Контрольные работы 9 класс габриелян: ГДЗ контрольные и проверочные работы по химии 9 класс Габриелян, Краснова Дрофа

RNA-seq, ChIP-seq и ATAC-seq были преобразованы в файлы BigWig с помощью deepTools (версия 2) ⁶⁰ и загружены в Cyverse (www .cyverse.org) для визуализации в UCSC Genome Browser ⁶¹ (genome.ucsc.edu).

Анализ генной сети

Картирование всех пиков Ebf1-, Pax5- и Erg-ChIP-seq с дифференциально экспрессируемыми генами в Rag1Cre ^{T / +} ; Erg ^{Δ / Δ} были идентифицированы пре-proB клетки в пределах 10 kb от TSS. Пики внутри тела гена были обозначены как «проксимальные мишени», пики, перекрывающие TSS, были помечены как регулируемые промотором мишени, пики менее 3 т.п.н. выше или ниже TSS были помечены как предполагаемые регулируемые промотором мишени, пики более чем на 3 т.п. нижестоящие TSS были обозначены как предполагаемые дистальные мишени.Аннотации генов онтогенеза (GO) дифференциально экспрессируемых генов были выполнены и подверглись экспертной ручной корректировке. Сеть была построена с использованием пакета CRAN ⁶² и экспортирована в Cytoscape ⁶³ для настройки с использованием пакета RCy3 ⁶⁴ R / Bioconductor.

Анализ Hi-C

Для анализа Hi-C in situ ^{13 , 65} библиотеки первичных иммунных клеток были созданы в биологических дубликатах для каждого генотипа.Illumina NextSeq 500 использовался для секвенирования библиотек с считыванием парных концов 80 пар оснований для создания библиотек размером от 42 до 100 миллионов допустимых пар считывания. Каждый образец был выровнен по геному mm10 с использованием пакета diffHic v1.14.0 ⁶⁶ , который использует cutadapt v0.9.5 ⁶⁷ и bowtie2 v2.2.5 ⁵⁸ для выравнивания. Полученный файл BAM был отсортирован по имени чтения, команде FixMateInformation из пакета Picard v1.117 (https://broadinstitute.github.io/picard/), повторяющиеся чтения были отмечены, а затем повторно отсортированы по имени. Было определено, что пары считывания являются свисающими концами и удалялись, если пары обращенных внутрь или наружу считываний на одной и той же хромосоме были разделены менее чем на 1000 п.н. для обращенных внутрь чтения и 6000 п.н. для обращенных наружу считываний. Пары чтения с размером фрагмента более 1000 п.н. удалялись. Оценка ошибки выравнивания была получена путем сравнения местоположения на карте 3′-сегмента каждого считываемого химерного фрагмента с таковым 5′-сегмента его партнера.Ошибка картирования была определена как присутствующая, если два сегмента не были обращены внутрь и разделены менее чем на 1000 п.н., и около 1–2%, по оценкам, имели ошибки. Дифференциальные взаимодействия (ДВ) между тремя разными группами были обнаружены с помощью пакета diffHic ⁶⁶ . Пары считывались в пары бункеров 100 кбит / с. Бины отбрасывались, если обнаруживались на половых хромосомах, содержали менее 10, содержали геномные области, занесенные в черный список, как определено ENCODE для mm10 ⁶⁸ , или находились в центромерной или теломерной области.Фильтрация пар бинов выполнялась с использованием функции filterDirect, где пары бинов сохранялись только в том случае, если их средняя интенсивность взаимодействия более чем в 5 раз превышала частоту фонового лигирования. Частоту лигирования оценивали по межхромосомным парам бинов из матрицы подсчета пар бинов 500 кб. Подсчеты были нормализованы между библиотеками с использованием подхода на основе лесса. Тесты для DI были выполнены с использованием структуры квази-правдоподобия (QL) ⁶⁹ пакета edgeR.Матрица дизайна была построена с использованием макета, в котором указывалась группа ячеек, к которой принадлежала каждая библиотека, и пол мыши. Зависимый от среднего тренд был подогнан к отрицательным биномиальным дисперсиям с помощью функции EstimationDisp. Обобщенная линейная модель (GLM) была приспособлена к счетчикам для каждой пары бинов ⁷⁰ , и дисперсия QL была оценена из отклонения GLM с помощью функции glmQLFit. Затем дисперсии QL были сжаты до второй тенденции, зависящей от среднего, с использованием надежной эмпирической стратегии Байеса ⁷¹ .Значение P было вычислено относительно нулевой гипотезы для каждой пары бинов с использованием теста QL F . P Значения были скорректированы для множественного тестирования с использованием метода Бенджамини – Хохберга. DI был определен как пара бункеров с вероятностью ложного обнаружения (FDR) ниже 5%. DI, смежные в пространстве взаимодействия, были объединены в кластеры с помощью функции diClusters для создания кластерных DI. DI объединялись в кластер, если они перекрывались в пространстве взаимодействия, до максимального размера кластера 1 Мбит / с.Порог значимости для каждой пары бинов был определен таким образом, чтобы FDR на уровне кластера находился на уровне 5%. Статистика кластера была рассчитана с использованием пакета csaw v1.16.0 ⁷² . Перекрытия между некластеризованными парами бинов и геномными интервалами были выполнены с использованием пакета InteractionSet ⁷³ . Пледы были построены с использованием контактных матриц и функции plotHic из пакета Sushi R ⁷⁴ .Цветовая палитра была взята из пакета viridis (https://github.com/sjmgarnier/viridis, доступ 30 марта 2018 г.), а диапазон интенсивностей цвета на каждом графике был масштабирован в соответствии с размером библиотеки образца. Функция plotBedpe пакета Sushi использовалась для построения некластеризованных DI в виде дуг, где показатель z , показанный на вертикальном доступе, был рассчитан как -log ₁₀ ( p -значение). Эти данные были депонированы в базе данных Gene Expression Omnibus (номер доступа {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE133246», «term_id»: «133246»}} GSE133246).

Флуоресцентная гибридизация in situ

Культивированные предшественники В-клеток ресуспендировали в гипотоническом 0,075 М растворе KCl и нагревали до 37 ° C в течение 20 мин. Клетки осаждали и ресуспендировали в смеси метанол: ледяная уксусная кислота в соотношении 3: 1 (об. / Об.). Фиксированные клетки помещали на покрытые полизином слайды Shandon ^TM (ThermoFisher Scientific) и сушили на воздухе. Клетки гибридизовали с зондами FISH (Creative Bioarray) при 37 ° C в течение 16 часов под покровным стеклом, закрытым Fixogum (Marabu), после денатурации при 73 ° C в течение 5 минут.Клетки промывали при 73 ° C в 0,4 × SSC / 0,3% NP ₄₀ в течение 2 минут, затем 2 × SSC / 0,1% NP ₄₀ в течение менее 1 минуты при комнатной температуре и сушили на воздухе в темноте и снимали крышку. . Изображения ядер получали на инвертированном конфокальном объективе Zeiss LSM 880 с иммерсионным масляным объективом с числовой апертурой 63 × / 1,4. Затем были захвачены Z-стопки изображений с использованием режима лямбда-сканирования, 405-го и многополосного светоделителя (488/561/633). Использовались следующие лазерные линии: 405, 488, 561 и 633 нм. Спектральные данные регистрировали с интервалом 8 нм.Во всех случаях изображения были настроены с размером пикселя 70 нм и интервалом 150 нм для z-стека. Отдельные контроли красителя, использующие ту же конфигурацию, были захвачены, и спектры импортированы для спектрального разделения с использованием программного обеспечения Zen (Zen 2.3, Zeiss Microscopy). Несмешанные данные затем деконволюционировали с помощью инструмента пакетной экспрессии в профессиональном программном обеспечении Huygens (Scientific Volume Imaging). Изображения анализировали с помощью программного обеспечения TANGO ⁷⁵ после линейной деконволюции. Ядерные границы были выделены в TANGO с использованием фонового ядерного сигнала в канале Aqua.Был применен трехмерный медианный фильтр, и трехмерное изображение спроецировано с максимальной проекцией двумерного изображения для обнаружения ядер с использованием метода треугольника для автоматического определения порога в ImageJ ⁷⁶ . Были заполнены дыры в двоичных изображениях и реализована двухмерная процедура разделения соприкасающихся ядер с использованием реализации 2D-водораздела ImageJ. Двухмерные границы обнаруженных ядер были расширены в трехмерном пространстве, и внутри каждой трехмерной ограниченной области была применена пороговая обработка треугольника для обнаружения ядерной границы в трехмерном пространстве.Полученные изображения от иммунофлуоресцентных зондов сначала были отфильтрованы с использованием трехмерного медианного и трехмерного фильтра «tophat» для улучшения пятноподобных структур с последующим применением плагина TANGO «spotSegmenter» с сохранением для анализа только четырех лучших пятен с самой высокой интенсивностью. Пятна, идентифицированные TANGO, были вручную проверены по исходному иммунофлуоресцентному изображению, чтобы идентифицировать и записать правильное расстояние, вычисленное TANGO между иммунофлуоресцентными зондами aqua и 5-Rox для обоих аллелей Igh в ядре.

Статистический анализ

Непарные двусторонние тесты Стьюдента t использовали с использованием GraphPad Prism (программное обеспечение GraphPad), если не указано иное. Если не указано иное, значение P <0,05 считалось значимым.

Подробная информация об используемых реактивах и программных пакетах представлена ​​в дополнительной таблице ⁴ .

Вклад авторов

Концептуализация, A.P.N., M.S.Y.L, A.J.K., T.M.J., M.A.D., R.S.A., K.R., D.M.T., G.K.S., M.J.D., S.L.N. и W.S.A .; Методология, A.P.N., M.S.Y.L, C.C.B., O.G., T.M.J., T.B., A.J.K., M.J.H., M.A.D., R.S.A., K.R., D.M.T., G.K.S., M.J.D., S.L.N. и W.S.A .; Расследование, A.P.N., H.D.C., S.H., K.B., T.M.J., M.S.Y.L., C.C.B., O.G., Y.C.C., T.B., L.D., C.D.H., H.I., S.M., E.V., A.J.K., R.F., A.G., T. Формальный анализ, A.P.N., H.D.C., S.H., M.S.Y.L., O.G., C.C.B., Y.C.C. T.B., K.R., M.J.D., S.L.N; Письмо — Оригинальный проект, A.P.N .; Письмо — обзор и редактирование, A.P.N., H.D.C., S.H., M.S.Y.L., A.J.K., G.K.S., S.L.N. и W.S.A .; Финансирование Приобретение, A.P.N. и W.S.A .; Надзор, A.P.N., M.A.D., D.M.T., G.K.S., M.J.D., S.L.N. и W.S.A.

