Марина Дружинина. Лекарство от контрольной — КиберПедия
Классный выдался денёк! Уроки закончились рано, погода отличная. Мы ка-а-ак выскочили из школы! Ка-а-ак начали кидаться снежками, прыгать по сугробам и хохотать! Всю жизнь бы так веселился!
Вдруг Владик Гусев спохватился:
— Братцы! Завтра же контроша по математике! Готовиться нужно! — и, отряхиваясь от снега, поспешил к дому.
— Подумаешь, контроша! — Вовка швырнул снежок вслед Владику и развалился на снегу. — Я предлагаю её пр-ропустить!
— Как это? — не понял я.
— А вот так! — Вовка запихнул в рот снег и широким жестом обвёл сугробы. — Вон сколько тут антиконтролина! Препарат сертифицирован! Лёгкая простуда на время контрольной гарантирована! Завтра поболеем — в школу не пойдём! Здорово?
— Здорово! — одобрил я и тоже принял противоконтрольного лекарства.
Потом мы ещё попрыгали по сугробам, слепили снеговика в виде нашего завуча Михаила Яковлевича, съели по дополнительной порции антиконтролинчика — для верности — и отправились по домам.
Утром я проснулся и сам себя не узнал. Одна щека стала раза в три толще другой, и при этом ужасно болел зуб. Ничего себе лёгкая простуда на один день!
— Ой, какой флюс! — всплеснула руками бабушка, увидев меня. — Немедленно к врачу! Школа отменяется! Я позвоню учительнице.
В общем, противоконтрольное средство сработало безотказно. Это, конечно, меня порадовало. Но не совсем так, как хотелось бы. У кого хоть когда-нибудь болели зубы, кто попадал в руки к зубным врачам, тот меня поймёт. А доктор к тому же «утешил» напоследок:
— Зуб поболит ещё пару дней. Так что терпи и не забывай полоскать.
Вечером звоню Вовке:
— Как дела?
В трубке раздалось какое-то шипение. Я с трудом разобрал, что это Вовка отвечает:
— У меня голос пропал.
Разговора не получилось.
На следующий день, в субботу, зуб, как и было обещано, продолжал ныть. Каждый час бабушка давала мне лекарство, и я старательно полоскал рот. Болеть ещё и в воскресенье никак не входило в мои планы: мы с мамой собирались идти в цирк.
В воскресенье я вскочил чуть свет, чтоб не опоздать, но мама тут же испортила мне настроение:
— Никакого цирка! Сиди дома и полощи, чтоб к понедельнику выздороветь. Не пропускать же опять занятия — конец четверти!
Я — скорей к телефону, Вовке звонить:
— Твой антиконтролин, оказывается, ещё и антицирколин! Цирк из-за него отменился! Предупреждать надо!
— Он ещё и антикинол! — сипло подхватил Вовка. — Из-за него меня в кино не пустили! Кто же знал, что будет столько побочных действий!
— Думать надо! — возмутился я.
— Сам дурак! — отрезал он!
Короче говоря, мы совсем разругались и отправились полоскать: я — зуб, Вовка — горло.
В понедельник подхожу к школе и вижу: Вовка! Тоже, значит, подлечился.
— Как жизнь? — спрашиваю.
— Отлично! — хлопнул меня по плечу Вовка. — Главное, контрошу-то проболели!
Мы расхохотались и пошли в класс. Первый урок — математика.
— Ручкин и Семечкин! Выздоровели! — обрадовалась Алевтина Васильевна. — Очень хорошо! Скорее садитесь и доставайте чистые листочки. Сейчас будете писать контрольную работу, которую пропустили в пятницу. А мы пока займёмся проверкой домашнего задания.
Вот так номер! Антиконтролин оказался форменным обдурином!
Или, может, дело не в нём?
______________________________________________________________________________________
И.С. Тургенев
Стихотворение в прозе «Милостыня»
Вблизи большого города, по широкой проезжей дороге шел старый, больной человек.
Он шатался на ходу; его исхудалые ноги, путаясь, волочась и спотыкаясь, ступали тяжко и слабо, словно чужие; одежда на нем висела лохмотьями; непокрытая голова падала на грудь… Он изнемогал.
Он присел на придорожный камень, наклонился вперед, облокотился, закрыл лицо обеими руками — и сквозь искривленные пальцы закапали слезы на сухую, седую пыль.
Он вспоминал…
Вспоминал он, как и он был некогда здоров и богат — и как он здоровье истратил, а богатство роздал другим, друзьям и недругам. .. И вот теперь у него нет куска хлеба — и все его покинули, друзья еще раньше врагов… Неужели ж ему унизиться до того, чтобы просить милостыню? И горько ему было на сердце и стыдно.
Вдруг он услышал, что кто-то зовет его по имени; он поднял усталую голову — и увидал перед собою незнакомца.
Лицо спокойное и важное, но не строгое; глаза не лучистые, а светлые; взор пронзительный, но не злой.
— Ты всё свое богатство роздал, — послышался ровный голос… — Но ведь ты не жалеешь о том, что добро делал?
— Не жалею, — ответил со вздохом старик, — только вот умираю я теперь.
— И не было бы на свете нищих, которые к тебе протягивали руку, — продолжал незнакомец, — не над кем было бы тебе показать свою добродетель, не мог бы ты упражняться в ней?
— Так и ты теперь не гордись, бедняк, — заговорил опять незнакомец, — ступай, протягивай руку, доставь и ты другим добрым людям возможность показать на деле, что они добры.
Старик встрепенулся, вскинул глазами… но незнакомец уже исчез; а вдали на дороге показался прохожий.
Старик подошел к нему — и протянул руку. Этот прохожий отвернулся с суровым видом и не дал ничего.
Но за ним шел другой — и тот подал старику малую милостыню.
И старик купил себе на данные гроши хлеба — и сладок показался ему выпрошенный кусок — и не было стыда у него на сердце, а напротив: его осенила тихая радость.
______________________________________________________________________________________
Отзыв о рассказе Дружининой «Лекарство от контрольной»
Главные герои рассказа Марины Дружининой «Лекарство от контрольной» — школьники Ручкин и Семечкин. Однажды они, играя после школы в снежки, придумали способ, как пропустить контрольную по математике. Один из них, Вовка, предложил поесть снежков, чтобы немного поболеть и не ходить в школу.
На следующий день, в пятницу, один из героев рассказа проснулся с распухшей щекой и ноющим зубом.
Поначалу такой способ избежать контрольной школьникам понравился, но когда в воскресенье одному из них не разрешили идти в цирк, а другой не смог пойти в кино, ребята задумались.
А в понедельник они встретились в школе, а там учительница приготовила им неприятный сюрприз. Она сказала, что на уроке математики Ручкин и Семечкин будут писать контрольную, которую они пропустили в пятницу. Ребята поняли, что лекарство от контрольной, которое они придумали, не подействовало так, как они хотели.
Таково краткое содержание рассказа.
Главная мысль рассказа заключается в том, что обман и ловкачество до добра не доводят. Главные герои рассказа специально испортили себе здоровье, чтобы не ходить на контрольную. Но поставленной цели они не достигли, потому что после выздоровления им все равно пришлось писать контрольную.
Рассказ учит серьезно относиться к учебе в школе, не увиливать от контрольных мероприятий и беречь свое здоровье.
В рассказе мне понравилась учительница Алевтина Васильевна, которая не оставила без внимания тот факт, что Ручкин и Семечкин пропустили по болезни контрольную, и заставила их выполнить эту работу после выздоровления. Этот рассказ мне понравился тем, что он ещё раз показывает: не надо изобретать велосипед, не надо искать способ, чтобы избежать контрольной. Надо учиться на совесть, и тогда страхов перед контрольными не будет. Знания приобретаются не для мамы, папы или учительницы. Знания приобретаются для себя.
Какие пословицы подходят к рассказу Дружининой «Лекарство от контрольной»?
Сами себя перехитрили.
Болезнь человека не красит.
Думать — самая трудная из работ.
Лекарство от контрольной — отзывы о книге
«Лекарство от контрольной»
Каждый школьник знает, как лучше всего избежать контрольную, чем удивить маму и как не перетрудиться в подготовке домашнего задания, особенно если астрологи и так пророчат тебе «невероятное везение».
Оценок: 5
Добавить отзывАвтор — Марина Дружинина
М. Дружинина – член Союза писателей России, автор более 80 книг, выпущенных различными издательствами. В настоящее время общий тираж книг М. Дружининой – более 5.5 млн. экземпляров. М. Дружинина – лауреат различных литературных премий. В 2007 году сборник сказок «Волшебная флейта» был признан Ассоциацией книгоиздателей России лучшей детской книгой.
Рецензии
«Лекарство от контрольной». Первое апреля и другие развлечения
Современный книжный рынок предлагает много литературы для подростков и еще больше для малышей, которые только учатся читать. А вот сектор для младших школьников – увы! – практически не охвачен.
Конечно, если ваш ребенок в 7-8 лет уже готов читать книги для 12-летних, вам, считайте, повезло.
А если нет? Если психологически и интеллектуально он вполне соответствует своему возрасту? Тогда подобрать для него достойное чтение оказывается задачей непростой. Именно поэтому книга Марины Дружининой меня по-настоящему порадовала.
Эта история просто идеальна для младших школьников. Она написана простым, легим языком. Текст делится на главки, каждая из которых представляет собой отдельную историю, и все они совсем коротенькие, динамичные, так что даже плохо читающий первоклашка не успеет соскучиться настолько, чтобы отложить книгу.
К тому же эти истории – все до единой! – актуальны для младших школьников. Судите сами: мораль в них присутствует, но ненавязчиво, при этом они смешные, как настоящий анекдот из школьной жизни.
Кстати, в книге очень здорово объясняется, чем плохи дурацкие первоапрельских шутки. И что когда планируешь над кем-то подшутить, надо заранее подумать, будет ли адресату так же весело, как и тебе самому.
Что касается «лекарства от контрольной», давшего название книге, так это, оказывается, обычный снег, которого наелись лоботрясы. Они надеялись в итоге заболеть и не ходить в школу. Только вот из-за болезни один не попал в цирк, другой – в кино. А контрольную им потом все равно пришлось написать.
Отзывы
Книга очень понравилась всей семье! Забавные, веселые, шуточные рассказы. От некоторых даже не удержаться от смеха, другие философские. Думаю, когда сын пойдёт в школу, рассказы ему понравятся ещё больше. Чувствуется, что автор близок к детям. Довольна книгой.
Книга мне и сыну не очень понравилась, показалась несколько занудной, хотя местами она забавная. В принципе, почитать для «расслабления мозгов» вполне возможно:)
Марина Дружинина. Лекарство от контрольной — Студопедия.Нет
Классный выдался денёк! Уроки закончились рано, погода отличная. Мы ка-а-ак выскочили из школы! Ка-а-ак начали кидаться снежками, прыгать по сугробам и хохотать! Всю жизнь бы так веселился!
Вдруг Владик Гусев спохватился:
— Братцы! Завтра же контроша по математике! Готовиться нужно! — и, отряхиваясь от снега, поспешил к дому.
— Подумаешь, контроша! — Вовка швырнул снежок вслед Владику и развалился на снегу. — Я предлагаю её пр-ропустить!
— Как это? — не понял я.
— А вот так! — Вовка запихнул в рот снег и широким жестом обвёл сугробы. — Вон сколько тут антиконтролина! Препарат сертифицирован! Лёгкая простуда на время контрольной гарантирована! Завтра поболеем — в школу не пойдём! Здорово?
— Здорово! — одобрил я и тоже принял противоконтрольного лекарства.
Потом мы ещё попрыгали по сугробам, слепили снеговика в виде нашего завуча Михаила Яковлевича, съели по дополнительной порции антиконтролинчика — для верности — и отправились по домам.
Утром я проснулся и сам себя не узнал. Одна щека стала раза в три толще другой, и при этом ужасно болел зуб. Ничего себе лёгкая простуда на один день!
— Ой, какой флюс! — всплеснула руками бабушка, увидев меня. — Немедленно к врачу! Школа отменяется! Я позвоню учительнице.
В общем, противоконтрольное средство сработало безотказно. Это, конечно, меня порадовало. Но не совсем так, как хотелось бы. У кого хоть когда-нибудь болели зубы, кто попадал в руки к зубным врачам, тот меня поймёт. А доктор к тому же «утешил» напоследок:
— Зуб поболит ещё пару дней. Так что терпи и не забывай полоскать.
Вечером звоню Вовке:
— Как дела?
В трубке раздалось какое-то шипение. Я с трудом разобрал, что это Вовка отвечает:
— У меня голос пропал.
Разговора не получилось.
На следующий день, в субботу, зуб, как и было обещано, продолжал ныть. Каждый час бабушка давала мне лекарство, и я старательно полоскал рот. Болеть ещё и в воскресенье никак не входило в мои планы: мы с мамой собирались идти в цирк.
В воскресенье я вскочил чуть свет, чтоб не опоздать, но мама тут же испортила мне настроение:
— Никакого цирка! Сиди дома и полощи, чтоб к понедельнику выздороветь. Не пропускать же опять занятия — конец четверти!
Я — скорей к телефону, Вовке звонить:
— Твой антиконтролин, оказывается, ещё и антицирколин! Цирк из-за него отменился! Предупреждать надо!
— Он ещё и антикинол! — сипло подхватил Вовка. — Из-за него меня в кино не пустили! Кто же знал, что будет столько побочных действий!
— Думать надо! — возмутился я.
— Сам дурак! — отрезал он!
Короче говоря, мы совсем разругались и отправились полоскать: я — зуб, Вовка — горло.
В понедельник подхожу к школе и вижу: Вовка! Тоже, значит, подлечился.
— Как жизнь? — спрашиваю.
— Отлично! — хлопнул меня по плечу Вовка. — Главное, контрошу-то проболели!
Мы расхохотались и пошли в класс. Первый урок — математика.
— Ручкин и Семечкин! Выздоровели! — обрадовалась Алевтина Васильевна. — Очень хорошо! Скорее садитесь и доставайте чистые листочки. Сейчас будете писать контрольную работу, которую пропустили в пятницу. А мы пока займёмся проверкой домашнего задания.
Вот так номер! Антиконтролин оказался форменным обдурином!
Или, может, дело не в нём?
Леонид Каминский
Сочинение
Лена сидела за столом и делала уроки. Смеркалось, но от снега, лежавшего во дворе сугробами, в комнате было ещё светло.
Перед Леной лежала раскрытая тетрадь, в которой было написано всего две фразы:
Как я помогаю маме.
Сочинение.
Дальше работа не шла. Где-то у соседей играл магнитофон. Слышно было, как Алла Пугачёва настойчиво повторяла: «Я так хочу, чтобы лето не кончалось!..».
«А правда, – мечтательно подумала Лена, – хорошо, если бы лето не кончалось!.. Загорай себе, купайся, и никаких тебе сочинений!».
Она снова прочла заголовок: «Как я помогаю маме». «А как я помогаю? И когда тут помогать, если на дом столько задают!».
В комнате загорелся свет: это вошла мама.
– Сиди, сиди, я тебе мешать не буду, я только в комнате немного приберу. – Она стала протирать книжные полки тряпкой.
Лена начала писать:
«Я помогаю маме по хозяйству. Убираю квартиру, вытираю тряпкой пыль с мебели».
– Что же ты свою одежду разбросала по всей комнате? – спросила мама. Вопрос был, конечно, риторическим, потому что мама и не ждала ответа. Она стала складывать вещи в шкаф.
«Раскладываю вещи по местам», – написала Лена.
– Кстати, передник твой постирать бы нужно, – продолжала мама разговаривать сама с собой.
«Стираю бельё», – написала Лена, потом подумала и добавила: «И глажу».
– Мама, у меня там на платье пуговица оторвалась, – напомнила Лена и написала: «Пришиваю пуговицы, если нужно».
Мама пришила пуговицу, потом вышла на кухню и вернулась с ведром и шваброй.
Отодвигая стулья, стала протирать пол.
– Ну-ка подними ноги, – сказала мама, проворно орудуя тряпкой.
– Мама, ты мне мешаешь! – проворчала Лена и, не опуская ног, написала: «Мою полы».
Из кухни потянуло чем-то горелым.
– Ой, у меня картошка на плите! – крикнула мама и бросилась на кухню.
«Чищу картошку и готовлю ужин», – написала Лена.
– Лена, ужинать! – позвала из кухни мама.
– Сейчас! – Лена откинулась на спинку стула и потянулась.
В прихожей раздался звонок.
– Лена, это к тебе! – крикнула мама.
В комнату, румяная от мороза, вошла Оля, одноклассница Лены.
– Я ненадолго. Мама послала за хлебом, и я решила по дороге – к тебе.
Лена взяла ручку и написала: «Хожу в магазин за хлебом и другими продуктами».
– Ты что, сочинение пишешь? – спросила Оля. – Дай-ка посмотреть.
Оля заглянула в тетрадь и прыснула:
– Ну ты даёшь! Да это же всё неправда! Ты же всё это сочинила!
– А кто сказал, что нельзя сочинять? – обиделась Лена. – Ведь поэтому так и называется: со-чи-не-ние!
Рассказы (Дружинина Марина) — слушать аудиокнигу онлайн
00:00 / 07:16
01_А всё из-за смешинки
07:01
02_Батарейки
07:37
03_Битва с вампирами
04:05
04_Брависсимо!
07:01
05_Встреча с известным писателем
11:42
06_Гороскоп
02:44
07_Для разнообразия
04:53
08_Загадочный букет
09:50
09_Дело чести
06:14
10_Звоните, вам споют!
05:19
11_Кому отдать ужин
04:53
12_Кроссворд с продолжением
05:02
13_Лекарство от контрольной
06:07
14_Мой весёлый выходной
05:50
15_Мой приятель супермен
03:54
16_Мы с тобой одной крови
04:18
17_Непослушные цыплята
02:52
18_Объяснительная записка
05:06
19_От приятного к неприятному
05:23
20_Открытка
07:32
21_Пальцем в небо
01:42
22_Песенка обо всём
04:16
23_Самая верная примета
05:51
24_Старушка и контролёры
04:31
26_Элементарно, Ватсон!
07:25
27_Вовкина сдача
04:20
28_Впечатляющие новости
07:04
29_Гошка и Мурзилка
01:39
30_Девочка наоборот
02:09
31_Дразнительное имя
08:56
32_Звезда и капуста
02:59
33_Коварные усы
03:07
35_На что намекает котёнок Кузька, когда говорит мур-мур-мур
03:25
36_Очень полезный подарок
09:02
37_Про Федю, Федину маму и про кое-кого ещё
03:42
38_Прыжок фигуристки
05:42
39_Ручка и ножка
04:19
40_Сборы набирают обороты
03:15
41_Семейное увлечение
03:29
42_Серые клеточки
04:27
43_Спортивная шоколадка
05:46
44_Супер-железяка
03:04
45_Хорошо быть оптимистом
Аудио Рассказы Марины Дружининой слушать онлайн
Аудио рассказы Марины Дружининой о жизни маленьких школьников. Рассказы можно слушать онлайн или скачать. Аудиокнига с рассказами Марины Дружининой представлена в mp3 формате.
