Итоговая (стандартизированная) контрольная работа по химии 9 класс О.С. Габриелян | Методическая разработка по химии (9 класс):
Лист самооценки по химии
__________________________ (ФИ) _______ класс_______________ учебный год
Умение | Номер заданий из стандартизированной работы | Уровень усвоения | Возникшие трудности | ||
Не умею | Решаю с трудом, допускаю ошибки | умею | |||
описывать строение атома | А1 | ||||
объяснять закономерности изменения строения атомов, свойств элементов в пределах малых периодов и главных подгрупп; определять по положению в ПС принадлежность элемента к определенной группе веществ | А2, А5 | ||||
определять факторы, влияющие на скорость химической реакции | А3 | ||||
характеризовать физические и химические свойства | А4,А6, А7,А8, В1 | ||||
классифицировать химические реакции по различным признакам | В2 | ||||
осуществлять цепочки превращения, применяя знания химических свойств неорганических соединений, составлять химические реакции, записывать уравнения в молекулярном и ионном виде | С1 | ||||
Проводить вычисления по химическим формулам и уравнениям. | С2 | ||||
составлять уравнения окислительно-восстановительных реакций, определять окислитель и восстановитель; | С3 |
СПЕЦИФИКАЦИЯ
Итоговой (стандартизированной) контрольной работы по химии
за курс «Химия. 9 класс» МБОУ технического лицея № 176 Карасукского района Новосибирской области.
Назначением работы является проведение промежуточной аттестации учащихся 9-х классов по предмету химия. Работа проводится в форме стандартизированной контрольной работы по окончанию 9 класса.
Цель – определение уровня (степени) достижения планируемых результатов освоения основной образовательной программы основного общего образования по предмету химия за курс 9 класса.
Документы, определяющие содержание работы. Содержание диагностической работы соответствует нормативным документам:
- Федеральный закон от 29.12.2012 г. № 273-ФЗ «Об образовании в Российской Федерации».
- Федеральный государственный образовательный стандарт основного общего образования (Приказ Министерства образования и науки Российской Федерации от 17.12.2010 № 1897).
- Основная образовательная программа МБОУ технического лицея № 176 Карасукского района Новосибирской области.
- Рабочие программы к УМК О.С.Габриеляна: Химия.8-9 классы: учебно-методическое пособие/ сост. Т.Д.Гамбурцева. – 2-е изд., стереотип. – М.:Дрофа, 2014
- 2 Примерные программы по учебным предметам. Химия. 8-9 классы:проект. – М.: Просвещение, 2010.- 48 с- ( стандарты второго поколения).
- Рабочая программа по химии.
Структура диагностической работы
Диагностическая работа состоит из трех частей, различающихся формой и уровнем сложности заданий. Всего в работе 13 заданий.
Работа содержит 8 заданий базового уровня сложности с выбором ответа; 2 задания повышенного уровня сложности на установление соответствия, 3 задания требуют полного ответа.
Распределение заданий диагностической работы по проверяемым умениям и элементам содержания
Отбор содержания, подлежащего проверке, в работе осуществляется в соответствии с требованиями ФГОС к уровню подготовки выпускников и с учетом содержания учебника (Приказ Министерства образования и науки Российской Федерации от 31.03.2014 г. № 253), описанными в виде предметных умений так, чтобы обеспечить проверку их сформированности в соответствии с предметными планируемыми результатами освоения обучающимися основной образовательной программы основного общего образования по химии за курс 9 класса.
Кодификатор
Распределение заданий работы в соответствии с планируемыми предметными результатами
№ задания | Раздел/тема программы | Проверяемые предметные достижения | Уровень сложности | Максимальный балл |
Общая характеристика химических элементов и химических реакций. | Определять число электронов у частиц (атомов, молекул). | базовый | 1 | |
Общая характеристика химических элементов и химических реакций. | Устанавливать закономерности положения химического элемента в ПС и их свойств. | базовый | 1 | |
Общая характеристика химических элементов и химических реакций. | Определять влияние факторов на скорость химической реакции. | базовый | 1 | |
Общая характеристика химических элементов и химических реакций. | Классифицировать химические реакции по различным признакам. | повышенный | 2 | |
Металлы. | Определять физические свойства металлов. | базовый | 1 | |
Металлы. | Определять принадлежность металла к определенной группе. | базовый | 1 | |
Металлы. | Определять химические свойства металлов. | базовый | 1 | |
Неметаллы. | Определять физические свойства неметаллов. | базовый | 1 | |
Неметаллы. | Определять химические свойства неметаллов. | базовый | 1 | |
Обобщение знаний по химии за курс основной школы. | Определять по исходным веществам продукты реакции. | повышенный | 2 | |
Обобщение знаний по химии за курс основной школы. | Составлять уравнения химических реакций на основе знаний о химических свойствах простых веществ и основных классов неорганических веществ, писать реакции в ионном виде. | повышенный | 3 | |
Обобщение знаний по химии за курс основной школы. | Выполнять расчеты по химическим уравнениям. | повышенный | 3 | |
Обобщение знаний по химии за курс основной школы. | Расставлять степени окисления, составлять электронный баланс, определять окислитель, восстановитель. | повышенный | 3 | |
Всего | 21 |
Распределение заданий по разделам программы
Раздел программы | Количество заданий базового уровня сложности | Количество заданий повышенного уровня сложности |
Общая характеристика химических элементов и химических реакций. | 3 | 1 |
Металлы. | 3 | — |
Неметаллы. | 2 | — |
Обобщение знаний по химии за курс основной школы. | — | 4 |
Всего заданий | 8 (62 %) | 5 (38%) |
Заданий базового уровня сложности – 8 (62 %), повышенного – 5 (38%).
Итоговая (стандартизированная) контрольная работа по химии
за курс «Химия. 9 класс».
Вариант № 1
А1. Распределение электронов по энергетическим уровням 2е, 8е, 2е соответствует частице 1) Мg0 2) О2- 3) Мg2+ 4) S2-
А2. В ряду элементов Na – Mg – Al — Si
- уменьшаются радиусы атомов
- уменьшается число протонов в ядрах атомов
- увеличивается число электронных слоёв в атомах
- уменьшается высшая степень окисления атомов в соединениях
А3. Фактор, не влияющий на скорость химических реакций,
- природа реагирующих веществ
- температура
- концентрация реагирующих веществ
4)тип химической реакции
А4. Наиболее электропроводным металлом из перечисленных является
- цинк 3) свинец
- медь 4) хром
А5. Металл, не относящийся к щёлочноземельным,
1)магний 3) стронций
2)кальций 4) барий
А6. Наиболее активно реагирует с водой
- скандий 3) калий
- магний 4) кальций
А7. Агрегатное состояние иода при нормальных условиях
- жидкое 2) твёрдое 3) газообразное
А8. Металл, с которым не взаимодействует концентрированная серная кислота,
1)железо 2)магний 3)цинк 4)натрий
Часть В. Тестовые задания на соответствие.
В1. Установите соответствие между реагирующими веществами и продуктами их взаимодействия.
Реагирующие Продукты их
вещества взаимодействия
А) Cu +Cl2 1) Cu(OH)2 и Cl2
Б) CuО + HCl 2) CuCl
В) Cu 2О + HCl 3) CuCl2 и h3O
4) CuCl2
5) CuCl и h3O
В2. Установите соответствие между типами и уравнениями химических реакций.
ТИПЫ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
А) соединения, ОВР, необратимая
Б) разложения, ОВР, эндотермическая
В) соединения, ОВР, гомогенная
УРАВНЕНИЯ РЕАКЦИЙ
- N2(г) + 3h3(г) ↔ 2Nh4(г) + Q
- 2КNO3 = 2KNO2 + O2 +Q
- FeO + C → Fe + CO -Q
- 4Fe + 3O2 + 6h3O = 4Fe(OH)3
- 2Al + Fe2O3 = 2Fe + Al2O3 +Q
Часть С. Задания с развёрнутым ответом.
С1. Запишите уравнения реакций, с помощью которых можно осуществить превращения Zn → ZnCl2 → Zn(OH)2 → ZnO
Для перехода 2 запишите ионное уравнение.
С2. . К 34,8г сульфата калия прилили раствор, содержащий 83,2 г хлорида бария. Определите массу образовавшегося осадка. (5б).