Разработанные варианты CRISPR-Cas12a и гибридные руководства ДНК-РНК обеспечивают надежное и быстрое тестирование COVID-19

Характеристика ферментов Cas12a с различными гРНК

Мы стремились оценить эффективность различных комплексов РНП Cas12a во флуоресценции транс -расщепление (рис.1a) и сравните их с тем, что используется в системе DETECTR ¹⁷ , где LbCas12a дикого типа был спарен с 20-нуклеотидной (нт) гРНК, нацеленной на N-ген SARS-CoV-2 (в данном документе называемой N-Mam гРНК ) (Рис. 1б). Для создания новых гРНК мы выровняли геномы SARS-CoV-2 и других родственных коронавирусов и выбрали шесть дополнительных сайтов-мишеней (O1, O2, S1, S2, S3 и N1), которые не только содержали соседний мотив протоспейсера TTTV (PAM ) для Cas12a, но также сильно различались между коронавирусами (дополнительный рис.1). Мы также очистили пять различных ферментов Cas12a для тестирования. Чтобы оценить возможность развертывания диагностического анализа на основе CRISPR в внелабораторных условиях (например, в домашних условиях), мы сначала провели реакции расщепления при комнатной температуре с использованием синтетических фрагментов ДНК. Флуоресценцию контролировали в течение 30 минут в считывающем устройстве для микропланшетов (рис. 1с и дополнительный рис. 2-4). Для гРНК N-Mam мы наблюдали, что, хотя LbCas12a может обнаруживать SARS-CoV-2 с минимальной перекрестной реактивностью для SARS-CoV или MERS-CoV, как и ожидалось, другие четыре фермента Cas12a работали аналогично, а enAsCas12a давала еще более высокую флуоресценцию. сигнала, чем LbCas12a в присутствии субстрата SARS-CoV-2.ГРНК N-Mam также была не самой идеальной для LbCas12a. Коллатеральная активность LbCas12a в комплексе с гРНК S3 была примерно вдвое выше, чем у того же фермента в комплексе с гРНК N-Mam в присутствии SARS-CoV-2. S2-гРНК также генерировала более сильные сигналы флуоресценции, чем N-Mam-гРНК, когда была спарена с LbCas12a, а также с AsCas12a, enAsCas12a и enRVR. Среди всех протестированных ферментов enAsCas12a продемонстрировал самую высокую коллатеральную активность с гРНК S2 в присутствии SARS-CoV-2.В целом минимальная длина спейсера для гРНК в нашем диагностическом анализе оказалась равной 20nt. Когда мы сократили длину спейсера для N-Mam или S2 гРНК до 18nt или 19nt, побочная активность всех нуклеаз Cas12a была снижена.

a Схема флуоресцентного анализа расщепления транс . Здесь репортер представляет собой флуорофор, связанный с гасителем коротким фрагментом оцДНК.GRNA запрограммирована на распознавание определенного локуса генома SARS-CoV-2. В отсутствие вируса репортерная молекула не повреждена, и поэтому флуоресценция не наблюдается. Однако, когда присутствует вирус, Cas12a RNP будет связываться и расщеплять свою запрограммированную мишень, становиться гиперактивируемой и разрывать линкер между флуорофором и гасителем, тем самым генерируя сигнал флуоресценции. b Организация генома SARS-CoV-2. Гены, кодирующие структурные белки, обозначены зелеными прямоугольниками, а гены, кодирующие вспомогательные белки, обозначены голубыми прямоугольниками.Хотя ORF10 аннотирован в геноме, в настоящее время нет доказательств его экспрессии ⁷¹ . Расположение новых гРНК показано розовыми полосами под генами, а локус N-Mam показан красной полосой. c Измерения флуоресценции с использованием микропланшетного ридера после 30 мин реакции расщепления. 1E11 копии соответствующей ДНК-мишени присутствовали в 50 мкл реакции. Все показания были нормализованы к контролю без матрицы (NTC) в начале эксперимента. ГРНК N1 дала неожиданный результат, в результате чего она запускала побочную активность AsCas12a и его вариантов без матрицы.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [N-Mam, O1, O2, S2, S3], 4 [S1] или 6 [N1] биологических повторений). d Последовательности идеально согласованных (PM) или несовпадающих (MM) спейсеров, нацеленных на локус N-Mam. Каждая несовпадающая позиция обозначается жирной красной буквой. e Тепловая карта, показывающая толерантность различных ферментов Cas12a к несовпадающим гРНК N-Mam. Показания флуоресценции имеют шкалу от 0 до 1, где 1 — это максимальное полученное измерение, а 0 — фоновый сигнал для NTC в начале эксперимента. f Последовательности идеально согласованных (PM) или несовпадающих (MM) спейсеров, нацеленных на локус S2. Каждая несовпадающая позиция обозначается жирной красной буквой. г Тепловая карта, показывающая толерантность различных ферментов Cas12a к несовпадающим гРНК S2. Показания флуоресценции имеют шкалу от 0 до 1, где 1 — это максимальное полученное измерение, а 0 — фоновый сигнал для NTC в начале эксперимента. Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Затем мы проверили, как несовпадения на границе раздела гРНК-субстрат могут влиять на сигнал флуоресценции.Мы создали десять новых gRNAs, нацеленных на локус N-Mam, каждая из которых несла единственную точечную мутацию в различных местах вдоль спейсера (рис. 1d). Из анализа расщепления trans мы обнаружили, что LbCas12a очень чувствителен к несовершенному спариванию оснований между гРНК и целевым субстратом, поскольку любое несоответствие вдоль спейсера снижает выход флуоресценции до почти фоновых уровней, в то время как AsCas12a и его варианты были способны выдерживать некоторые несоответствия (рис. 1e и дополнительный рис.5). В частности, enAsCas12a оказался наиболее устойчивым к несоответствию единичных нуклеотидов среди пяти протестированных ферментов. Чтобы проверить результаты, мы создали десять дополнительных gRNAs, нацеленных на локус S2, каждая из которых несла точечную мутацию в разных положениях вдоль спейсера (рис. 1f). Интересно, что мы обнаружили, что отдельные несовпадения в локусе S2 влияют на коллатеральную активность всех эндонуклеаз Cas12a намного меньше, чем таковые в локусе N-Mam (Fig. 1g и Supplementary Fig. 6). Тем не менее, enAsCas12a снова продемонстрировал самую высокую толерантность к точечным мутациям, в то время как LbCas12a дикого типа снова оказался наиболее чувствительным к несовершенному спариванию оснований между гРНК и ее целевым субстратом.Мы далее подтвердили плохую толерантность LbCas12a к несоответствию, создав больше несовпадающих (MM) gRNAs, нацеленных на локус S3, и обнаружили, что побочная активность LbCas12a была значительно снижена для всех новых MM gRNAs (Supplementary Fig. 7).

Дальнейшая характеристика enAsCas12a с помощью гРНК S-гена

До сих пор мы выполнили обнаружение CRISPR-Cas при комнатной температуре (24 ° C), чтобы имитировать нелабораторные условия, но мы задавались вопросом, сможет ли наш диагностический анализ существенно работать. лучше при более оптимальной температуре реакции (37 ° C), а также если наши наблюдения о том, что enAsCas12a является более устойчивым ферментом, все еще сохраняются при более высокой температуре.Следовательно, мы повторили эксперименты по нацеливанию на S2 при 37 ° C. С помощью идеально подобранной (PM) гРНК мы наблюдали, что сигнал флуоресценции в нашем анализе расщепления trans увеличивался примерно в два раза быстрее при 37 ° C в присутствии предполагаемой матрицы SARS-CoV-2 для всех тестируемых ферментов и достигал гораздо более высокие уровни после 30 минут реакции, при этом демонстрируя небольшую перекрестную реактивность для SARS-CoV и MERS-CoV (рис. 2а и дополнительный рис. 8). Кроме того, профиль активности при наличии различных точечных мутаций оставался сходным, при этом enAsCas12a, как и прежде, демонстрировал лучшую устойчивость к несоответствию (рис.2b и дополнительный рис. 8). Следовательно, наши результаты показывают, что наш анализ на основе CRISPR следует проводить при 37 ° C, если требуется более быстрый результат, и что enAsCas12a является более подходящим ферментом для использования в диагностическом тесте, который устойчив к мутациям вирусного генома и внутриклеточному редактированию РНК. .

a Измерения флуоресценции для одной S2 гРНК в комплексе с различными нуклеазами Cas12a после 30 мин реакции расщепления trans при 37 ° C.По сравнению с более ранними результатами, полученными при 24 ° C, перекрестная реактивность для SARS-CoV или MERS-CoV все еще отсутствовала при более высокой температуре, но сигнал флуоресценции для SARS-CoV-2 был примерно в два раза выше. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). b Тепловая карта, показывающая толерантность различных ферментов Cas12a к несовпадениям в целевом сайте S2, когда анализ расщепления trans проводили при 37 ° C. Показания флуоресценции имеют шкалу от 0 до 1, где 1 — это максимальное полученное измерение, а 0 — фоновый сигнал для NTC в начале эксперимента. c Измерения флуоресценции enAsCas12a в комплексе с различными гРНК, нацеленными на S-ген SARS-CoV-2, после 30 мин реакции расщепления при 37 ° C. 1E11 копии ДНК присутствовали в 50 мкл реакции. Две из гРНК (S4 и S8) запускали побочную активность enAsCas12a без матрицы. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 [S9], 5 [S4, S5, S6, S7, S11, S14], 6 [S8, S10, S12, S13] или 7 [S15] биологических повторений). d Буферизация побочной активности enAsCas12a против SNV с помощью второй гРНК.Измерения флуоресценции здесь проводили через 30 мин реакции расщепления при 37 ° C. S6-гРНК использовали вместе с идеально согласованной (PM) или несовпадающей (MM10) S2-гРНК в отсутствие или в присутствии 0,1 М глицина. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [с глицином] или 4 [без глицина] биологических повторностей). (n.s. не значимо, P > 0,2; двусторонний тест Стьюдента t -тест). e Аналитический предел обнаружения (LoD) для enAsCas12a в комплексе как с гРНК S6, так и с идеально согласованной (PM) или несовпадающей (MM10) гРНК S2.Различные копии фрагментов РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут с использованием начального набора праймеров LAMP (0,2 мкМ каждого замещающего праймера, 1,6 мкМ каждого внутреннего праймера. и 0,8 мкМ каждого праймера петли). Затем проводили реакцию обнаружения Cas при 37 ° C, при этом измерения флуоресценции проводили через 10 мин. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 6 [2E6] или 7 [другие числа копий] биологических повторений). Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Хотя enAsCas12a проявляет более высокую толерантность к несовпадению, чем другие протестированные нуклеазы, на его активность все же могут заметно влиять несовпадения в определенных положениях вдоль интерфейса гРНК-мишень (например, MM10). Следовательно, чтобы еще больше повысить устойчивость анализа к вариантным нуклеотидам, мы попытались объединить две или более гРНК с этим ферментом. S2-гРНК хорошо работала с enAsCas12a, но сконструированная нуклеаза показала слабую активность расщепления trans как с S1, так и с S3-гРНК.Следовательно, мы провели скрининг дополнительных направляющих, нацеленных на область, окружающую локус S2, так что, когда мы объединили модуль обнаружения CRISPR с этапом изотермической амплификации, потребуется только один набор праймеров. На основе геномных последовательностей каждая из вновь созданных gRNA была в высшей степени уникальной для SARS-CoV-2 (дополнительный рисунок 9) и охватывала более 99,5% изолятов, аннотированных в GISAID, без несоответствий, вставок или делеций (инделек) (дополнительные данные) 2). По результатам флуоресцентного анализа расщепления trans , гРНК S6 оказалась наиболее многообещающим кандидатом, поскольку она проявляла наивысшую активность на мишени для SARS-CoV-2 с небольшой перекрестной реактивностью для SARS-CoV и MERS-CoV (рис.2c и дополнительный рис. 10).

Затем мы оценили, может ли вновь идентифицированная гРНК S6 устранить несоответствие в локусе S2. С этой целью мы собрали нуклеазу enAsCas12a как с гРНК S6, так и с идеально согласованной (PM) или несовпадающей (MM10) гРНК S2. Из анализа флуоресценции транс--расщепления с синтетической ДНК в качестве субстрата мы обнаружили, что не было значительной разницы в коллатеральной активности между гРНК S2 PM и гРНК S2 MM10, когда присутствовала гРНК S6 ( P > 0.2, двусторонний тест Стьюдента t ) (рис. 2d и дополнительный рис. 11). Кроме того, введение в реакцию глицина, который, как сообщалось, улучшает однореакторный тест STOPCovid ²² , также не оказывал значительного влияния на модуль обнаружения Cas.

Затем мы попытались объединить RT-LAMP с нашим модулем обнаружения двух гРНК CRISPR и сравнить чувствительность анализа в отсутствие или при наличии несоответствия в локусе S2. Мы протестировали три набора праймеров LAMP и обнаружили один набор, который хорошо амплифицировался даже при небольшом вводе (дополнительный рис.12). С этим выбранным набором праймеров мы провели RT-LAMP на вариабельных копиях синтетических матриц РНК SARS-CoV-2, транскрибированных in vitro (IVT), при 65 ° C в течение 15 минут перед использованием амплифицированных продуктов сразу в нашем trans — анализ расщепления. В целом, мы не обнаружили очевидной разницы в чувствительности между гРНК S2 PM и гРНК S2 MM10 при одновременном развертывании гРНК S6 (рис. 2e и дополнительный рис. 13). Взятые вместе, наши результаты демонстрируют, что использование двух гРНК может повысить надежность CRISPR-Dx в отношении присутствия вариантных нуклеотидов.