- 1. А всё из-за смешинки 7:04
- 2. Батарейки 7:01
- 3. Битва с вампирами 7:37
- 4. Брависсимо! 4:05
- 5. Вовкина сдача 7:25
- 6. Впечатляющие новости 4:20
- 7. Встреча с известным писателем 7:01
- 8. Гороскоп 11:42
- 9. Гошка и Мурзилка 7:03
- 10. Девочка наоборот 1:39
- 11. Дело чести 9:50
- 12. Для разнообразия 2:43
- 13. Дразнительное имя 2:09
- 14. Загадочный букет 4:53
- 15. Звезда и капуста 8:56
- 16. Звоните, вам споют! 6:14
- 17. Коварные усы 2:58
- 18. Кому отдать ужин 5:19
- 19. Кроссворд с продолжением 4:53
- 20. Кто я 6:13
- 21. Лекарство от контрольной 5:02
- 22. Мой весёлый выходной 6:07
- 23. Мой приятель супермен 5:50
- 24. Мы с тобой одной крови 3:54
- 25. На что намекает котёнок Кузька, когда говорит «мур-мур-мур» 3:07
- 26. Непослушные цыплята 4:18
- 27. Объяснительная записка 2:52
- 28. Открытка 5:23
- 29. От приятного к неприятному 5:06
- 30. Очень полезный подарок 3:25
- 31. Пальцем в небо 7:32
- 32. Песенка обо всём 1:42
- 33. Про Федю, Федину маму и про кое-кого ещё 9:02
- 34. Прыжок фигуристки 3:42
- 35. Ручка и ножка 5:42
- 36. Самая верная примета 4:16
- 37. Сборы набирают обороты 4:19
- 38. Семейное увлечение 3:15
- 39. Серые клеточки 3:29
- 40. Спортивная шоколадка 4:27
- 41. Старушка и контролёры 5:50
- 42. Супер-железяка 5:46
- 43. Сюрприз 2:50
- 44. Хорошо быть оптимистом 3:04
- 45. Элементарно, Ватсон! 4:31
Аудио Рассказы Марины Дружининой, содержание:
Веселые аудио Рассказы Марины Дружининой – это сборник историй о школьниках – мальчишках и девчонках. Каких только приключений не происходит с ними в школе и дома. Например, герою первого рассказа на уроке попадает в рот смешинка, и его выгоняют из класса думать над своим поведением. А во второй истории Павлик пытается спрятать от младшего брата свою любимую игру, но все заканчивается совершенно невероятным образом.
Что бывает, когда затеваешь битву с вампирами, или если вдруг твой приятель супермен.
Можно ли заскучать, если в твоем дневнике стоят только пятерки? Оказывается, можно.
Именно поэтому отличник Стасик, не в силах более выносить этого однообразия, поставил себе в дневник разноцветных четверок, троек, двоек и даже колов!
А как поступить, если кассирша не верит вам и требует заплатить за кефир, который вы не покупали? Инструкция – в рассказе «Коварные усы».
Если дослушать все эти аудио рассказы онлайн, можно услышать подборку впечатляющих новостей, встретиться с очень известным писателем, а так же познакомиться с девочкой наоборот – да, и такое тоже бывает!
Именно поэтому истории от Марины Дружининой с удовольствием слушают не только школьники, но и их родители.
Марина Дружинина
Марина Дружинина – редактор журнала «Весёлые картинки», автор детских книг, изданных тиражом более 3 миллионов экземпляров.
Литературная жизнь Дружининой первоначально не была связана с детской поэзией. Она родилась в 1953 году в Москве, закончила технический вуз, работала в «Литературной газете». Детские стихи, как это часто бывает, начала писать после рождения сына. Ребёнок вырос, но писать стихи для малышей она не перестала. Более того, в процессе работы у поэта складывалось собственное представление о том, какими они должны быть. «Это возраст общения, и поэзия для малышей должна быть поэзией общения», — считает М. Дружинина.
Её первое детское стихотворение появилось в журнале «Весёлые картинки» в 1988 году, первая книга – «Дали Маше погремушку» — вышла в 1991, вторая – «Ослик, ослик, где твой хвостик?» — в 1993. Поэт любит создавать четверостишия-диалоги. Стихи Марины Дружининой никогда не бывают описанием, констатацией обыденности. Они объединены темой, которая, так или иначе, звучит в каждом стихотворении: темой общения, сближения, дружбы. Весь богатый мир животных живёт, пульсирует, находиться в постоянном движении и общении друг с другом, а значит, и с ребёнком. У Дружининой много произведений, которые сейчас называются «прикладной поэзией». Они учат ребенка различать цвета, формы, запоминать цифры, алфавит, правила поведения в городе, видеть частное, индивидуальное в общем. Часто это комментарии, подписи под картинками. Но и здесь М. Дружинина остаётся поэтом, сохраняя свою интонацию, образность, богатство лексики. Мастерство поэта в том и состоит.
Дружинина, М. Мой весёлый выходной: рассказы, стихи [Текст] /Марина Дружинина.- М.: Аквилегия-М.- 188 с.- (Школьные прикольные истории).
Смешные рассказы и стихи про современных мальчишек и девчонок. Чего только не происходит с этими выдумщиками и озорниками в школе и дома!
Каждый школьник знает, как лучше всего избежать контрольную, чем удивить маму и как не перетрудиться в подготовке домашнего задания, особенно если астрологи и так пророчат тебе «невероятное везение». Но не все знают, как правильно давать сдачу, как исправить двойки с помощью радиопередачи и не смеяться, услышав впервые слово «пер-пен-ди-ку-ляр». Герои рассказов Марины Дружининой — обычные ребята, с которыми случаются самые разные истории. Тонкий юмор, умение найти неожиданный выход в забавных ситуациях — все это помогает ребятам увидеть себя со стороны и посмеяться над собой. В сборник вошло более 20 рассказов, среди которых: «Звоните, вам споют!», «Мой приятель — супермен», «Лекарство от контрольной», «Вовкина сдача», «Мой весёлый выходной» и другие.
Функциональная характеристика гистон-метилтрансферазы Drosophila Hmt4-20 / Suv4-20
Генетика. 2008 May; 179 (1): 317–322.
Отделение молекулярной биологии и биохимии, Институт Ваксмана, Онкологический центр Нью-Джерси, Университет Рутгерса, Пискатауэй, Нью-Джерси 08854-8020
1 Автор для переписки: Институт Ваксмана, Университет Рутгерса, 190 Frelinghuysen Rd., NJcataway 08854. Эл. Почта: ude.sregtur.lcbm@drawetsОтветственный редактор: Т.Schüpbach
Поступила в редакцию 29 января 2008 г .; Принято 29 февраля 2008 г.
Авторские права © 2008 Американского общества генетиков Эта статья цитируется в других статьях PMC.Abstract
Считается, что ди- и триметилирование гистона h5 lysine20 (h5K20) играет важную роль в контроле экспрессии генов у позвоночных и у дрозофилы. Вызывая нулевую мутацию в Drosophila Suv4-20 , мы показываем, что он кодирует гистоновую h5-лизин20-ди- и триметилтрансферазу.У мутантов Suv4-20 ди- и триметильные метки h5K20 сильно уменьшены или отсутствуют, а монометильная метка значительно увеличена. Мы обнаружили, что даже с этой биохимической функцией Suv4-20 не требуется для выживания и не контролирует вариэгацию с эффектом положения (PEV).
Организация ХРОМАТИНА частично регулируется посттрансляционной модификацией четырех гистоновых белков h3A, h3B, h4 и h5, которые контролируют упаковку ДНК в нуклеосомы.Гистоновые хвосты, состоящие из 20–35, в основном основных аминокислот, являются основными мишенями для этих модификаций. Считается, что метилирование гистоновых хвостов контролирует транскрипцию, в первую очередь, за счет упаковки хроматина в открытые домены, доступные для аппарата транскрипции, и в недоступные закрытые домены (Strahl and Allis 2000; Rice and Allis 2001; Sims et al. 2006). Недавно было показано, что метилирование гистонового хвоста также действует в ответ на повреждение ДНК у дрожжей и в прохождении клеточного цикла у дрозофилы и позвоночных (Sanders et al. 2004; Jorgensen et al. 2007; Сакагути и Стюард 2007; Тардат и др. 2007).
Гистоновые лизины могут быть моно-, ди- или триметилированными (me1, me2 и me3). Единственная метилированная аминокислота в хвосте гистона h5 — лизин 20 (h5K20). h5K20 me1, me2 и me3 относительно стабильны в клеточном цикле и развитии (Rice et al. 2002; Karachentsev et al. 2005). Me1 гистона h5 у позвоночных и дрозофил контролируется метилтрансферазой PR-Set7 (или -Set 8) (Fang et al. 2002; Nishioka et al. 2002).
Монометилтрансфераза PR-Set7 важна как для дрозофилы, так и для позвоночных. Дрозофила, лишенная этого фермента, погибает при переходе от личинки к куколке. В диплоидных клетках мозга мутантных личинок h5K20 me1 сильно снижен или отсутствует, митотическая прогрессия аномальна, и контрольная точка повреждения ДНК активирована. Кроме того, в этих клетках наблюдается сильный дефект конденсации хромосом. h5K20 me1, по-видимому, важен для нормального прохождения клеточного цикла, а не для транскрипции (Sakaguchi and Steward 2007).
Триметилтрансфераза гистона h5-K20, Suv4-20, была выделена и охарактеризована Schotta et al. (2004). Два гена Suv4-20 , Suv4-20h2 и Suv4-20h3 , существуют у позвоночных, но существует только один ортолог Drosophila. У позвоночных Suv4-20-зависимое триметилирование гистона h5-K20 сильно связано с конститутивным гетерохроматином в хромоцентре. Метка me3, по-видимому, распределяется по органам и изменяется в течение жизни животного (Караченцев и др. 2007).
Многие результаты у позвоночных, документирующие изменения гистона h5K20 me3 в раковых клетках и старение, предполагают, что эта модификация также играет фундаментальную роль в подавлении генов (Sarg et al. 2002; Wang et al. 2007). Чтобы исследовать важность этой модификации у дрозофилы и определить разницу в потребностях между h5K20 me1 и me3, мы индуцировали аллель полной потери функции Suv4-20 .
Suv4-20 представляет собой ди- и триметилтрансферазу дрозофилы h5K20.У личинок, лишенных фермента, h5K20 me1 значительно повышен. Мы не обнаружили потребности в Suv4-20 для выживания в нормальных и стрессовых условиях (повреждение ДНК и тепловой шок) у мух, выращиваемых в лаборатории. Неожиданно Suv4-20 не подавлял позиционно-зависимую пестролистность (PEV) (Schotta et al .2004).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мухи:
Все поголовья мух были получены из Bloomington Stock Center, за исключением P [EP1216a] , отправленного из складского центра в Сегеде, и винограда fsA4 из W.Theurkauf. Подвой w 118 использовали как подвой дикого типа во всех экспериментах.
ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинг:
Для ОТ-ПЦР суммарную РНК экстрагировали из личинок дикого типа и мутантных личинок. Эта РНК не обрабатывалась ДНКазой и служила матрицей для комбинированной обратной транскрипции и ПЦР с использованием набора QIAGEN (Валенсия, Калифорния) OneStep RT – PCR. ДНК, загрязняющая препарат РНК, также может быть амплифицирована этим методом (ДНК в). Праймеры, используемые для амплификации, указаны в (Suv4-20 F, 5′-ctcttaaggtggacacgcaacaactgaa-3 ‘; Suv4-20 R, 5′-cctctgtcagctcggcgatgcag-3′; skpA F, 5’-tgggtgagcatttctggaa skppA-3 ‘; ′ -Gcattctcatcgtcctccatgc-3 ′).Вестерн-блоттинг выполняли, как описано (Whalen and Steward 1993). Незеленые (мужские) личинки были собраны из стад, сбалансированных с использованием FM7-GFP , гомогенизированных в 2–3 объемах стандартного загрузочного буфера белка SDS – PAGE. Антитела использовали в следующих разведениях: кроличьи поликлональные антитела против h5-K20 моно-, ди- и триметил и гистон h5 (Upstate) 1: 1000.
Геномная область Suv4-20-skpA . Три вставки элемента P в ген Suv4-20; указаны две недавно выделенные делеции и праймеры (стрелки), использованные в экспериментах ОТ-ПЦР.
Suv4-20 — ди- и триметилтрансфераза гистона h5K20. (А) ОТ-ПЦР-эксперимент с РНК, выделенной из гемизиготных личинок Df (1) 174 и Df (1) 109 . Только мРНК skpA отсутствует в Df (1) 174 . (B) Вестерн-блоты дикого типа и Df (1) 109; P {w + , skpA} двойных гомозиготных личинок. Монометильная метка повышена у животных с дефицитом, тогда как метки h5K20 me2 и me3 сильно уменьшены или отсутствуют.
Препараты хромосом слюнных желез и окрашивание антител:
Слюнные железы личинок третьего возраста вскрывали, политенные хромосомы выделяли и помещали на предметные стекла, как описано (Lis et al. 2000). Политеновые хромосомы окрашивали ди- и триметил-поликлональным кроличьим анти-h5-K20 (Upstate) 1: 100.
Анализ повреждений ДНК:
Чувствительность к гидроксимочевине (HU) и метилметансульфонату (MMS) определяли количественно следующим образом: 10 самок и 10 самцов скрещивали в одном флаконе. Через 24 часа родителей перевели в новый флакон, а через 24 часа в корм добавили лекарство или дистиллированный H 2 O (более пяти флаконов на анализ). Были подсчитаны все классы взрослого потомства в кроссе grp или самки в других кроссах.Гомозиготные Df (1) 174 и Df (1) 109 были гомо- или гетерозиготными по P {w + , skpA} . Процент гомозиготных мух указан в.
ТАБЛИЦА 1
Чувствительность Suv4-20 к препаратам, повреждающим ДНК, HU и MMS
Генотип | H 2 O | 20 мм HU | |
---|---|---|---|
grp fsA4 / + × grp fsA4 / + | 29.7 (546) | 0 (119) | 2,22 (316) |
109 / FM7; P {w + , skpA} / + × 109 / Y; P {w + , skpA} / + | 53,0 (234) | 48,3 (331) | 50,0 (286) |
174 / FM7; P {w + , skpA} / + × 174 / Y; P {w + , skpA} / + | 42,6 (359) | 44,8 (399) | 47,4 (388) |
Реакция на γ-облучение:
Личинки третьей стадии были облучены с 2000 Р.Мозг препарировали, фиксировали и раздавливали через 30 мин и 2 часа после облучения и подсчитывали количество клеток в митозе, как описано (Sakaguchi and Steward 2007). Все митотические индексы (MI; митотические клетки / общее количество клеток × 100) были нормализованы относительно их соответствующего контрольного индекса t = 0 (2,16 для дикого типа, 3,10 для mei-41 и 2,22 для Df (1) 174 и Df (1) 109 ).
Фенотипическая характеристика
щетины и белого пестры:Для изучения PEV, w 118 / w 118 , Df (1) 174 / FM7 , FM7 (1) 109 / , P [BG00814] / P [BG00814] и w; Su (var) 3-9 06 , e, ro / TM6 Скрещены дев с T (2; 3) Sb v , In (3R) Mo , Sb 1 , и sr 1 / TM3 самцов.В следующем поколении четыре щитковых щетинки по крайней мере 30 транс -гетерозиготных самок были оценены как принадлежащие к дикому типу или Sb . Кроме того, стада мух, несущие w + трансгенов, вставленных в центромерный или теломерный гетерохроматин на второй, третьей или четвертой хромосоме (Cryderman et al. 1998, 1999), были скрещены с w 118 / w 118 , Df (1) 174 / FM7 или Df (1) 109 / FM7 .Сравнивали цвета глаз гетерозиготных самок F 1 trans .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Индукция нулевого аллеля
Suv4-20 :Доступны три линии P -элементов со вставками в ген Suv4-20 (). P [BG00814] (Schotta et al. 2004), P [EP1216a] и P [EY07422] не показали значительного снижения h5K20 me3 при вестерн-блоттинге или окрашивании слюнных желез, поэтому мы решили для получения нулевого аллеля для изучения функции гена.
Чтобы вызвать нулевую мутацию, мы мобилизовали P [EY07422] и получили шесть мутантов с летальным удалением личинок. Молекулярный анализ и секвенирование точек разрыва делеции показывают, что пять из наших мутантных линий были похожи на Df (1) 174 . Одна точка разрыва этой делеции находится в первом предсказанном экзоне skpA , а другая точка разрыва — в первом предсказанном интроне Suv4-20. Мы исследовали с помощью ОТ-ПЦР, присутствует ли какой-либо из двух транскриптов в делеции, и обнаружили, что фрагмент, кодируемый вторым и третьим экзоном Suv4-20 , может быть амплифицирован из Df (1) 174 РНК, что позволяет предположить что Suv4-20 обычно выражается в этих мушках (а).В одной дополнительной линии, Df (1) 109 , отсутствуют ∼600 п.н. на 5′-конце skpA , и делеция распространяется на первый кодирующий белок экзон Suv4-20 (и). В соответствии с этими наблюдениями, мы обнаружили Suv4-20-зависимый h5K20 me3 в экстрактах от Df (1) 174 личинок, но не в экстрактах от Df (1) 109 животных (дополнительный рисунок 1S).
Suv4-20 представляет собой гистон h5 лизин20 ди- и триметилтрансфераза:На Вестерн-блоттинге контрольных экстрактов дикого типа и Df (1) 174 (не показано) обнаружены все три модифицированных гистона.В экстрактах от личинок Df (1) 109 явно присутствует h5-K20 me1, но обнаруживаются только слабые полосы me2 и me 3 (). Эти слабые полосы me2 и me3, возможно, связаны с перекрестной реактивностью антитела с неметилированным гистоном h5. В то же время h5K20 me1 заметно увеличивается в экстрактах Df (1) 109 в отсутствие me2 и me3.
Как и ожидалось, на хромосомах слюнных желез Df (1) 109 личинок h5-K20 me2 и me3 сильно редуцированы или отсутствуют, в то время как на хромосомах дикого типа и Df (1) 174 их уровни и распределение нормальный ().Мы пришли к выводу, что Drosophila S uv4-20 кодирует метилтрансферазу, ответственную за ди- и триметилирование гистона h5K20.
Ди- и триметильная метка h5K20 не обнаруживается на хромосомах слюнных желез Df (1) 109 / Y . Показаны хромосомы дикого типа (слева) и мутантные хромосомы слюнных желез, окрашенные анти-диметилированным и анти-триметилированным антителом h5K20 (красный). ДНК окрашивали Hoechst (синий).
Функциональные требования для
Suv4-20 :Геномный трансген skpA P {w + , skpA} на третьей хромосоме спасает нулевых аллелей skpA до жизнеспособности (Murphy 2003).Гомозиготные Df (1) 174 и Df (1) 109 мух, несущих P {w + , skpA} , жизнеспособны и плодовиты. В обеих линиях коэффициент вылупления эмбрионов составляет всего ~ 60% от эмбрионов дикого типа.
Из-за этой частичной эмбриональной летальности мы исследовали, влияет ли дефицит на мейоз. Отличительным признаком мутаций, влияющих на мейоз, является нерасхождение хромосом, проявляющееся в производстве самок XXY. Мы не наблюдали увеличения фенотипа нерасхождения при скрещивании самок Df (1) 174 и Df (1) 109 с самцами, несущими отмеченную Y-хромосому.
Гены, функционирующие в ответ на повреждение ДНК, часто не являются существенными для жизнеспособности (Song 2005). Мы определили, есть ли у мутантов Suv4-20 дефекты в ответе на повреждение ДНК, подвергая мутантных личинок или эмбрионов воздействию гидроксимочевины и метилметансульфоната (Sibon et al. 1999). Выживание Df (1) 174 / Df (1) 174; P {w + , skpA} и Df (1) 109 / Df (1) 109; Мухи P {w + , skpA} не были затронуты, что показывает, что реакция на повреждение ДНК была нормальной у животных, лишенных Suv4-20 ().В качестве положительного контроля мы подвергли воздействию тех же препаратов винограда fsA4 ( grp fsA4 ), ортолога Drosophila Chk1 . Как и ожидалось, выживаемость гомозиготных мух grp fsA4 сильно пострадала (Sibon et al. 1999).
В Schizosaccharomyces pombe метилирование гистона h5-K20 не требуется для жизнеспособности, но контролирует время восстановления после повреждения ДНК, вызванного облучением (Sanders et al. 2004; Du et al. 2006). По существу, в том же эксперименте, что и на дрожжах, мы исследовали реакцию мух дикого типа и мутантов на γ-облучение. Определив ИМ, мы обнаружили, что реакция нормальная (). У дикого типа, как и ожидалось, ИМ резко упал через 30 мин после облучения. Df (1) 174 и Df (1) 109 показали аналогичный ответ на дикий тип. У дикого типа MI оставался подавленным в течение по крайней мере 2 часов. Оба дефицита восстанавливались быстрее, чем у дикого типа.Этот фенотип не зависит от Suv4-20 , потому что обе делеции вели себя одинаково. Мы использовали ортолог ATR mei-41 мухи в качестве положительного контроля и обнаружили, что MI mei-41 показал только 30% снижение ИМ через 30 минут после облучения (Hari et al. 1995).