С3.Расставьте коэффициенты в уравнении реакции с помощью электронного баланса. Cu +HNO3→Cu(NO3)2+NO +h3O.
Итоговая (стандартизированная) контрольная работа по химии за курс «Химия. 9 класс».
Вариант № 1
А1. Распределение электронов по энергетическим уровням 2е, 8е, 6е соответствует атому
- углерода 3) фосфора
- серы 4) хлора
А2. В ряду элементов С –N — О — F
- уменьшается высшая степень окисления элементов в соединениях
- увеличиваются радиусы атомов
- уменьшается восстановительная способность простых веществ
- увеличивается высшая степень окисления элементов в соединениях
А3. Фактор, не влияющий на скорость химических реакций,
- катализатор
- способ получения реагентов
- природа реагирующих веществ
- концентрация реагирующих веществ
А4. Металл, не относящийся к щелочным металлам,
- калий 3) литий
- кальций 4) натрий
А5. Свойство ртути, которое ограничивает её применение в бытовых термометрах
- агрегатное состояние
- температура плавления
- токсичность
- высокая плотность
А6. Водород нельзя получить путём взаимодействия металлов с кислотой
- азотной 3) соляной
- серной 4) фосфорной
А7. Свойство, характерное для озона,
- хорошо растворяется в воде
- не имеет запаха
- бактерициден
- легче воздуха
А8. Вода взаимодействует с каждым из веществ, формулы которых
1)Ca и Na2O 2) Na2O и Cu 3)CuO и N2O5 4)ZnO и SO2
Часть В. Тестовые задания на соответствие.
В2. Установите соответствие между исходными веществами и продуктами реакций.
Исходные вещества Продукты реакции
А) Na и h3O 1) Na2SO3 и h3O
Б) Na2O и h3O 2) NaOH и h3O
В ) NaOH и SO2 3) NaOH и h3
4) NaOH
В2. Установите соответствие между типами и уравнениями реакций.
ТИПЫ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
А) замещения, ОВР, эндотермическая
Б) разложения, ОВР, экзотермическая
В) соединения, ОВР, необратимая
УРАВНЕНИЯ РЕАКЦИЙ
- N2(г) + 3h3(г) ↔ 2Nh4(г) + Q
- 2КNO3 = 2KNO2 + O2 +Q
- FeO + C → Fe + CO -Q
- 4Fe + 3O2 + 6h3O = 4Fe(OH)3
- 2Al + Fe2O3 = 2Fe + Al2O3 +Q
Часть С. Задания с развёрнутым ответом.
С1. Запишите уравнения реакций, с помощью которых можно осуществить превращения MgO→ MgCI2→Mg(OH)2→ Mg(NO3)2
Для перехода 3 запишите ионное уравнение.
С2. К раствору, содержащему 63,9г нитрата алюминия, прилили раствор, содержащий 39,2г фосфорной кислоты. Определите массу фосфата алюминия.
С3. Расставьте коэффициенты в уравнении реакции с помощью электронного баланса. Cu + HNO3→ Cu(NO3)2 + NO2 + h3O
Рекомендации по оцениванию работы
Максимальное количество баллов – 21 балла
Задания базового уровня (А1-А8), только один правильный ответ. (1 балл)
Задания повышенного уровня (В1-В2), найти соответствие. ( 2 балла)
Задание С1, С2, С3 — требуют полного ответа. ( 3 балла)
Ответы: Итоговая (стандартизированная) контрольная работа по химии за курс «Химия. 9 класс». контрольная работа по химии
за курс «Химия. 9 класс».
Вариант 1. Часть А.
Часть В.
Часть С. 1.
2. Задача 34,8г 83,2г х К2SO4 + BaCl2 → BaSO4 + 2KCl 1*174г 1*208г 1*233
Х = 0,2*233 = 46,6г
| Вариант 2 Часть А.
Часть В.
Часть С. 1. MgO+2HCl=MgCl2+h3O MgCl2+2KOH=Mg(OH)2+2KCl Mg(OH)2+2HNO3=Mg(NO3)2+2h3O 2. Задача 63,9г 39,2г х Al(NO3)3 + h4PO4 → AlPO4 + 3HNO3 1*213г 1*98г 1*122г
Х = 0,3*122 = 36,6г 3. Cu⁰+4HN⁺⁵O3(конц.)=Cu⁺²(NO3)2+2N⁺⁴O2+2h3O |
▶▷▶ химия контрольные и проверочные работы 9 класс решебник
▶▷▶ химия контрольные и проверочные работы 9 класс решебникИнтерфейс | Русский/Английский |
Тип лицензия | Free |
Кол-во просмотров | 257 |
Кол-во загрузок | 132 раз |
Обновление: | 15-11-2018 |
химия контрольные и проверочные работы 9 класс решебник — Yahoo Search Results Yahoo Web Search Sign in Mail Go to Mail» data-nosubject=»[No Subject]» data-timestamp=’short’ Help Account Info Yahoo Home Settings Home News Mail Finance Tumblr Weather Sports Messenger Settings Want more to discover? Make Yahoo Your Home Page See breaking news more every time you open your browser Add it now No Thanks Yahoo Search query Web Images Video News Local Answers Shopping Recipes Sports Finance Dictionary More Anytime Past day Past week Past month Anytime Get beautiful photos on every new browser window Download ГДЗ Химия 8 класс Контрольные и проверочные работы Решебник uchebenet … За 8 класс Химия Ответы для гдз по учебнику Химия 8 класс Контрольные и проверочные работы 2011-2016 год от автора Габриелян издательства Дрофа ГДЗ решебник по химии 9 класс контрольные и проверочные gdzputinaco 9 класс Химия ГДЗ / 9 класс / Химия / контрольные и проверочные работы Габриелян Краснова Онлайн ответы из решебника по химии за 11 класс авторов Габриеляна ОС, Краснова ВГ 2015 года издания Решебник ГДЗ по Химии 9 класс Контрольные и проверочные 5urokovru/load/gdz_ 9 _klass/khimija/reshebnik Cached Контрольные и проверочные работы к учебнику О С Габриеляна « Химия 9 класс »» Время летит неумолимо быстро Вот и Ваш ребенок также незаметно подрос Химия Контрольные И Проверочные Работы 9 Класс Решебник — Image Results More Химия Контрольные И Проверочные Работы 9 Класс Решебник images Химия 9 класс Контрольные и проверочные работы Габриелян ОС allengorg/d/chem/chem56htm Cached Химия 9 класс Контрольные и проверочные работы Габриелян ОС 9 -е изд, стер ГДЗ решебник по химии 8 класс контрольные и проверочные gdzputinaco 8 класс Химия ГДЗ / 8 класс / Химия / контрольные и проверочные работы Габриелян Краснова ГДЗ по химии за 8 класс авторов Габриелян ОС, Красновой ВГ 2017 года издания Габриелян О С Химия 10 класс : контрольные и проверочные edu-libcom/izbrannoe/gabrielyan-o-s-himiya-10 Cached Габриелян О С Химия 10 класс : контрольные и проверочные работы к учебнику О С Габриеляна Химия Контрольные и проверочные работы Тестовые задания 7 uchebnikiby/rus/katalog/5- 9 -klassy/21853 Cached Все учебные предметы Зборнік задач па хіміі 9 клас Сборник контрольных и самостоятельных работ по химии 7— 9 классы Химия в 8 классе Сборник задач по химии 7 класс Химия 9 класс Учебник Химия 9 класс ОС Габриелян, ПН Березкин, АА vklasseonline … Химия Скачайте на мобильный На нашем интернет-ресурсе можно скачать учебник Химия 9 класс ОС Габриелян, ПН Березкин, АА Ушакова Контрольные и проверочные работы и сохранить его на своем мобильном устройстве ГДЗ Химия 9 класс Контрольные и проверочные работы Габриелян gdz-na-5com Химия 9 класс Данное учебное пособие содержит тексты и решения проверочных и контрольных работ, которые размещены в учебнике Габриеляна О С « Контрольные и проверочные работы по химии для 9 -го класса» Контрольные и проверочные работы к учебнику ОС Габриеляна superhimikru/ 9 -klass/kontrolnye-i-proverochnye-raboty-k Cached Контрольные и проверочные работы к учебнику ОС Габриеляна ( Химия 9 класс ) Металлы 1 вариант Promotional Results For You Free Download | Mozilla Firefox ® Web Browser wwwmozillaorg Download Firefox — the faster, smarter, easier way to browse the web and all of Yahoo 1 2 3 4 5 Next 31,100 results Settings Help Suggestions Privacy (Updated) Terms (Updated) Advertise About ads About this page Powered by Bing™
- направленные на проверку и контроль знаний учащихся Все выполненные работы рассчитаны на текущий и итоговый контроль знаний школьников Скрыть 8 Химия 9 класс Контрольные и проверочные работы 11klasovru › …himiya…klass-kontrolnye…proverochnye… Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте 9 класс Контрольные и проверочные работы — Габриелян ОС cкачать в PDF Настоящее Пособие состоит из текстов контрольных и проверочных работ
- Красновой ВГ 2015 года издания Сборник по своему объему достаточно большой и Сюда вошли готовые ответы на контрольные работы
- Краснова Дрофа 9 класс не пора оставлять изучение сложных предметов на последние выходные перед важными уроками