Буферизация реакции LAMP против вариантных нуклеотидов

Помимо модуля обнаружения Cas, мутации или редактирование вирусного генома также могут влиять на стадию изотермической амплификации. Следовательно, мы стремились определить, какие праймеры LAMP были более восприимчивыми к несовпадениям в их сайтах связывания. Оригинальный метод основан на двух внутренних праймерах, известных как FIP и BIP, и двух праймерах смещения, известных как F3 и B3, которые в совокупности нацелены на шесть различных областей в матрице ДНК (рис.3а). Мы предположили, что несовпадения на 3’-конце каждого праймера могут влиять на удлинение ДНК-полимеразой Bst. Поэтому мы протестировали реакцию RT-LAMP с праймерами с идеальным соответствием (PM) или праймерами с несовпадением (MM), расположенными на первом, втором или третьем нуклеотиде с 3’-конца (рис. 3b). Более того, поскольку несовершенное спаривание оснований может также влиять на удлинение свободного 3′-конца гантельной ДНК, генерируемой во время LAMP (рис. 3a), мы дополнительно протестировали реакцию с праймерами FIP или BIP, несущими несовпадение на своих 5′-концах (рис. .3б). За реакцией RT-LAMP следили в режиме реального времени с помощью флуоресцентного красителя. Наши эксперименты показали, что несовпадения двух смещающих праймеров не оказали заметного влияния на этап амплификации (рис. 3c). Напротив, несовпадения на 3 ’концах FIP и BIP, а также на 5’ конце FIP значительно снижали скорость амплификации ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t ).

a Схема ЛАМПЫ.Шесть различных областей в целевом локусе (F1, F2, F3, B1, B2 и B3) распознаются четырьмя коровыми праймерами, у которых есть черная стрелка на их 3 ’концах, что означает удлинение ДНК-полимеразой. FIP представлен темно-зеленым прямоугольником, соединенным с наклонным светло-голубым прямоугольником. BIP представлен темно-коричневым прямоугольником, соединенным со скошенным светло-фиолетовым прямоугольником. Кроме того, праймер замещения F3 представлен красным прямоугольником, а праймер замещения B3 представлен оранжевым прямоугольником.Буква «c», добавленная к имени каждого региона, указывает на обратную комплементарную последовательность. После процесса оптимизации LAMP мы включили роевые праймеры, последовательности которых эквивалентны F1c и B1c. Более того, чтобы продемонстрировать, как несовпадение на 5’-конце FIP может повлиять на реакцию LAMP, мы добавили желтую звездочку, чтобы отслеживать прогрессирование несовпадения. b Протестированы последовательности праймеров LAMP. Несоответствия обозначены жирными красными буквами. c Полосовая диаграмма, показывающая, как несоответствие между праймерами LAMP и их сайтами связывания влияет на скорость изотермической амплификации.RT-LAMP выполняли при 65 ° C в приборе реального времени с 20000 копий синтетической РНК, соответствующей S-гену SARS-CoV-2. Значения порога цикла (Ct) были получены прибором с использованием настроек по умолчанию. Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют среднее значение ( n = 3 [F3 MM, B3 MM] или 4 [PM, FIP (3 ‘) MM, BIP (3’) MM, FIP (5 ‘) ММ, BIP (5’) MM, NTC] биологические реплики). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Полосовая диаграмма, показывающая восстановление реакции LAMP с помощью усеченных праймеров и ДНК-полимеразы высокого качества Q5 в присутствии несовпадений на 3 ’концах FIP и BIP. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 4 [FIP PM + tPM + Q5, BIP PM + tPM + Q5], 5 [PM, PM + Q5, FIP MM + tPM + Q5, FIP PM + tPM, BIP MM + tPM + Q5, BIP PM + tPM] или 6 [FIP MM, FIP MM + Q5, FIP MM + tPM, BIP MM, BIP MM + Q5, BIP MM + tPM, NTC ] биологические реплики). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . e Полосная диаграмма, показывающая восстановление реакции LAMP с помощью усеченных праймеров и ДНК-полимеразы высокого качества Q5 в присутствии несовпадающего на 5 ’конце FIP. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 4 биологических повтора). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t .Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Затем мы стремились разработать или применить стратегии для повышения устойчивости реакции LAMP против потенциальных вариантных нуклеотидов. Мы рассудили, что, поскольку MM1 вызывает наибольшее снижение эффективности амплификации, использование праймера FIP или BIP, который был усечен прямо на конце, позволило бы вообще избежать наиболее опасного несоответствия (рис. 3b). Действительно, использование смеси исходных внутренних праймеров и усеченных праймеров (tPM-3 или tPM-5) привело к значительному улучшению скорости амплификации ( P <0.05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 3г, д). Кроме того, мы отметили, что ДНК-полимераза Bst не обладает экзонуклеазной активностью 3’-к-5 ’и, таким образом, столкнется с трудностями при удлинении любой ДНК с несовпадениями на 3’ конце. Одним из возможных решений было добавление в реакцию LAMP небольшого количества высокоточной ДНК-полимеразы, которая обладала способностью корректировать считывание и, таким образом, могла помочь удалить любые несовпадающие основания на 3’-конце ⁴⁹ . Действительно, мы обнаружили, что добавление 0,15U высокоточной полимеразы действительно привело к значительному увеличению скорости реакции, несмотря на наличие концевых несовпадений в FIP или BIP ( P <0.05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 3г, д). Примечательно, что в случае несовпадений на 3 ’концах внутренних праймеров наблюдалось еще большее улучшение эффективности амплификации, когда две стратегии усеченных праймеров и высокоточной ДНК-полимеразы использовались вместе (фиг. 3d). В совокупности наши результаты показывают, что мы можем повысить устойчивость реакции LAMP против вариантных нуклеотидов с помощью двух наборов внутренних праймеров (полноразмерных и tPM-3) и высокоточной полимеразы.

Стратегии повышения чувствительности LAMP

Важным показателем, используемым для оценки эффективности диагностического анализа, является его чувствительность. Хотя наш анализ содержал функции для обработки SNV в вирусном геноме, мы отметили, что по мере уменьшения числа копий с 2E6 до 2, чувствительность теста также монотонно снижалась (рис. 2e и дополнительный рис. 13). Следовательно, мы стремились повысить чувствительность нашего анализа.

Во-первых, мы проверили, как вариации концентраций праймеров могут влиять на реакцию LAMP.Мы сосредоточились на праймерах смещения (F3 и B3) и внутренних праймерах (FIP и BIP), которые были частью исходной установки LAMP. В качестве входных данных использовали 20 копий матрицы РНК, и реакцию отслеживали в приборе в реальном времени с флуоресцентным красителем (рис. 4а). В целом мы заметили, что удвоение концентрации F3, FIP или BIP ухудшило производительность нашего CRISPR-Dx. Напротив, когда мы увеличили количество B3 в два раза, чувствительность анализа незначительно улучшилась: 75% (9 из 12) повторов показали успешную амплификацию.Это могло быть связано с тем, что праймер B3, предоставленный программным обеспечением для проектирования PrimerExplorer (https://primerexplorer.jp/e/), был неоптимальным.

Полосная диаграмма , показывающая, как на чувствительность к LAMP влияет концентрация используемых праймеров. Мы протестировали различные концентрации вытесняющих праймеров и внутренних праймеров. RT-LAMP выполняли при 65 ° C в приборе реального времени с 20 копиями матрицы РНК, соответствующей S-гену SARS-CoV-2.Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение (n = 7 [1X, 2X F3, 2X FIP, 2X BIP], 10 [1X без tPM], 12 [2X B3] или 15 [NTC] биологические реплики). b Полосовая диаграмма, показывающая, как чувствительность LAMP изменялась 0,1 М глицином. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20 копиями матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 3 [NTC] или 6 [с шаблоном] биологических повторов). Значение P было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . c Полосовая диаграмма, показывающая, как чувствительность LAMP была изменена при использовании праймеров роя или стебля. Зеленая рамка разделяет четыре основных праймера, которые были включены в каждый эксперимент. Концентрации каждого вытесняющего праймера, внутреннего праймера, праймера петли, праймера роя и праймера стебля составляли 0,2, 1,6, 0,8, 1,6 и 1,6 мкМ соответственно. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 5 [рой, стержень _в , петля + стержень _в , NTC для цикла + рой] или 7 [цикл, цикл + рой , NTC для петли] биологических реплик).Значение P- было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Дальнейшее рассечение праймеров стебля. На полосовой диаграмме показано влияние различных праймеров для стебля на чувствительность к LAMP. Здесь каждая реакция содержала праймеры замещения (0,2 мкМ каждый), внутренние праймеры (1,6 мкМ каждый) и праймеры петли (0,8 мкМ каждый). Кроме того, он также может содержать либо два дополнительных праймера для роя, либо один или два дополнительных праймера для стебля (с концентрацией каждого дополнительного праймера, равной 1.6 мкМ). RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 3 [NTC] или 4 [с шаблоном] биологических повторов). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . e Аналитическая LoD для enAsCas12a в комплексе как с гРНК S6, так и с гРНК PM или MM10 S2. RT-LAMP выполняли при 65 ° C в течение 15 минут в оптимизированных условиях, которые включали удвоение концентрации B3 до 0.4 мкМ, используя как полноразмерные, так и усеченные 1nt внутренние праймеры (1,6 мкМ каждый), включая праймеры роя (1,6 мкМ каждый), и добавляя 0,15 ЕД полимеразы Q5 и 0,1 М глицина в каждую реакцию. Показаны показания флуоресценции с использованием микропланшетного ридера после 10 мин реакции расщепления при 37 ° C. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 5 [2E6] или 6 [другие числа копий] биологических копий). f Аналитическая LoD для enAsCas12a, когда в вирусной матрице присутствовала мутация S254F.Нуклеаза была собрана либо с гРНК S2 отдельно, либо с гРНК S2 и S6. Эти гРНК были разработаны таким образом, чтобы полностью соответствовать эталонному геному SARS-CoV-2. RT-LAMP выполняли при 65 ° C в течение 15 минут в оптимизированных условиях. Показаны показания флуоресценции через 10 мин реакции расщепления при 37 ° C. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 5 биологических повторов). г Эксперименты, аналогичные f , за исключением того, что использовали другой репортер и в каждую пробирку с образцом добавляли индикаторную полоску после 10 минут реакции расщепления.Полосы на щупах появились через 2 мин. Красная стрелка указывает на тестовые полосы, а зеленая стрелка указывает на контрольные полосы. Отношение интенсивности тестовой полосы к интенсивности контрольной полосы указано под каждым щупом. Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Ферментная инженерия может улучшить производительность LAMP. Следовательно, во-вторых, мы сравнили несколько различных коммерчески доступных полимераз Bst, а именно Bst2.0, Bst3.0 (мутантная полимераза с внутренней активностью обратной транскриптазы) и Turbo Bst (полимераза, слитая с дополнительным ДНК-связывающим доменом), используя наша установка RT-LAMP (дополнительный рис.14). В то время как один только Bst3.0 работал хуже, чем исходный мастер-микс Bst2.0, который мы использовали, Bst3.0 с добавлением отдельной обратной транскриптазы значительно улучшал кинетику реакции ( P <0,01, односторонний показатель Стьюдента t -контрольная работа). Однако мы заметили, что комбинация Bst3.0 и дополнительной обратной транскриптазы очень склонна к ложной амплификации, давая сигнал флуоресценции даже в отсутствие матрицы. Более того, мы обнаружили, что хотя Turbo Bst также незначительно улучшал кинетику реакции, он также был значительно более подвержен ложной амплификации, чем Bst2.0 ( P <0,01, односторонний тест Стьюдента t -тест). Поэтому мы сохранили использование мастермикса Bst2.0 для последующих экспериментов.

В-третьих, мы спросили, может ли использование химических добавок повысить чувствительность LAMP. Недавнее исследование показало, что глицин и таурин могут улучшить кинетику одноразового теста STOPCovid ²² . Однако неясно, происходит ли улучшение в реакции RT-LAMP или в модуле обнаружения Cas. Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели реакцию RT-LAMP только с одним из двух химикатов или без них.В целом, наши данные показали, что добавление глицина увеличивало чувствительность RT-LAMP, причем более 90% (11 из 12) повторов показали успешную амплификацию 20 копий вирусной матрицы (рис. 4b). Добавление таурина также улучшало чувствительность анализа аналогично глицину, хотя использование обоих химических веществ вместе не имело синергетического эффекта (дополнительный рисунок 15). Помимо глицина и таурина, в другом исследовании сообщалось, что диметилсульфоксид (ДМСО) увеличивает чувствительность и специфичность реакций LAMP ⁵⁰ .Сероорганическое соединение также часто используется в ПЦР для разрушения вторичных структур GC-богатых матриц. Однако мы обнаружили, что как 2,5%, так и 5% ДМСО вместо этого оказывали ингибирующее действие на LAMP (дополнительный рисунок 16). Двигаясь вперед, мы включили глицин в наш анализ, поскольку он обычно обнаруживается в лабораториях.