ТАБЛИЦА 2
Suv4-20 и реакция на γ-облучение
Относительный MI (± 2SD) после γ-облучения | ||
---|---|---|
Генотип | 30 мин | 2 часа |
Дикий тип | 0.27 ± 0,14 | 0,48 ± 0,23 |
mei-41 D3 / mei-41 D3 | 0,70 ± 0,07 | 1,00 ± 0,40 |
109 P {w + , skpA} / P {w + , skpA} | 0,33 ± 0,17 | 1,05 ± 0,29 |
174/174; P {w + , skpA} / P {w + , skpA} | 0,16 ± 0,11 | 1,38 ± 0,20 |
Мы дополнительно проверили, влияют ли h5K20 me2 и me3 на тепло- шоковая реакция.Мы подвергали взрослых гомозиготных самок Df (1) 174 и Df (1) 109 , несущих одну копию трансгена skpA , и самок дикого типа при 36 ° в течение 60 мин. Были выполнены вестерн-блоттинги экстрактов этих самок и самок, не подвергшихся тепловому шоку. Индукция экспрессии белков HSP70 и HSP 23 была сходной у самок дикого типа и мутантных самок. В экстрактах всех мух, подвергшихся тепловому шоку, индукция двух белков была нормальной (результаты не показаны).
Suv4-20 и подавление PEV:Schotta et al. (2004) показал, что вставка элемента P в 3′-UTR Suv4-20, P [BG00814] функционирует как доминирующий подавитель T (2; 3) Sb v . На хромосоме T (2; 3) Sb v доминантный маркер щетины Stubble ( Sb ) локализован вблизи перицентрического гетерохроматина. Экспрессия этого перемещенного маркера варьируется на фоне дикого типа. Пестрота становится более выраженной на фоне мутанта Suv4-20 , индуцированного P.
Мы повторили эти эксперименты с той же линией P -элементов, использованной в Schotta et al. (2004) эксперимент с Df (1) 174 и Df (1) 109 и, в качестве контроля, с white 118 и Su (var) 3-9 (). Мы оценили одни и те же четыре щетинки щитка и обнаружили аналогичные числа во всех генетических комбинациях, за исключением Su (var) 3-9 (). Наименьшее количество щетинок Sb (29%) было у T (2; 3) Sb v .
ТАБЛИЦА 3
Фенотипическая характеристика щетины пестролистности
Генотип | % Sb щетинки |
---|---|
, sr 1 | 40 |
Df (1) 174 / In (3R) Mo, Sb 1 , sr 1 | 50 |
43 | |
w 118 / In (3R) Mo, Sb 1 , sr 1 | 34 |
Su (var) 3-9 06 / In (3R) Mo, Sb 1 , sr 1 | 100 |
TM3 / In (3R) Mo, Sb 1 , sr 1 | 29 |
Мы дополнительно проверили работу Suv4-20 90 009 в подавлении PEV путем скрещивания Df (1) 174 и Df (1) 109 самцов, несущих одну копию трансгена skpA девственницам из 10 хромосом тестера PEV, несущих w + вставок в центромере и теломерный гетерохроматин всех хромосом (см. материалы и методы; Cryderman et al. 1998, 1999). В следующем поколении исследовали гетерозиготных самок, не несущих P {w + , skpA} . Цвет глаз всех транс -гетерозиготных самок был неотличим от цвета глаз братьев и сестер, не несущих дефектов.
Оба этих эксперимента согласуются друг с другом и показывают, что Suv4-20 не контролирует экспрессию генов. Следовательно, название гена Suv4-20 вводит в заблуждение, и мы предлагаем переименовать ген в гистон-метилтрансфераза 4-20 ( hmt4-20 ).
ОБСУЖДЕНИЕ
Было показано, что два белка HMT4-20 позвоночных (Suv4-20h2 и Suv4-20h2) действуют как специфические нуклеосомные ферменты триметилирования h5K20 (Schotta et al. 2004). Недавно Suv4-20h3 был идентифицирован как ответственный за h5K20 me3 на теломерах позвоночных (Benetti et al. 2007). Ферментативная активность Suv4-20h2 у позвоночных пока не определена.
Мы обнаружили, что фермент Drosophila HMT4-20 / Suv4-20 обладает ди- и триметилирующей активностью.Одновременно с отсутствием меток h5K20 me2 и me3 уровень h5K20 me1 значительно повышается (), что позволяет предположить, что me1 представляет собой субстрат для фермента HMT4-20. Этот результат согласуется с нашим предыдущим наблюдением, что в отсутствие PR-Set7 и сильного снижения h5K20 me1 на хромосомах слюнных желез у личинок позднего третьего возраста me2 и me3 также уменьшаются (Karachentsev et al. 2005). Этот вывод также подтверждается наблюдением Pesavento et al. (2008), который с помощью масс-спектрометрии обнаружил, что в клетках HeLa h5K20 сначала монометилирован. Затем h5K20 me1 преобразуется в me2, и часть этого h5K20 me2 преобразуется в me3.
Наши генетические эксперименты показывают, что гистон h5K20 me2 и me3 не влияет на PEV. Этот результат удивителен, поскольку Schotta et al. (2004) сообщил, что у Drosophila P-вставка в третий экзон (3′-UTR) hmt4-20 / Suv4-20 P [BG00814] подавляла PEV репортерного гена Sb , перемещенного в гетерохроматин. .Мы протестировали несколько мутантных и контрольных хромосом на предмет их влияния на экспрессию транслоцированного гена Sb и обнаружили, что при обоих наших недостатках только в одном из них отсутствует hmt4-20 / Suv4-20 и P [BG00814] количество щетинок Sb было аналогичным (40, 50 и 43% соответственно). В комбинации с w 118 и в поголовье, несущем транслокацию, цифры были ниже (34 и 29%). В сочетании с четко определенным супрессором PEV, Su (var) 3-9 , 100% щетинок демонстрировали фенотип Sb .Наш второй подход — в котором мы тестировали влияние на PEV w + , вставленного в центромерный или теломерный гетерохроматин w 118 и двумя линиями делеций — не показал значительного изменения экспрессии w + трансгенов. Мы пришли к выводу, что hmt4-20 / Suv4-20 не имеет значительной функции в регуляции транскрипции.
Метильные метки гистонов считаются необходимыми для фундаментальных аспектов структуры хроматина и контроля экспрессии генов, репликации ДНК или митоза — процессов, важных для мух в лаборатории и в дикой природе.Ранее мы изучили распределение трех метильных меток h5K20 и показали, что они онтогенетически регулируются и выявляются специфично для клеточного цикла на хромосомах (Karachentsev et al. 2007). Требование монометильной метки h5K20 является фундаментальным для позвоночных и мух. В его отсутствие активируется контрольная точка повреждения ДНК и нарушается целостность хромосомы (Jorgensen et al. 2007; Sakaguchi and Steward 2007; Tardat et al. 2007).
Поэтому тем более удивительно, что наши эксперименты, направленные на определение функции hmt4-20 / Suv4-20 в жизнеспособности, мейозе, фертильности, модификации PEV, ответе на повреждение ДНК и реакции на стресс, показали, что Метилирование me2 и me3 h5K20 необязательно для всех этих процессов.
В дрожжах фермент Set9 контролирует h5K20 me1, me2 и me3. Хотя метильные метки необходимы для жизнеспособности, они обнаруживают слабый фенотип в ответе на повреждение ДНК (Sanders et al. 2004; Du et al. 2006). Этот аспект метилирования h5K20 был утрачен у Drosophila.
Ферменты позвоночных HMT4-20 / Suv4-20 также выполняют значительно менее важную функцию, чем моно-метилтрансфераза, кодируемая PR-Set7 . Утрата обоих ферментов HMT4-20 / Suv4-20, по-видимому, жизнеспособна в эмбриональных фибробластах мыши, но приводит к нарушениям регуляции длины теломер (Benetti et al. 2007).
Благодарности
Мы благодарим Светлану Минахину и Корделию Раусколб за критические комментарии к рукописи и Ли Нгуен за корм для мух. Эта работа была поддержана грантом 5R01HD18055 Национального института здравоохранения и Фондом Голдсмита.
Ссылки
- Benetti, R., S. Gonzalo, I. Jaco, G. Schotta, P. Klatt et al. , 2007. Suv4–20h Дефицит приводит к удлинению теломер и дерепрессии рекомбинации теломер.J. Cell Biol. 178 925–936. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Крайдерман, Д. Э., М. Х. Куайконг, С. С. Элгин и Л. Л. Валрат, 1998. Характеристика последовательностей, связанных с изменением положения в перицентрических сайтах гетерохроматина дрозофилы. Хромосома 107 277–285. [PubMed] [Google Scholar]
- Крайдерман, Д. Э., Э. Дж. Моррис, Х. Биссманн, С. К. Элгин и Л. Л. Валрат, 1999. Молчание на теломерах дрозофилы: ядерная организация и структура хроматина играют решающую роль.EMBO J. 18 3724–3735. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Du, L. L., T. M. Nakamura и P. Russell, 2006. Зависимые и независимые от гистоновых модификаций пути рекрутирования белка контрольной точки Crb2 на двухцепочечные разрывы. Genes Dev. 20 1583–1596. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Фанг, Дж., К. Фэн, К. С. Кетель, Х. Ван, Р. Цао и др. , 2002. Очистка и функциональная характеристика SET8, метилтрансферазы, специфичной для нуклеосомного гистона h5-лизин 20.Curr. Биол. 12 1086–1099. [PubMed] [Google Scholar]
- Hari, K. L., A. Santerre, J. J. Sekelsky, K. S. McKim, J. B. Boyd et al. , 1995. Ген mei-41 D. melanogaster является структурным и функциональным гомологом гена атаксии-телеангиэктазии человека. Ячейка 82 815–821. [PubMed] [Google Scholar]
- Jorgensen, S., I. Elvers, M. B. Trelle, T. Menzel, M. Eskildsen et al. , 2007. Гистон-метилтрансфераза SET8 необходима для S-фазы прогрессирования.J. Cell Biol. 179 1337–1345. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Караченцев Д., К. Сарма, Д. Рейнберг и Р. Стюард, 2005. PR-Set7-зависимое метилирование гистона h5 Lys 20 выполняет функции репрессии экспрессии генов и необходим для митоза. Genes Dev. 19 431–435. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Караченцев Д., М. Дружинина и Р. Стюард, 2007. Свободное и связанное с хроматином моно-, ди- и триметилирование гистона h5-лизина 20 в процессе развития и прогрессирование клеточного цикла.Dev. Биол. 304 46–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Лис, Дж. Т., П. Мейсон, Дж. Пенг, Д. Х. Прайс и Дж. Вернер, 2000. Рекрутирование и функция киназы P-TEFb в локусах теплового шока. Genes Dev. 14 792–803. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Murphy, T. D., 2003. Drosophila skpA, компонент убиквитинлигаз SCF, регулирует дупликацию центросом независимо от накопления циклина E. J. Cell Sci. 116 2321–2332. [PubMed] [Google Scholar]
- Нисиока, К., J. C. Rice, K. Sarma, H. Erdjument-Bromage, J. Werner et al. , 2002. PR-Set7 представляет собой специфичную для нуклеосом метилтрансферазу, которая модифицирует лизин 20 гистона h5 и связана с молчащим хроматином. Мол. Cell 9 1201–1213. [PubMed] [Google Scholar]
- Песавенто, Дж. Дж., Х. Янг, Н. Л. Келлехер и К. А. Миззен, 2008. Определенное и прогрессирующее метилирование гистона h5 по лизину 20 во время клеточного цикла. Мол. Клетка. Биол. 28 468–486. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Rice, J.C., and C. D. Allis, 2001. Генная регуляция: код молчания. Природа 414 258–261. [PubMed] [Google Scholar]
- Райс, Дж. К., К. Нисиока, К. Сарма, Р. Стюард, Д. Рейнберг и другие. , 2002. Митотически-специфическое метилирование гистона h5 Lys 20 следует за повышенной экспрессией PR-Set7 и его локализацией в митотических хромосомах. Genes Dev. 16 2225–2230. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Сакагучи, А. и Р. Стюард, 2007. Аберрантное монометилирование гистона h5 лизина 20 активирует контрольную точку повреждения ДНК у Drosophila melanogaster.J. Cell Biol. 176 155–162. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Sanders, S. L., M. Portoso, J. Mata, J. Bahler, R. C. Allshire et al. , 2004. Метилирование гистона h5 лизином 20 контролирует рекрутирование Crb2 на участки повреждения ДНК. Ячейка 119 603–614. [PubMed] [Google Scholar]
- Sarg, B., E. Koutzamani, W. Helliger, I. Rundquist и H. H. Lindner, 2002. Постсинтетическое триметилирование гистона h5 по лизину 20 в тканях млекопитающих связано со старением.J. Biol. Chem. 277 39195–39201. [PubMed] [Google Scholar]
- Schotta, G., M. Lachner, K. Sarma, A. Ebert, R. Sengupta et al. , 2004. Путь сайленсинга для индукции триметилирования h4-K9 и h5-K20 конститутивного гетерохроматина. Genes Dev. 18 1251–1262. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Sibon, O.C., A. Laurencon, R. Hawley и W. E. Theurkauf, 1999. Гомолог Drosophila ATM Mei-41 выполняет важную функцию контрольной точки при переходе в среднюю бластулу.Curr. Биол. 9 302–312. [PubMed] [Google Scholar]
- Sims, J. K., S. I. Houston, T. Magazinnik и J. C. Rice, 2006. Гистоновый код, транслируемый по хвосту, определяемый монометилированными h5 Lys-20 и h4 Lys-9, разграничивает отдельные области молчащего хроматина. J. Biol. Chem. 281 12760–12766. [PubMed] [Google Scholar]
- Сонг, Ю. Х., 2005. Drosophila melanogaster: модель для изучения реакции контрольной точки повреждения ДНК. Мол. Ячейки 19 167–179. [PubMed] [Google Scholar]
- Strahl, B.D., and C.Д. Аллис, 2000. Язык ковалентных модификаций гистонов. Природа 403 41–45. [PubMed] [Google Scholar]
- Tardat, M., R. Murr, Z. Herceg, C. Sardet и E. Julien, 2007. PR-Set7-зависимое метилирование лизина обеспечивает репликацию и стабильность генома через S-фазу. J. Cell Biol. 179 1413–1426. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Wang, G. G., C. D. Allis и P. Chi, 2007. Ремоделирование хроматина и рак, часть I: ковалентные модификации гистонов. Тенденции Мол. Med.13 363–372. [PubMed] [Google Scholar]
- Whalen, A. M., and R. Steward, 1993. Диссоциация комплекса дорсальный кактус и фосфорилирование дорсального белка коррелируют с ядерной локализацией дорсального. J. Cell Biol. 123 523–534. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
(PDF) Zfrp8, ортолог PDCD2 дрозофилы, участвует в развитии лимфатических узлов и контролирует пролиферацию клеток
Связь между фенотипами, описанными выше, и функцией Zfrp8
стала Это стало ясно, когда мы обнаружили, что часть белка Zfrp8
локализуется рядом с центросомой в ткани
дикого типа.Эта субклеточная локализация согласуется с функцией
Zfrp8 в организации центросом и в прикреплении белков
, таких как ␥-Tubulin и CycB, к этой органелле.
Zfrp8 может также влиять на экспрессию настоящих регуляторов клеточного цикла
. Белок содержит домен цинкового пальца, MYND,
, присутствующий в ряде регуляторов транскрипции, который способствует взаимодействию белков
и рекрутирует корепрессоры (Ansieau and Leutz,
2002; Ibanez et al., 2004; Jensik et al., 2004; Lutterbach et al., 1998).
PDCD2 / Zfrp8, как известно, взаимодействует с регулятором транскрипции HCF-1
, что предполагает, что PDCD2 / Zfrp8 может участвовать в
регуляции клеточного цикла на уровне транскрипции.
Zfrp8 может выполнять двойную функцию благодаря своей ассоциации с центросомой
и в качестве регулятора транскрипции клеточного цикла.
Было обнаружено, что несколько регуляторов транскрипции локализуются в центросоме
, но их центросомная функция
не задокументирована (Andersen et al., 2003; Doxsey et al., 2005; Hsu и
White, 1998).
Функция Zfrp8 важна для контроля пролиферации клеток
уже в эмбрионе. В этом случае он функционирует на
выше большинства консервативных сигнальных путей, вовлеченных
в кроветворение и иммунитет мух. Из-за сходства белка
у мух и позвоночных, возможно, что PDCD2 выполняет аналогичную функцию
в кроветворении позвоночных (Hartenstein, 2006;
Evans et al., 2003).
Мы благодарим Андреаса Бергманна, Джона Абрамса, Чарльза Диролфа, Лори Вальрат,
Германа Стеллера, Кеннета Ирвина, Эрнста Хафена, Иштвана Андо, Мишель Мориц,
Кейко Хошизаки, Даниэля Дукат и Yixian Zheng за акции;
Шубха Говинд и Корделия Раусколб за полезное обсуждение рукописи
; Марина Арутюнян за помощь в скрининге мутантов Zfrp8. Работа
была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения и грантом
W.Фонд Горация Голдсмита.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье доступны по адресу
http://dev.biologies.org/cgi/content/full/134/13/2387/DC1
Ссылки
Andersen, JS, Wilkinson, К.Дж., мэр, Т., Мортенсен, П., Нигг, Е.А. и
,Манн, М. (2003). Протеомная характеристика центросомы человека по профилированию корреляции белков
. Nature 426, 570-574.
Ансьо, С. и Лейтц, А.(2002). Консервативный домен Mynd BS69 связывает
клеточных и онковирусных белков через общий мотив PXLXP. J. Biol. Chem.
277, 4906-4910.
Аша, Х., Надь, И., Ковач, Г., Стетсон, Д., Андо, И. и Дирольф, К. Р. (2003).
Анализ Ras-индуцированной гиперпролиферации в гемоцитах дрозофилы. Генетика
163, 203-215.
Барбоса В., Ямамото Р. Р., Хендерсон Д. С. и Гловер Д. М. (2000).
Мутация субъединицы кольцевого комплекса гамма-тубулина дрозофилы, кодируемая дисками
degenerate-4, дифференциально нарушает локализацию центросомного белка.Genes Dev.
14, 3126-3139.
Чен, К., Цянь, К. и Янь, К. (2005). Клонирование кДНК с доменом PDCD2 (C)
и их экспрессия при апоптозе клеток HEK293T. Мол. Клетка. Biochem.
280, 185-191.
Чу, С. К., Акдемир, Ф., Чен, П., Лу, В. Дж., Миллс, К., Дайш, Т., Кумар, С.,
Родригес, А. и Абрамс, Дж. М. (2004). Апикальный каспазный дрон управляет
запрограммированной и незапрограммированной гибелью клеток у дрозофилы. Dev. Cell 7, 897-907.
Чиу, Х. и Говинд, С. (2002). Естественное инфицирование D. melanogaster вирулентными паразитическими осами
вызывает апоптотическое истощение гемопоэтических предшественников. Cell
Death Differ. 9, 1379–1381.
Коломби, Н., Вероле, К., Сампайо, П., Мойзанд, А., Сункель, К., Бурбон, Х.
М., Райт, М. и Рейно-Мессина, Б. (2006) . Субъединица малого комплекса тубулина Dgrip84 Drosophila gamma-
необходима для структурной и функциональной целостности аппарата веретена.Мол. Биол. Cell 17, 272-282.
Дага А., Карлович К. А., Думстрей К. и Банерджи У. (1996). Формирование паттерна
клеток в глазу дрозофилы с помощью леденцов, которые имеют общие гомологичные домены с
AML1. Genes Dev. 10, 1194–1205.
Дебек А. и Монмори К. (1992). Циклин B связан с центросомами в
митотических клетках дрозофилы. Биол. Cell 75, 121-126.
Докси, С., Циммерман, В. и Микуле, К. (2005). Центросомный контроль клеточного цикла
.Trends Cell Biol. 15, 303-311.