опросы хорошо использовать ГДЗ по химии Габриелян и Краснова Качество самоподготовки зависит от подхода к контролю своих знаний Стоит ли просто смотреть в ответы
в Периодической системе занимает положение: 4-й период
- ПН Березкин
- smarter
- ПН Березкин
Яндекс Яндекс Найти Поиск Поиск Картинки Видео Карты Маркет Новости ТВ онлайн Музыка Переводчик Диск Почта Коллекции Все Ещё Дополнительная информация о запросе Показаны результаты для Нижнего Новгорода Москва 1 Контрольные работы Габриелян 9 класс reshakru › ГДЗ › 9 класс Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте ГДЗ контрольные работы Габриелян 9 класс 2016 года по химии включают в Девятиклассники уже давно ищут ГДЗ контрольные и проверочные работы Reshakru — самый полный сборник решебников для учеников старших классов Здесь вы сможете найти решебники , ГДЗ, переводы текстов Читать ещё ГДЗ контрольные работы Габриелян 9 класс 2016 года по химии включают в себя все ответы на тесты учебника Девятиклассники уже давно ищут ГДЗ контрольные и проверочные работы Габриелян 9 класс нового образца Благодаря совместным усилиям со спиши-онлайнру был составлен данный сбоник и подготовлен для пользования Все ответы — в виде тестов с подчеркнутыми верными вариантами Reshakru — самый полный сборник решебников для учеников старших классов Здесь вы сможете найти решебники , ГДЗ, переводы текстов Практически весь материал, собранный на сайте — сделанный для людей! Все решебники выполнены качественно, в понятном интерфейсе, с приятной навигацией Скрыть 2 ГДЗ по химии 9 класс контрольные и проверочные eurokiorg › …himiya…klass/kontrolnye…proverochnye… Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте ГДЗ контрольные и проверочные работы по химии 9 класс Габриелян, Краснова Дрофа 9 класс не пора оставлять изучение сложных предметов на последние выходные перед важными уроками, особенно это касается предмета, как химия Помощь для подготовки школьных проверок, типа: контрольные Читать ещё ГДЗ контрольные и проверочные работы по химии 9 класс Габриелян, Краснова Дрофа 9 класс не пора оставлять изучение сложных предметов на последние выходные перед важными уроками, особенно это касается предмета, как химия Помощь для подготовки школьных проверок, типа: контрольные , проверочные , тесты , опросы хорошо использовать ГДЗ по химии Габриелян и Краснова Качество самоподготовки зависит от подхода к контролю своих знаний Стоит ли просто смотреть в ответы, не разбирая непонятные задания ? Скрыть 3 Химия 9 класс : контрольные и проверочные работы edu-libcom › …himiya-9-klass…proverochnyie-rabotyi… Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте 9 класс : контрольные и проверочные работы к учебнику О С Габриеляна « Химия 1 146 Вариант 2 147 Вариант 3 148 Вариант 4 149 Проверочные работы Положение металлов в ПСХЭ, физические свойства, сплавы 151 Общие химические свойства металлов 153 Щелочные и щелочноземельные металлы Читать ещё 9 класс : контрольные и проверочные работы к учебнику О С Габриеляна « Химия 9 класс » / О С Габриелян, П Н Березкин, А А Ушакова и др — 9 -е изд, стереотип — М, 2011 — 174, [2] с Настоящее пособие состоит из текстов контрольных и проверочных работ , соответствующих программе по химии для 9 класса О С Габриеляна 1 146 Вариант 2 147 Вариант 3 148 Вариант 4 149 Проверочные работы Положение металлов в ПСХЭ, физические свойства, сплавы 151 Общие химические свойства металлов 153 Щелочные и щелочноземельные металлы 154 Алюминий и его соединения 155 Железо и его соединения 157 Неметаллы: атомы и простые вещества Кислород, озон, воздух Скрыть 4 ГДЗ Химия 9 класс Контрольные и проверочные GDZ-na-5com › Химия › 9 класс › …-i-proverochnye-raboty… Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте 9 класс Контрольные и проверочные работы О С Габриелян Ответы представлены в таком порядке Работа 4 Вариант 9 Работа 4 Вариант 10 Работа 4 Вариант 11 Тема 3 Работа 4 Вариант 12 Работа 4 Вариант 13 Работа 4 Вариант 14 Работа 5 Вариант 1 Работа 5 Вариант 2 Работа 5 Вариант 3 Работа 5 Читать ещё 9 класс Контрольные и проверочные работы О С Габриелян Ответы представлены в таком порядке Работа 4 Вариант 9 Работа 4 Вариант 10 Работа 4 Вариант 11 Тема 3 Работа 4 Вариант 12 Работа 4 Вариант 13 Работа 4 Вариант 14 Работа 5 Вариант 1 Работа 5 Вариант 2 Работа 5 Вариант 3 Работа 5 Вариант 4 Тема 4 Работа 1 Вариант 1 Работа 1 Вариант 2 Работа 1 Вариант 3 Работа 1 Вариант 4 Работа 2 Вариант Скрыть 5 ГДЗ решебник по химии 9 класс контрольные GdzPutinaco › 9-klass…himiya-9…reshebnik…himiya-9… Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Онлайн ответы из решебника по химии за 11 класс авторов Габриеляна ОС, Краснова ВГ 2015 года издания Издание по своему объему достаточно объемное и содержит точные и лаконичные ответы на целый ряд проверочных работ Читать ещё Онлайн ответы из решебника по химии за 11 класс авторов Габриеляна ОС, Краснова ВГ 2015 года издания Пособие предусмотрено для проверки и активизации знаний и умений школьников Здесь представлены готовые решения на многочисленные упражнения, рассчитанные, как для текущего, так и для итогового контроля знаний учащихся Издание по своему объему достаточно объемное и содержит точные и лаконичные ответы на целый ряд проверочных работ Сборник с готовыми решениями состоит из следующих тем: «Предмет химии Вещества», «Относительная атомная и молекулярная массы», «Основные сведения о строении а Скрыть 6 ГДЗ: Контрольные и проверочные работы по химии yougdzcom › 2018 год Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Химия 9 класс : Контрольные и проверочные работы Авторы: Габриелян ОС, Краснова ВГ Издательство: Дрофа 2018 год Проверочные работы Проверочная работа №1 Характеристика химического элемента на основании его Читать ещё Химия 9 класс : Контрольные и проверочные работы Авторы: Габриелян ОС, Краснова ВГ Издательство: Дрофа 2018 год Задания : открыть список Контрольные работы Итоговая контрольная работа : Вариант 1 Вариант 2 Контрольная работа №1: Вариант 1 Вариант 2 Контрольная работа №2: Вариант 1 Вариант 2 Контрольная работа №3: Вариант 1 Вариант 2 Проверочные работы Проверочная работа №1 Характеристика химического элемента на основании его положения в Периодической системе: Вариант 1 Вариант 2 Скрыть 7 ГДЗ по химии 9 класс Габриелян Краснова контрольные GDZme › 9 класс › Химия › Краснова вг Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте ГДЗ по химии за 9 класс авторов Габриелян ОС, Красновой ВГ 2015 года издания Сборник по своему объему достаточно большой и Сюда вошли готовые ответы на контрольные работы , направленные на проверку и контроль знаний учащихся Читать ещё ГДЗ по химии за 9 класс авторов Габриелян ОС, Красновой ВГ 2015 года издания Сборник по своему объему достаточно большой и охватывает 41 параграф К ним прикреплены многочисленные таблицы и рисунки соответствующего стандарта Все готовые решения к упражнениям предусмотрены для базового и повышенного уровня подготовки Сюда вошли готовые ответы на контрольные работы , направленные на проверку и контроль знаний учащихся Все выполненные работы рассчитаны на текущий и итоговый контроль знаний школьников Скрыть 8 Химия 9 класс Контрольные и проверочные работы 11klasovru › …himiya…klass-kontrolnye…proverochnye… Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте 9 класс Контрольные и проверочные работы — Габриелян ОС cкачать в PDF Настоящее Пособие состоит из текстов контрольных и проверочных работ , соответствующих программе по Химии для 9 класса О С Габриеляна Читать ещё 9 класс Контрольные и проверочные работы — Габриелян ОС cкачать в PDF Настоящее Пособие