В-четвертых, мы задались вопросом, обеспечат ли альтернативные схемы реакции LAMP более высокую чувствительность. Хотя самый ранний метод LAMP основывался на четырех ядерных праймерах ⁸ , в последующих исследованиях были описаны улучшения этого метода за счет добавления новых наборов праймеров.Наиболее часто добавляемый набор праймеров представляет собой «петлевые праймеры» (LF и LB), которые нацелены на области одноцепочечных петель в гантелевых структурах, образующихся во время реакции ⁵¹ . Петлевые праймеры поставляются с четырехъядерными праймерами с помощью программного обеспечения для проектирования PrimerExplorer. Кроме того, два других набора праймеров, которые могут быть добавлены, включают «стеблевые праймеры», которые нацелены на одноцепочечную область между F1 / F2 / F3 и B1 / B2 / B3 (рис. 3a) ⁵² , и «роевые праймеры» ”, Которые отжигаются с цепью матрицы, противоположной цепи FIP или BIP, чтобы обнажить сайты связывания для внутренних праймеров ⁵³ .Поэтому мы протестировали новые стволовые праймеры и праймеры для роев в сочетании с нашим предыдущим набором праймеров LAMP, нацеленных на S-ген SARS-CoV-2. Данные из нашей первоначальной серии экспериментов показали, что, хотя добавление стеблевых праймеров (Stem _в ) было вредным для реакции RT-LAMP, возможно, из-за короткой области, доступной между F1 / F2 / F3 и B1 / B2 / B3, добавление Роевые праймеры значительно улучшили кинетику реакции ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t -тест) (рис.4в). Примечательно, что это улучшение наблюдалось только тогда, когда праймеры «роя» использовали с праймерами ядра и праймерами петли. Когда праймеры петли были опущены, амплификация произошла намного позже, чем наша первоначальная установка RT-LAMP, что указывает на то, что праймеры роя не могут заменить праймеры петли. Затем мы изучили конструкцию наших стержневых праймеров (Stem _в ) и заметили, что они указывают друг на друга своими 3’-концами, конкурирующими за связывание с матрицей. Таким образом, мы протестировали каждый из праймеров индивидуально, а также оценили другую пару стеблевых праймеров (стержень _из ), которые указывали друг от друга.Наши результаты показали, что один только праймер Stem _{в праймере} , а также праймеры Stem _из были способны улучшить кинетику реакции LAMP в различной степени (фиг. 4d). Более того, добавление одного или двух стержневых праймеров к смеси праймеров core, loop и swarm не улучшило кинетику LAMP (дополнительный рис. 17). Поэтому, двигаясь вперед, мы не стали продолжать изучение стеблевых праймеров и сосредоточились в основном на праймерах петель и роя. Наш последний набор праймеров LAMP высокоспецифичен для SARS-CoV-2, как показано выравниванием последовательностей нескольких коронавирусных геномов (дополнительный рис.18).

Мы оценили, могут ли оптимизированные условия LAMP вместе с нашим модулем обнаружения CRISPR с двумя гРНК (S2 и S6) улучшить чувствительность анализа и приспособиться к точечным мутациям. В отличие от исходных условий LAMP без каких-либо праймеров или глицина (рис. 2e и дополнительный рис. 13), мы обнаружили, что сигнал флуоресценции не падал так сильно с уменьшением количества матрицы РНК, когда мы использовали оптимизированные условия (рис. 4e и Дополнительный рис. 19а). Аналитический предел обнаружения (LoD) составлял 20 копий на реакцию с нашими оптимизированными условиями, независимо от отсутствия или присутствия несоответствия в локусе S2.Эта чувствительность была дополнительно подтверждена анализом бокового потока (дополнительный рисунок 19b), который представляет собой удобную бумажную платформу для считывания результатов (дополнительный рисунок 20).

Вместо того, чтобы искусственно создавать несовпадения в gRNA, мы стремились оценить надежность нашего анализа с реальной мутацией в матрице-мишени с использованием PM gRNAs. С этой целью мы выбрали известную мутацию S254F в S-гене ^54,55,56,57 , которая потенциально может мешать связыванию гРНК S2.При нацеливании мутантной вирусной РНК с enAsCas12a в комплексе только с гРНК S2 мы наблюдали низкие уровни флуоресценции, которые близки к фону для количества копий матрицы до 2E6 (фиг. 4f и дополнительный фиг. 21). Напротив, нацеливание на мутантную матрицу S254F как с гРНК S2, так и с S6 давало гораздо более высокие сигналы флуоресценции. Мы дополнительно подтвердили эти результаты с помощью анализа бокового потока, в котором положительный результат теста был четко получен с двумя гРНК, даже когда присутствовали только 20 копий мутантной матрицы (рис.4г). В совокупности данные показывают, что наш анализ устойчив к вариантным нуклеотидам в вирусной мишени и может обнаруживать низкие копии SARS-CoV-2.

Обнаружение вирусной РНК в образцах общей РНК человека

Оценив эффективность нашего теста VaNGuard с чистыми синтетическими РНК, мы затем попытались оценить наш анализ в более реалистичных ситуациях. В частности, мы задавались вопросом, может ли РНК SARS-CoV-2 все еще обнаруживаться в большом пуле человеческой РНК. Во-первых, мы добавили 20000 копий вирусной РНК, транскрибированной in vitro, в 10 нг общей РНК, экстрагированной из различных линий клеток человека, а затем провели RT-LAMP в оптимизированных условиях с последующим анализом расщепления флуоресценции trans как с S2, так и с помощью S6 гРНК (рис.5а и дополнительный рис. 22). Наши данные показали, что присутствие сложного пула РНК человека не оказало значительного влияния на сигнал флуоресценции анализа ( P > 0,2, односторонний тест Стьюдента t -тест). Мы также проверили, может ли присутствие человеческой РНК и геномной ДНК вместе помешать обнаружению вируса, но не наблюдали заметной потери сигнала флуоресценции.

a 20000 копий синтетических фрагментов РНК SARS-CoV-2 были добавлены к 10 нг общей РНК, экстрагированной из различных иммортализованных линий клеток человека, для имитации инфекции в различных типах клеток [HEK293T: предшественник надпочечников, A549: легкие, PC9: легкое, HCC2279: легкое, HL60: кровь (промиелоциты), THP-1: кровь (моноциты), U937: кровь (моноциты), K562: кровь (гранулоциты / эритроциты) и Jurkat: кровь (Т-клетки)]. Чистые синтетические вирусные РНК использовали в качестве контроля. Контрольные образцы или образцы РНК с добавками служили входными данными для RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 15 минут.Затем проводили реакцию обнаружения Cas при 37 ° C, через 30 мин проявлялась флуоресценция. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [все, кроме контроля и РНК HEK293T], 6 [контроль] или 7 [РНК HEK293T] биологических повторностей). Не было значительной потери сигнала в присутствии РНК человека (н.у .: не значимо, P > 0,2; односторонний тест Стьюдента t -тест). b Аналитическая LoD для матрицы двойной мутантной РНК S254F N234N либо сама по себе, либо в смеси с 10 нг общей РНК человека из клеток HCC2279.Различные копии синтетической вирусной матрицы (с РНК человека или без нее) использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 15 мин. Затем проводили реакцию обнаружения Cas при 37 ° C, через 10 мин проявлялась флуоресценция. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. (n = 4 биологических повтора). c Аналитическая LoD для очищенной синтетической РНК-матрицы SARS-CoV-2 дикого типа в присутствии 2 или 4 мкл UTM. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). d Аналитическая LoD для матрицы двойной мутантной РНК дикого типа (WT) или S254F N234N, смешанной с 10 нг общей РНК человека из клеток HCC2279 в присутствии 2 мкл UTM.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Во-вторых, мы спросили, повлияет ли присутствие сложного пула человеческой РНК на чувствительность нашего анализа на COVID-19, если вирусная последовательность была изменена или изменена. С этой целью мы создали синтетический вирусный шаблон, содержащий не только мутацию S254F, но и вторую молчащую мутацию N234N, которая была обнаружена по крайней мере в десяти секвенированных изолятах SARS-CoV-2 со всего мира (дополнительные данные 2).В то время как первая мутация может влиять на распознавание мишени с помощью гРНК S2, вторая мутация может влиять на связывание мишени с помощью гРНК S6. Мы исследовали чувствительность нашего анализа, используя эту двойную мутантную вирусную матрицу либо отдельно, либо в пуле общей человеческой РНК из линии клеток легких HCC2279. Обнадеживает то, что мы обнаружили, что LoD оставался на уровне 20 копий на реакцию в обоих случаях (рис. 5b и дополнительный рис. 23), что подчеркивает надежность нашего теста VaNGuard против известных мутаций в вирусной РНК даже в присутствии полной человеческой РНК.

В-третьих, поскольку использование образцов пациентов напрямую без дополнительного этапа выделения РНК уменьшит время и стоимость диагностического теста, мы исследовали, могут ли различные среды для сбора образцов влиять на производительность нашего анализа (дополнительный рис. 24). Поразительно, но всего 1 мкл имеющегося в продаже реагента SAFER Sample было достаточно, чтобы полностью заблокировать реакцию RT-LAMP. Напротив, до 4 мкл универсальной транспортной среды (UTM) можно было переносить с незначительным снижением кинетики RT-LAMP.Реакция изотермической амплификации также может вместить до 4 мкл QuickExtract, хотя и в меньшей степени, чем UTM. Тем не менее, когда мы изучали влияние UTM на весь рабочий процесс RT-LAMP-CRISPR, мы заметили, что 4 мкл UTM явно снижают чувствительность нашего теста VaNGuard по сравнению с всего 2 мкл этой широко используемой среды сбора (рис. 5c и Дополнительный рис.25). Следовательно, мы заключаем, что до 2 мкл (или менее 10% объема) UTM может быть добавлено в наш анализ без каких-либо неблагоприятных последствий для его работы.Впоследствии мы исследовали чувствительность анализа с использованием вирусной матрицы дикого типа или двойного мутанта, смешанной с общей РНК из клеток HCC2279 в 2 мкл UTM, и обнаружили, что наличие двух мутаций в сайтах связывания гРНК все еще не ухудшало LoD нашего анализ (рис. 5d и дополнительный рис. 26). В целом, наши результаты показывают, что образцы пациентов в небольшом количестве UTM могут использоваться непосредственно в нашем тесте VaNGuard, не влияя на его устойчивость к SNV в шаблоне.