Эванс, К. Дж., Хартенштейн, В. и Банерджи, У. (2003). Толще крови:
консервативных механизмов кроветворения у дрозофилы и позвоночных. Dev. Ячейка 5,
673-690.
Фан, К. В., Чан, К. К., Чао, К. К., Фан, Х. А., Шеу, Д. Л. и Чан, Е. С.
(2004). Паттерны экспрессии клеточного цикла и генов, связанных с апоптозом, в линии клеток карциномы толстой кишки человека с множественной лекарственной устойчивостью
. Сканд. J. Gastroenterol.39,
464-469.
Фудзивара Ю., Чанг А. Н., Уильямс А. М. и Оркин С. Х. (2004). Функциональное перекрытие
GATA-1 и GATA-2 в примитивном гемопоэтическом развитии. Кровь
103, 583-585.
Говинд, С. (1996). Сигнальный путь Rel и фенотип меланотической опухоли
Drosophila. Biochem. Soc. Пер. 24, 39-44.
Гросс, К. Т. и МакГиннис, В. (1996). DEAF-1, новый белок, который связывает существенную область
в деформированном ответном элементе.EMBO J. 15, 1961-1970.
Хартенштейн, В. (2006). Кровяные клетки и развитие клеток крови в царстве животных
. Анну. Rev. Cell Dev. Биол. 22, 677-712.
Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W. and Klapper, R. (2003). У
идва источника гемоцитов у дрозофилы. Разработка 130, 4955-4962.
Хсу, Л. К. и Уайт, Р. Л. (1998). BRCA1 связан с центросомой
во время митоза. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 95, 12983-12988.
Хуанг Дж. И Рафф Дж. У. (1999). Исчезновение циклина B в конце митоза
–пространственно регулируется в клетках дрозофилы. EMBO J. 18, 2184-2195.
Ибанез, В., Шарма, А., Буонамичи, С., Верма, А., Калаконда, С., Ван, Дж.,
,Кадкол, С. и Саунтарараджах, Ю. (2004). AML1-ETO снижает взаимодействия ETO-2
(MTG16) с корепрессором ядерного рецептора, эффект, который ухудшает дифференцировку гранулоцитов
. Cancer Res. 64, 4547-4554.
Джекман, М., Линдон, К., Нигг, Э. А. и Пайнс, Дж. (2003). Активный циклин B1-Cdk1
сначала появляется на центросомах в профазе. Nat. Cell Biol. 5, 143–148.
Йенсик П. Дж., Хуггенвик Дж. И. и Коллард М. В. (2004). Идентификация
ядерных экспортных сигналов и доменов взаимодействия белков в деформированном эпидермальном
ауторегуляторном факторе-1 (DEAF-1). J. Biol. Chem. 279, 32692-32699.
Юнг, С. Х., Эванс, К. Дж., Уэмура, К. и Банерджи, У.(2005). Лимфатическая железа Drosophila
как модель развития кроветворения. Развитие 132,
2521-2533.
Кавагути, С., Чжэн, Ю. (2004). Характеристика центросомного белка CP309 Drosophila
, который имеет гомологию с кендрином и CG-NAP.
Мол. Биол. Cell 15, 37-45.
Каваками Т., Фурукава Ю., Судо К., Сайто Х., Таками С., Такахаши Е.
и Накамура Ю. (1995). Выделение и картирование гена человека (PDCD2)
, который высоко гомологичен Rp8, гену крысы, связанному с запрограммированной смертью клетки
.Cytogenet. Cell Genet. 71, 41-43.
Крамер, А., Майланд, Н., Лукас, К., Сильюасен, Р. Г., Уилкинсон, К. Дж., Нигг, Е.
,А., Бартек, Дж. И Лукас, Дж. (2004). Связанный с центросомой Chk1 предотвращает
преждевременной активации киназы циклин-B-Cdk1. Nat. Cell Biol. 6, 884-891.
Krzemien, J., Dubois, L., Makki, R., Meister, M., Vincent, A. and Crozatier,
M. (2007). Контроль гомеостаза клеток крови у личинок дрозофилы с помощью заднего сигнального центра
.Nature 446, 325-328.
Куруц, Э., Зеттервалл, К. Дж., Синка, Р., Вильмос, П., Пиварчи, А., Экенгрен, С.
Хегедус, З., Андо, И. и Халтмарк, Д. (2003). Hemese, специфический для гемоцитов трансмембранный белок
, влияет на клеточный иммунный ответ у дрозофилы.
Proc. Natl. Акад. Sci. USA 100, 2622-2627.
Ланот Р., Захари Д., Холдер Ф. и Мейстер М. (2001). Постэмбриональный
гемопоэз у дрозофилы. Dev. Биол. 230, 243-257.
Лавин, М.Д. и Стрэнд М. Р. (2002). Гемоциты насекомых и их роль в иммунитете
. Насекомое Biochem. Мол. Биол. 32, 1295-1309.
Лебестки Т., Юнг С. Х. и Банерджи У. (2003). A Serrate-expressing signaling
center контролирует гематопоэз Drosophila. Genes Dev. 17, 348-353.
Луо, Х., Роуз, П. Э., Робертс, Т. М. и Дирольф, К. Р. (2002). Киназа Hopscotch Jak
требует, чтобы путь Raf способствовал активации клеток крови и дифференцировке
у Drosophila.Мол. Genet. Геномика 267, 57-63.
Lutterbach, B., Sun, D., Schuetz, J. and Hiebert, S. W. (1998). Мотив MYND
необходим для репрессии базовой транскрипции с промотора множественной лекарственной устойчивости
1 слитым белком t (8; 21). Мол. Клетка. Биол. 18, 3604-
3611.
Махаджан С.С. и Уилсон А.С. (2000). Мутации фактора 1 клетки-хозяина отделяют
его роль в пролиферации клеток от рекрутирования VP16 и LZIP. Мол. Клетка.Биол. 20,
919-928.
Мандал, Л., Банерджи, У. и Хартенштейн, В. (2004). Доказательства наличия у плодовой мухи
гемангиобласта и сходства между гемопоэзом лимфатических узлов у плодовой мухи
и мезодермы аорты-гонад-мезонефроса млекопитающих. Nat. Genet. 36, 1019-
1023.
Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C.J., Hartenstein, V. и
Banerjee, U. (2007). Hedgehog- и Antennapedia-зависимая ниша
поддерживает гематопоэтических предшественников Drosophila.Природа 446, 320-324.
Майстер, М. (2004). Клетки крови дрозофилы: клоны клеток и роль в защите хозяина
. Curr. Opin. Иммунол. 16, 10-15.
2395ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯPDCD2 / Zfrp8 в развитии лимфатических узлов
Агрономия | Бесплатный полнотекстовый | Защитное и лечебное действие Trichoderma asperelloides Ta41 на корневую гниль томатов, вызванную Rhizoctonia solani Rs33
1. Введение
Помидор (Lycopersicon esculentum L.) является второй по употребляемой овощной культуре после картофеля во всем мире [1].Некоторые патогены могут инфицировать растения томатов и вызывать заболевания. Многие распространенные болезни, поражающие помидоры, вызываются грибами, бактериями, нематодами и вирусами [2,3]. Среди грибковых патогенов, вызывающих несколько заболеваний томатов, Rhizoctonia solani является наихудшим грибком, который может повредить растения томатов и снизить урожайность [4,5,6] .R. solani — это разрушительный почвенный патоген, который вызывает серьезные потери многих сельскохозяйственных культур во всем мире. R. solani не образует бесполые споры (конидии), но воспроизводит форму выживания, называемую склероции [7], которая считается основной причиной R.solani инфекция. Чрезмерное использование химических фунгицидов, наиболее распространенная стратегия, применяемая фермерами для борьбы с R. solani, представляет серьезный риск для здоровья человека и окружающей среды и приводит к появлению устойчивых к патогенам штаммов. Поэтому биологический контроль чаще используется как альтернатива борьбе с болезнями растений. Биологический контроль является экологически чистым и эффективным средством борьбы с большинством грибковых патогенов растений. Большинство исследований по борьбе с болезнями было выполнено с использованием различных штаммов гриба Trichoderma [8,9,10].Гены внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS), субъединицы 2 РНК-полимеразы II (Rpb2) и фактора элонгации трансляции 1 альфа (Tef-1) являются наиболее часто используемыми молекулярными маркерами в филогенетическом анализе для высокопроизводительной чувствительной идентификации и характеристики Trichoderma spp. для раннего скрининга потенциальных антагонистов против почвенных патогенов [11]. Виды Trichoderma используют различные механизмы для ингибирования патогенов, такие как микопаразитизм через секрецию гидролитических ферментов, антибиоз через производство вторичных метаболитов, конкуренцию за пространство и питательные вещества, стимулирование роста растений и индукция механизмов системной резистентности растений [12].Trichoderma spp. являются эффективными агентами биоконтроля благодаря быстрому размножению или устойчивости к суровым условиям [13]. Trichoderma spp. обладают мощным антагонизмом и микопаразитарным действием на патогены растений, что позволяет им снизить частоту заболеваний растений, а основным механизмом для видов Trichoderma является гиперпаразитизм [14,15]. Многие гены Trichoderma spp. кодирующие внеклеточные протеазы и переносчики олигопептидов экспрессируются при контактах между Trichoderma spp. и хозяин-патоген [16,17].Во время гиперпаразитарного процесса ферменты, разрушающие клеточную стенку (CWDE), то есть глюканазы, хитиназы и протеиназы, могут секретироваться Trichoderma spp. [18]. Секретируемые CWDE могут разрушать клеточную стенку растительного патогена [19]. Колонизация корней Trichoderma вызывает рост корневых волосков и запускает защитные действия, такие как значительные изменения в различных метаболических путях и активация генов, участвующих в защите растений-хозяев, в первую очередь через сигнальные пути с участием жасмоновой кислоты и этилена [20,21].У Arabidopsis колонизация грибом Trichoderma до заражения биотрофными или некротрофными патогенами растений запускала окислительный статус, который увеличивал системную резистентность [22]. Микробные сообщества привлекали большое внимание как экологически приемлемое и экономичное повышение устойчивости к болезням за счет индуцированной системной резистентности ( ISR) путем высвобождения белков, вторичных метаболитов и стимуляции роста растений для долгосрочного растениеводства [23,24,25]. Вторичные метаболиты, продуцируемые Trichoderma spp.предлагают селективные преимущества в таких механизмах, как конкурентоспособность, симбиотические отношения, транспортировка минералов, производство роста, зондирование и микопаразитарное поведение [26,27]. Признавая важность скрининга новых видов Trichoderma с более сильной противогрибковой активностью для использования в сельском хозяйстве, настоящее исследование направлено на оценку защитной и лечебной активности Trichoderma asperelloides Ta41 в отношении корневой гнили томатов, вызываемой Rhizoctonia solani Rs33, в контролируемых тепличных условиях.Кроме того, оценивали влияние Ta41 на параметры роста растений, содержание хлорофилла, общее содержание фенола и уровни экспрессии генов, связанных с защитой, с или без Rs33.4. Обсуждение
Применение грибов, способствующих росту растений (PGPF), в качестве агентов биоконтроля является безопасной заменой нежелательного использования химических фунгицидов и считается устойчивой и экологически чистой альтернативой [43,44]. Среди PGPFs Trichoderma spp. являются высокоэффективными грибами-антагонистами и обладают биологической активностью в отношении многих фитопатогенных грибов, таких как R.solani, S. rolfsii, V. dahliae и др. [45,46]. Результаты ITS молекулярной характеристики изолированного возбудителя от корневых гнилей растений томатов показали, что возбудителем является Rhizoctonia solani Rs33. Для идентификации изолята Trichoderma мы провели полный мультигенный анализ с тремя маркерами: ITS, Tef-1 и Rpb2. Среди секвенированных маркеров наиболее информативным оказался ген Tef-1, за ним следуют Rpb2 и ITS. Филограмма, основанная на объединении трех последовательностей генов, подтвердила идентификацию Trichoderma asperelloides Ta41 среди эталонных последовательностей на основе их кластеризации с эталонными таксонами [47,48].Наши результаты указывают на способность биоагента Ta41 останавливать распространение патогена Rs33 на 83,33%, поскольку Ta41 рос в три раза быстрее, чем Rs33, в ранних экспериментах in vitro, проведенных в этом исследовании. Рамирес-Кариньо и др. [49] сообщили, что T. asperelloides имеет большое преимущество перед патогенами A. alternata и F. oxysporum в борьбе за пространство и питательные вещества из-за более высокой скорости роста. T. asperelloides Ta41 предотвращал развитие патогенов и запускал гиперпаразитизм, в основном на фитопатогены, с использованием метода двойного культивирования.10 × микроскопические фотографии анализов взаимодействия были использованы для подтверждения этого механизма. Изображения показывают, что при взаимодействии Ta41 и Rs33 гифы Ta41 оборачиваются вокруг гиф Rs33. Микопаразитизм — сложный процесс, включающий распознавание, инвазию и возможное проникновение, а также уничтожение патогенов [50]. Результаты этого исследования согласуются с результатами Alamri et al. [51], которые обнаружили, что T. harzianum паразитирует на гифах R. solani, обвиваясь вокруг них, а затем выделяя вторичные метаболиты, такие как литические ферменты, чтобы ослабить и разрушить клеточную стенку-мишень и способствовать усвоению питательными веществами корма.Точно так же несколько авторов упомянули роль вторичных метаболитов нескольких штаммов Trichoderma spp. для борьбы с некоторыми патогенами растений, особенно в ризосфере. Trichoderma spp. и R. solani взаимодействуют со многими механизмами, разрушающими клеточную стенку гиф и проницаемость мембран. Было показано, что T. asperelloides подавляет заболеваемость R. solani, который вызывает заболевание затухания бобов и индуцирует гены дефенсина в проростках огурцов против Pseudomonas syringae pv. lachrimans [52].Кроме того, Trichoderma spp. было подтверждено, что он эффективно лечит Sclerotinia sclerotiorum в посевах сои [45]. Doley et al. [53] обнаружили, что T. asperelloides снижает распространенность патогена Sclerotium rolfsii в растениях арахиса. В литературе нет других исследований, посвященных использованию T. asperelloides для борьбы с R. solani в растениях томатов, кроме этого исследования. В контролируемых тепличных условиях оценивались противогрибковые защитные (T4) и лечебные (T5) обработки Ta41 против Rs33. изучение.Применение Ta41 значительно улучшило параметры роста томатов, включая длину побегов и корней, свежий и сухой вес побегов и корней, а также содержание хлорофилла, со значительной разницей по сравнению с контролем (T1) и инфицированными растениями томатов (T2). Наши результаты показали, что Rs33 можно ингибировать обработкой растений томатов Ta41 до или после заражения Rs33. Эти результаты согласуются с усилением роста побегов и корней, как сообщалось ранее [54,55].Полученные данные также согласуются с данными, обнаруженными Yedidia и соавторами, которые сообщили о более сильном эффекте обработки T. harzianum на растения огурца, который увеличивал длину корней на 75%, длину побегов на 95% и сухую массу. на 80% по сравнению с контрольными растениями [56]. Применение T. harzianum и T. asperellum увеличило содержание хлорофилла в растениях, обработанных дынями [57,58]. Как органическое удобрение, Trichoderma может разлагать питательные вещества почвы и усиливать фотосинтез растений, что приводит к улучшению роста растений; растения и некоторые микроорганизмы могут синтезировать индолуксусную кислоту (ИУК) [59,60].Гормон индолуксусной кислоты необходим для роста корней и побегов растений и считается ключевым регулятором корневых волосков и развития боковых корней [46,61]. Исследования показали, что Trichoderma spp. из различных географических регионов может производить ИУК и стимулировать рост растений, таких как огурцы, помидоры и горькая тыква [46,61]. Контрерас-Корнехо и др. [62] показали, что секреция ИУК Trichoderma spp. может значительно улучшить рост растений и боковых корней. Trichoderma spp. может производить летучие и нелетучие вторичные метаболиты, включая 6-н-пентил-6H-пиран-2-он (6PP), виридин, глиотоксин, гарциандион, гарцианопиридон и пептаиболы [27,63], которые в качестве стимуляторов роста растений , имеют значительный эффект [8,55].Вторичные метаболиты коммерческих штаммов T22 и T39 T. harzianum и T. atroviride P1, а также T. harzianum A6 также значительно влияют на стимуляторы роста растений [64]. Проникая в эпидермис, Trichoderma spp. колонизируют корни растений, которые обычно связаны с метаболизмом растений и запускают его, изменяя экспрессию генов [62,65]. В текущем исследовании оценивали влияние Ta41 на относительные уровни экспрессии четырех связанных с защитой генов (PR-1, PR-2, PR-3 и CHS) при 20 dpi.Сообщалось, что, когда растение контактирует с патогеном, активируется механизм SAR, в то время как при взаимодействии с непатогенным организмом активируется механизм ISR [66,67]. Во время взаимодействия Trichoderma с растением различные вторичные метаболиты индуцируют экспрессию белков PR, которые запускают механизмы защиты растений от патогена [68,69]. PR-1, маркерный ген салициловой кислоты (SA), является важным регулятором SAR и может быть индикатором ранней защитной реакции у растений [70,71].Между тем, повышение устойчивости растений часто связано с индукцией PR-1 и накоплением содержания СК [72,73]. В настоящем исследовании растения томатов, зараженные только Rs33 (T2), показали подавление PR-1 с относительным уровнем экспрессии в 0,63 раза ниже, чем в контроле (T1). Интересно, что растения томатов, инокулированные только Ta41 (T3), показали самый высокий уровень экспрессии (в 2,94 раза выше), за ними следовали защитные (T4) и лечебные (T5) обработки с относительными уровнями транскрипции 2.В 39 и 1,46 раза выше контроля (Т1). Следовательно, мы предполагаем, что Ta41 может продуцировать молекулу метаболита-элиситора, которая индуцирует систему иммунной защиты, что приводит к активации SAR. Повышение регуляции PR1 может быть связано с активацией SAR и статусом ISR [74]. Таким образом, можно сделать вывод, что T. asperelloides Ta41 может модулировать ответ растения, повышать устойчивость и предотвращать подавление защитных генов, вызванных R. solani Rs33. PR-2 белки обладают β-1,3-глюканазной активностью. , участвуют в патогенной защите и различных физиологических функциях растений и индуцируются в основном SAR и индукторами SAR, такими как SA [75,76,77].В текущем исследовании все растения томатов, обработанные Ta41 (T3, T4 и T5), показали повышенную регуляцию PR-2 по сравнению с контролем (T1). С другой стороны, снижение экспрессии PR-2 растений Т2 (в 0,94 раза ниже, чем в контроле) не показывает значимой разницы по сравнению с контролем. Активность PR-2 увеличивалась у растений, обработанных Ta41, что могло быть связано с элиситорами (высвобождаемыми олигосахаридами) ответной реакции растений и вторичным метаболизмом грибов [9]. Этот результат согласуется с другими исследованиями, показывающими, что колонизация штаммом Trichoderma вызывает увеличение транскрипта PR-2 в растениях [22,78,79].Документально подтверждено, что увеличение активности 1,3-глюканазы в клеточной стенке увеличивает количество высвобождаемых олигосахаридов, действующих как элиситоры защитных реакций растений и / или вторичного метаболизма биоагентов [9,78] .PR-3, который кодирует фермент хитиназу, который катализирует гидролиз хитина, является фунгицидом, который защищает растения от заражения грибами, подавляя рост грибов [79,80]. Способность каждого штамма Trichoderma подавлять рост R. solani может быть связана с различиями в активности микопаразитов за счет секреции ферментов, например.например, хитиназы, разрушающие клеточную стенку грибов [79]. В микопаразитарном действии хитиназа является одним из наиболее важных внеклеточных литических ферментов [81]. В настоящем исследовании растения томатов, зараженные только RS33 или обработанные Ta41, проявляли повышенную регуляцию гена PR-3. Наибольшая относительная экспрессия (в 3,13 раза выше, чем в контроле) была показана у растений Т3, за ней следовали растения Т4, Т5 и Т2 (в 2,63, 2,32 и 1,43 раза соответственно) (Т1). Полученные результаты показывают роль PR-3 в повышении устойчивости растений к грибковой инфекции.Заселение корней видами Trichoderma способствует усиленной активации в тканях листьев многих генов дефенсина, включая PR-3, что приводит к более высокой устойчивости к патогенам [68,82]. Накопление фенольных соединений при воздействии видов Trichoderma коррелировало. с окислительной биохимической защитой от патогенных грибов. Yedidia et al. [83] сообщили, что корни, пораженные и завоеванные T. harzianum, показали высокую защиту от вредных организмов, и это коррелировало с изменениями в накоплении фенольных соединений.При обработке Т4 содержание фенола было почти в четыре раза выше, чем содержание в контроле, тогда как в Т3 или Т5 оно было в 2,78 и 2,54 раза выше. Кроме того, при лечении атакой патогенов (T2) концентрации фенолов были ниже, чем при всех других обработках, но все же были примерно в два раза выше, чем у необработанных растений (T1). Следовательно, фенольные соединения, накапливающиеся в растениях, обработанных Trichoderma, могут служить донорами электронов и водорода, предотвращая окислительное повреждение корневой ткани во время атак патогенов [84].Наши результаты TPC соответствуют защите томатов от фитопатогена R. solani. Это также было обнаружено Ortega-García et al. [85] в своих исследованиях лука. CHS, начальный фермент пути флавоноидов, превращает п-кумароил-КоА в халконы нарингенина и считается строгим предшественником, необходимым для растительных флавоноидов [41,86]. Среди четырех протестированных генов CHS продемонстрировал самую высокую экспрессию с относительными уровнями транскрипции в T3, T4, T5 и T2, которые составляли 3,91-, 3,50-, 2.В 81 и 1,52 раза выше контроля. В более ранних исследованиях было обнаружено, что сверхэкспрессия CHS приводит к высокому накоплению флавоноидов и изофлавоноидов, которые проявляют широкую противогрибковую активность против различных грибковых фитопатогенов [87,88,89,90]. Следовательно, обработка растений томата Ta41 в качестве защитных или лечебных средств может увеличить количество многих флавоноидных соединений. Таким образом, Ta41 может быть использован в качестве средства биоконтроля против инфекций R. solani.Однако для будущих полевых применений требуются дополнительные исследования.границ | Новые биоразлагаемые полимерные микрочастицы способствуют заживлению ран без рубцов, способствуя реэпителизации и ингибируя фиброз
Введение
Заживление кожных ран — сложный процесс, который включает начальную коагуляцию и быструю инфильтрацию миелоидных клеток, что приводит к воспалительной реакции, за которой следуют фазы пролиферации и реэпителизации (1). Баланс между этими процессами определяет динамику регенерации, а также исход заживления ран, в частности фиброз, образование рубцов и эффективное восстановление придатков кожи (2).Воспалительная фаза, которая, по-видимому, является триггером и решающим регулятором регенерации кожи, включает активацию множества провоспалительных цитокинов (3, 4). Среди них TNF и IL-6 демонстрируют наибольшее влияние на заживление ран, однако их роль в этом процессе остается спорной. Первоначально было показано, что передача сигналов TNF вредна для регенерации кожи, поскольку дефицит TNFRp55 (TNFRI) привел к ускоренному заживлению ран и усилению реэпителизации у мышей (5). В то же время это было связано с накоплением коллагена в ложе раны, что могло указывать на фиброз (6) и образование рубца.Дальнейшие исследования показали, что TNF важен для индукции миграции ILC3 к месту раны и для запуска процесса регенерации (7). В частности, введение рекомбинантного TNF в кожные раны ускоряет заживление, тогда как местная блокада TNF приводит к замедленной регенерации. Важно отметить, что TNF, продуцируемый миелоидными клетками, имеет решающее значение для качества регенерации кожи, поскольку у TNF-дефицитных мышей, а также у мышей с ограниченным миелоидными клетками TNF обнаружен нарушенный индуцированный раной неогенез волос (WIHN) (8 ).Роль IL-6, другого провоспалительного цитокина, в заживлении кожных ран также была исследована с использованием обратной генетики. Интересно, что животные с дефицитом IL-6, но не с дефицитом IL-6R, характеризовались задержкой регенерации (9-11) и нарушением регенерации волос (12-14). Поскольку было показано, что активация STAT3 имеет решающее значение для заживления ран (15, 16), следует учитывать возможность участия других цитокинов семейства IL-6 в процессе регенерации кожи.
