также благодарим докторов наук. А. Луговскому и Е. Воротеляку за критические замечания и ценные советы при подготовке рукописи.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.02851/full#supplementary-material

Список литературы

3. Ланден Н.Х., Ли Д., Столе М. Переход от воспаления к разрастанию: критический шаг во время заживления ран. Cell Mol Life Sci. (2016) 73: 3861–85. DOI: 10.1007 / s00018-016-2268-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Мори Р., Кондо Т., Охима Т., Исида Ю., Мукаида Н. Ускоренное заживление ран у мышей с дефицитом рецептора фактора некроза опухоли p55 с уменьшенной инфильтрацией лейкоцитов. FASEB J. (2002) 16: 963–74. DOI: 10.1096 / fj.01-0776com

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Вик Дж., Грундтман С., Майерл С., Вимписсинджер Т.Ф., Файхтингер Дж., Зельгер Б. и др.Иммунология фиброза. Annu Rev Immunol. (2013) 31: 107–35. DOI: 10.1146 / annurev -munol-032712-095937

CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Li Z, Hodgkinson T., Gothard EJ, Boroumand S, Lamb R, Cummins I, et al. Epidermal Notch2 рекрутирует врожденные лимфоидные клетки группы 3 RORγ ⁺ для управления нормальным восстановлением кожи. Nat Commun. (2016) 7: 11394. DOI: 10.1038 / ncomms11394

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8.Wang X, Chen H, Tian R, Zhang Y, Drutskaya MS, Wang C, et al. Макрофаги индуцируют AKT / бета-катенин-зависимую активацию стволовых клеток Lgr5 ⁺ и регенерацию волосяных фолликулов через TNF. Nat Commun. (2017) 8: 14091. DOI: 10.1038 / ncomms14091

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Галуччи Р.М., Симеонова П.П., Матесон Дж. М., Комминени С., Гуриэль Дж. Л., Сугавара Т. и др. Нарушение заживления кожных ран у мышей с дефицитом интерлейкина-6 и иммунодефицитом. FASEB J. (2000) 14: 2525–31. DOI: 10.1096 / fj.00-0073com

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Lin Z-Q, Kondo T., Ishida Y, Takayasu T., Mukaida N. Существенное участие IL-6 в процессе заживления кожных ран, о чем свидетельствует замедленное заживление ран у мышей с дефицитом IL-6. J Leukoc Biol. (2003) 73: 713–21. DOI: 10.1189 / jlb.0802397

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. МакФарланд-Манчини М.М., Фанк Х.М., Палуч А.М., Чжоу М., Гиридхар П.В., Мерсер Калифорния и др.Различия в заживлении ран у мышей с дефицитом IL-6 по сравнению с рецептором IL-6. J Immunol. (2010) 184: 7219–28. DOI: 10.4049 / jimmunol.09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Нельсон А.М., Редди С.К., Рэтлифф Т.С., Хоссейн М.З., Кацефф А.С., Чжу А.С. и др. дцРНК, высвобождаемая при повреждении тканей, активирует TLR3, чтобы стимулировать регенерацию кожи. Cell Stem Cell (2015) 17: 139–51. DOI: 10.1016 / j.stem.2015.07.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Нельсон А.М., Кацефф А.С., Резник С.Р., Ратлифф Т.С., Чжу А.С., Гарза Л.А. Нулевые по интерлейкину 6 мыши парадоксальным образом демонстрируют повышенную активность Stat3 и индуцированный раной неогенез волос. J Invest Dermatol. (2016) 136: 1051–3. DOI: 10.1016 / j.jid.2015.12.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Киз Б. Е., Лю С., Асаре А., Наик С., Леворс Дж., Полак Л. и др. Нарушение передачи сигналов между эпидермальными и дендритными Т-клетками замедляет заживление ран в стареющей коже. Cell (2016) 167: 1323–38.DOI: 10.1016 / j.cell.2016.10.052

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Сано С., Итами С., Такеда К., Тарутани М., Ямагути Ю., Миура Х. и др. Специфическая для кератиноцитов абляция Stat3 демонстрирует нарушение ремоделирования кожи, но не влияет на морфогенез кожи. EMBO J. (1999) 18: 4657–68. DOI: 10.1093 / emboj / 18.17.4657

CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Кира М., Сано С., Такаги С., Йошикава К., Такеда Дж., Итами С.Дефицит STAT3 в кератиноцитах приводит к нарушению миграции клеток из-за гиперфосфорилирования p130cas. J Biol Chem. (2002) 277: 12931–6. DOI: 10.1074 / jbc.M110795200

CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Эльдардири М., Мартин И., Роксбург Дж., Лоуренс-Уотт Д. Д., Шарп-младший. Сокращение раны значительно снижается за счет использования микроносителей для доставки кератиноцитов и фибробластов в модели заживления и регенерации ран у свиньи in vivo . Tissue Eng Part A (2011) 18: 587–97. DOI: 10.1089 / ten.tea.2011.0258

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Гаинза Г., Виллулас С., Педраз Дж. Л., Эрнандес Р. М., Игартуа М. Достижения в системах доставки лекарств (DDS) для высвобождения факторов роста для заживления ран и регенерации кожи. Наномедицина (2015) 11: 1551–73. DOI: 10.1016 / j.nano.2015.03.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19.Berthet M, Gauthier Y, Lacroix C, Verrier B, Monge C. Повязка на основе наночастиц: будущее лечения ран? Trends Biotechnol. (2017) 35: 770–84. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2017.05.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Орлова А.А., Котлярова М.С., Лавренов В.С., Волкова С.В., Архипова А.Ю. Связь между концентрацией желатина в композитных каркасах на основе фиброина шелка и адгезией и пролиферацией фибробластов эмбриона мыши. Bull Exp Biol Med. (2014) 158: 88–91. DOI: 10.1007 / s10517-014-2699-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Архипова А.Ю., Носенко М.А., Малюченко Н.В., Зварцев Р.В., Мойсенович А.М., Жданова А.С. и др. Влияние микроносителей фиброина на воспаление и регенерацию глубоких кожных ран у мышей. Биохимия (2016) 81: 1251–60. DOI: 10.1134 / S00062970031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Богуш В.Г., Соколова О.С., Давыдова Л.И., Клинов Д.В., Сидорук К.В., Есипова Н.Г. и др.Новая модельная система для создания биоматериалов на основе рекомбинантных аналогов белков паучьего шелка. J Neuroimmune Pharmacol. (2009) 4: 17–27. DOI: 10.1007 / s11481-008-9129-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Мойсенович М.М., Пустовалова О.Л., Архипова Ю.Ю., Васильева Т.В., Соколова О.С., Богуш В.Г. и др. In vitro и in vivo исследования биосовместимости рекомбинантного аналога каркасов спидроина 1. J Biomed Mater Res Part A (2011) 96: 125–31.DOI: 10.1002 / jbm.a.32968

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Мойсенович М.М., Пустовалова О., Шакелфорд Дж., Васильева Т.В., Дружинина Т.В., Каменчук Ю.А. и др. Регенерация ткани in vivo в каркасах рекомбинантного спидроина 1. Биоматериалы (2012) 33: 3887–98. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2012.02.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Мойсенович М.М., Малюченко Н.В., Архипова А.Ю., Котлярова М.С., Давыдова Л.И., Гончаренко А.В. и др.Новые 3D-микроносители из рекомбинантного спидроина для регенеративной медицины. Докл Биохим Биофиз. (2015) 463: 232–5. DOI: 10.1134 / S16076720109

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Коннер Д.А. Препарат питающих клеток фибробласта эмбриона мыши (MEF). Curr Protoc Mol Biol. (2001) 51: 23.2.1–23.2.7. DOI: 10.1002 / 0471142727.mb2302s51

CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Muller M, Eugster HP, Le Hir M, Shakhov A, Di Padova F, Maurer C, et al.Коррекция или перенос иммунодефицита вследствие делеции TNF-LT альфа путем трансплантации костного мозга. Mol Med. (1996) 2: 247–55. DOI: 10.1007 / BF03401621

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Келсо А., Гласбрук А.Л., Канагава О., Бруннер К.Т. Производство фактора активации макрофагов клонами Т-лимфоцитов и корреляция с другими активностями лимфокинов. J Immunol. (1982) 129: 550–6.