Условия реакции, влияющие на коллатеральную активность enAsCas12a

В наших предыдущих анализах бокового кровотока, хотя положительные результаты тестов были получены для образцов, содержащих не менее 20 копий синтетической РНК SARS-CoV-2, мы заметили, что тестовые полосы были относительно слабыми по сравнению с контрольные полосы (рис.4g и дополнительный рис. 19b). Мы предположили, что мы могли бы использовать неоптимальный буфер (буфер 3.1) для анализа, опосредованного enAsCas12a. Следовательно, мы протестировали альтернативный реакционный буфер (буфер 2.1) вместе с различной продолжительностью теста и более высокими концентрациями Cas12a RNP (рис. 6a). В целом, мы наблюдали, что реакции в исходном буфере показали более медленную кинетику, чем реакции в альтернативном буфере. Например, интенсивность тестовой полосы после 20 минут в буфере 3.1 была достигнута примерно за 10 минут в буфере 2.1. Более того, увеличение концентрации Cas12a RNP по крайней мере на 50% также усиливало тестовый сигнал. Поэтому мы повторно оценили чувствительность нашего теста VaNGuard с использованием буфера 2.1 и матриц РНК SARS-CoV-2, транскрибированных in vitro (рис. 6b). Более сильные тестовые полосы наблюдались от 2 до 2E6 копий вирусных матриц дикого типа и мутантного S254F с реакцией обнаружения Cas, выполняемой всего за 10 мин.

a Оценка различных экспериментальных условий, включая разные концентрации enAsCas12a и разную продолжительность реакции расщепления.1X указывает 65 нМ. 2E6 копии синтетической РНК SARS-CoV-2 дикого типа служили входными данными для RT-LAMP. b Обнаружение последовательности SARS-CoV-2 дикого типа или мутантного S254F с использованием гРНК S2 и S6. Различные копии фрагментов РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 15 мин. Затем реакцию обнаружения Cas проводили при 37 ° C в течение 10 мин в буфере 2.1 с DTT перед добавлением щупа в каждую реакционную пробирку. c Систематическое тестирование различных реакционных буферов и температур для стадии обнаружения Cas.Здесь enAsCas12a в комплексе только с гРНК S2 использовали в анализе 50 мкл trans -расщепления с 2E11 копиями матрицы ДНК, соответствующей S-гену SARS-CoV-2. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [41 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C только Tango, 60 ° C без DTT и NTC], 4 [37 ° C, 55 ° C все, кроме только Tango], или 6 [60 ° C с DTT] биологические повторы). d Предварительная оценка нашего теста VaNGuard с оставшимися образцами пациентов. Значение Ct 30 было оценено как эквивалент 500 копий вируса.RT-LAMP выполняли при 65 ° C в течение 15 минут, затем реакцию обнаружения Cas проводили при 37 ° C в течение 10 минут в CutSmart с DTT. Каждый клинический образец тестировался дважды с помощью тест-полосок. e Повторное тестирование пилотного набора клинических образцов РНК с использованием считывания флуоресценции. RT-LAMP проводили при 65 ° C в течение 15 мин. Впоследствии 4 мкл продуктов LAMP (из 25 мкл) использовали для анализа расщепления trans , который проводили при 37 ° C в приборе реального времени, где измерения проводились каждую минуту.Показания флуоресценции для всех шести клинически отрицательных образцов оставались низкими на протяжении всего эксперимента. Кроме того, показания флуоресценции для пяти из шести клинически положительных образцов показали явное экспоненциальное увеличение со временем. Оставшийся положительный образец (RP6), который содержал 14 копий вируса, давал сигналы флуоресценции, которые были лишь немного выше сигналов отрицательных образцов. Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Ободренные этими результатами, мы систематически исследовали условия реакции, при которых очищенный белок enAsCas12a был активен in vitro.В частности, мы протестировали четыре различных буфера с дитиотреитолом (DTT) или без него в диапазоне температур с использованием гРНК S2 с enAsCas12a (рис. 6c и дополнительный рис. 27). Неожиданно мы обнаружили, что enAsCas12a был активен в нашем анализе расщепления транс при всех испытанных температурах. В целом сконструированный фермент показал лучшие результаты в буферах, содержащих ацетатные соли (CutSmart и Tango), чем в буферах, содержащих хлоридные соли (Buffer 2.1 и Buffer 3.1). При 37 ° C CutSmart с DTT оказался лучшим буфером для использования с enAsCas12a, а при 60 ° C Tango оказался наиболее подходящим.Добавление DTT помогло в определенных условиях реакции, например CutSmart при 37 ° C (дополнительный рисунок 28). Мы также подтвердили, что DTT требуется в буфере CutSmart для enAsCas12a для оптимального функционирования при 37 ° C с использованием гРНК S6 (дополнительный рисунок 29).

Впоследствии мы применили наш диагностический анализ к экспериментальному набору оставшихся образцов РНК, взятых из мазков из носоглотки (NP) пациента, которые ранее были проанализированы с помощью qRT-PCR в больнице (рис. 6d). Мы выбрали образцы, которые демонстрировали диапазон значений Ct, и выполнили этап обнаружения Cas при 37 ° C в буфере CutSmart с DTT.Все шесть образцов, которые были отрицательными при анализе qRT-PCR, также оказались отрицательными при анализе бокового потока, что свидетельствует о 100% специфичности нашего теста VaNGuard. Кроме того, пять из шести инфицированных образцов дали очевидные положительные результаты на индикаторных полосках, а оставшийся образец дал тестовую полосу, нормализованная интенсивность которой была лишь немного выше фоновой. Мы подтвердили результаты, повторив тест на том же наборе образцов пациентов, используя вместо этого считывание флуоресценции на приборе в реальном времени (рис.6д). Следовательно, наш анализ, по-видимому, смог обнаружить SARS-CoV-2 в клинических образцах РНК, содержащих не менее 93 копий вируса, что соответствовало пороговому значению цикла (Ct) 32,42 для используемого набора qRT-PCR.

Разработка руководств для повышения чувствительности обнаружения Cas12a

Из экспериментальной оценки клинических образцов мы заметили, что, хотя наш анализ дал положительный результат теста для инфицированного образца со значением Ct 32,42, интенсивностью тестовой полосы и сигнал флуоресценции был слабее, чем у образцов с более высокой вирусной нагрузкой (рис.6г, д). Поэтому мы спросили, можно ли повысить чувствительность модуля обнаружения Cas. С этой целью мы стремились определить, будут ли модифицированные гРНК повышать активность бесклеточного расщепления наших очищенных РНП Cas12a in vitro, поскольку в предыдущих исследованиях сообщалось, что такие гРНК могут увеличивать активность расщепления цис — и транс Нуклеазы Cas9 и Cas12a ^{32,58,59,60,61,62,63,64} . Во-первых, мы проверили, могут ли удлинения гРНК на ее 3’-конце увеличивать активность наших ферментов Cas12a.Мы пробовали расширения U ₃ , U ₈ и U ₄ AU ₆ , но в отличие от предыдущей работы ^32,62 , мы не наблюдали заметного или последовательного улучшения активности (дополнительный рисунок 30) .

Во-вторых, мы спросили, будут ли расширения гРНК на ее 5 ’конце увеличивать побочную активность enAsCas12a. Сообщалось, что такие расширения увеличивают эффективность редактирования генов Cas12a в клетках и in vivo ⁶³ . Мы удлинили 5 ’конец гРНК S2 на 4nt или 9nt (рис.7а). В то время как удлинение на 4 нуклеотида не привело к значительному улучшению сигнала флуоресценции в анализе расщепления trans , удлинение на 9 нуклеотидов действительно увеличило активность enAsCas12a при 37 ° C значительно ( P <0,001, односторонняя оценка Стьюдента ). t -test) (Рис. 7b и Дополнительный Рис. 31).

a Последовательности исходной гРНК, нацеленной на S2, и модифицированных гидов, оцениваемых в нашей работе.5-дюймовые удлинители обозначены зеленым цветом. 2’-O-метилрибонуклеотиды (2’OMe РНК) обозначены строчной буквой m перед соответствующим нуклеотидом. 2’-дезокси-2’-фтор-рибонуклеотиды (2’F РНК) показаны фиолетовым цветом. Нуклеотиды ДНК обозначены красным цветом. Фосфоротиоатные (ФС) связи отмечены звездочками. b Сравнение 5’-удлиненных гРНК с исходной гРНК, нацеленной на S2, при 37 ° C для enAsCas12a. Измерения флуоресценции здесь проводили с использованием считывающего устройства для микропланшетов после 5 мин реакции расщепления с 2E11 копиями синтетической ДНК.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 6 [S2 5’ext (+9)] или 11 [S2, S2 5’ext (+4)] биологических повторений). Значение P- было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . c Сравнение химически модифицированной gRNA с исходной S2-нацеленной gRNA при 37 ° C для enAsCas12a. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [S2 SARS, S2 MERS], 6 [S2 chem mod SARS, S2 chem mod MERS] или 8 биологических повторений [COVID-19, NTC]). Значение P было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Сравнение гибридных гидов ДНК-РНК с исходной гРНК, нацеленной на S2, при 37 ° C для различных ферментов Cas12a. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t-. e Последовательности исходной гРНК, нацеленной на S6, и модифицированных гидов, оцениваемых в нашей работе. 5-дюймовые удлинители обозначены зеленым цветом. Нуклеотиды ДНК обозначены красным цветом. f Сравнение 5’-удлиненных гРНК и руководства по гибридным ДНК-РНК с исходной S6-нацеленной гРНК при 37 ° C для enAsCas12a.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [S6 4DNA] или 4 [S6, S6 5’ext (+4), S6 5’ext (+9)] биологических повторений). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . г , ч Сравнение 5’-удлиненных гРНК и гибридных гидов ДНК-РНК с соответствующими немодифицированными гРНК при 60 ° C для enAsCas12a. Направляющие S2-targeting и S6-targeting тестировались отдельно. Измерения флуоресценции здесь проводили после г, 5 мин и ч 30 минут реакции расщепления с 2E11 копиями синтетической ДНК.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . i Оценка нашего модуля CRISPR с двумя гРНК с использованием неизмененных и модифицированных руководств. Измерения флуоресценции проводились каждые 5 минут с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Опосредованную enAsCas12a реакцию расщепления проводили при 60 ° C с 2E11 копиями синтетической ДНК. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [S2 + S6 отрицательные контроли, S2 4DNA + S6 5’ext (+9)] или 5 [S2 + S6 COVID-19, S2 4DNA + S6 4DNA] биологических повторений).Исходные данные доступны в файле исходных данных.

В-третьих, мы спросили, будут ли гРНК, несущие дополнительные химические модификации, обеспечивать более высокую побочную активность с enAsCas12a, чем обычные гРНК. В частности, мы исследовали руководство, нацеленное на локус S2, которое содержало основания 2’-O-метил РНК, основания 2’-фтор и фосфоротиоатные связи в различных положениях (рис. 7a). Дизайн был основан на предыдущей работе, которая показала, что такое руководство дает более высокую эффективность редактирования Cas12a, чем обычная гРНК в человеческих клетках ⁶⁴ .Мы обнаружили, что дополнительные химические модификации действительно повышали скорость реакции обнаружения Cas при 37 ° C ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 7c и дополнительный рис. 32).

В-четвертых, мы оценили, будут ли гибридные гиды ДНК-РНК давать более высокие побочные активности с AsCas12a и его сконструированными вариантами, чем обычные гиды, содержащие только основания РНК. С этой целью мы создали направляющие для S2-нацеливания, которые содержали две или четыре замены оснований ДНК (рис.7а). Мы начали с изменений на 3 ’конце направляющей, потому что эта область направляющей, образованная комплексом с ее мишенью, оказалась неупорядоченной в ранее решенной кристаллической структуре и, таким образом, могла быть гибкой ⁶⁵ . Кроме того, мы попробовали замены в положениях 1 и 8 в спейсере, поскольку ранее было показано, что эти положения допускают несовпадения ⁶⁶ . При 37 ° C оба наших гибридных гида (с двумя или четырьмя основаниями ДНК) смогли значительно увеличить коллатеральную активность AsCas12a и его сконструированных вариантов по сравнению с исходной гРНК без оснований ДНК ( P <0.05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 7d и дополнительный рис. 33).

Мы стремились проверить влияние модификаций справочника с использованием другого целевого сайта, локуса S6. С этой целью мы создали три новых направляющих для S6 — одну гРНК с 5 ’удлинением на 4 нуклеотида, одну гРНК с 5’ удлинением на 9 нуклеотидов и одну гибридную направляющую с четырьмя заменами оснований ДНК (рис. 7e). Мы решили не заниматься химически модифицированной гРНК, потому что она была намного дороже, чем гибридная ДНК-РНК-гид, но не работала лучше.В целом, мы обнаружили, что результаты анализа транс--расщепления, проведенного при 37 ° C для локуса S6, отражают результаты для локуса S2 (рис. 7f и дополнительный рис. 34). Удлинение гРНК на 9nt на 5 ’конце или замена четырех оснований РНК основаниями ДНК значительно увеличивали побочную активность enAsCas12a ( P <0,01, односторонний тест Стьюдента t ).