состоит из текстов контрольных и проверочных работ , соответствующих программе по Химии для 9 класса О С Габриеляна Оно предназначено для проведения на уроках текущего и итогового контроля по основным темам курса Содержание Комбинированные контрольные работы Повторение основных вопросов курса 8 класса Введение в курс 9 класса 8 Вариант 1 8 Вариант 2 10 Рубрика: Химия / 9 класс Автор: Габриелян ОС Год: 2011 Для учеников: 9 класс Язык учебника: Русский Формат: PDF Скрыть 9 Химия Контрольные и проверочные работы 9 класс Решебник — смотрите картинки ЯндексКартинки › химия контрольные и проверочные работы 9 класс Пожаловаться Информация о сайте Ещё картинки 10 ГДЗ контрольные работы по химии 9 класс Габриелян LoveGDZcom › gdz/9-klass/himiya-9/kim-gabrielyan…9/ Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Решебник по химии за 9 класс авторов Габриеляна ОС, Красновой ВГ 2017 года издания Ответы на контрольные и проверочные работы комбинированы, что облегчает работу школьникам с разным уровнем подготовки Читать ещё Решебник по химии за 9 класс авторов Габриеляна ОС, Красновой ВГ 2017 года издания Ответы на контрольные и проверочные работы комбинированы, что облегчает работу школьникам с разным уровнем подготовки С первых страниц авторы вводят целый ряд заданий на повторения, готовые решения на подобные упражнения также отображены в пособии Издание разбито на блоки специально отведенных тем для изучения школьной программы Каждая из предложенных тем содержит 4 варианта работ , соответственно и ответы на них также разбиты на подгруппы Скрыть Тест по химии ( 9 класс ) на тему: тематические nsportalru › Школа › Химия › …raboty-po-khimii-9-klass Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Сайт – выбор пользователей Подробнее о сайте Контрольные работы разработаны в тестовой форме для тематического контроля по школьному курсу химии 9 класса к 9 класс стартовый контроль Повторение основных вопросов 8 класс Введение в курс 9 класс Читать ещё Контрольные работы разработаны в тестовой форме для тематического контроля по школьному курсу химии 9 класса к авторской программе ОС Габриэляна 9 класс стартовый контроль Повторение основных вопросов 8 класс Введение в курс 9 класс Вариант 1 Часть А Тестовые задания с выбором ответа (2 балла) 1 Химический элемент, имеющий схему строения атома +14 2, 8, 4, в Периодической системе занимает положение: 4-й период, главная подгруппа III группа Скрыть Вместе с « химия контрольные и проверочные работы 9 класс решебник » ищут: химия контрольные и проверочные работы к учебнику габриеляна 8 класс химия контрольные и проверочные работы к учебнику габриеляна 9 класс химия контрольные и проверочные работы к учебнику габриеляна 10 класс химия контрольные и проверочные работы к учебнику габриеляна 11 класс химия 8 класс контрольные и проверочные работы габриелян ос химия 9 класс контрольные и проверочные работы габриелян ос ответы химия контрольные и самостоятельные 9 класс к учебнику кузнецова химия контрольные работы химия контрольные и проверочные работы 8 класс химия 10 класс контрольные и проверочные работы габриелян ос ответы 1 2 3 4 5 дальше Bing Google Mailru Нашлось 182 млн результатов Дать объявление Регистрация Войти 0+ Браузер с Алисой поможет управлять компьютером Установить Закрыть Попробовать еще раз Включить Москва Настройки Клавиатура Помощь Обратная связь Для бизнеса Директ Метрика Касса Телефония Для души Музыка Погода ТВ онлайн Коллекции Яндекс О компании Вакансии Блог Контакты Мобильный поиск © 1997–2018 ООО «Яндекс» Лицензия на поиск Статистика Поиск защищён технологией Protect Алиса в ЯндексБраузере Слушает и выполняет голосовые команды 0+ Скачать
ГДЗ решебник по химии 9 класс Габриелян, Краснова тетрадь для контрольных и проверочных работ Дрофа
Химия 9 класс
Тип пособия: Тетрадь для контрольных и проверочных работ
Авторы: Габриелян, Краснова
Издательство: «Дрофа»
«ГДЗ по химии за 9 класс, контрольные и проверочные работы, Габриелян, Краснова (Дрофа)» было разработано высококвалифицированными специалистами. Авторы придерживались современной, но и не забывали о традиционной методики обучения. Они действительно постарались на славу и создали качественный решебник, способный во многом помочь юным исследователям.
Химия в 9 классе
На уроках и дома ученики будут выполнять самые разнообразные задания из учебника и рабочей тетради, чтобы понять все тонкости и нюансы следующих тем:
- Соединения кремния и их свойства.
- Углерод.
- Силикатные материалы.
- Аминокислоты. Белки.
- Углеводороды.
- Жиры.
На уроках редко у кого возникают вопросы, так как учитель находится рядом и всегда может подсказать, как решается то или иное уравнение. Трудности появляются при выполнении домашних заданий. Школьники остаются наедине со сложными задачами. Из-за обилия информации, получаемой на каждом уроке, возникает путаница в понятиях, формулах. Чтобы во всем разобраться и справиться с любым заданным на дом номером, ученики могут обратиться за помощью к сборнику верных ответов.
Как устроено ГДЗ
На страницах довольно объёмного издания можно найти не только выполненные контрольные и практические, но еще и:
- основные формулы;
- алгоритмы решения задач;
- развернутые авторские комментарии;
- инструкции по работе с оборудованием;
- заметки методистов.
Все это сопровождается схемами, рисунками, таблицами. Сама информация была неоднократно проверена авторами книги. К тому же она изложена простым и понятным языком. В ней сумеет разобраться каждый пользователь.
Родители и онлайн-справочник
Взрослые могут тоже ознакомиться с материалами «ГДЗ по химии за 9 класс, контрольные и проверочные работы, Габриелян О. С., Краснова В. Г. (Дрофа)». В книге они найдут правильные ответы на интересующие их вопросы. Они вспомнят все то, что когда-то сами учили в школе, а также выработают ценный навык грамотного объяснения сложных тем. И даже если подростки часто пропускают школу по болезни или другим уважительным причинам, то наверстать упущенное они с легкостью сумеют благодаря родителям и ценным материалам, содержащимся в данном учебно-методическом комплексе, который находится в электронном доступе. А это значит, что воспользоваться решебником можно в любое время, находясь где угодно. Самое главное — иметь под рукой электронное устройство с выходом в Интернет.
Итоговая контрольная работа
12К/р по вариантам №1
12К/р по вариантам №2
12К/р по вариантам №3
12П/р по вариантам №1
12П/р по вариантам №2
12П/р по вариантам №3
12П/р по вариантам №4
12П/р по вариантам №6
12П/р по вариантам №7
12П/р по вариантам №8
12П/р по вариантам №9
12П/р по вариантам №10
12П/р по вариантам №11
12П/р по вариантам №12
12П/р по вариантам №13
12П/р по вариантам №14
12П/р по вариантам №15
12П/р по вариантам №16
12П/р по вариантам №17
12П/р по вариантам №18
12П/р по вариантам №19
12П/р по вариантам №20
12П/р по вариантам №21
12П/р по вариантам №22
12П/р по вариантам №23
12П/р по вариантам №24
12П/р по вариантам №25
12П/р по вариантам №26
12П/р по вариантам №27
12П/р по вариантам №28
12П/р по вариантам №29
12П/р по вариантам №30
12П/р по вариантам №31
12П/р по вариантам №32
12Похожие ГДЗ Химия 9 класс
Итоговая контрольная работа по химии в 9 классе
Контрольная работа по химии (итоговая) в 9 классе
Базовый уровень
Часть А
1.(1 балл) Электронная оболочка атома самого активного неметалла IV группы
1) 2е, 8е, 5е 3) 2е, 4е
2) 2е, 8е, 6е 4) 2е, 8е, 4е
(1 балл) В ряду элементов натрий→магний→алюминий
увеличивается число электронных слоев;
увеличивается число электронов во внешнем слое;
уменьшается число протонов в ядре;
уменьшается степень окисления элементов в соединениях с кислородом.