В то же время, когда были выяснены ключевые воспалительные факторы, влияющие на заживление кожных ран, возникла тенденция к получению микро- и наночастиц (MP и NP), которые могут использоваться в качестве носителей для введения определенных типов клеток или лекарств в пострадавших. кожа для быстрого заживления ран без рубцов (17–19).Хотя эти предварительные результаты подтверждают продолжение исследований частиц, полученных из биоматериала, для восстановления тканей, прорегенеративный потенциал in vivo МП вне зависимости от введенных клеток или факторов роста не исследовался. В этой работе мы стремились выяснить (а) вклад перенесенных микрочастиц в заживление раны; (б) влияние этих биополимерных каркасов на провоспалительные медиаторы заживления ран; и (c) степень сходства и различий в механизме действия различных каркасов, полученных из биоматериалов.
Чтобы ответить на эти вопросы, мы оценили два типа ранее описанных МП на основе шелка, полученных из фиброин / желатиновых (20, 21) каркасов или спидроиновых (22–24) гидрогелей, и охарактеризовали их регенеративный и воспалительный потенциал in vivo in модель глубоких кожных ран у мышей, а также прямые эффекты на экспрессию воспалительных и профибротических генов в нескольких типах клеток, участвующих в регенерации кожи in vitro . Мы продемонстрировали, что, обладая сходным прорегенеративным потенциалом, эти носители заметно различаются по своему взаимодействию с иммунной системой хозяина.Этот неожиданный результат предполагает, что возможная адаптация биополимерного носителя к типу излечиваемого повреждения позволит оптимизировать свойства лекарства, доставляемого таким носителем, «на месте».
Материалы и методы
Мыши
мышей C57Bl / 6 были выведены в Пущинском животноводческом комплексе (филиал Института биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова РАН) в специальных условиях, свободных от патогенов, с 12-часовым циклом свет / темнота при комнатной температуре.Для опытов с МП использовали животных в возрасте 7–9 недель. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (NRC 2011), Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, Совета Европы (ETS 123 ) и «Методические указания по манипуляциям с экспериментальными животными» (постановление Президиума РАН от 2 апреля 1980 г., №12000-496). Все процедуры на животных были одобрены Ученым советом Института молекулярной биологии им. Энгельгардта.
Генерация микрочастиц
Микрочастицы фиброин-желатин были получены путем криодеструкции фиброиновых композитных губчатых каркасов, замещенных 30% желатином, как описано ранее (20). Полученные микрочастицы последовательно пропускали через лабораторные фильтры с размером пор 500, 250, а затем 100 мкм. Целевая фракция была представлена микрочастицами, которые прошли через поры размером 500 и 250 мкм, но не прошли через поры размером 100 мкм.Микрочастицы рекомбинантного спидроина rS1 / 9 получали физическим измельчением гидрогелей, приготовленных из 3% раствора rS1 / 9 в 10% растворе хлорида лития в 90% муравьиной кислоте с последующим диализом против дистиллированной воды (25), и имели диапазон размеров от 100 до 300 мкм. Оба типа МП хранили в 70% этаноле и 3 раза промывали PBS перед использованием. Для in vivo экспериментов были созданы раны, а затем микрочастицы были подкожно. вводили в виде 50% суспензии в PBS тремя инъекциями на участок кожи по 20 мкл на каждую инъекцию (всего 60 мкл на участок), для экспериментов in vitro 50% суспензию микрочастиц добавляли к равному объему клеточной суспензии.Растворимый фиброин (sF) и спидроин (sSp) использовали в качестве контролей in vitro при концентрации 1 мг / мл в среде для культивирования клеток.
Анализ морфологии поверхности
Структуру поверхности микрочастиц анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Полимер конъюгировали с TRITC в соответствии со следующей процедурой: микрочастицы замачивали в растворе, содержащем 2,5 мг / мл TRITC в 0,1 М бикарбонатном буфере, реакцию останавливали, погружая микрочастицы в 0.1 М раствор ТРИТЦ на 20 мин. Затем микрочастицы переносили в буферный раствор фосфата калия на 15 мин для удаления остаточного TRITC. Для получения трехмерной реконструкции была создана серия оптических срезов с использованием микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем A1 (Nikon Corporation, Япония) и объективом CFI Plan Apo VC 20 × /0,75. Подготовка микрочастиц для SEM проводилась по стандартному протоколу. Вкратце, MP фиксировали в течение ночи с использованием 2,5% глутарового альдегида в 0.1 M какодилатный буфер при + 4 ° C. Затем образцы промывали трижды в 0,1 М какодилатном буфере с pH = 7,2 в течение 5 мин с последующей дегидратацией сериями растворов этанола с возрастающими концентрациями и ацетона (Химмед, Россия). После сушки до критической точки с использованием сушилки Hitachi для критической точки HCP-2 (Hitachi, Ltd., Япония) MP были металлизированы слоем платины толщиной 20 нм с использованием Ion Coater IB3 (Eiko Engineering Co., Япония). Полученные образцы анализировали с помощью микроскопа Camscan S2 (Cambridge Instruments, UK) при разрешении 10 нм и рабочем напряжении -20 кВ.Изображения получали с помощью программы MicroCapture (SMA, Россия).
Клеточные культуры
Первичные эмбриональные фибробласты мыши (MEF) были созданы, как описано ранее (26). Первичные макрофаги, происходящие из костного мозга мыши (BMDM), были созданы промыванием бедренных костей и культивированием клеток костного мозга в течение 10 дней в соответствии со стандартным протоколом (27, 28) в DMEM с добавлением 30% кондиционированной среды из клеток L929 (источник M -CSF) и 20% лошадиной сыворотки (Biological Industries, Kibbutz, Israel, lot No.1630708). Первичные кератиноциты мышей выделяли и культивировали в соответствии с ранее опубликованным протоколом (29). Были приготовлены по крайней мере два независимых изолята для всех первичных культур клеток. Для экспериментов MEF и BMDM культивировали на пластиковых чашках в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco) и пенициллина / стрептамицина / L-глутамина (Gibco). Кератиноциты культивировали в среде DMEM / Ham’s F12 (3,5: 1,1) с добавлением 0,05 мМ Ca 2+ , 10% FCS (FCS Gold, PAA), 0.18 мМ аденин (Sigma Aldrich), 0,5 мкг / мл гидрокортизона (Sigma Aldrich), 5 мкг / мл инсулина (Invitrogen), 10 -10 M холерный токсин (Sigma Aldrich), 10 нг / мл EGF, 2 мМ глутамин, 1 мМ пируват. Для определения уровней мРНК цитокинов и других воспалительных генов 4 × 10 5 клеток на лунку высевали на частицы фиброина / желатина или спидроина (100 мкл 50% суспензии на лунку) в 24-луночный планшет и инкубировали при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 6 и 24 часов. Для оценки продукции цитокинов супернатанты собирали через 24 часа после культивирования клеток в присутствии микрочастиц.Культуры клеток без микрочастиц использовали в качестве контроля. Для измерения адгезионной способности клеток к F / G или Sp MP 1 × 10 6 клеток инкубировали с 250 мкл 50% суспензии MP в течение 1 ч при 37 ° C, 5% CO 2 . Затем суспензии фильтровали через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм (Miltenyi Biotec) для отделения неприкрепленных клеток. Затем подсчитывали количество клеток в проточном потоке и рассчитывали результирующую эффективность адгезии как (N клеток начальное — N клеток начальное ) / N клеток начальное * 100%.
Иммунофлуоресценция клеток на микрочастицах
Иммунофлуоресценциюиспользовали для визуализации MEF, выращенного на микрочастицах в течение 7 дней, а также для анализа инфильтрации микрочастиц in vivo иммунными клетками через 24 часа после подкожной инъекции. В обоих случаях MP фиксировали 4% параформальдегидом и обрабатывали 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 10 мин. Для обнаружения актинового цитоскелета использовали фаллоидин, конъюгированный с Alexa488. Для обнаружения воспалительных клеток Ly6C + использовали антитело против Ly6C, конъюгированное с PE-Cy7 (таблица 1).Ядра клеток визуализировали с помощью Hoechst 33342. Изображения получали с использованием микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем A1 (Nikon Corporation, Япония) и объективом CFI Plan Apo VC 20 × /0,75.
Таблица 1 . Антитела для анализа проточной цитометрией.
Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность кератиноцитов, MEF и BMDM после 1, 3 и 7 дней культивирования in vitro на фиброине / желатине и рекомбинантных MP спидроина определяли с помощью набора LIVE / DEAD ™ Viability / Cytotoxicity Kit для клеток млекопитающих (ThermoFisher) в соответствии с инструкции производителя.Окрашенные клетки наблюдали с помощью микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем A1 (Nikon Corporation, Япония) и объективом CFI Plan Apo VC 20 × / 0,75.
МТТ-Тест
Клеточные культуры были созданы на MP фиброина / желатина и рекомбинантного спидроина, как описано выше. Через 1, 3 и 7 дней добавляли 200 мкл раствора МТТ (5 мг / мл в PBS) и инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Клеточную суспензию с микрочастицами собирали и центрифугировали при 14 500 g, осадок растворяли в ДМСО и колориметрические измерения проводили при 540 нм.
Глубокие кожные раны
Глубокие кожные раны были внесены в соответствии с ранее опубликованным протоколом (21). Вкратце, мышей анестезировали i.p. инъекция 100 мкл смеси Золетил 100 (Вирбак) и Рометар (Биовета) в стерильном PBS в концентрации 10 и 20% соответственно. Во избежание обезвоживания сетчатки глазные капли постоянно наносили на область вокруг глаз. После исчезновения всех рефлексов область спины мышей депилировали с помощью крема для депиляции (Veet), а затем на спине мышей наносили две полные раны кожи с помощью 4-миллиметровых перфораторов для биопсии (Medex).Мышей держали на грелке до полного выздоровления от анестетика. День операции обозначили как день 0. Для морфометрии раны мышей фотографировали в дни 0, 1, 7, 10 и 21 с помощью цифровой камеры (Nikon D810 с объективом AF Micro-Nikkor ED 200 мм f / 4 D IF). Каждый день площадь раны измеряли по фотографиям с использованием программного обеспечения ImageJ и рассчитывали как процент от начальной площади раны в день 0. Площадь рубца измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ на 21 день после ранения.
Проточная цитометрия
Для анализа проточной цитометрии вырезали образцы кожи размером 10 мм × 10 мм и хранили в PBS на льду.Затем образцы разрезали ножницами и расщепляли в 1 мл среды для переваривания, состоящей из RPMI1640 (Gibco), 0,5 мг / мл ДНКазы I, 1 мг / мл коллагеназы D и 0,1 мг / мл либеразы TL (все ферменты от Sigma Aldrich). Расщепление выполняли с использованием мягкого MACS Octo Dissociator с нагревателями в C-пробирках (Miltenyi Biotec) в течение 1 ч при 37 ° C. После переваривания клетки пропускали через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм (Miltenyi Biotec) и промывали 9 мл PBS. Затем клетки блокировали Fcγ-блокирующим антителом (ThermoFisher) и окрашивали на поверхностные маркеры (таблица 1).Данные были получены на BD FACS Canto II и проанализированы с помощью FlowJo. Для оценки количества клеток использовали счетные шарики (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя.
Выделение РНК и анализ экспрессии генов
РНК из образцов выделяли с использованием TriZol (Sigma Aldrich), следуя инструкциям производителя. Для выделения РНК образцы кожи быстро замораживали в жидком азоте, гомогенизировали с помощью ступки и пестика, а затем ресуспендировали в TriZol. Количество РНК оценивали с помощью Nanodrop 1000 (ThermoFisher).Затем образцы РНК обрабатывали ДНКазой (ThermoFisher) и использовали для обратной транскрипции (ThermoFisher) с олиго (dT) праймерами в соответствии с протоколом производителя. Сгенерированную кДНК затем использовали для RT-PCR в Applied Biosystems (AB7500 Real Time PCR System) с использованием предварительно смешанного буфера для RT-PCR (Eurogene) и специфичных для генов праймеров (Eurogene, последовательности праймеров суммированы в таблице 2). Относительную экспрессию гена рассчитывали согласно ΔΔCt с эталонным геном Actb .
Таблица 2 .Праймеры для анализа КПЦР.
ELISA
УровниIL-6, TNF и IL-1beta в супернатантах клеточных культур определяли с использованием ELISA Ready-SET-Go мышиного IL-6, ELISA Ready-SET-Go мышиного TNF alpha и готового ELISA ELISA мыши IL-1b. -Идите наборы (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя.
Гистология
Через пять дней после индукции глубоких кожных ран мышам вводили анестезию, вырезали два образца кожи размером 15 мм × 15 мм, окружающие место повреждения, и затем фиксировали один в 4% растворе PFA, а другой — в растворе Буэна (насыщенный водный пикриновый раствор). кислоты, формалина и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15: 5: 1) и гистологический анализ ткани был проведен, как описано ранее (21).Для измерения реэпителизации образцы кожи окрашивали красителем по Мэллори и исследовали с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Германия) и камеры AxioCam MRC 5 (Carl Zeiss, Германия). Длину ложа раны оценивали на гистологических слайдах с помощью программного обеспечения ImageJ. Инфильтрацию иммунных клеток внутри имплантированных микрочастиц анализировали путем окрашивания гематоксилином / эозином.
Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 6, Сан-Диего, Калифорния, США).Односторонний и двусторонний дисперсионный анализ с пост-тестом Холма-Сидака использовался для множественных попарных сравнений. Данные были получены как минимум в трех независимых экспериментах и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. p <0,05 считали показателем статистической значимости.
Результаты
Биофизические свойства MPs фиброина / желатина и спидроина
В экспериментах использовались рекомбинантные микрочастицы на основе спидроина rS1 / 9 (Sp) и фиброина / желатина (F / G) (соответственно, Sp MP и F / G MP) (рис. 1).Размер частиц составлял от 100 до 300 мкм для Sp MP и 100–250 мкм для F / G MP. Sp MP были получены в результате физического измельчения гидрогеля и представляют собой частицы микрогеля со сложной поверхностью. Элементы поверхности включают наноструктуры диаметром 100–300 нм и микроструктуры размером 10–30 мкм (рис. 1С). Одним из важных свойств спидроина rS1 / 9 является ярко выраженный положительный заряд молекул, что связано с наличием 29 остатков Arg в отсутствие отрицательно заряженных остатков (теоретическая pI: 10.49) (22, 30). Для рекомбинантного спидроина характерно чередование коротких гидрофобных и гидрофильных участков, что позволяет поверхности микрогеля проявлять либо гидрофобные, либо гидрофильные свойства в зависимости от окружающей среды. F / G MP были получены путем криодеструкции губчатых каркасов (21, 31). Получающиеся в результате F / G MP представляют собой фрагменты каркаса со сложной поверхностью, обеспечивающие большую площадь поверхности для клеточной адгезии и пролиферации. При физиологическом pH фиброин имеет отрицательный заряд (pI = 4.2), что увеличивает сорбцию биологически активных молекул и улучшает миграцию клеток (32). Для улучшения адгезии клеток к поверхности F / G MP в биополимер был введен желатин, биосовместимый продукт частичного гидролиза коллагена, содержащий интегрин-связывающие аминокислотные последовательности RGD (Arg-Gly-Asp). Присутствие желатина положительно влияет на адгезию, пролиферацию, миграцию и жизнеспособность различных типов клеток (33–36).
Рисунок 1 .Структура микрочастиц фиброина / желатина и спидроина. (A) CLSM-изображения микрочастиц фиброина / желатина или спидроина, визуализированные с помощью TRITC. Шкала шкалы −100 мкм. (B) СЭМ-изображения микрочастиц фиброина / желатина или спидроина. Шкала шкалы −100 мкм. Черный квадрат указывает область, увеличенную на (C) .