Поскольку enAsCas12a оказался активным в широком диапазоне температур, мы затем попытались оценить модифицированные направляющие при 60 ° C.Для набора направляющих, нацеленных на S2, мы наблюдали, что обе гРНК с 5 ’удлинениями, а также оба гибридных ДНК-РНК-проводника демонстрируют более быструю кинетику реакции с enAsCas12a, чем исходная немодифицированная гРНК; через 5 минут они генерировали значительно более высокие сигналы флуоресценции в анализе расщепления trans ( P <0,001, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 7g и дополнительный рис. 35). Неожиданно, однако, две гРНК с 5 ’удлинениями вызвали побочную активность enAsCas12a даже в отсутствие матрицы, о чем свидетельствует очевидное увеличение фонового сигнала к 30 минутам времени реакции (рис.7h и дополнительный рис. 35). Аналогичные результаты были получены с тремя разными реакционными буферами. Двигаясь вперед, мы исключили эти две гРНК из дальнейшего рассмотрения. Для набора направляющих S6-targeting результаты, полученные при 60 ° C, совпадают с результатами, полученными при 37 ° C (рис. 7g, h и дополнительный рис. 36). Как гРНК с 9-нуклеотидным 5 ‘удлинением, так и гибридная направляющая значительно увеличивали скорость реакции ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t ), и не было неожиданного запуска коллатеральной активности enAsCas12 в отсутствие шаблона.

Впоследствии мы спросили, как одновременное развертывание двух модифицированных направляющих вместе с enAsCas12a может улучшить модуль обнаружения CRISPR. Мы сравнили исходный набор немодифицированных гРНК S2 и S6 с гибридной направляющей S2, содержащей четыре основания ДНК, объединенной либо с гРНК S6, удлиненной на 9nt на ее 5 ’конце, либо с гибридной направляющей S6, содержащей четыре основания ДНК (рис. 7i). В присутствии предполагаемого шаблона SARS-CoV-2 каждый набор модифицированных направляющих демонстрировал более быструю кинетику реакции, чем исходный набор немодифицированных гРНК, с насыщением сигнала флуоресценции в течение 5 мин.Кроме того, мы наблюдали, что модифицированные руководства полностью подавляли любую побочную активность enAsCas12a в отсутствие шаблона или в присутствии тесно связанных шаблонов SARS-CoV и MERS-CoV. В совокупности наши результаты демонстрируют, что использование модифицированных направляющих может увеличить скорость реакции обнаружения Cas и эффективно сдерживать любую нецелевую активность.

Оценка реакции квази-одного горшочка с клиническими образцами РНК

Мы задались вопросом, как мы можем улучшить полный рабочий процесс RT-LAMP-CRISPR.До сих пор мы переносили только 4 мкл продуктов LAMP в 46 мкл реакционной смеси CRISPR, чтобы минимизировать изменение буфера на этапе обнаружения Cas. Однако сама реакция LAMP имела общий объем 25 мкл, который не использовался полностью. Следовательно, мы проверили, выдерживает ли реакция CRISPR большее количество неочищенных продуктов LAMP, сохраняя при этом ее конечный объем постоянным на уровне 50 мкл (дополнительный рисунок 37). Мы обнаружили, что кинетика реакции CRISPR постепенно замедлялась с увеличением количества продуктов LAMP в ней.Сигнал флуоресценции для установки, содержащей всю 25 мкл смеси LAMP в реакции CRISPR (т.е. продукты LAMP были разбавлены 1: 1), был значительно ниже, чем сигнал для исходного рабочего процесса как при 37 ° C, так и при 60 ° C ( P <0,05, односторонний критерий Стьюдента t ). Это наводило на мысль, что какой-то неизвестный фактор в смеси LAMP может частично ингибировать фермент enAsCas12a и должен быть разбавлен. Затем мы протестировали альтернативную установку, в которой вместо переноса продуктов LAMP в реакцию CRISPR мы добавляли 50 мкл реакционной смеси CRISPR в реакционную пробирку LAMP (т.е. продукты LAMP разбавляли 1: 2). Это не только позволило нам использовать все продукты LAMP, но и помогло свести к минимуму человеческий фактор и перекрестное загрязнение, поскольку из реакционной пробирки LAMP ничего не извлекалось. Обнадеживает то, что мы обнаружили, что альтернативная установка демонстрирует кинетику реакции, аналогичную исходному рабочему процессу, и дает еще более высокий сигнал флуоресценции при насыщении.

Впоследствии мы попытались сравнить LoD исходного рабочего процесса и альтернативной установки с использованием синтетической РНК SARS-CoV-2 (рис.8а, б и дополнительный рис. 38). RT-LAMP проводили при 65 ° C, а реакцию обнаружения Cas проводили при 60 ° C. Хотя только один из трех повторов показал успешную амплификацию двух копий вирусного шаблона в исходном рабочем процессе, все реплики были успешными при альтернативной настройке. Мы повторили эксперименты с разными буферами для реакции CRISPR и получили аналогичные результаты. Кроме того, мы подтвердили, что небольшое количество UTM может быть допустимым, даже если все продукты LAMP использовались на этапе обнаружения Cas ниже по потоку (дополнительный рис.39). Поэтому, двигаясь вперед, мы приняли альтернативную установку, в которой 50 мкл РНЧ enAsCas12a в буфере Tango добавляли непосредственно в реакционную пробирку LAMP после завершения изотермической амплификации.

a Analytical LoD на основе исходного рабочего процесса. Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут. Затем реакцию расщепления проводили только на 4 мкл продуктов LAMP при 60 ° C, при этом измерения флуоресценции проводили через 10 мин с использованием считывающего устройства для микропланшетов.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). b Аналитическая нагрузка при использовании всех продуктов LAMP. После завершения RT-LAMP 50 мкл реагентов CRISPR добавляли непосредственно в каждую пробирку с образцом для реакции расщепления. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). c Полосовая диаграмма, показывающая, как изменялась чувствительность к LAMP при замене 0,1 М глицина (Gly) на 40 мМ гуанидина (Gua). RT-LAMP выполняли при 65 ° C в приборе реального времени с различными копиями синтетической РНК.Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 5 биологических повторов). Значения P- были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Сравнение чувствительности анализа глицина и гуанидина. Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут. Затем 50 мкл реагентов CRISPR добавляли непосредственно в каждую пробирку с образцом и проводили реакцию расщепления при 60 ° C, при этом измерения флуоресценции проводили через 10 мин с использованием считывающего устройства для микропланшетов.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 8 биологических повторов). e Анализ бокового потока для оценки кинетики реакции расщепления с гуанидином в смеси для анализа. Фермент enAsCas12a образовал комплекс как с гибридным гидом S2, так и с 5’-удлиненной гРНК S6. После завершения RT-LAMP реакцию обнаружения Cas проводили при 60 ° C в течение 5, 7 или 10 минут перед добавлением щупа в каждую пробирку для образца. f Анализ бокового потока для оценки чувствительности теста VaNGuard с гуанидином в смеси для анализа.Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут. Затем реакцию обнаружения Cas проводили при 60 ° C в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую пробирку с образцом. г Аналитическая LoD для матрицы двойной мутантной РНК WT или S254F N234N с использованием реакции квази-одного горшка. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. Измерения флуоресценции здесь проводили через 5 мин реакции расщепления транс .Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). ч Оценка специфичности нашего теста VaNGuard. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. 1E6 копии синтетической РНК от различных респираторных вирусов были использованы в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка. Измерения флуоресценции проводились с 5-минутными интервалами с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). i Оценка с использованием клинических образцов РНК.Значения Ct были получены с использованием набора Fortitude Kit. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. 2 мкл каждого образца РНК использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. Реакцию обнаружения Cas проводили в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую пробирку с образцом. Отношение менее 0,15 в нашем тесте считалось отрицательным. Следовательно, для очищенных образцов РНК анализ бокового потока дал 0 ложноположительных и 8 ложноотрицательных результатов (RP6, RP45-51). j Ленточная диаграмма, обобщающая результаты клинической оценки нашего теста VaNGuard с использованием образцов очищенной РНК.«Да» означает, что в нашем тесте образцы оказались положительными, а «Нет» означает, что образцы оказались отрицательными. Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Пока наш проект продолжался, было опубликовано другое исследование, в котором сообщалось, что скорость и чувствительность LAMP можно повысить с помощью гуанидина ⁶⁷ . Следовательно, мы стремились определить, гуанидин или глицин, которые мы включили в наш CRISPR-Dx ранее (рис. 4b), лучше подходят для анализа. Сначала мы провели только RT-LAMP и обнаружили, что гуанидин увеличивает скорость реакции более заметно, чем глицин (рис.8c). Затем мы выполнили весь анализ с гуанидином или глицином в реакционной смеси и обнаружили, что анализ с гуанидином оказался более чувствительным (рис. 8d и дополнительный рис. 40). Гуанидин позволил обнаружить 10 копий вируса в семи из восьми повторов, в то время как глицин позволил успешно обнаружить только в двух из восьми повторов. Таким образом, мы заменили глицин на гуанидин в нашем анализе и подтвердили скорость и чувствительность нашего обновленного теста с помощью индикаторных полосок (рис.8д, е).

Удивительная устойчивость enAsCas12a к температуре дала нам возможность выполнить весь рабочий процесс RT-LAMP-CRISPR за один температурный шаг. RT-LAMP до сих пор проводился при 65 ° C, в то время как реакция обнаружения Cas была протестирована только до 60 ° C. Поэтому мы задались вопросом, можно ли проводить оба этапа при одинаковой температуре. Сначала мы протестировали реакцию CRISPR при 60, 63 и 65 ° C и обнаружили, что, хотя показания флуоресценции немного уменьшились при 63 ° C, падение сигнала было более заметным при 65 ° C (дополнительный рис.41а). Затем мы оценили чувствительность нашего анализа с RT-LAMP, выполненного при немного более низкой температуре, 63 ° C, при поддержании шага CRISPR на уровне 60 ° C. 14 из 15 повторов показали успешную амплификацию 20 копий синтетической вирусной матрицы (дополнительный рисунок 41b). Наконец, мы проверили, можно ли выполнить весь рабочий процесс с помощью всего одного теплового блока, установленного на 63 ° C или 60 ° C. Продолжительность RT-LAMP была увеличена с 15 до 22 минут, чтобы приспособиться к несколько неоптимальной температуре, с которой сталкивается реакция изотермической амплификации.Примечательно, что наши анализы бокового потока показали, что положительные результаты теста могут быть получены в течение 5 минут после реакции CRISPR даже при наличии только двух копий синтетической вирусной матрицы в образце (дополнительный рис. 41c, d). Мы назвали нашу установку с одним тепловым блоком «квази-одним горшком», в которой РНЧ enAsCas12a добавлялись непосредственно в реакционную трубку LAMP без изменения температуры образца. Примечательно, что весь анализ может быть завершен в течение 30 минут (22 минуты для RT-LAMP, 5 минут для реакции расщепления trans и 2 минуты для полос, развивающихся на индикаторных полосках).

Мы спросили, будет ли квази-одна установка по-прежнему устойчивой к SNV на целевых сайтах, но при этом проявлять исключительную специфичность для SARS-CoV-2. С этой целью мы исследовали толерантность к несоответствию нашего оптимизированного анализа (enAsCas12a в комплексе с двумя гибридными направляющими ДНК-РНК) и обнаружили, что он показал аналогичную чувствительность для матрицы дикого типа и двойной мутантной матрицы S254F N234N (рис. 8g и дополнительный рис. 42). Мы дополнительно протестировали наш анализ на ряде коронавирусов и других респираторных вирусов, включая вирусы гриппа, парамиксовирусы и энтеровирусы.Флуоресценция была обнаружена только для SARS-CoV-2 в течение 30 минут, что подтвердило специфичность нашего теста (рис. 8h).

Впоследствии мы подвергли наш CRISPR-Dx клинической оценке с образцами РНК, выделенными из мазков с НП пациента, которые ранее были проанализированы с помощью qRT-PCR в больнице. Эти образцы были взяты от 45 пациентов с COVID-19 и 30 неинфицированных людей. Подобно нашему более раннему пилотному тесту (рис. 6d, e), все образцы, которые были отрицательными с помощью qRT-PCR, также оказались отрицательными в анализе бокового потока, подтверждая 100% специфичность нашего анализа (рис.8i). Кроме того, наш тест VaNGuard дал однозначный положительный результат для клинических образцов, которые имели значение Ct 33,32 или ниже при анализе qRT-PCR (рис. 8i, j). Следовательно, на основе этих клинических образцов РНК наш анализ показал LoD 50 копий на реакцию или 2 копии на микролитр.