3. (1 балл) Соединение с ковалентной неполярной связью образуется между атомами:
1) металлов и неметаллов; 2) разных неметаллов;
3) разных металлов; 4) одинаковых неметаллов
4.(1 балл) Основание, кислота, соль и кислотный оксид составляют группу веществ:
1) Сu(OH)
3) Fe(OH)3, Н2SiO3, Na2S, P2O5 4) Ва(OH)2, FeСl3, Н3РO4, СаО
5. (1 балл) С каждым из веществ, формулы которых ВаСl2, Сu(OH)2, Fe, будут взаимодействовать растворы:
1) сульфата цинка 2) гидроксида натрия
3) серной кислоты 4) нитрата магния
6. (1 балл) Схеме превращений S-2 → S0 соответствует уравнение химической реакции:
1) 2Н2S + О2 = S + Н2О 2) 2Н
3) Н2S + Рb(NO3)2 = РbS + 2HNO3 4) 2Na + S = Na2S
7) (1 балл) Углерод проявляет восстановительные свойства в реакции:
1) Тi + C = TiC 2) ZnO + C = Zn + CO
3) CO2 + Na2O = Na2CO3 4) CO2 + 2KOH = K2CO3 + H2O
8. (2 балла) Нерастворимое вещество образуется при взаимодействии растворов
1) карбоната натрия и азотной кислоты;
2) нитрата меди (II) и хлорида натрия;
3) гидроксида кальция и соляной кислоты;
4) гидроксида калия и сульфата железа (II)
9. (2 балла) В уравнении реакции между оксидом алюминия и азотной кислотой
коэффициент перед формулой азотной кислоты равен:
1) 1 2) 2 3) 3 4) 6
Напишите реакцию.
10. (2 балла) В соответствии с сокращенным ионным уравнением
Сu2+ + 2ОН— = Сu(OH)2 взаимодействует пара электролитов:
1) СuSO4 и Fe(OH)2 2) СuСl2 и Ва(OH)2
3) Сu2SO3 и NaОН 4) Сu2S и КОН
Напишите реакцию.
Часть Б
11. (3 балла) Используя метод электронного баланса, расставьте коэффициенты
в уравнении окислительно-восстановительной реакции. Укажите окислитель и
восстановитель.
t
C + HNO3 (конц.) →CO2 + NO2 + H2O
12. (3 балла) Напишите уравнения реакций, позволяющих осуществить
следующие превращения:
Mgà MgO à Mg(NO3)2 à Mg(OH)2
13. (5 баллов) Решите задачу.
При сливании 200 г 7,3 %-ной соляной кислоты с раствором карбоната натрия,
выделился газ объемом
1) 2, 24л 2) 4, 48л 3) 11, 2л 4) 44, 8л
Пояснительная записка
Контрольная работа (тест)
по курсу химии основной общеобразовательной школы
Базовый уровень
Учебник: О.С. Габриелян, «Химия – 9», 2015 г, Дрофа
Цель работы: проверить уровень усвоения программного материала по курсу химии основной общеобразовательной школы в 9 классе на базовом уровне.
Тест позволяет оценить уровни достижений и потенциальные возможности учащихся на базовом уровне.
Перечень структурных элементов содержания, являющихся объектами контроля:
№ | Содержание тестовых заданий |
1 | Общее представление о строении атома. |
2 | Зависимость свойств атомов от изменения атомного радиуса. |
3 | Типы химической связи. |
4 | Основные классы неорганических веществ. |
5 | Химические свойства классов неорганических веществ |
6 | Окислительно-восстановительные реакции. |
7 | Реакции ионного обмена. |
8 | Осуществление цепочки превращений по генетической связи. |
9 | Химическое уравнение. Расчет массы или объема продукта реакции по известной массе реагентов, с массовой долей вещества в растворе. |
Контрольная работа (тест) соответствует базовому минимуму содержания образования и рекомендована для осуществления контроля знаний учащихся. Тест содержит 13 заданий, на выполнение которых отводится 40 минут. Работа дифференцирована, часть А содержит задания №1-10 обязательного 1-2 уровня, часть Б задания №11-13 повышенного 3-го уровня сложности.
Распределение тестовых заданий по уровням трудности: 1 уровень — 30%, 2 уровень – 40%, 3 уровень — 30%.
Тестовые задания части А 1-го и 2-го уровня сложности с выбором ответа, предусматривает выбор одного правильного ответа на каждый вопрос.
Задания части А с №1 по № 7 оцениваются по 1 баллу за каждое задание, задания с № 8 по №10 оцениваются 2-мя баллами за каждое задание. Формулировка вопросов теста соответствует формулировкам тестовых вопросов государственной итоговой аттестации по химии.
Тестовые задания 3 уровня сложности части Б содержат задания, которые предусматривают проведение расчетов по формулам и уравнениям реакций, осуществление переходов по генетическим цепочкам химических превращений, метод электронного баланса в ОВР.
Задания части Б с №11 по №12 оцениваются 3-мя баллами за каждое задание, задание №13 оценивается гораздо более высоким баллом — 5 баллов. В этой части оцениваются не только полнота и правильность выполнения (максимальный балл), но и отдельные элементы.
Максимальное количество баллов за выполненную работу – 24 балла.
При выполнении работы можно пользоваться Периодической системой химических элементов Д. И. Менделеева, таблицей растворимости солей, кислот и оснований, электрохимическим рядом напряжений металлов и непрограммируе-мым калькулятором.
Критерии оценивания:
Оценки выставляются в соответствии с полностью выполненным заданием избранного уровня сложности.