PubMed Аннотация | Google Scholar

29.Ходивала-Дилке К. Первичная культура кератиноцитов мыши. В Wise C — редактор. Протоколы культуры эпителиальных клеток, Vol. 188. Totowa, NJ: Humana Press (2002) стр. 139–44. DOI: 10.1385 / 1-59259-185-X: 139

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Артимо П., Йонналагедда М., Арнольд К., Баратин Д., Чарди Г., де Кастро Э. и др. ExPASy: портал ресурсов SIB по биоинформатике. Nucleic Acids Res. (2012) 40: W597–603. DOI: 10.1093 / nar / gks400

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31.Агапов И.И., Мойсенович М.М., Васильева Т.В., Пустовалова О.Л., Коньков А.С., Архипова А.Ю. и др. Биоразлагаемые матрицы из регенерированного шелка Bombyx mori . Докл Биохим Биофиз. (2010) 433: 201–4. DOI: 10.1134 / S1607672

CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Лу Кью, Чжу Х, Чжан Ц., Чжан Ф., Чжан Б., Каплан Д.Л. Механизмы самосборки шелка и управление от термодинамики до кинетики. Биомакромолекулы (2012) 13: 826–32. DOI: 10.1021 / bm201731e

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Мас-Моруно С., Фрайоли Р., Рехенмахер Ф., Нойбауэр С., Капп Т.Г., Кесслер Х. alphavbeta3- или alpha5beta1-Integrin-селективные пептидомиметики для поверхностного покрытия. Angew Chem Int Ed Engl. (2016) 55: 7048–67. DOI: 10.1002 / anie.201509782

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Плотников С.В., Пасапера А.М., Сабасс Б., Уотерман СМ. Колебания силы внутри фокальных спаек опосредуют определение жесткости ECM, чтобы направлять направленную миграцию клеток. Cell (2012) 151: 1513–27. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.11.034

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Давиденко Н., Шустер С.Ф., Бак Д.В., Фарндейл Р.В., Хамая С., Бест С.М. и др. Оценка связывания клеток с коллагеном и желатином: исследование влияния 2D и 3D архитектуры и химии поверхности. J Mater Sci Mater Med. (2016) 27: 148. DOI: 10.1007 / s10856-016-5763-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36.Саркер Б., Сингх Р., Сильва Р., Ротер Дж. А., Кашта Дж., Детч Р. и др. Оценка адгезии и пролиферации фибробластов на гидрогеле, сшитом альгинат-желатином. PLoS ONE (2014) 9: e107952. DOI: 10.1371 / journal.pone.0107952

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Chujo S, Shirasaki F, Kondo-Miyazaki M, Ikawa Y, Takehara K. Роль фактора роста соединительной ткани и его взаимодействие с основным фактором роста фибробластов и хемоаттрактантным белком-1 макрофагов в фиброзе кожи. J Cell Physiol. (2009) 220: 189–95. DOI: 10.1002 / jcp.21750

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Geissmann F, Jung S, Littman DR. Моноциты крови состоят из двух основных подгрупп с различными миграционными свойствами. Иммунитет (2003) 19: 71–82. DOI: 10.1016 / S1074-7613 (03) 00174-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Smits AIPM, Bouten CVC. Тканевая инженерия встречается с иммуноинженерией: перспектива персонализированных стратегий тканевой инженерии in situ . Curr Opin Biomed Eng. (2018) 6: 17–26. DOI: 10.1016 / j.cobme.2018.02.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Фарохи М, Моттагиталаб Ф, Фатахи Й, Хадемхоссейни А, Каплан DL. Обзор использования фиброина шелка в перевязочных материалах для ран. Trends Biotechnol. (2018) 36: 907–22. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2018.04.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Мартинес-Мора С., Мровец А., Гарсия-Вискаино Е. М., Алькарас А., Сенис Ю. Л., Николас Ф. Дж.Фиброин и серицин из шелка Bombyx mori стимулируют миграцию клеток за счет активации и фосфорилирования c-Jun. PLoS ONE (2012) 7: e42271. DOI: 10.1371 / journal.pone.0042271

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Парк Ю. Р., Султан М. Т., Пак Х. Дж., Ли Дж. М., Джу Х. У., Ли О. Дж. И др. Передача сигналов NF-κB является ключевой в процессах заживления ран фиброином шелка. Acta Biomater. (2017) 67: 183–95. DOI: 10.1016 / j.actbio.2017.12.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Бхаттачарджи М., Шульц-Татер Э., Трелла Э., Миот С., Дас С., Лопарич М. и др. Роль трехмерной структуры и конформации белка на врожденный и адаптивный иммунный ответ на биоматериалы на основе шелка. Биоматериалы (2013) 34: 8161–71. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2013.07.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Носенко М.А., Малученко Н.В., Друцкая М.С., Архипова А.Ю., Агапов И.И., Недоспасов С.А. и др.Индукция экспрессии ICAM-1 в эмбриональных фибробластах мыши, культивируемых на фиброин-желатиновых каркасах. Acta Naturae (2017) 9: 89–93.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