MPs фиброин / желатин и спидроин способствуют реэпителизации раны и ингибируют образование рубцов
Чтобы исследовать прорегенеративный потенциал МП на основе шелка, мы сначала сравнили способность двух типов МП (рис. 1) способствовать заживлению глубоких кожных ран после подкожной инъекции.Интересно, что введение МП фиброин / желатин приводило к замедленному сокращению раны в день 1 по сравнению с ранами, обработанными PBS и спидроином (Фигуры 2A, B). Однако на 7 день не было обнаружено разницы в размере раны (фигура 2B, день 7), а полное закрытие раны наблюдалось на 10 день во всех трех группах (фигура 2B, день 10). Поскольку фиброз кожи является важным показателем качества заживления раны, мы измерили поверхность рубца, формирующуюся на участке раны на 21 день после заживления раны (рис. 2B, день 21), и наблюдали значительное уменьшение образования рубцов после лечения MP как по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS (рис. 2C).Кроме того, анализ гистологических срезов раненой ткани выявил значительное улучшение скорости реэпителизации после лечения обоими типами МП по сравнению с контролем (рисунки 2D, E). Интересно, что на 5-й день после п / к инъекции MPs, F / G, но не Sp MPs, были окружены иммунными клетками, как выявлено гистологическим окрашиванием (рис. 2F). Таким образом, как фиброин / желатин, так и спидроиновые МП продемонстрировали сравнимую способность способствовать реэпителизации кожной раны и предотвращать фиброз.
Рисунок 2 . Микрочастицы фиброина / желатина (F / G) и спидроина (Sp) способствуют реэпителизации раны и ингибируют образование рубцов. (A) Типичные фотографии глубоких кожных ран после подкожной инъекции MP фиброина / желатина или спидроина по сравнению с контрольной обработкой (PBS). (B) Размер раны в% от начальной площади в указанные моменты времени, рассчитанный по фотографиям раны ( n = 6). (C) Размер рубца в мм 2 на 21 день, рассчитанный по фотографиям раны ( n = 7). (D) Репрезентативные гистологические срезы ран на 5 день, окрашенные красителем по Мэллори. Стрелками обозначены края ложа раны. Шкала шкалы −500 мкм. (E) Размер раневого ложа рассчитан на основе гистологических срезов на 5-й день после ранения ( n = 5). (F) MPs фиброин / желатин и спидроин, выявленные окрашиванием H&E образцов ран на 5-й день. Стрелки указывают на инфильтрацию иммунных клеток. Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. **** п <0.0001.
Только MP фиброина / желатина индуцируют экспрессию провоспалительных цитокинов в MEF и BMDM, тогда как MPs фиброина / желатина и спидроина подавляют экспрессию профибротического фактора роста в MEF
Поскольку только MP фиброин / желатин задерживают сокращение раны (рисунки 2B, C), мы решили дополнительно охарактеризовать in vitro прямое воздействие обоих типов носителей на клетки, участвующие в заживлении ран, такие как фибробласты, кератиноциты и макрофаги. Мы создали первичные культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEF), кератиноцитов и макрофагов, полученных из костного мозга (BMDM), и культивировали их на двух типах MPs, а также в обычных условиях 2D культивирования в качестве контроля.Оба типа МП поддерживали рост клеток (рисунок 3A, дополнительный рисунок 1A) и были связаны с высокой жизнеспособностью клеток в течение по крайней мере 1 недели культивирования (данные не показаны). Интересно, что два типа МП различаются по своей способности способствовать адгезии фибробластов и макрофагов, которые представляют два основных типа клеток, взаимодействующих с МП при их подкожной инъекции. MP F / G поддерживали адгезию BMDM, в то время как MEF проявляли высокую адгезию к Sp MP через 1 час инкубации (рис. 3B). В меньшей степени кератиноциты также лучше прилипали к Sp MPs (дополнительный рисунок 1B).Затем мы проанализировали экспрессию провоспалительных генов в клетках, культивируемых на двух типах МП. Неожиданно мы наблюдали значительную индукцию провоспалительных цитокинов TNF и IL-6 как на уровне мРНК, так и на уровне белка в MEF и BMDM, культивируемых на фиброине / желатине, но не на MPs спидроина (Фигуры 3C, D). Интересно, что MEF оказался основным источником IL-6, тогда как BMDM продуцировал в основном TNF в ответ на MP фиброин / желатин. Однако экспрессия провоспалительных генов была временной и исчезла через 24 часа культивирования (дополнительный рисунок 1D).Кератиноциты не изменяли уровни экспрессии провоспалительных генов в ответ на любой тип MPs, однако они усиливали экспрессию молекулы адгезии Vcam1 при культивировании на спидроиновых MP (дополнительный рисунок 1C). Кроме того, мы обнаружили значительное подавление экспрессии генов Ctgf и Fgf2 в MEF, культивируемых на любом типе MP, по сравнению с контролем (рис. 3E). Известно, что эти факторы роста способствуют фиброзу во время заживления кожных ран (37).Чтобы отличить вклад биоматериала от влияния каркаса на клетки, мы проанализировали экспрессию генов в MEF, культивируемых в присутствии растворимых белков фиброина или спидроина. Важно отметить, что ни растворимый фиброин, ни спидроин (sF или sSp соответственно) не индуцировали экспрессию провоспалительных цитокинов в MEF (дополнительный рисунок 1E). Однако оба белка индуцировали подавление экспрессии Ctgf и Fgf2 в MEF, что позволяет предположить, что и фиброин, и спидроин обладают антифиброзными свойствами (рис. 3E).Таким образом, оба типа МП показали антифиброзный потенциал in vitro , в то время как только МП фиброин / желатин индуцировали временный воспалительный ответ в фибробластах и макрофагах.
Рисунок 3 . Только MP фиброин / желатин индуцируют экспрессию провоспалительных цитокинов в MEF и BMDM, тогда как MP как фиброин / желатин, так и спидроин подавляют экспрессию факторов профибротического роста в MEF. (A) Монослой MEF после 1 недели культивирования на микрочастицах фиброин-желатин (F / G) или спидроин (Sp).Актиновый цитоскелет окрашивается фаллоидином-Alexa488 (зеленый), ядра окрашиваются Hoechst 33342. Шкала шкалы — 50 мкм. (B) Эффективность адгезии MEF и BMDM к MP фиброина / желатина и спидроина ( n = 4). (C, D) Экспрессия TNF (C) и IL-6 (D) тремя типами клеток, культивируемых на фиброин / желатиновых или спидроиновых МП, по сравнению с обычными 2D-культурами (контроль), как выявлено с помощью кПЦР через 6 часов (слева) и с помощью ELISA в супернатантах через 24 часа (справа). (E) Экспрессия генов факторов роста фибробластов, Ctgf и Fgf2 , с помощью MEF, культивированных в течение 6 часов на фиброин / желатиновых или спидроиновых МП, по сравнению с растворимым фиброином или спидроином (sF или sSp) и обычным 2D культур (контроль), выявленных анализом кПЦР ( n = 3). Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. * р <0,05; ** p <0,01; *** р <0,001; **** п <0.0001.
Подкожная инъекция микрочастиц фиброина / желатина способствует умеренному воспалению и проникновению миелоидных клеток в кожу мыши
in vivoЗатем мы исследовали краткосрочные эффекты введения МП на гомеостаз кожи после подкожной инъекции. Основываясь на наших данных in vitro (рис. 3), мы ожидали увеличения воспалительного ответа и увеличения инфильтрации кожи иммунными клетками (дополнительный рис. 2) после инъекции МП фиброина / желатина по сравнению с МП спидроина.Интересно, что инъекция МП фиброина / желатина или спидроина приводила к увеличению инфильтрации кожи миелоидными клетками CD11b + на 1-й день после инъекции по сравнению с контрольной группой, которым вводили PBS, хотя разница не достигла статистической значимости из-за высокая вариабельность между образцами (Рисунки 4A, B). Проникающие миелоидные клетки дополнительно характеризовались их провоспалительной способностью в соответствии с экспрессией поверхностной молекулы Ly6C. В частности, было показано, что клетки Ly6C hi обладают провоспалительным действием, а клетки Ly6C low обладают противовоспалительным и прорегенеративным действием (38).В соответствии с нашими данными in vitro , мы наблюдали значительное увеличение процента сильно воспалительных миелоидных клеток Ly6C hi после инъекции МП фиброина / желатина по сравнению с МП спидроина и контрольной группой (рисунки 4A, C). . Это коррелировало со слегка уменьшенной долей невоспалительных клеток Ly6C low после инъекции MPs фиброина / желатина по сравнению с MPs спидроина и контрольной группой (рис. 4C). Более того, воспалительные клетки Ly6C hi , которые мигрировали в ответ на MP фиброина / желатина, показали значительное увеличение экспрессии Ly6C, как показано MFI (фиг. 4D).Чтобы определить, взаимодействуют ли эти клетки с введенными МП, мы выполнили иммунофлуоресцентный анализ ex vivo (рис. 4E). Действительно, мы наблюдали ряд воспалительных клеток Ly6C hi , непосредственно прикрепленных к фиброину / желатину, но не к MP спидроина, в соответствии с нашими данными in vitro , которые показали повышенную адгезию макрофагов к MP фиброина / желатина (Рисунок 3B). . Следует отметить, что мы не наблюдали каких-либо значительных изменений количества нейтрофилов Ly6G + в ответ на введение MPs (данные не показаны).Таким образом, МП фиброин / желатин, но не спидроин, вызывают инфильтрацию кожи провоспалительными миелоидными клетками после подкожной инъекции.
Рисунок 4 . Подкожная инъекция фиброина / желатина и спидроина MP влияет на инфильтрацию миелоидных клеток и снижает экспрессию факторов профибротического роста. (A) Типичные точечные графики, показывающие экспрессию Ly6C и Ly6G миелоидными клетками, выделенными из кожи через 1 день после инъекции с PBS, фиброин / желатин или спидроиновые МП (стратегия гейтирования — дополнительный рисунок 2). (B) Общее количество миелоидных клеток CD11b + в образцах кожи. (C) Доля миелоидных клеток Ly6C hi и Ly6C — в образцах кожи. (D) MFI окрашивания Ly6C среди Ly6G — Ly6C hi популяции миелоидных клеток. Все ячейки имеют VD — CD45 + CD11b + . (E) Иммунофлуоресцентное окрашивание MP фиброина / желатина и спидроина анти-Ly6C-антителом через 24 часа после подкожной инъекции.Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342. (F – H) Экспрессия провоспалительных цитокинов (F) , хемокинов (G) и профибротических факторов роста (H) в коже через 1 день после инъекции PBS, фиброин / желатин или спидроиновые МП. Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. * р <0,05; ** p <0,01; *** р <0,001.
Затем мы проанализировали экспрессию основных провоспалительных и прорегенеративных генов в образцах кожи после инъекции МП.В соответствии с нашими данными in vitro мы смогли обнаружить только незначительное увеличение экспрессии генов Tnf и Il6 в коже через 24 часа после введения фиброин / желатиновых МП (рис. 4F). Однако инъекция обоих типов МП приводила к значительному увеличению экспрессии хемокина Ccl2 , который, как известно, способствует инфильтрации иммунных клеток во время заживления ран и воспаления кожи (фиг. 4G). Это коррелирует с повышенной инфильтрацией миелоидных клеток в кожу после инъекции обоих типов МП по сравнению с контролем (рис. 4В).Среди генов, кодирующих факторы роста, в соответствии с нашими результатами in vitro , мы наблюдали значительное снижение экспрессии гена Fgf2 в ответ на оба типа МП по сравнению с контрольной группой, инъецированной PBS (фиг. 4H). Этот результат указывает на то, что прорегенеративный потенциал MP фиброина / желатина и спидроина может быть обусловлен их ингибирующим действием на фиброз кожи.
Обсуждение
Долгое время считалось, что биоинженерные МП проявляют свой прорегенеративный потенциал в основном за счет обеспечения основы для роста клеток и тканей, что, в свою очередь, способствует регенерации тканей (39, 40).Однако влияние биоматериалов на определенные типы клеток и их транскрипционную программу было в значительной степени недооценено, поскольку трудно различить эффекты, основанные на каркасе и биоматериалах. Сравнительные исследования нескольких типов биоматериалов могут дать новое представление об их различном влиянии на фенотип клеток. Действительно, наши данные решительно подтверждают идею о том, что, помимо того, что они служат клеточным каркасом, биоинженерные МП могут стимулировать определенный паттерн экспрессии воспалительных генов в зависимости от используемого материала.Мы наблюдали значительную экспрессию провоспалительных генов в MEF и BMDM, культивируемых на фиброин / желатине, но не на спидроиновых MP (Фигуры 3C, D), доказывая, что композитные MP фиброин / желатин могут специфически вызывать временное воспаление. Эти данные полностью согласуются с недавно опубликованными наблюдениями, предполагающими, что фиброин обладает провоспалительными свойствами (41–43). Однако в нашей работе мы не обнаружили какого-либо увеличения провоспалительных признаков в культивируемых клетках в ответ на растворимый фиброин (дополнительный рисунок 1E и данные не показаны), что указывает на то, что полимерный фиброин обладает уникальными свойствами активации клеток.Это дополнительно подтверждается опубликованной работой, показывающей, что только определенная конфигурация фиброиновых каркасов вызывает воспалительную реакцию в моноцитах (44). Кроме того, модификация желатина, используемая в этой работе для увеличения биосовместимости фиброиновых каркасов, может дополнительно модулировать влияние MP на культивируемые клетки, хотя в предыдущих исследованиях мы не наблюдали какого-либо влияния модифицированных желатином фиброиновых каркасов на экспрессию генов в MEF (45).
Важно отметить, что этот провоспалительный эффект различается для различных типов клеток, изучаемых здесь, поскольку MEF, культивируемые на MP фиброина / желатина, являются основным источником IL-6, BMDM в основном продуцирует TNF, в то время как первичные кератиноциты не сверхэкспрессируют ни TNF, ни IL-6 в ответ. депутатам (Рисунки 3C, D).Этот умеренный воспалительный ответ приводит к более высокой инфильтрации кожи воспалительными миелоидными клетками после инъекции MPs фиброин / желатин (рисунки 2F, 4A – E), что может быть важно для быстрого заживления ран (46). Действительно, несмотря на замедленное сокращение раны (Рисунки 2A, B), мы наблюдали значительное увеличение скорости реэпителизации глубоких кожных ран после инъекции MPs фиброин / желатин (Рисунки 2C-E). Интересно, что хотя MP спидроина не проявляли никаких провоспалительных свойств, они также вызывали сверхэкспрессию Ccl2 (Рисунок 4G), что приводило к усилению инфильтрации миелоидных клеток (Рисунок 4B) и индуцировало быструю реэпителизацию раны при подкожной инъекции (Рисунки 2D). , E), не влияя на сокращение раны (рисунки 2A, B).Это указывает на то, что MP спидроина обладают своими прорегенеративными свойствами посредством другого механизма. Мы также установили, что MP спидроина сильно индуцируют адгезию фибробластов и кератиноцитов in vitro (рис. 3В). Кроме того, мы обнаружили повышенную экспрессию молекулы адгезии Vcam1 в кератиноцитах, культивируемых на спидроиновых МП, по сравнению с фиброин / желатиновыми МП (дополнительный рисунок 1С), что может быть полезно для их миграции во время заживления ран.
Кроме того, мы наблюдали значительный антифиброзный эффект, индуцированный носителями, о чем свидетельствует снижение уровней экспрессии генов, кодирующих ключевые факторы роста Ctgf и Fgf2 , после культивирования MEF на обоих типах MP (рис. 3E).Важно отметить, что тот же эффект был вызван растворимым фиброином и спидроином, что позволяет предположить, что выбор биоматериала может иметь решающее значение для антифиброзных свойств биоинженерных частиц (рис. 3E). Более того, экспрессия Fgf2 значительно подавлялась после подкожной инъекции MP (фиг. 4H). Это привело к уменьшению образования рубцов во время регенерации кожи, что указывает на улучшение качества заживления ран (Рисунок 2C). Антифиброзные свойства этих каркасов представляют особый интерес для разработки соединений, направленных на лечение фиброзных осложнений гепатита, аутоиммунных и метаболических заболеваний, для которых степень фиброза определяет скорость прогрессирования заболевания и возможные исходы.В соответствии с нашей первоначальной гипотезой, мы предоставляем доказательства того, что некоторые эффекты лечения на основе MP (например, антифиброзные свойства) обусловлены внутренними свойствами биоматериала, в то время как другие (например, провоспалительные свойства F / G MP), по-видимому, зависят в большей степени. на конструкции строительных лесов. Мы считаем, что этот аспект следует учитывать при оценке новых биоинженерных повязок для клинического использования.
В целом, наши результаты подчеркивают значительные возможности в оптимизации транспортных средств-носителей, которые ранее считались инертными, и открывают новые возможности для быстрой адаптации терапевтических свойств системы лекарственное средство / носитель с помощью методов изменения состава.
Выводы и перспективы на будущее
Мы показываем, что MP фиброин / желатин и спидроин оказывают два основных эффекта на заживление ран in vivo : они увеличивают скорость реэпителизации и ингибируют образование рубцов. Однако депутаты используют разные механизмы для выполнения этих задач. MPs фиброин / желатин вызывают временный воспалительный ответ в MEF и BMDM in vitro и in vivo после их подкожной инъекции, что приводит к замедленному сокращению раны, в то время как MP спидроина не проявляют никаких провоспалительных свойств, а скорее поддерживают адгезию фибробластов и кератиноциты in vitro .Оба типа биоматериалов подавляют экспрессию профибротических факторов в MEF и предотвращают фиброз кожи во время заживления ран. Мы продемонстрировали, что, обладая сходным прорегенеративным потенциалом, эти носители заметно различаются во взаимодействии с иммунной системой хозяина. Этот неожиданный результат предполагает, что в контексте терапии микрочастицами можно резко изменить ее результат, заменив биополимерный носитель. Мы надеемся, что это позволит быстро оптимизировать терапию микроносителями в зависимости от типа раны, которую необходимо заживить (например,(например, травматические, послеоперационные, кардиометаболические и т. д.), что привело к появлению разнообразного набора более эффективных лекарств и устройств.
Авторские взносы
MN, AM, RZ, AA, AZ, TV и MD проводили эксперименты. VB, VD и MM предоставили важные материалы и технологии. MN, MM, IA, SN и MD разработали эксперименты и обсудили результаты. Рукопись написали MN, MD, MM и SN.
Финансирование
Работа поддержана РФФИ (грант № 15-29-04903), Программой фундаментальных исследований биомедицинских технологий РАН, Российским научным фондом (грант №14-25-00160).