Примерная шкала перевода тестовых баллов в ранговую шкалу оценок (в пятибалльную систему оценки):
0– 7 — «2» (0-32 %)
8 – 13 — «3» ( 33- 54)
14 – 19 — «4» (55-79%)
20 – 24 — «5» (80-100%)
Эталонные бланки ответов:
Часть А
№ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
1 | + | |||||||||
2 | + | + | + | |||||||
3 | + | + | + | |||||||
4 | + | + | + |
Задание №8
2КОН+FeSO4=К2SO4 + Н2О
Задание №9
Al2O3 + 6HNO3= 2Al(NO3)3 + 3h3O
Задание №10
СuСl2 + Ва(OH)2 =Cu(OH)2 + BaCl2
Часть Б
Задание №11
t
C + 4HNO3 (конц.) →CO2 + 4NO2 + 2H2O
C – 4е →C 4 1 – восстановитель C
N + 1е→N 1 4 – окислитель N
Задание №12
Mgà MgO à Mg(NO3)2 à Mg(OH)2
2 Mg + О2 = 2 MgO
MgO + 2HNO3= Mg(NO3)2 + Н2О
Mg(NO3)2 + 2NaОН = Mg(OH)2 +2Na NO3
Задание №13
Дано: Решение:
гдз по контрольной работе по химии 9 класс
гдз по контрольной работе по химии 9 класс
Вирусов нет:
Ответы@Mail.Ru: …и проверочные работы по химии 9 класс к уч…••• Помогите найти гдз без скачивания контрольные и проверочные работы по химии 9 класс к уч Габриеляна (Габриелян, Березкин. Анна Стяжкина Ученик (130), закрыт 9 месяцев назад. Решебник по контрольным работам химия 9класс / aejorb / F5 Похожих файлов: 24. Главная > Блоги > nukec > Гдз по контрольной работе по химии 9 класс. … Контрольные работы в новом формате. и др. Она решебник по контрольным и проверочным работам по химии 9 класс по габриеляну каком. Химия. 9 класс. Контрольные и проверочные работы. Габриелян… Настоящее Пособие состоит из текстов контрольных и проверочных работ, соответствующих программе по Химии для 9 класса О. С. Габриеляна. … ГДЗ по химии. Студентам- книги. Рефераты. …контрольных и самостоятельных работ по химии за 9 класс… ГДЗ по химии — Решение контрольных и самостоятельных работ по химии за 9 класс к пособию. … 7, 8, 9, 10, 11 класс. Химия. В этом разделе можно найти ссылки на готовые домашние задания (ГДЗ) по химии. Химия, 9 класс, Контрольные и проверочные работы, Габриелян… 4 вересня 2012Настоящее Пособие состоит из текстов контрольных и проверочных работ, соответствующих программе по Химии для 9 класса О. С. Габриеляна. Оно предназначено для проведения на уроках текущего и итогового контроля по основным темам курса. ГДЗ — …задания. Химия. 9 класс. Контрольные работы…. ГДЗ — готовые домашние задания. Химия. 9 класс. Контрольные работы. … Решение контрольных и проверочных работ по химии к пособию «Химия. Гдз по химии 9 класс Габриелян О. С., Березкин П. Н., Ушакова… Химия, 9 класс → Готовое домашнее задание (ГДЗ) по химии «Контрольные работы к учебнику Габриеляна О.С. 9 класс.» Решение контрольных и проверочных работ по химии к пособию «Химия. ГДЗ по хими 9 класс Габриелян — решебник, ответы онлайн. В этом случае на помощь и приходит гдз по химии за 9 класс Габриеляна. … Вы должны понимать, что глупое списывание с решебника неизбежно приведет к плачевным результатам на контрольных. …по химии контрольные и проверочные работы 9класс… Пусть себе русский язык 5 класс бабайцева кому хотят. Гдз по химии 10 кузнецова, он резко обернулся вошел в свой загончик, гдз по химии 10 кузнецова еще раз выполнение … Решебник по химии контрольные и проверочные работы 9класс габриелян 2007года скачать бесплатно. Скачать контрольные и проверочные работы по химии, 9 класс… Добро пожаловать на reshebka.ru! Здесь вы можете бесплатно скачать решебник, гдз, ответы к большому количеству учебников учебникам. Кроме этого на нашем сайте можно скачать учебники по большинству предметов.
контрольные и проверочные работы к учебнику О. С. Габриеляна ОНЛАЙН
Химия. 9 класс : контрольные и проверочные работы к учебнику О. С. Габриеляна «Химия. 9 класс» / О. С. Габриелян, П. Н. Березкин, А. А. Ушакова и др. — 9-е изд., стереотип. — М., 2011. — 174, [2] с.
Настоящее пособие состоит из текстов контрольных и проверочных работ, соответствующих программе по химии для 9 класса О. С. Габриеляна. Оно предназначено для проведения на уроках текущего и итогового контроля по основным темам курса.
Содержание
Комбинированные контрольные работы
Повторение основных вопросов курса 8 класса. Введение в курс 9 класса 8
Вариант 1 8
Вариант 2 10
Вариант 3 12
Вариант 4 15
Металлы 17
Вариант 1 17
Вариант 2 19
Вариант 3 21
Вариант 4 24
Неметаллы 26
Вариант 1 26
Вариант 2 28
Вариант 3 29
Вариант 4 31
Галогены 33
Вариант 1 33
Варианте 35
Вариант 3 37
Вариант 4 39
Подгруппа кислорода 41
Вариант 1 41
Вариант 2 43
Вариант 3 45
Вариант 4 47
Подгруппа азота 49
Вариант 1 49
Вариант 2 51
Вариант 3 52
Вариант 4 54
Подгруппа углерода 56
Вариант 1 56
Вариант 2 58
Вариант 3 60
Вариант 4 62
Итоговая контрольная работа по теме «Неметаллы» 64
Вариант 1 64
Вариант 2 66
Вариант 3 68
Вариант 4 70
Органические вещества 72
Вариант 1 72
Вариант 2 75
Вариант 3 77
Вариант 4 79
Количественные отношения в химии 81
Вариант 1 81
Вариант 2 83
Вариант 3 84
Вариант 4 86
Генетическая связь между классами неорганических соединений 88
Вариант 1 88
Вариант 2 90
Вариант 3 92
Вариант 1 94
Итоговая работа за курс основной школы 96
Вариант 1 96
Вариант 2 97
Вариант 3 99
Вариант 4 101
Разноуровневые контрольные работы
Характеристика элемента по его положению в Периодической системе химических элементов Д. И. Менделеева. Химическое равновесие 104
Первый уровень 104
Вариант 1 104
Вариант 2 105
Вариант 3 106
Вариант 4 107
Второй уровень 108
Вариант 1 108
Вариант 2 108
Вариант 3 109
Вариант 4 109
Третий уровень 110
Вариант 1 110
Вариант 2 111
Вариант 3 Ill
Вариант 4 112
Металлы 113
Первый уровень 113
Вариант 1 113
Вариант 2 113
Вариант 3 114
Вариант 4 114
Второй уровень 115
Вариант 1 115
Вариант 2 115
Вариант 3 116
Вариант 4 117
Третий уровень 117
Вариант 1 117
Вариант 2 118
Вариант 3 118
Вариант 4 119
Неметаллы 120
Первый уровень 120
Вариант 1 120
Вариант 2 121
Вариант 3 121
Вариант 4 122
Второй уровень 123
Вариант 1 123
Вариант 2 124
Вариант 3 124
Вариант 4 125
Третий уровень 126
Вариант 1 126
Вариант 2 126
Вариант 3 127
Вариант 4 128
Органические вещества 129
Первый уровень 129
Вариант 1 129
Вариант 2 129
Вариант 3 130
Вариант 4 131
Второй уровень 131
Вариант 1 131
Вариант 2 132
Вариант 3 133
Вариант 4 134
Третий уровень 134
Вариант 1 134
Вариант 2 136
Вариант 3 136
Вариант 4 137
Итоговая контрольная работа за курс основной школы 1З8
Первый уровень 138
Вариант 1 138
Вариант 2 139
Вариант 3 140
Вариант 4 141
Второй уровень 142
Вариант 1 142
Вариант 2 143
Вариант 3 144
Вариант 4 145
Третий уровень 146
Вариант 1 146
Вариант 2 147
Вариант 3 148
Вариант 4 149
Проверочные работы
Положение металлов в ПСХЭ, физические свойства, сплавы 151
Общие химические свойства металлов 153
Щелочные и щелочноземельные металлы 154
Алюминий и его соединения 155
Железо и его соединения 157
Неметаллы: атомы и простые вещества. Кислород, озон, воздух. Химические элементы в клетках живых организмов 158
Галогены 160
Кислород 161
Сера. Серная кислота 162
Азот. Аммиак. Соли аммония 164
Азотная кислота. Нитраты 165
Углерод и кремний 166
Углеводороды 168
Кислородсодержащие органические соединения 169
Контрольная работа по химии «Металлы» (9 класс)