Прямое применение теста VaNGuard к неочищенным клиническим образцам

Важным моментом для экспресс-тестов является то, могут ли они принимать образцы пациентов напрямую. Извлечение РНК обычно занимает не менее 15 минут и усложняет рабочий процесс, тем самым увеличивая время ожидания и делая тест менее пригодным для использования неподготовленными профессионалами.Поэтому мы спросили, можем ли мы использовать наш анализ непосредственно на образцах пациентов без дополнительного этапа выделения РНК. Одна из проблем с образцами пациентов — это наличие РНКаз, которые могут быстро разрушать вирусную РНК, которую мы хотим обнаружить. Чтобы инактивировать РНКазы, мы сначала попробовали протокол Hudson ¹⁶ , но обнаружили, что добавление TCEP и EDTA запускало ложную амплификацию без матрицы при значениях Ct менее 25 в большинстве повторений (дополнительный рис. 43).

Мы исследовали другие варианты инактивации РНКазы, а именно обработку протеиназой К и нагревание ^68,69 .В качестве моделирования мы создали лентивирус, который экспрессировал соответствующий фрагмент S-гена из SARS-CoV-2 и внес различные его количества в слюну человека. Затем мы провели реакцию RT-LAMP на искусственно созданных образцах, которые не обрабатывали, нагревали при 95 ° C только в течение 5 минут или обрабатывали протеиназой K и теплом (рис. 9a). В соответствии с недавними исследованиями ^68,69 , мы обнаружили, что обработка протеиназой К и теплом, по-видимому, улучшает скорость и чувствительность RT-LAMP.Затем мы оценили LoD нашего CRISPR-Dx, используя в качестве входных данных надуманные образцы. Образцы предварительно обрабатывали протеиназой К и нагревали. Примечательно, что наш анализ смог обнаружить 40 копий лентивируса во всех повторах (рис. 9b). Важно отметить, что пропуск стадии экстракции РНК не повлиял на скорость нашего теста, так как сигнал флуоресценции насыщался через 5 минут реакции CRISPR.

a Полосная диаграмма, показывающая влияние протеиназы K и тепловой обработки на RT-LAMP, когда в качестве входных данных использовались различные копии лентивируса, экспрессирующего S-ген, в слюне.Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение (без ПК + без нагрева: n = 5 [4E5-4E6], 7 [4-4E2], 10 [4E4] или 12 [4E3 и NTC]; без PK + нагрев: n = 7 [4E5], 9 [4E6], 10 [4-4E2], 15 [4E4] или 17 [4E3 and NTC]; PK + тепло: n = 7 [4-4E2], 11 [4E5], 13 [4E6], 15 [4E4], 18 [4E3] или 20 [NTC] биологических копий). b Оценка чувствительности теста VaNGuard к неочищенному псевдовирусу. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6.Различные копии лентивируса, внесенные в слюну, обрабатывали протеиназой К и нагревали перед использованием в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка. Измерения флуоресценции проводили с 5-минутными интервалами с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). c Оценка чувствительности теста VaNGuard к неочищенному SARS-CoV-2. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. Различные копии коронавируса, продуцируемые в клетках Vero E6, вводили в клинически отрицательный UTM, обрабатывали протеиназой K и нагреванием, а затем использовали в качестве входных данных для реакции квази-одного горшка.Стадия обнаружения Cas выполнялась в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую реакционную пробирку. d Клиническая оценка с образцами мазков NP. Значение Ct 30 было оценено как эквивалент 500 копий вируса. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. Каждый образец обрабатывали протеиназой К и нагревали перед тем, как 2 мкл использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. Стадия обнаружения Cas выполнялась в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую реакционную пробирку. e Повторный тест неправильно классифицированных образцов мазков NP с использованием удвоенного реакционного объема. 4 мкл каждого образца использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. В целом для прямых образцов пациентов анализ бокового потока дал 0 ложноположительных и 4 ложноотрицательных результата (DP16, DP18, DP20 и DP21). f Полосовая диаграмма, обобщающая результаты клинической оценки нашего теста VaNGuard с использованием неочищенных образцов тампона NP. «Да» означает, что в нашем тесте образцы оказались положительными, а «Нет» означает, что образцы оказались отрицательными.Исходные данные доступны в файле исходных данных.

Затем мы спросили, может ли наш анализ обнаруживать вирионы SARS-CoV-2 в среде для сбора образцов. С этой целью мы добавили различное количество вируса, продуцируемого клетками Vero E6, в клинически отрицательный UTM, который ранее использовался для сбора мазков у здоровых людей. После протеиназы К и термической обработки мы применили наш анализ к этим надуманным образцам и наблюдали четкие тестовые полосы на индикаторных полосках для 100 или более копий SARS-CoV-2 (рис.9в).

Впоследствии мы попытались оценить наш анализ с использованием клинических мазков NP непосредственно без какой-либо экстракции РНК. Мы получили 21 образец от пациентов с инфекцией COVID-19 и еще 21 образец от здоровых людей. Часть этих образцов ранее подвергалась экстракции РНК и qRT-PCR в диагностической лаборатории, поэтому мы могли сравнить результаты наших тестов со значениями Ct, предоставленными лабораторией. Мы обрабатывали образцы протеиназой К и нагревали перед проведением анализа бокового потока (рис.9г). Ожидается, что все клинически отрицательные образцы также оказались отрицательными в нашем тесте VaNGuard, подтверждающем его 100% специфичность. Кроме того, тест дал однозначный положительный результат для клинических образцов, которые имели значение Ct 28,98 или ниже, что соответствует 1000 или более копий на реакцию. Любопытно, что мы также заметили, что хотя наш тест, похоже, пропустил образец со значением Ct 29,42, он правильно пометил другой образец со значением Ct 30,36. Следовательно, чтобы увеличить вероятность обнаружения вируса, мы повторно протестировали пять клинически положительных образцов, которые были неправильно классифицированы, с удвоенным объемом реакции и вдвое большим объемом введенного образца (рис.9д). Однако наш тест правильно идентифицировал только один дополнительный образец со значением Ct 31,80. В целом, в отличие от более ранней клинической оценки с образцами очищенной РНК (рис. 8i, j), граница для значения Ct между положительным и отрицательным результатом в нашем тесте не была такой четкой для неочищенных образцов мазков NP (рис. 9f). Для значений Ct от 29 до 32 наш анализ может дать положительный или отрицательный результат. Эта неоднозначность может быть связана с неизвестной и потенциально сложной матрицей образца (например, слизью из носа), которая может варьироваться от образца к образцу и оказывать некоторое ингибирующее действие на ферменты анализа.Более того, степень восстановления вирусной РНК во время процесса очистки в диагностической лаборатории может быть не совсем согласованной, особенно для образцов с низкой вирусной нагрузкой. Следовательно, образец, который на самом деле имел более высокую вирусную нагрузку в исходном тампоне NP, может в конечном итоге иметь более низкое значение Ct из-за большей потери образца. Взятые вместе, наши результаты показывают, что, хотя и более сложный, наш тест VaNGuard может применяться непосредственно к образцам пациентов без дополнительной очистки РНК с LoD 1000 копий на реакцию или 40 копий на микролитр.Поскольку тампоны, использованные в нашем исследовании, были собраны в 3 мл UTM, и мы взяли только 2 мкл для нашего теста, чувствительность может быть лучше, если тампоны были собраны в меньшем объеме среды.

Включение человеческого внутреннего контроля в одну и ту же реакцию

Диагностический тест на COVID-19 должен включать человеческий внутренний контроль, чтобы убедиться, что отрицательный результат связан с отсутствием вируса, а не просто с недостаточным вводом образца. С этой целью мы стремились идентифицировать подходящий набор праймеров LAMP, нацеленных на некоторый ген домашнего хозяйства, для использования в нашем анализе.Мы проверили три набора праймеров против POP7 , четыре набора праймеров против ACTB и четыре набора праймеров против GAPDH , используя термически обработанную человеческую слюну в качестве образца (рис. 10а). Все наборы праймеров успешно давали продукты амплификации, хотя и с разной скоростью. Кроме того, несколько наборов праймеров также давали ложные побочные продукты без матрицы.

a Полосковая диаграмма, показывающая эффективность различных наборов праймеров LAMP, нацеленных на человеческий ген POP7 , ACTB или GAPDH .Праймеры, помеченные «Set1», «Set2» или «Set3», разработаны заново, в то время как праймеры, помеченные «Pub», были опубликованы ^17,72,73 . 2 мкл термообработанной слюны использовали в качестве образца для ввода в RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 40 минут в приборе реального времени. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 6 [ POP7 Pub and Set1-2, ACTB Set2-3, GAPDH Set2-3], 8 [ ACTB Set1, GAPDH Pub and Set1] или 14 [ ACTB Pub] биологических копий).Сравнения проводились относительно праймеров POP7 Pub ¹⁷ . P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . b Полосовая диаграмма, показывающая влияние различных наборов человеческих праймеров на изотермическую амплификацию S-гена SARS-CoV-2. Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовались в качестве образца для ввода в RT-LAMP, который выполнялся при 65 ° C в течение 40 минут в приборе реального времени. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 3 [ POP7 Pub 2E5] или 6 [ POP7 Pub все, кроме 2E5, ACTB Set2] биологических реплик). c , d Оценка нашего прототипа анализа VaNGuard, содержащего человеческий внутренний контроль, с использованием c клинически отрицательных и d клинически положительных образцов мазка NP. Зеленая флуоресценция происходит от общего ДНК-связывающего красителя, а красная флуоресценция исходит от репортера Cy5-quencher, специфичного для SARS-CoV-2. Каждый образец обрабатывали протеиназой К и нагревали перед тем, как 2 мкл использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. e 20 копий синтетической РНК SARS-CoV-2 были использованы в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка с различными количествами пирофосфатазы, добавленными на этапе обнаружения Cas.Измерения флуоресценции здесь проводили через 5 мин реакции расщепления транс . Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). Значение P было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . f Оценка нашего анализа с различными количествами человеческих праймеров и пирофосфатазы. Различные копии синтетической РНК, добавленные в термически обработанную слюну, использовали в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка. Измерения флуоресценции проводились с 5-минутными интервалами с использованием считывающего устройства для микропланшетов.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). г Клиническая оценка нашего оптимизированного анализа VaNGuard, содержащего внутренний контроль человека. В качестве входных данных использовали 2 мкл каждой пробы протеиназы К и термообработанного тампона NP. Исходные данные доступны в файле исходных данных.

В идеале внутренний контроль должен быть встроен в ту же реакционную пробирку, что и тест на COVID-19. Следовательно, затем мы оценили, будут ли человеческие праймеры мешать нашим праймерам SARS-CoV-2 в реакции RT-LAMP (рис.10b и дополнительный рис. 44). Использовали вариабельные копии синтетической вирусной РНК-матрицы. Интересно, что мы наблюдали, что несколько наборов праймеров, таких как целевые праймеры POP7 , развернутые в системе DETECTR ¹⁷ , вызвали неспецифическую амплификацию. Мы выбрали набор целевых праймеров ACTB , чтобы продолжить, потому что он не вызывал серьезных ошибок амплификации без матрицы, а наши праймеры SARS-CoV-2 LAMP продолжали хорошо амплифицироваться в его присутствии даже при низком количестве копий вирусной РНК.

Чтобы включить внутренний контроль в ту же реакционную пробирку, что и тест на COVID-19, необходимо использовать считывание флуоресценции вместо индикаторных полосок, и требуются два цвета, чтобы отличить ампликоны SARS-CoV-2 от человеческих ампликонов. Сначала мы заменили зеленый флуорофор (FAM) в репортере CRISPR на красный флуорофор (Cy5) и подтвердили, что сигнал был аналогичным (дополнительный рис. 45a). Затем мы проверили чувствительность нашего анализа, используя синтетическую вирусную РНК, добавленную в термически обработанную слюну.Реакционная смесь содержала стандартный зеленый ДНК-связывающий краситель и Cy5-репортер. Обнадеживает то, что мы наблюдали, что наш анализ может обнаружить 20 или более копий вирусной РНК даже при одновременной амплификации человеческого ACTB (дополнительный рис. 45b). Кроме того, зеленая, но не красная флуоресценция детектировалась для контрольной реакции без матрицы, если это желательно.