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Лабораторные животные, использованные в исследовании, предоставлены коллекциями биоресурсов ИБХ РАН при поддержке программы Федерального агентства научных организаций по поддержке коллекций биоресурсов. Мы благодарим Dr.Давыдовой Л.И. за получение рекомбинантного спидроина rS1 / 9 и спидроиновых МП. Мы также благодарим докторов наук. А. Луговскому и Е. Воротеляку за критические замечания и ценные советы при подготовке рукописи.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.02851/full#supplementary-material
Список литературы
3. Ланден Н.Х., Ли Д., Столе М. Переход от воспаления к разрастанию: критический шаг во время заживления ран. Cell Mol Life Sci. (2016) 73: 3861–85. DOI: 10.1007 / s00018-016-2268-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
5. Мори Р., Кондо Т., Охима Т., Исида Ю., Мукаида Н. Ускоренное заживление ран у мышей с дефицитом рецептора фактора некроза опухоли p55 с уменьшенной инфильтрацией лейкоцитов. FASEB J. (2002) 16: 963–74. DOI: 10.1096 / fj.01-0776com
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
6. Вик Дж., Грундтман С., Майерл С., Вимписсинджер Т.Ф., Файхтингер Дж., Зельгер Б. и др.Иммунология фиброза. Annu Rev Immunol. (2013) 31: 107–35. DOI: 10.1146 / annurev -munol-032712-095937
CrossRef Полный текст | Google Scholar
7. Li Z, Hodgkinson T., Gothard EJ, Boroumand S, Lamb R, Cummins I, et al. Epidermal Notch2 рекрутирует врожденные лимфоидные клетки группы 3 RORγ + для управления нормальным восстановлением кожи. Nat Commun. (2016) 7: 11394. DOI: 10.1038 / ncomms11394
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
8.Wang X, Chen H, Tian R, Zhang Y, Drutskaya MS, Wang C, et al. Макрофаги индуцируют AKT / бета-катенин-зависимую активацию стволовых клеток Lgr5 + и регенерацию волосяных фолликулов через TNF. Nat Commun. (2017) 8: 14091. DOI: 10.1038 / ncomms14091
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
9. Галуччи Р.М., Симеонова П.П., Матесон Дж. М., Комминени С., Гуриэль Дж. Л., Сугавара Т. и др. Нарушение заживления кожных ран у мышей с дефицитом интерлейкина-6 и иммунодефицитом. FASEB J. (2000) 14: 2525–31. DOI: 10.1096 / fj.00-0073com
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
10. Lin Z-Q, Kondo T., Ishida Y, Takayasu T., Mukaida N. Существенное участие IL-6 в процессе заживления кожных ран, о чем свидетельствует замедленное заживление ран у мышей с дефицитом IL-6. J Leukoc Biol. (2003) 73: 713–21. DOI: 10.1189 / jlb.0802397
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
11. МакФарланд-Манчини М.М., Фанк Х.М., Палуч А.М., Чжоу М., Гиридхар П.В., Мерсер Калифорния и др.Различия в заживлении ран у мышей с дефицитом IL-6 по сравнению с рецептором IL-6. J Immunol. (2010) 184: 7219–28. DOI: 10.4049 / jimmunol.09
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
12. Нельсон А.М., Редди С.К., Рэтлифф Т.С., Хоссейн М.З., Кацефф А.С., Чжу А.С. и др. дцРНК, высвобождаемая при повреждении тканей, активирует TLR3, чтобы стимулировать регенерацию кожи. Cell Stem Cell (2015) 17: 139–51. DOI: 10.1016 / j.stem.2015.07.008
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
13.Нельсон А.М., Кацефф А.С., Резник С.Р., Ратлифф Т.С., Чжу А.С., Гарза Л.А. Нулевые по интерлейкину 6 мыши парадоксальным образом демонстрируют повышенную активность Stat3 и индуцированный раной неогенез волос. J Invest Dermatol. (2016) 136: 1051–3. DOI: 10.1016 / j.jid.2015.12.043
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
14. Киз Б. Е., Лю С., Асаре А., Наик С., Леворс Дж., Полак Л. и др. Нарушение передачи сигналов между эпидермальными и дендритными Т-клетками замедляет заживление ран в стареющей коже. Cell (2016) 167: 1323–38.DOI: 10.1016 / j.cell.2016.10.052
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
15. Сано С., Итами С., Такеда К., Тарутани М., Ямагути Ю., Миура Х. и др. Специфическая для кератиноцитов абляция Stat3 демонстрирует нарушение ремоделирования кожи, но не влияет на морфогенез кожи. EMBO J. (1999) 18: 4657–68. DOI: 10.1093 / emboj / 18.17.4657
CrossRef Полный текст | Google Scholar
16. Кира М., Сано С., Такаги С., Йошикава К., Такеда Дж., Итами С.Дефицит STAT3 в кератиноцитах приводит к нарушению миграции клеток из-за гиперфосфорилирования p130cas. J Biol Chem. (2002) 277: 12931–6. DOI: 10.1074 / jbc.M110795200
CrossRef Полный текст | Google Scholar
17. Эльдардири М., Мартин И., Роксбург Дж., Лоуренс-Уотт Д. Д., Шарп-младший. Сокращение раны значительно снижается за счет использования микроносителей для доставки кератиноцитов и фибробластов в модели заживления и регенерации ран у свиньи in vivo . Tissue Eng Part A (2011) 18: 587–97. DOI: 10.1089 / ten.tea.2011.0258
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
18. Гаинза Г., Виллулас С., Педраз Дж. Л., Эрнандес Р. М., Игартуа М. Достижения в системах доставки лекарств (DDS) для высвобождения факторов роста для заживления ран и регенерации кожи. Наномедицина (2015) 11: 1551–73. DOI: 10.1016 / j.nano.2015.03.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
19.Berthet M, Gauthier Y, Lacroix C, Verrier B, Monge C. Повязка на основе наночастиц: будущее лечения ран? Trends Biotechnol. (2017) 35: 770–84. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2017.05.005
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
20. Орлова А.А., Котлярова М.С., Лавренов В.С., Волкова С.В., Архипова А.Ю. Связь между концентрацией желатина в композитных каркасах на основе фиброина шелка и адгезией и пролиферацией фибробластов эмбриона мыши. Bull Exp Biol Med. (2014) 158: 88–91. DOI: 10.1007 / s10517-014-2699-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
21. Архипова А.Ю., Носенко М.А., Малюченко Н.В., Зварцев Р.В., Мойсенович А.М., Жданова А.С. и др. Влияние микроносителей фиброина на воспаление и регенерацию глубоких кожных ран у мышей. Биохимия (2016) 81: 1251–60. DOI: 10.1134 / S00062970031
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
22. Богуш В.Г., Соколова О.С., Давыдова Л.И., Клинов Д.В., Сидорук К.В., Есипова Н.Г. и др.Новая модельная система для создания биоматериалов на основе рекомбинантных аналогов белков паучьего шелка. J Neuroimmune Pharmacol. (2009) 4: 17–27. DOI: 10.1007 / s11481-008-9129-z
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
23. Мойсенович М.М., Пустовалова О.Л., Архипова Ю.Ю., Васильева Т.В., Соколова О.С., Богуш В.Г. и др. In vitro и in vivo исследования биосовместимости рекомбинантного аналога каркасов спидроина 1. J Biomed Mater Res Part A (2011) 96: 125–31.DOI: 10.1002 / jbm.a.32968
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
24. Мойсенович М.М., Пустовалова О., Шакелфорд Дж., Васильева Т.В., Дружинина Т.В., Каменчук Ю.А. и др. Регенерация ткани in vivo в каркасах рекомбинантного спидроина 1. Биоматериалы (2012) 33: 3887–98. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2012.02.013
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
25. Мойсенович М.М., Малюченко Н.В., Архипова А.Ю., Котлярова М.С., Давыдова Л.И., Гончаренко А.В. и др.Новые 3D-микроносители из рекомбинантного спидроина для регенеративной медицины. Докл Биохим Биофиз. (2015) 463: 232–5. DOI: 10.1134 / S16076720109
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
26. Коннер Д.А. Препарат питающих клеток фибробласта эмбриона мыши (MEF). Curr Protoc Mol Biol. (2001) 51: 23.2.1–23.2.7. DOI: 10.1002 / 0471142727.mb2302s51
CrossRef Полный текст | Google Scholar
27. Muller M, Eugster HP, Le Hir M, Shakhov A, Di Padova F, Maurer C, et al.Коррекция или перенос иммунодефицита вследствие делеции TNF-LT альфа путем трансплантации костного мозга. Mol Med. (1996) 2: 247–55. DOI: 10.1007 / BF03401621
CrossRef Полный текст | Google Scholar
28. Келсо А., Гласбрук А.Л., Канагава О., Бруннер К.Т. Производство фактора активации макрофагов клонами Т-лимфоцитов и корреляция с другими активностями лимфокинов. J Immunol. (1982) 129: 550–6.
PubMed Аннотация | Google Scholar
29.Ходивала-Дилке К. Первичная культура кератиноцитов мыши. В Wise C — редактор. Протоколы культуры эпителиальных клеток, Vol. 188. Totowa, NJ: Humana Press (2002) стр. 139–44. DOI: 10.1385 / 1-59259-185-X: 139
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
30. Артимо П., Йонналагедда М., Арнольд К., Баратин Д., Чарди Г., де Кастро Э. и др. ExPASy: портал ресурсов SIB по биоинформатике. Nucleic Acids Res. (2012) 40: W597–603. DOI: 10.1093 / nar / gks400
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
31.Агапов И.И., Мойсенович М.М., Васильева Т.В., Пустовалова О.Л., Коньков А.С., Архипова А.Ю. и др. Биоразлагаемые матрицы из регенерированного шелка Bombyx mori . Докл Биохим Биофиз. (2010) 433: 201–4. DOI: 10.1134 / S1607672
0149CrossRef Полный текст | Google Scholar
32. Лу Кью, Чжу Х, Чжан Ц., Чжан Ф., Чжан Б., Каплан Д.Л. Механизмы самосборки шелка и управление от термодинамики до кинетики. Биомакромолекулы (2012) 13: 826–32. DOI: 10.1021 / bm201731e
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
33. Мас-Моруно С., Фрайоли Р., Рехенмахер Ф., Нойбауэр С., Капп Т.Г., Кесслер Х. alphavbeta3- или alpha5beta1-Integrin-селективные пептидомиметики для поверхностного покрытия. Angew Chem Int Ed Engl. (2016) 55: 7048–67. DOI: 10.1002 / anie.201509782
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
34. Плотников С.В., Пасапера А.М., Сабасс Б., Уотерман СМ. Колебания силы внутри фокальных спаек опосредуют определение жесткости ECM, чтобы направлять направленную миграцию клеток. Cell (2012) 151: 1513–27. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.11.034
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
35. Давиденко Н., Шустер С.Ф., Бак Д.В., Фарндейл Р.В., Хамая С., Бест С.М. и др. Оценка связывания клеток с коллагеном и желатином: исследование влияния 2D и 3D архитектуры и химии поверхности. J Mater Sci Mater Med. (2016) 27: 148. DOI: 10.1007 / s10856-016-5763-9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
36.Саркер Б., Сингх Р., Сильва Р., Ротер Дж. А., Кашта Дж., Детч Р. и др. Оценка адгезии и пролиферации фибробластов на гидрогеле, сшитом альгинат-желатином. PLoS ONE (2014) 9: e107952. DOI: 10.1371 / journal.pone.0107952
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
37. Chujo S, Shirasaki F, Kondo-Miyazaki M, Ikawa Y, Takehara K. Роль фактора роста соединительной ткани и его взаимодействие с основным фактором роста фибробластов и хемоаттрактантным белком-1 макрофагов в фиброзе кожи. J Cell Physiol. (2009) 220: 189–95. DOI: 10.1002 / jcp.21750
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
38. Geissmann F, Jung S, Littman DR. Моноциты крови состоят из двух основных подгрупп с различными миграционными свойствами. Иммунитет (2003) 19: 71–82. DOI: 10.1016 / S1074-7613 (03) 00174-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
40. Smits AIPM, Bouten CVC. Тканевая инженерия встречается с иммуноинженерией: перспектива персонализированных стратегий тканевой инженерии in situ . Curr Opin Biomed Eng. (2018) 6: 17–26. DOI: 10.1016 / j.cobme.2018.02.006
CrossRef Полный текст | Google Scholar
41. Фарохи М, Моттагиталаб Ф, Фатахи Й, Хадемхоссейни А, Каплан DL. Обзор использования фиброина шелка в перевязочных материалах для ран. Trends Biotechnol. (2018) 36: 907–22. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2018.04.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
42. Мартинес-Мора С., Мровец А., Гарсия-Вискаино Е. М., Алькарас А., Сенис Ю. Л., Николас Ф. Дж.Фиброин и серицин из шелка Bombyx mori стимулируют миграцию клеток за счет активации и фосфорилирования c-Jun. PLoS ONE (2012) 7: e42271. DOI: 10.1371 / journal.pone.0042271
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
43. Парк Ю. Р., Султан М. Т., Пак Х. Дж., Ли Дж. М., Джу Х. У., Ли О. Дж. И др. Передача сигналов NF-κB является ключевой в процессах заживления ран фиброином шелка. Acta Biomater. (2017) 67: 183–95. DOI: 10.1016 / j.actbio.2017.12.006
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
44. Бхаттачарджи М., Шульц-Татер Э., Трелла Э., Миот С., Дас С., Лопарич М. и др. Роль трехмерной структуры и конформации белка на врожденный и адаптивный иммунный ответ на биоматериалы на основе шелка. Биоматериалы (2013) 34: 8161–71. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2013.07.018
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
45. Носенко М.А., Малученко Н.В., Друцкая М.С., Архипова А.Ю., Агапов И.И., Недоспасов С.А. и др.Индукция экспрессии ICAM-1 в эмбриональных фибробластах мыши, культивируемых на фиброин-желатиновых каркасах. Acta Naturae (2017) 9: 89–93.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
% PDF-1.4 % 2 0 obj > эндобдж 61 0 объект > эндобдж 118 0 объект > поток Apogee Series3 Pilot v1.0.1u22005-01-27T13: 00: 04Z2021-07-23T06: 00: 29-07: 002021-07-23T06: 00: 29-07: 00uuid: accd15d1-1dd1-11b2-0a00-3009275d6100uuid: accd15d4-1dd1-11b2-0a00-aa0000000000приложение / PDF конечный поток эндобдж 12 0 объект > эндобдж 1 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 13 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 21 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 25 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 30 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / TrimBox [9 9 621 801] / Type / Page >> эндобдж 119 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 139 0 объект [145 0 R 146 0 R 147 0 R 148 0 R 149 0 R 150 0 R 151 0 R] эндобдж 140 0 объект > поток q 287.5 0 0 75 169,75 690 см / Im0 Do Q BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 327,25977 591,99982 тм () Tj 0 0 1 рг -9.73 0 Тд (10.1101 / gad.1263005) Tj 0 г -16.89598 0 Тд (Доступ к самой последней версии на сайте doi 🙂 Tj 9,78299 1 тд () Tj / T1_1 1 Тс -1,44499 0 тд (19:) Tj / T1_0 1 Тс -2,78 0 тд (2005,) Tj / T1_2 1 Тс -5.558 0 Тд (Genes Dev. \ 240) Tj / T1_0 1 Тс 0 1.00001 TD (\ 240) Tj 0 1 ТД (Дмитрий Караченцев, Кавита Сарма, Дэнни Рейнберг и др.) Tj Т * (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс 15 0 0 15 61 641,99997 тм (подавление экспрессии генов и важно для митоза) Tj Т * (PR-Set7-зависимое метилирование гистона h5 Lys 20 функционирует в) Tj ET 61 580 м 566 580 л 0 0 мес. S BT ET BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 145.942 534,99994 тм (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс -3,50099 1 тд (Материал) Tj -2,77799 1,00001 тд (Дополнение) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 166 547,99997 тм (\ 240) Tj 32.78883 1 тд () Tj 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс -32.78883 0 Тд (http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2005/01/25/gad.1263005.DC1)Tj ET BT 0 г / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 145.942 503.99997 тм (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс -5.11299 1 Td (Ссылки) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 166 495,99994 тм (\ 240) Tj 28.89583 1 тд () Tj 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс -28.89583 0 Тд (http: // genesdev.cshlp.org/content/19/4/431.full.html#ref-list-1)Tj 0 г / T1_0 1 Тс 0 1.00001 TD (Эта статья цитирует 12 статей, 4 из которых доступны бесплатно по адресу:) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 145.942 473.99997 тм (\ 240) Tj / T1_1 1 Тс -3,44598 1 тд (Лицензия) Tj ET BT / T1_1 1 Тс 11 0 0 11 109,86 185 447,99997 тм (Сервис) Tj -3,16599 1 тд (Оповещение по электронной почте) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 166 439,99994 тм (\ 240) Tj 17.39696 1 Td () Tj 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс -4,892 0 Тд (нажмите здесь.) Tj 0 г / T1_0 1 Тс -12.50496 0 Тд (правый угол статьи или) Tj Т * (Получайте бесплатные уведомления по электронной почте, когда новые статьи цитируют эту статью — зарегистрируйтесь \ в рамке вверху) Tj ET 61 427 кв.м. 566 427 л 0 0 мес. S BT ET q 468 0 0 60 79.5117 см -1.00001 TL / Im1 Do Q 61 77 кв.м. 566 77 л 0 0 мес. S BT ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 63 51 тм (Пресса лаборатории Колд-Спринг-Харбор) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 8 0 0 8 505,97 174 788 тм () Tj 0 0 1 рг -16.44997 0 Тд (Пресса лаборатории Колд-Спринг-Харбор) Tj 0 г -14,50799 0 Тд (23 июля 2021 г. — опубликовано) Tj 0 0 1 рг -8.67099 0 Тд (genesdev.cshlp.org) Tj 0 г -8.11399 0 Тд (Скачано с) Tj ET конечный поток эндобдж 143 0 объект > / Filter / FlateDecode / Height 300 / Length 73148 / Name / X / Subtype / Image / Type / XObject / Width 1150 >> stream Hypq lJjBa 80 @ bA «pRHB) CSJP (M` * jQC`Ӻ \ =} Oaq ‘ٍ3 ~ ?ly |` #
Анализ трех пероксиредоксинов 1-Cys из Aspergillus fumigatus показывает, что цитозольный Prx1 является центральным для метаболизма и вирулентности H2O2.
Браун, Г. Д. и др. . Скрытые убийцы: грибковые инфекции человека. Sci Transl Med. 4 , 165rv113, https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3004404 (2012).
Артикул CAS Google Scholar
Kosmidis, C. & Denning, D. W. Переиздано: Клинический спектр легочного аспергиллеза. Postgrad Med J 91 , 403–410, https://doi.org/10.1136/postgradmedj-2014-206291rep (2015).
Артикул PubMed Google Scholar
Хеллер Дж. И Тудзински П. Активные формы кислорода в фитопатогенных грибах: передача сигналов, развитие и болезнь. Annu Rev Phytopathol 49 , 369–390, https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-072910-095355 (2011).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Холливелл, Б.И Гаттеридж, Дж. М. С. Свободные радикалы в биологии и медицине . Издание пятое. edn, (Oxford University Press, 2015).
Натан, С. и Шайло, М. Ю. Реактивные промежуточные соединения кислорода и азота во взаимоотношениях между млекопитающими-хозяевами и микробными патогенами. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97 , 8841–8848 (2000).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Захрт, Т. К. и Деретич, В. Реактивные промежуточные соединения азота и кислорода и защита бактерий: необычные адаптации у Mycobacterium tuberculosis. Антиоксиданты и редокс-сигнализация 4 , 141–159, https://doi.org/10.1089/152308602753625924 (2002).
Артикул CAS Google Scholar
Алегрия, Т. Г. и др. . Ор играет центральную роль в ответных реакциях бактерий на гидропероксиды жирных кислот и пероксинитрит. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 114 , E132 – E141, https://doi.org/10.1073/pnas.1619659114 (2017).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Имлай, Дж. А. Молекулярные механизмы и физиологические последствия окислительного стресса: уроки на модельной бактерии. Nat Rev Microbiol 11 , 443–454, https://doi.org/10.1038 / nrmicro3032 (2013).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Breitenbach, M., Weber, M., Rinnerthaler, M., Karl, T. & Breitenbach-Koller, L. Окислительный стресс у грибов: его функция в передаче сигнала, взаимодействии с растениями-хозяевами и лигноцеллюлозой деградация. Биомолекулы 5 , 318–342, https://doi.org/10.3390/biom5020318 (2015).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Пайва, К. Н. и Бозза, М. Т. Всегда ли активные формы кислорода вредны для патогенов? Антиоксиданты и редокс-сигнализация 20 , 1000–1037, https://doi.org/10.1089/ars.2013.5447 (2014).
Артикул CAS Google Scholar
Jaeger, T. Системы пероксиредоксина в микобактериях. Субклеточная биохимия 44 , 207–217 (2007).
Артикул PubMed Google Scholar
Мир, А.А. и др. . Систематическая характеристика семейства генов пероксидазы позволяет по-новому взглянуть на патогенность грибов Magnaporthe oryzae. Sci Rep 5 , 11831, https://doi.org/10.1038/srep11831 (2015).
ADS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar
Кайхами, Г. Х. и др. . Участие пероксиредоксина 1-Cys в вирулентности бактерий. Патогены PLoS 10 , e1004442, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004442 (2014).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Hillmann, F. et al. . Кристаллическая структура пероксиредоксина Asp f3 обеспечивает понимание механизмов устойчивости к окислительному стрессу и вирулентности Aspergillus fumigatus. Sci Rep 6 , 33396, https: // doi.org / 10.1038 / srep33396 (2016).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Srinivasa, K. et al. . Характеристика предполагаемой тиоредоксинпероксидазы prx1 Candida albicans. Молекулы и клетки 33 , 301–307, https://doi.org/10.1007/s10059-012-2260-y (2012).