Контрольная работа по химии для 9 класса. Тема «Металлы». подготовила учитель химии Казакова Татьяна Геннадьевна 2018 Настоящее пособие является комбинированной контрольной работой, соответствующей программе по химии для 9 класса О. С. Габриеляна. Оно предназначено для проведения на уроках итогового контроля по теме «Металлы», а также для тренинга в ходе повторения при подготовке к ОГЭ. Время выполнения работы 40 минут. Число вариантов 4 . Работа состоит из двух частей: часть А – тестовые задания с выбором одного правильного ответа на каждый вопрос или на соотнесение; часть Б – задания со свободной формой ответа, которые предусматривают, дополнение пропущенного, написание уравнений химических реакций, расчёты по формулам и уравнениям реакций. Обработка результатов контрольной работы. Работа оценивается в 21 балл .Тестовые ответы части «А» оцениваются одним баллом каждое. В части «Б» количество баллов определяется уровнем сложности задания. Их оценка проводится не только за полностью правильный ответ, но и за выполнение определённых этапов и элементов задания. Это отражено в правилах проверки. Примерная шкала перевода в пятибальную систему оценки соответствует рекомендациям автора программы О. С. Габриеляна в процентном выражении применительно к общему числу баллов 21. 9 класс. Контрольная работа «Металлы» Вариант 1 Часть А. Тестовые задания с выбором одного ответа. 1. (1 балл). Распределение электронов в атоме магния: а)2,4 ; б)2,8,8,2 ; в)2,8,2 ; г)2,2 ; 2. (1 балл). Тип химической связи в цинке: а) ионная; б) ковалентная полярная; в) ковалентная неполярная; г) металлическая; 3. (1 балл). Радиус атома элементов 3го периода с увеличением заряда ядра от щелочного металла к галогену: а) изменяется периодически; б) не изменяется; в) увеличивается ; г) уменьшается; 4. (1 балл). Наиболее энергично реагирует с водой: а) калий ; б) кальций ; в) скандий ; г) железо. 5. (1 балл). Гидроксид бериллия взаимодействует с веществом, формула которого: а) KOH ; б) NaC l(рр) ; в) KNO3(рр) ; г)BaSO4. Часть Б. Задания со свободным ответом. 6. (8 баллов). Составьте уравнения реакций по схеме, одно из них в ионном виде, а другое в окислительновосстановительном: t Х +h3SO4 У +NaOH Z +HСL CuCL2 Cu(OH)2 7.(4 балла) Дайте характеристику атому натрия (протоны, электроны, нейтроны,расположение в ПС, расположение электронов в атоме, степень окисления, свойства оксида и гидроксида натрия). +Zn 8. (4 балла). Рассчитайте массовые доли элементов в сульфате калия. Вариант 2 Часть А. Тестовые задания с выбором одного ответа. 1. (1 балл). Распределение электронов в атоме алюминия: а)2,1 ; б)2,8 ; в)2,8,1 ; г)2,8,3 ; 2. (1 балл). Простое вещество с наиболее ярко выраженными металлическими свойствами: а) бериллий; б) кальций; в) магний; г) стронций; 3. (1 балл) .Атом алюминия отличается от иона алюминия: а) зарядом ядра; б) радиусом частицы; в) числом протонов; г) числом нейтронов; 4. (1 балл). С разбавленной серной кислотой не взаимодействует: а) железо; б) алюминий; в) золото; г) цинк. 5. (1 балл) .Ряд в котором все вещества реагируют с цинком: а) HCl, NaOH , h3SO4; б) CO, HCl, HNO3; в) KOH,HgO,h4PO4 ; г)h3 ,O2 ,CO2. Часть Б. Задания со свободным ответом. 6. (8 баллов). Составьте уравнения реакций по схеме, одно из них в ионном виде, а другое в окислительно восстановительном: Al(OH)3 AlCl3 Al(OH)3 Al2O3 Al 7. (4 балла). Дайте характеристику атому кальция (протоны, электроны, нейтроны,расположение в ПС, расположение электронов в атоме, степень окисления, свойства оксида и гидроксида кальция). 8. (4 балла). Рассчитайте массовые доли элементов в сульфате кальция. Вариант 3 Часть А. Тестовые задания с выбором одного ответа. 1. (1 балл). Распределение электронов в атоме лития: а)2,1 ; б)2,2 ; в)2,3 ; г)2,8,1 ; 2. (1 балл). Тип химической связи у алюминия: а) ионная; в) ковалентная неполярная; б) ковалентная полярная; г) металлическая; 3. (1 балл). Радиус атома элементов главной подгруппы с увеличением заряда ядра а) изменяется периодически; б) не изменяется; в) увеличивается ; г) уменьшается; 4. (1 балл). Наиболее энергично реагирует с водой: а) барий ; б) кальций ; в) магний; г) стронций. 5. (1 балл). Гидроксид бериллия взаимодействует с веществом, формула которого: а) BaSO4; б) NaOH ; в) h3O ; г)KCl(рр). Часть Б. Задания со свободным ответом. 6. (8 баллов). Составьте уравнения реакций по схеме, одно из них в ионном виде и окислительно восстановительном: Zn +O2 X +HCl y +NaOH Z t ZnO 7. 4 балла). Дайте характеристику атому алюминия(протоны, электроны, нейтроны,расположение в ПС, расположение электронов в атоме, степень окисления, свойства оксида и гидроксида алюминия). 8.(4 балла). Рассчитайте массовые доли элементов в нитрате калия. Вариант 4 Часть А. Тестовые задания с выбором одного ответа. 1. (1 балл). Распределение электронов в атоме кальция: а)2,8,2 ; б)2,8,4; в)2,8,8,2 ; г)2,2 ; 2. (1 балл). Простое вещество с наиболее ярко выраженными металлическими свойствами: а) алюминий; б) бор; в) галлий; г) индий; 3. (1 балл). Атом кальция отличается от иона кальция: а) зарядом ядра; б) числом электронов на внешнем энергетическом уровне; в) числом протонов; г) числом нейтронов 4. (1 балл). С соляной кислотой не реагирует: а) алюминий ; б) магний; в) серебро; г) цинк. 5. (1 балл). Ряд, в котором все вещества реагируют с цинком: а) HCl, CO2, CO; б) Cl2, CuCl2 , HCl; в) h3, O2, CaO; г) SiO2, HCl, S. Часть Б. Задания со свободным ответом. 6. (8 баллов). Составьте уравнения реакций по схеме, одно из них в ионном виде и окислительно восстановительном: Са СаО Са(ОН)2 СаСО3 СаCl2 7. (4 балла). Дайте характеристику атому магния(протоны, электроны, нейтроны,расположение в ПС, расположение электронов в атоме, степень окисления, свойства оксида и гидроксида магния). 8. (4 балла). Рассчитайте массовые доли элементов в хлориде железа(I I I). 9 класс Контрольная работа «Металлы». Правила проверки, кодификаторы ответов. ЧастьА (5 баллов) № вопрос а Баллы 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 Кодификаторы ответов части А. Часть Б( 20 баллов) 6 7 4 8 4 8 № вопроса 1 2 3 4 5 1вариант 2вариант 3 вариант 4 вариант В Г Г А А Г Г Г В А А Г В А Б В Г Б В Б Проверка заданий части Б (поэтапно) Задание 6(алгоритмическое): 1б х 4ур. + 2б за ионное ур.+ 2б за ОВР = 8 баллов Задание7(поисковое) работа с периодической системой химических элементов Д.И.Менделеева = 4 балла Задание 8: 1бсоставление формулы + 1б нахождение молекулярной массы вещества + 2б за нахождение массовых долей химических элементов в веществе = 4 балла. Оценочная шкала : % выполнения 0 33% 34 61% 62 89% баллы 0 6 7 12 13 18 отметка «2» « 3» «4» 90 100% 19 21 «5» Список использованной литературы. Габриелян О.С. Программа курса химии для 8 11классов общеобразовательных учреждений. М.: « Дрофа » 2014. Габриелян О.С. Химия. 9 класс: учебник для общеобразовательных учреждений М.: Дрофа, 2013. Габриелян О.С. Химия 89 классы: Методическое пособие. М. : Дрофа, 2014. Габриелян О.С. Настольная книга учителя химии 9 класс М.: Дрофа, 2016. Габриелян О.С. Контрольные и проверочные работы. 9 класс. М.: Дрофа 2016 Габриелян О.С. Задачи по химии и способы их решения М.: Дрофа 2015. Габриелян О.С. Изучаем химию М.: Дрофа 2015. Габриелян О.С. , Воскобойникова Н.П. Химия в тестах, задачах, упражнениях 8 – 9 классы. Дрофа, 2015 Габриелян О.С., . Рунов Н.Н, Толкунов В.И. Химический эксперимент в школе М.: Дрофа, 20014.
Управляемая Erg программа транскрипции контролирует лимфопоэз В-клеток
Abstract
Развитие В-лимфоида инициируется дифференцировкой гемопоэтических стволовых клеток в предшественники, коммитированные по клону, в конечном итоге генерируя зрелые В-клетки. Этот строго регулируемый процесс генерирует клональное иммунологическое разнообразие за счет рекомбинации генных сегментов иммуноглобулинов V, D и J. Хотя были определены несколько факторов транскрипции, которые контролируют развитие В-клеток и рекомбинацию V (D) J, то, как эти процессы инициируются и координируются в точную регуляторную сеть, остается плохо изученным.Здесь мы показываем, что ген транскрипционного фактора ETS ( Erg ) важен для ранней дифференцировки B-лимфоидов. Erg инициирует транскрипционную сеть, включающую гены, определяющие клон B-клеток, Ebf1 и Pax5 , которые непосредственно стимулируют экспрессию ключевых генов, участвующих в рекомбинации V (D) J и формировании рецептора B-клеток. Комплементация дефицита Erg продуктивно перестроенным геном иммуноглобулина спасла развитие линии B, демонстрируя, что Erg является важным и стадийно-специфическим регулятором генной регуляторной сети, контролирующей B-лимфопоэз.