Впоследствии мы попытались оценить наш анализ с внутренним контролем на неочищенных клинических образцах. С этой целью мы использовали тот же набор мазков NP, который ранее оценивали с помощью щупов (рис.9г – е). Для всех отрицательных образцов qRT-PCR амплификация наблюдалась для человеческого ACTB , но не для S-гена SARS-CoV-2, как ожидалось (рис. 10c). Что касается qRT-PCR-положительных образцов, мы сосредоточились на тех, которые были правильно классифицированы в исходном анализе. Усиление наблюдалось как в зеленом, так и в красном каналах для каждого образца (рис. 10d). Однако кинетика реакции CRISPR для многих образцов была медленнее, чем ожидалось.

Мы стремились улучшить наш анализ с помощью внутреннего контроля, используя синтетическую вирусную РНК, добавленную в термически обработанную слюну в экспериментах по устранению неполадок.Во время реакции LAMP образуется большое количество пирофосфата, в результате чего магний выпадает в осадок из раствора. Мы задавались вопросом, снизит ли это со временем концентрацию ионов магния, доступных для реакции, или пирофосфат ингибирует реакцию CRISPR. Следовательно, мы проверили, улучшит ли наш тест VaNGuard добавление термостабильной пирофосфатазы. Хотя добавление до 2U пирофосфатазы, по-видимому, не улучшало RT-LAMP (дополнительный рис. 46), оно действительно значительно улучшало кинетику реакции обнаружения Cas (рис.10e и дополнительный рис. 47). Затем мы предположили, что человеческие праймеры конкурируют с праймерами SARS-CoV-2 за реагенты LAMP. Таким образом, мы исследовали эффект уменьшения вдвое количества праймеров ACTB человека в нашем анализе. В целом снижение концентрации человеческих праймеров привело к ощутимо более низкой скорости генерации зеленой флуоресценции, предположительно из-за менее эффективной амплификации ACTB (дополнительный рисунок 48). Тем не менее, это не препятствовало успешной амплификации каких-либо реплик в течение 22 минут RT-LAMP.Кроме того, мы обнаружили, что использование меньшего количества человеческих праймеров явно увеличивает чувствительность нашего анализа для SARS-CoV-2 (рис. 10f). Дальнейшее добавление 2U пирофосфатазы в реакцию обнаружения Cas также улучшило кинетику реакции.

Наконец, мы задались вопросом, как улучшенная версия нашего анализа с внутренним контролем будет работать на реальных образцах пациентов. Мы повторно оценили клинически положительные мазки NP, которые дали более слабые, чем ожидалось, сигналы красной флуоресценции в нашем более раннем двухцветном анализе (рис.10г). Кроме того, мы повторно проанализировали DN12, поскольку ранее он показал более позднюю амплификацию ACTB , чем другие клинически отрицательные образцы (рис. 10c), и поэтому мы были обеспокоены тем, что уменьшение вдвое количества человеческих праймеров может помешать внутреннему контролю работать в этом образце . Повторный тест показал, что корректировка концентраций праймера LAMP и добавление 2U пирофосфатазы позволило более надежно обнаружить SARS-CoV-2 в каждом клинически положительном мазке на NP (рис. 10g). Более того, амплификация все еще наблюдалась для гена ACTB человека, но не для S-гена SARS-CoV-2 в DN12.Взятые вместе, результаты демонстрируют, что наш тест VaNGuard, содержащий внутренний контроль в рамках той же реакции, может быть успешно применен к неочищенным клиническим образцам без экстракции РНК.

Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Andrographis paniculata — однолетнее растение с горьким вкусом, распространенное на большей части Азии. В традиционной медицине он часто используется в сочетании с другими травами для лечения инфекционных заболеваний и связанных с ними лихорадок. Он также используется в народной медицине для лечения укусов змей.Андрографис продвигается в дополнительной форме для профилактики рака, лечения рака и для противодействия токсичности химиотерапии у людей. Препараты, содержащие стандартизованные экстракты андрографиса, также продаются от простуды и гриппа.

Исследования in vitro и на животных показывают, что андрографис обладает противомикробным действием ⁽²³⁾ , противовоспалительным ⁽²⁶⁾ , антиоксидантом ⁽²⁷⁾ , противоопухолевым ^{(13) (18)} и антиметастатическим ^{(15). )} объекта.

Kan Jang, стандартизированный экстракт Andrographis paniculata и Eleutherococcus senticosus, был изучен в спонсируемых производителем клинических испытаниях по облегчению респираторных симптомов от простуды и гриппа ^{(1) (2) (3) (4)} . Было обнаружено, что экстракт андрографиса полезен при лечении симптомов инфекции верхних дыхательных путей ⁽⁵⁾ . Несколько метаанализов показывают возможное преимущество A. paniculata в снижении частоты и тяжести кашля. ^{(45) (46)} .

Андрографис также оценивался на предмет выявления язвенного колита. В одном испытании те, кто получал экстракт A. paniculata в более высоких дозах, имели больше шансов достичь клинического ответа по сравнению с плацебо ⁽⁴⁷⁾ . Другое исследование показало, что он не менее эффективен при лечении язвенного колита, чем месаламин. ⁽⁶⁾ .

В других предварительных исследованиях экстракты андрографиса снижали ревматоидные факторы и облегчали симптомы ревматоидного артрита. ⁽⁷⁾ .У пациентов с умеренной гипертриглицеридемией высокие дозы экстракта андрографиса снижали уровни триглицеридов аналогично гемфиброзилу ⁽⁴⁸⁾ .

В доклинических исследованиях рака андрографолид проявлял активность против стволовых клеток множественной миеломы ⁽⁴⁹⁾ , обращал резистентность к 5-ФУ в клетках колоректального рака человека ⁽⁵⁰⁾ и модулировал опосредованную P-гликопротеином множественную лекарственную устойчивость ⁽⁵¹⁾ .

Кайнозойская сдвиговая тектоника и структурные ограничения Cu-Mo-порфировых и эпитермальных отложений в ходе геодинамической эволюции самого южного Малого Кавказа, Тетийского металлогенического пояса | Экономическая геология

Зангезур-Ордубадский горнорудный район на самом юге Малого Кавказа расположен в центральной части Тетийского металлогенического пояса и состоит из медно-молибденовых порфиров и эпитермальных систем Au и цветных металлов, расположенных в сложном кайнозойском Мегри-Ордубадском плутоне.Рудовмещающие структуры и магматические интрузии преимущественно приурочены к центральному коридору северо-восточного направления длиной 40 км и шириной от 10 до 12 км, расположенному между двумя региональными правосторонними разломами северо-северо-западного направления, Хуступ-Гиратахским и Сальвард-Ордубадским разломами. Анатомия и кинематика основной сети разломов согласуются с тектоникой правого сдвига, контролируемой разломами Хуступ-Гиратах и ​​Сальвард-Ордубад, ориентированными на северо-запад.

Правосдвиговая тектоника началась в эоцене, одновременно с окончательной субдукцией Неотетиса, и контролировала внедрение Агарак, Ханкасар, Айгедзор и Дастакертский порфир Cu-Mo, Тей-Личкваз и Тертерасар, эпитермальные Au и основные металлы. депозиты.Структуры эоцена неоднократно реактивировались во время последующей эволюции неогена при переходе к постсубдукционной геодинамической обстановке. Рудоносные структуры на месторождении Cu-Mo каджаранских порфиров мирового класса в олигоцене также контролировались правосдвиговой тектоникой, а также порфировым оруденением и его эпитермальным наложением, образовавшимся в результате интрузии раннего миоцена в Личке.

Правосдвиговая тектоника от эоцена до раннего миоцена имела место во время сжатия, ориентированного с северо-востока на северо-северо-восток, связанного с конвергенцией Евразии и Аравии палеогена и последующей постколлизионной эволюцией в неогене.Реконструкция палеонапряжений указывает на серьезную реорганизацию кинематики тектонических плит с раннего миоцена, которая привела к сжатию с северо-востока на северо-запад. Эпитермальный след раннего миоцена на месторождении порфиров Каджаран и левосторонняя реактивация разломов и минерализованных структур связаны с этой поздней неогеновой реорганизацией тектонических плит.

Чувствительность к парше полевой яблони разнообразной коллекции зародышевой плазмы Malus определяет потенциальные источники устойчивости для селекции яблонь | CABI Agriculture and Bioscience

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Страница не найдена | Институт мира США

Найдите USIP.org

Тип содержания Запись в блогеЦентрКурсЦифровая библиотека мирного процесса в Южном СуданеСобытиеВнешние новостиСтандартТема обсужденияGC — Академия LandingGC — Продвижение курсаGC — СобытиеГлоссарий TermGrantINPROL PublicationЦелевая страницаНовостиОнлайн курсСтраницаЛицаПроектыПубликацияБиблиотечный ресурсУведомление на сайте

Страны Африка-Ангола-Бенин-Ботсвана-Буркина-Фасо-Бурунди-Камерун-Кабо-Верде-Центральноафриканская Республика-Чад-Коморские Острова-Кот-д’Ивуар-Демократическая Республика Конго-Джибути-Экваториальная Гвинея-Эритрея-Эфиопия-Габон-Гана- Гвинея-Гвинея-Бисау-Кения-Лесото-Либерия-Мадагаскар-Малави-Мали-Мавритания-Маврикий-Мозамбик-Намибия-Нигер-Нигерия-Руанда-Сан-Томе и Принсипи-Сенегал-Сейшельские острова-Сьерра-Леоне-Сомали-Южная Африка-Южная Африка Судан-Судан-Свазиленд-Танзания-Гамбия-Республика Конго-Того-Уганда-Замбия-Зимбабве Америка-Антигуа и Барбуда-Аргентина-Багамы-Барбадос-Белиз-Боливия-Бразилия-Канада-Чили-Колумбия-Коста-Рика- Куба-Доминика-Доминиканская Республика-Эквадор-Сальвадор-Гренада-Гватемала-Гайана-Гаити-Гондурас-Ямайка-Мексика-Никарагуа-Панама-Парагвай-Перу-Сент-Китс и Невис-Сент-Люсия-Сент-Винсент и Гренадины-Тринидад и Тобаго-США-Уругвай-Венесуэла Азия-Афганистан-Австралия-Бангладеш-Бутан-Бруней-Бирма-Камбоджа-Китай-Фиджи-Индия-Индонезия-Япония-Казахстан-Кирибати-Кыргызстан Стан-Лаос-Малайзия-Мальдивы-Маршалловы острова-Микронезия-Монголия-Науру-Непал-Новая Зеландия-Северная Корея-Пакистан-Палау-Папуа-Новая Гвинея-Филиппины-Самоа-Сингапур-Соломоновы острова-Южная Корея-Шри-Ланка-Суринам- Таджикистан-Таиланд-Восточный Тимор-Тонга-Туркменистан-Тувалу-Узбекистан-Вануату-Вьетнам-Европа-Албания-Андорра-Армения-Австрия-Азербайджан-Беларусь-Бельгия-Босния-Герцеговина-Болгария-Хорватия-Кипр-Чехия-Дания-Эстония- Финляндия-Франция-Грузия-Германия-Греция-Гренландия-Святой Престол (Ватикан) -Венгрия-Исландия-Ирландия-Италия-Косово-Латвия-Лихтенштейн-Литва-Люксембург-Македония-Мальта-Молдова-Монако-Черногория-Нидерланды-Норвегия -Польша-Португалия-Румыния-Россия-Сан-Марино-Сербия-Словакия-Словения-Испания-Швеция-Швейцария-Турция-Украина-Соединенное Королевство Ближний Восток и Северная Африка-Алжир-Бахрейн-Египет-Иран-Ирак-Израиль и палестинские территории -Иордания-Кувейт-Ливан-Ливия-Марокко-Оман-Катар-Саудовская Аравия-Сирия-Тунис-Объединенные Арабские Эмираты-Йемен

Области проблемы Военно-гражданские отношенияАнализ и предотвращение конфликтовДемократия и управлениеЭкономика и окружающая средаОбразование и обучениеЭлекторальное насилиеХрупкость и устойчивостьГендерГлобальное здоровьеГлобальная политикаПрава человекаСправедливость, безопасность и верховенство законаМедиация, переговоры и диалогНасильственные действияМиропроцессы примирениеРелигиозность11 Сортировать

Актуальность

Дата