MathSciNet Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Урбан, К. и др. . Подрабатывающий белок Tsa1p участвует в реакции на окислительный стресс и в биогенезе клеточной стенки у Candida albicans. Молекулярная микробиология 57 , 1318–1341, https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.04771.x (2005).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Reyes, A.M. et al. . PrxQ B из Mycobacterium tuberculosis представляет собой мономерную, тиоредоксин-зависимую и высокоэффективную гидропероксидредуктазу жирных кислот. Свободнорадикальная биология и медицина 101 , 249–260, https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.10.005 (2016).
Артикул CAS Google Scholar
Таирум, К. А. и др. . Каталитический остаток Thr или Ser модулирует структурные переключатели в 2-цис-пероксиредоксине с помощью различных механизмов. Sci Rep 6 , 33133, https://doi.org/10.1038/srep33133 (2016).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Орта, Б. Б., де Оливейра, М. А., Дискола, К. Ф., Куссиол, Дж. Р. и Нетто, Л. Е. Структурная и биохимическая характеристика пероксиредоксина Qbeta из Xylella fastidiosa: каталитический механизм и высокая реакционная способность. Журнал биологической химии 285 , 16051–16065, https://doi.org/10.1074/jbc.M109.094839 (2010).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Ри, С.Г. и Кил, И. С. Множественные функции и регуляция пероксиредоксинов млекопитающих. Annu Rev Biochem , https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060815-014431 (2017).
Кокс, А.Г., Винтерборн, К.С. и Хэмптон, М.Б. Участие митохондриального пероксиредоксина в антиоксидантной защите и окислительно-восстановительной передаче сигналов. Биохимический журнал 425 , 313–325, https://doi.org/10.1042/BJ200
(2009).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Chae, HZ, Uhm, TB и Rhee, SG Димеризация тиол-специфического антиоксиданта и важная роль цистеина 47. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91 , 7022–7026 (1994 ).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Ри, С. Г., Ча, Х. З. и Ким, К. Пероксиредоксины: исторический обзор и предварительный предварительный просмотр новых механизмов и новых концепций передачи сигналов в клетках. Свободнорадикальная биология и медицина 38 , 1543–1552, https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2005.02.026 (2005).
Артикул CAS Google Scholar
Chen, J. W., Dodia, C., Feinstein, S. I., Jain, M. K. & Fisher, A. B. 1-Cys пероксиредоксин, бифункциональный фермент с активностями глутатионпероксидазы и фосфолипазы A2. Журнал биологической химии 275 , 28421–28427, https: // doi.org / 10.1074 / jbc.M005073200 (2000).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Nevalainen, T. J. 1-Цистеинпероксиредоксин: фермент двойного действия с пероксидазной и кислой Ca2 + -независимой активностями фосфолипазы A2. Biochimie 92 , 638–644, https://doi.org/10.1016/j.biochi.2010.01.019 (2010).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Ангелуччи, Ф. и др. . Типичные 2-Cys пероксиредоксины у человеческих паразитов: несколько физиологических ролей для потенциальной мишени химиотерапии. Mol Biochem Parasitol 206 , 2–12, https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2016.03.005 (2016).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Jeelani, G. & Nozaki, T. Entamoeba, окислительно-восстановительный метаболизм на основе тиолов: потенциальная цель для разработки лекарств. Mol Biochem Parasitol 206 , 39–45, https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2016.01.004 (2016).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Pineyro, M. D., Parodi-Talice, A., Arcari, T. & Robello, C. Пероксиредоксины из Trypanosoma cruzi: факторы вирулентности и лекарственные мишени для лечения болезни Шагаса? Gene 408 , 45–50, https://doi.org/10.1016/j.gene.2007.10.014 (2008).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Harper, A. F. et al. . Атлас пероксиредоксинов, созданный с использованием подхода, основанного на профиле активного сайта, для функционально релевантной кластеризации белков. PLoS Comput Biol 13 , e1005284, https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005284 (2017).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Лессинг, Ф. и др. . Регулятор транскрипции Aspergillus fumigatus AfYap1 представляет собой главный регулятор защиты от реактивных кислородных промежуточных соединений, но он незаменим для патогенности в модели интраназальной инфекции у мышей. Эукариотическая клетка 6 , 2290–2302, https://doi.org/10.1128/EC.00267-07 (2007).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Вуд, З. А., Пул, Л. Б. и Карплюс, П. А. Выделение пероксиредоксина и регуляция передачи сигналов перекиси водорода. Science 300 , 650–653, https://doi.org/10.1126/science.1080405 (2003).
ADS Статья PubMed CAS Google Scholar
Pedrajas, J. R., Miranda-Vizuete, A., Javanmardy, N., Gustafsson, J. A. & Spyrou, G. Митохондрии Saccharomyces cerevisiae содержат пероксиредоксин одного типа цистеина с активностью пероксидазы тиоредоксина. Журнал биологической химии 275 , 16296–16301 (2000).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Toledo, J. C. Jr. et al. . Соединение I пероксидазы хрена как инструмент для исследования реактивных белков-цистеиновых остатков: от количественной оценки до кинетики. Свободнорадикальная биология и медицина 50 , 1032–1038, https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2011.02.020 (2011).
Артикул CAS Google Scholar
Tairum, C.A. et al. . Биохимия дисульфидов в 2-цис-пероксиредоксине: потребность в Glu50 и Arg146 для снижения дрожжевого Tsa1 тиоредоксином. J Mol Biol 424 , 28–41, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2012.09.008 (2012).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Flohe, L., Toppo, S., Cozza, G. & Ursini, F. Сравнение механизмов тиолпероксидазы. Антиоксиданты и редокс-сигнализация 15 , 763–780, https://doi.org/10.1089/ars.2010.3397 (2011).
Артикул CAS Google Scholar
Ветрано, А. М. и др. . Характеристика оксидазной активности каталазы млекопитающих. Журнал биологической химии 280 , 35372–35381, https: // doi.org / 10.1074 / jbc.M5039 (2005 г.).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Hu, W. et al. . Идентификация основных генов и приоритезация мишеней для лекарств у Aspergillus fumigatus. Патогены PLoS 3 , e24, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0030024 (2007).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Демаси, А. П., Перейра, Г. А. и Нетто, Л. Е. Цитозольная тиоредоксинпероксидаза I необходима для антиоксидантной защиты дрожжей с дисфункциональными митохондриями. писем ФЭБС 509 , 430–434 (2001).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Ламбу, К., Ламар, К., Бо, Р., Дюфур, Н. и Латж, Дж. П. Функциональный анализ семейства супероксиддисмутазы у Aspergillus fumigatus. Молекулярная микробиология 75 , 910–923, https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.07024.x (2010).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Paris, S. et al. . Каталазы Aspergillus fumigatus. Инфекция и иммунитет 71 , 3551–3562 (2003).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Граль, Н., Динамарко, Т. М., Виллджер, С. Д., Гольдман, Г. Х. и Крамер, Р. А. Цепь митохондриального транспорта электронов Aspergillus fumigatus опосредует гомеостаз окислительного стресса, реакции гипоксии и грибковый патогенез. Молекулярная микробиология 84 , 383–399, https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2012.08034.x (2012).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Джозеф-Хорн, Т., Холломон, Д. В. и Вуд, П. М. Грибковое дыхание: сочетание стандартных и альтернативных компонентов. Biochimica et biophysica acta 1504 , 179–195 (2001).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Neubauer, M. et al. . Митохондриальная динамика в патогенной плесени Aspergillus fumigatus: терапевтические и эволюционные последствия. Молекулярная микробиология 98 , 930–945, https: // doi.org / 10.1111 / mmi.13167 (2015).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Максвелл, Д. П., Ван, Ю. и Макинтош, Л. Альтернативная оксидаза снижает выработку реактивного кислорода митохондриями в клетках растений. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 , 8271–8276 (1999).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Purvis, A.C. Роль альтернативной оксидазы в ограничении производства супероксида митохондриями растений. Physiologia Plantarum 100 , 165–170, https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1997.tb03468.x (1997).
Артикул CAS Google Scholar
Magnani, T. et al. . Подавление гена митохондриальной альтернативной оксидазы Aspergillus fumigatus увеличивает производство активных форм кислорода и уничтожение гриба макрофагами. J Bioenerg Biomembr 40 , 631–636, https://doi.org/10.1007/s10863-008-9191-5 (2008).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Hagiwara, D. et al. . Гистидинкиназа NikA / TcsC участвует в конидиации, морфологии гиф и ответах на осмотический стресс и противогрибковые химические вещества у Aspergillus fumigatus. PloS one 8 , e80881, https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0080881 (2013).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
McCormick, A. et al. . Двухкомпонентная сенсорная киназа TcsC и ее роль в стрессоустойчивости патогенной для человека плесени Aspergillus fumigatus. PloS one 7 , e38262, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038262 (2012).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Bruder Nascimento, A.C. et al. . Активированные митогеном протеинкиназы SakA (HOG1) и MpkC взаимодействуют в отношении вирулентности Aspergillus fumigatus. Молекулярная микробиология 100 , 841–859, https://doi.org/10.1111/mmi.13354 (2016).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Kojima, K., Bahn, Y. S. & Heitman, J. Calcineurin, Mpk1 и Hog1 MAPK-пути независимо контролируют чувствительность к противогрибковым препаратам флудиоксонила у Cryptococcus neoformans. Microbiology 152 , 591–604, https://doi.org/10.1099/mic.0.28571-0 (2006).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Упадхья, Р. и др. . Сульфиредоксин играет пероксиредоксин-зависимые и независимые роли через сигнальный путь HOG в Cryptococcus neoformans и способствует вирулентности грибов. Молекулярная микробиология 90 , 630–648, https: // doi.org / 10.1111 / mmi.12388 (2013).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Морано, К. А., Грант, К. М. и Мой-Роули, В. С. Ответ на тепловой шок и окислительный стресс у Saccharomyces cerevisiae. Genetics 190 , 1157–1195, https://doi.org/10.1534/genetics.111.128033 (2012).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Калера, Дж. А. и др. . Клонирование и разрушение гена антигенной каталазы Aspergillus fumigatus. Инфекция и иммунитет 65 , 4718–4724 (1997).
PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Santos, C. S. et al. . Мониторинг h3O2 внутри Aspergillus fumigatus с помощью встроенного микроэлектрода: роль пероксиредоксинового белка Prx1. Anal Chem , https: // doi.org / 10.1021 / acs.analchem.7b04074 (2018).
Vodisch, M. et al. . Двумерные справочные карты протеома патогенного мицелиального гриба человека Aspergillus fumigatus. Proteomics 9 , 1407–1415, https://doi.org/10.1002/pmic.200800394 (2009).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Gomes, F. et al. . Протеолитическое расщепление комплексом пептидазы внутренней мембраны (IMP) или пептидазой Oct1 контролирует локализацию дрожжевого пероксиредоксина Prx1 в различных компартментах митохондрий. Журнал биологической химии 292 , 17011–17024, https://doi.org/10.1074/jbc.M117.788588 (2017).
Артикул PubMed CAS PubMed Central Google Scholar
Chae, H. Z., Kim, H. J., Kang, S. W. & Rhee, S. G. Характеристика трех изоформ пероксиредоксина млекопитающих, которые восстанавливают пероксиды в присутствии тиоредоксина. Diabetes Res Clin Pract 45 , 101–112 (1999).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Перкинс, А., Нельсон, К. Дж., Парсонейдж, Д., Пул, Л. Б. и Карплюс, П. А. Пероксиредоксины: защитники окислительного стресса и модуляторы пероксидной передачи сигналов. Trends Biochem Sci 40 , 435–445, https://doi.org/10.1016/j.tibs.2015.05.001 (2015).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Vogtle, F. N. et al. . Общий анализ митохондриального N-протеома определяет процессинговую пептидазу, критическую для стабильности белка. Cell 139 , 428–439, https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.07.045 (2009).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Mokranjac, D. & Neupert, W. Тридцать лет транслокации белков в митохондрии: неожиданно сложный и все еще загадочный. Biochimica et biophysica acta 1793 , 33–41, https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2008.06.021 (2009).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Lee, C.M., Sedman, J., Neupert, W. & Stuart, R.A. ДНК-геликаза, Hmi1p, транспортируется в митохондрии с помощью C-концевого расщепляемого нацеливающего сигнала. Журнал биологической химии 274 , 20937–20942 (1999).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Пойтон Р. О., Болл К. А. и Кастелло П. Р. Митохондриальная генерация свободных радикалов и гипоксическая передача сигналов. Trends Endocrinol Metab 20 , 332–340, https://doi.org/10.1016/j.tem.2009.04.001 (2009).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Tahara, E.Б., Наварете, Ф. Д. и Ковальтовски, А. Дж. Тканевые, субстратные и сайт-специфические характеристики генерации митохондриальных активных форм кислорода. Свободнорадикальная биология и медицина 46 , 1283–1297, https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2009.02.008 (2009).
Артикул CAS Google Scholar
Akhter, S. et al. . Роль альтернативного гена оксидазы в патогенезе Cryptococcus neoformans. Инфекция и иммунитет 71 , 5794–5802 (2003).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Мартинс, В. П. и др. . Участие альтернативной оксидазы в окислительном стрессе и дифференцировке мицелия в дрожжи у Paracoccidioides brasiliensis. Эукариотическая клетка 10 , 237–248, https://doi.org/10.1128/EC.00194-10 (2011).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Авила-Адам, С. и Коллер, В. Нарушение альтернативного гена оксидазы у Magnaporthe grisea и его влияние на инфекцию хозяина. Mol Plant Microbe Interact 15 , 493–500, https://doi.org/10.1094/MPMI.2002.15.5.493 (2002).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Рогов А.Г., Суханова Е.И., Уральская Л.А., Аливердиева Д.А., Звягильская Р.А. Альтернативная оксидаза: распределение, индукция, свойства, структура, регуляция и функции. Биохимия (Моск.) 79 , 1615–1634, https://doi.org/10.1134/S00062970112 (2014).
Артикул CAS Google Scholar
Делоне А., Иснард А. Д. и Толедано М. Б. Зондирование h3O2 посредством окисления фактора транскрипции Yap1. EMBO J 19 , 5157–5166, https://doi.org/10.1093/emboj/19.19.5157 (2000).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Окадзаки С., Наганума А. и Куге С. Пероксиредоксин-опосредованная окислительно-восстановительная регуляция ядерной локализации Yap1, фактора транскрипции в почкующихся дрожжах. Антиоксиданты и редокс-сигнализация 7 , 327–334, https://doi.org/10.1089/ars.2005.7.327 (2005).
Артикул CAS Google Scholar
Килани, Дж. И Филлинджер, С. Фенилпирролы: 30 лет, две молекулы и (почти) отсутствие сопротивления. Frontiers in microbiology 7 , 2014, https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.02014 (2016).
Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar
Segmuller, N., Ellendorf, U., Tudzynski, B. & Tudzynski, P. BcSAK1, активируемая стрессом митоген-активированная протеинкиназа, участвует в вегетативной дифференцировке и патогенности Botrytis cinerea. Эукариотическая клетка 6 , 211–221, https: // doi.org / 10.1128 / EC.00153-06 (2007).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Лин, К. Х. и Чанг, К. Р. Специализированные и общие функции опосредованных гистидинкиназой и HOG1 MAP-киназой сигнальных путей у Alternaria alternata, мицелиальных грибов, патогенных цитрусовых. Fungal Genet Biol 47 , 818–827, https://doi.org/10.1016/j.fgb.2010.06.009 (2010).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Van Thuat, N., Schafer, W. и Bormann, J. Стресс-активированная протеинкиназа FgOS-2 является ключевым регулятором жизненного цикла злокачественного патогена Fusarium graminearum. Mol Plant Microbe Interact 25 , 1142–1156, https://doi.org/10.1094/MPMI-02-12-0047-R (2012).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Delaunay, A., Pflieger, D., Barrault, M.-B., Vinh, J. & Toledano, M.B.Тиолпероксидаза является рецептором h3O2 и редокс-преобразователем при активации генов. Ячейка 111 , 471–481, https://doi.org/10.1016/s0092-8674(02)01048-6 (2002).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Leal, S.M. et al. . Грибковые антиоксидантные пути способствуют выживанию против нейтрофилов во время инфекции. Журнал клинических исследований 122 , 2482–2498, https: // doi.org / 10.1172 / JCI63239 (2012).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Philippe, B. et al. . Уничтожение Aspergillus fumigatus альвеолярными макрофагами опосредуется реактивными промежуточными окислителями. Инфекция и иммунитет 71 , 3034–3042 (2003).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edn, (CSHL Press, 2001).
Огусуку Р., Реттори Д., Мунхоз Д. К., Нетто Л. Е. и Аугусто О. Реакции дрожжевых тиоредоксинпероксидаз I и II с пероксидом водорода и пероксинитритом: константы скорости по конкурентной кинетике. Свободнорадикальная биология и медицина 42 , 326–334, https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2006.10.042 (2007).
Артикул CAS Google Scholar
Кафер, Э. Мейотическая и митотическая рекомбинация у Aspergillus и его хромосомные аберрации. Успехи в генетике 19 , 33–131 (1977).
PubMed CAS Google Scholar
Малавази И. и Гольдман Г. Х. Разрушение генов у Aspergillus fumigatus с использованием стратегии на основе ПЦР и in vivo рекомбинации в дрожжах. Методы Mol Biol 845 , 99–118, https: // doi.org / 10.1007 / 978-1-61779-539-8_7 (2012).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Марис, А.Ф., Ассумпкао, А.Л., Бонатто, Д., Брендель, М. и Энрикес, Дж. А. Стрессоустойчивость к гидропероксидам, вызванная диауксическим сдвигом, у Saccharomyces cerevisiae не является адаптивной реакцией на стресс и не зависит от функциональной митохондрии. Текущая генетика 39 , 137–149 (2001).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Мунхоз, Д. К. и Нетто, Л. Е. Цитозольные тиоредоксинпероксидазы I и II являются важными средствами защиты дрожжей от воздействия органического гидропероксида: каталазы и пероксиредоксины взаимодействуют при разложении h3O2 дрожжами. Журнал биологической химии 279 , 35219–35227, https://doi.org/10.1074/jbc.M313773200 (2004).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Rocha, M. C. и др. . Мутант Aspergillus fumigatus pkcA G579R является дефектным в активации пути целостности клеточной стенки, но является незаменимым для вирулентности в модели нейтропенической инфекции у мышей. PloS one 10 , e0135195, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0135195 (2015).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Ямагути, Х., Учида, К., Нагино, К. и Мацунага, Т.Полезность колориметрического метода для определения чувствительности видов Aspergillus к вориконазолу противогрибковых препаратов. Журнал инфекции и химиотерапии: официальный журнал Японского общества химиотерапии 8 , 374–377, https://doi.org/10.1007/s10156-002-0201-y (2002).
Артикул CAS Google Scholar
Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2 (-Delta Delta C (T)). Методы 25 , 402–408, https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262 (2001).
Артикул PubMed CAS PubMed Central Google Scholar
Malavazi, I. et al. . Фенотипический анализ генов, накопление мРНК которых зависит от кальциневрина у Aspergillus fumigatus. Fungal Genet Biol 46 , 791–802, https://doi.org/10.1016/j.fgb.2009.06.009 (2009).
Артикул PubMed CAS Google Scholar
Бом, В. Л. и др. . Гомолог фосфатазы Aspergillus fumigatus sitA важен для адгезии, целостности клеточной стенки, образования биопленок и вирулентности. Эукариотическая клетка 14 , 728–744, https://doi.org/10.1128/EC.00008-15 (2015).
Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Марим, Ф. М., Сильвейра, Т. Н., Лима, Д. С. мл. И Замбони, Д. С. Способ получения макрофагов, полученных из костного мозга, из криоконсервированных клеток костного мозга мыши. PloS one 5 , e15263, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015263 (2010).
ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar
Mech, F., Thywissen, A., Guthke, R., Brakhage, A.