% PDF-1.4 % 2 0 obj > эндобдж 61 0 объект > эндобдж 118 0 объект > поток Apogee Series3 Pilot v1.0.1u22005-01-27T13: 00: 04Z2021-07-23T06: 00: 29-07: 002021-07-23T06: 00: 29-07: 00uuid: accd15d1-1dd1-11b2-0a00-3009275d6100uuid: accd15d4-1dd1-11b2-0a00-aa0000000000приложение / PDF конечный поток эндобдж 12 0 объект > эндобдж 1 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 13 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 21 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 25 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 30 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 119 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 139 0 объект [145 0 R 146 0 R 147 0 R 148 0 R 149 0 R 150 0 R 151 0 R] эндобдж 140 0 объект > поток q 287.5 0 0 75 169,75 690 см / Im0 Do Q BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 327,25977 591,99982 тм () Tj 0 0 1 рг -9.73 0 Тд (10.1101 / gad.1263005) Tj 0 г -16.89598 0 Тд (Доступ к самой последней версии на сайте doi 🙂 Tj 9,78299 1 тд () Tj / T1_1 1 Тс -1,44499 0 тд (19:) Tj / T1_0 1 Тс -2,78 0 тд (2005,) Tj / T1_2 1 Тс -5.558 0 Тд (Genes Dev. \ 240) Tj / T1_0 1 Тс 0 1.00001 TD (\ 240) Tj 0 1 ТД (Дмитрий Караченцев, Кавита Сарма, Дэнни Рейнберг и др.) Tj Т * (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс 15 0 0 15 61 641,99997 тм (подавление экспрессии генов и важно для митоза) Tj Т * (PR-Set7-зависимое метилирование гистона h5 Lys 20 функционирует в) Tj ET 61 580 м 566 580 л 0 0 мес. S BT ET BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 145.942 534,99994 тм (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс -3,50099 1 тд (Материал) Tj -2,77799 1,00001 тд (Дополнение) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 166 547,99997 тм (\ 240) Tj 32.78883 1 тд () Tj 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс -32.78883 0 Тд (http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2005/01/25/gad.1263005.DC1)Tj ET BT 0 г / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 145.942 503.99997 тм (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс -5.11299 1 Td (Ссылки) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 166 495,99994 тм (\ 240) Tj 28.89583 1 тд () Tj 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс -28.89583 0 Тд (http: // genesdev.cshlp.org/content/19/4/431.full.html#ref-list-1)Tj 0 г / T1_0 1 Тс 0 1.00001 TD (Эта статья цитирует 12 статей, 4 из которых доступны бесплатно по адресу:) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 145.942 473.99997 тм (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс -3,44598 1 тд (Лицензия) Tj ET BT / T1_1 1 Тс 11 0 0 11 109,86 185 447,99997 тм (Сервис) Tj -3,16599 1 тд (Оповещение по электронной почте) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 166 439,99994 тм (\ 240) Tj 17.39696 1 Td () Tj 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс -4,892 0 Тд (нажмите здесь.) Tj 0 г / T1_0 1 Тс -12.50496 0 Тд (правый угол статьи или) Tj Т * (Получайте бесплатные уведомления по электронной почте, когда новые статьи цитируют эту статью — зарегистрируйтесь \ в рамке вверху) Tj ET 61 427 кв.м. 566 427 л 0 0 мес. S BT ET q 468 0 0 60 79.5117 см -1.00001 TL / Im1 Do Q 61 77 кв.м. 566 77 л 0 0 мес. S BT ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 63 51 тм (Пресса лаборатории Колд-Спринг-Харбор) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 8 0 0 8 505,97 174 788 тм () Tj 0 0 1 рг -16.44997 0 Тд (Пресса лаборатории Колд-Спринг-Харбор) Tj 0 г -14,50799 0 Тд (23 июля 2021 г. — опубликовано) Tj 0 0 1 рг -8.67099 0 Тд (genesdev.cshlp.org) Tj 0 г -8.11399 0 Тд (Скачано с) Tj ET конечный поток эндобдж 143 0 объект > / Filter / FlateDecode / Height 300 / Length 73148 / Name / X / Subtype / Image / Type / XObject / Width 1150 >> stream Hypq ޽ lJjBa 80 @ bA «pRHB) CSJP (M` * jQC`Ӻ \ =} Oaq ‘ٍ3 ~ ?ly |` #

Анализ трех пероксиредоксинов 1-Cys из Aspergillus fumigatus показывает, что цитозольный Prx1 является центральным для метаболизма и вирулентности H2O2.