Тематические термины: VDJ-рекомбинация, Генная регуляция в иммунных клетках, Лимфопоэз, В-клетки
Введение
Факторы транскрипции имеют решающее значение для контроля экспрессии генов, которые регулируют развитие В-клеток. Важность специфических факторов транскрипции B-лимфоидов подчеркивается фенотипом моделей нокаута генов. Нарушение спецификации линии B-клеток от мультипотенциальных предшественников происходит при делеции Ikzf1 1 и Spi1 ( Pu.1) 2 , в то время как делеция Tcf3 (E2A) 3 и Foxo1 4 приводит к отказу развития В-клеток из общих лимфоидных предшественников (CLP). Остановка развития позже в B-лимфопоэзе наблюдается при делеции Ebf1 и Pax5 на стадиях pre – proB и proB, соответственно 5 , 6 . Этот последовательный паттерн остановки развития, связанный с потерей функции гена, наряду с исследованиями эктопической комплементации генов 2 , профилированием экспрессии генов 7 и анализом связывания факторов транскрипции с генами-мишенями, поддерживают модели, в которых факторы транскрипции организованы в иерархические сети регуляции генов, которые определяют судьбу, приверженность и функцию B-лимфоидной линии 8 .
Два фактора транскрипции, которые играют множественные роли во время развития B-клеток, — это Ebf1, член семейства COE, и Pax5, член семейства PAX. В то время как Ebf1 и Pax5, как было показано, связываются с регуляторными элементами генов общего набора генов-мишеней взаимозависимым образом на более поздних стадиях фиксации линии B 9 , оба проявляют разные роли на разных стадиях развития. Было высказано предположение, что Ebf1 формирует транскрипционную сеть с E2A и Foxo1 в CLP, что, по-видимому, важно для определения судьбы ранних B-лимфоидов 10 , в то время как на более поздних стадиях B-лимфопоэза Ebf1 действует как пионерный фактор транскрипции, который регулирует доступность хроматина. в подмножестве генов, совместно связанных с Pax5 11 , а также с самим промотором Pax5 12 .Pax5, напротив, регулирует геномную организацию В-клеток 13 , включая локус тяжелой цепи иммуноглобулина (Igh) во время рекомбинации V (D) J, взаимодействуя с такими факторами, как CTCF 14 , а также как трансактивирующий 15 и способствующий активности комплекса гена, активирующего рекомбиназу (Rag) 16 .
Однако неясно, как эти различные функции Ebf1 и Pax5 координируются на разных стадиях развития B-лимфоида.В частности, было бы важно обеспечить координированную коэкспрессию Ebf1 и Pax5 до контрольной точки до BCR, чтобы Ebf1 и Pax5 координировали гены-мишени, необходимые для V (D) J. рекомбинация и образование комплекса пре-В-клеточного рецептора оптимально экспрессируются 9 .
Здесь мы показываем, что ген, связанный с ETS ( Erg ), член семейства транскрипционных факторов ETS, играет эту жизненно важную роль в B-лимфопоэзе.Делеция Erg из ранних лимфоидных предшественников приводила к остановке развития на ранней стадии пре-проВ-клеток и потере рекомбинации V H с DJ H . Профилирование экспрессии генов, анализ связывания ДНК и исследования комплементации продемонстрировали, что Erg является регулятором транскрипции, который лежит на вершине Erg-зависимой регуляторной сети генов Ebf1 и Pax5, начинающейся в pre-proB клетках. Эта взаимозависимая транскрипционная сеть напрямую контролирует экспрессию генов, активирующих рекомбиназу Rag1 / Rag2 и генов репарации ДНК Lig4 и Xrcc6 , необходимых для рекомбинации V (D) J, а также экспрессию компонентов пре- Комплекс BCR, такой как CD19, Igll1, Vpreb1 и Vpreb2 .Взятые вместе, мы определили важную Erg-опосредованную сеть транскрипционных факторов, необходимую для регуляции экспрессии Ebf1 и Pax5 , которая в высшей степени специфична для стадий во время раннего развития B-лимфоидов.
Результаты
Erg необходим для развития B-клетокОсновываясь на предшествующей работе по определению роли фактора транскрипции Erg в регуляции гемопоэтических стволовых клеток (HSC) 17 и мегакариоцит-эритроидных спецификации 18 , мы стремились определить, играет ли Erg роль в других гемопоэтических клонах.Экспрессия Erg в гемопоэзе взрослых была сначала исследована на мышах, несущих первый репортерный аллель Erg tm1a (KOMP) wtsi ( Erg KI ) (рис.). В соответствии с известной ролью Erg в гематопоэзе 17 — 21 , значительная экспрессия LacZ , управляемая эндогенным промотором Erg , наблюдалась в HSC и мультипотенциальных клетках-предшественниках, а также в гранулоцитах. — популяции макрофагов и мегакариоцитов-эритроидных предшественников со снижающейся активностью, сопровождающей созревание эритроидов (рис.с определениями исследованных клеток, приведенными в дополнительной таблице 1 , и репрезентативными графиками проточной цитометрии на дополнительном рисунке 1 ). В других клонах транскрипция из локуса Erg была очевидна в CLP, всех лимфоидных предшественниках лимфоидных и B-клеточно-предвзятых клеток, а также в коммитированных клетках пре-proB, proB и preB и дважды отрицательных тимусных T- субпопуляции лимфоидных клеток со снижением транскрипции с более поздним созреванием В- и Т-клеток (рис.).Мы подтвердили эти результаты с помощью анализа РНК-секвенирования (RNA-seq), который показал значительную РНК Erg в клетках pre-proB, proB и preB (рис.). Эта подробная характеристика экспрессии Erg повысила вероятность того, что Erg играет специфичную для стадии функцию на ранних стадиях развития лимфоидных клонов.
Экспрессия и целенаправленное нарушение лимфопоэза Erg . a Дикий тип ( Erg) , Erg tm1a (KOMP) wtsi lacZ reporter ( Erg KI ), условный ( Erg000 fl) а также аллели с удаленными рекомбиназой Cre ( Erg Δ ) с экзонами, сайтами распознавания рекомбиназ Cre (loxP) и Flp (frt).IRES, внутренний сайт входа в рибосомы; Neo, кассета с устойчивостью к неомицину. б Транскрипционная активность Erg за счет экспрессии lacZ в популяциях клеток Erg KI костного мозга (BM) и тимуса (см. «Методы» и дополнительный рисунок 1 , дополнительную таблицу 1 ). Среднее отношение интенсивности флуоресценции (MFI) ± стандартное отклонение от Erg KI ( n = 4) до C57BL / 6 ( n = 4) биологически независимых образцов. P adj <0,028 по двустороннему непарному тесту Стьюдента t , скорректированному с использованием модификации Холма для множественного тестирования для каждой популяции, кроме BM Ter119 + и NK1.1 + , и DP тимуса, CD4 + CD8 — и CD8 + CD4 — популяции ( P прил. > 0,05). c Типичные графики проточной цитометрии: BM pre – proB (синий), proB (зеленый), preB (оранжевый) и контроль дикого типа (черный) B220 + IgM — IgD — (слева) с lacZ MFI (справа). d Экспрессия Erg с помощью RNA-seq (среднее ± стандартное отклонение, количество фрагментов на килобазу транскрипта на миллион отображенных считываний, FPKM) в Erg fl / fl pre-proB, proB и preB клетках ( n = 2 биологически независимые образцы) e Erg RNA-seq (FPKM) в Erg fl / fl и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ 0005 pre – pro nB = 2 биологически независимых образца; * двустороннее скорректированное значение edgeR P для множественных сравнений = 1.41e − 5, дополнительные данные 1 ) и Erg locus RNA-seq в Erg fl / fl (WT) и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ (Erg KO, розовая подсветка отсутствует экспрессия) в клетках pre – proB, h4K4me3 и h4k27ac ChIP-seq в клетках proB дикого типа и доступность хроматина (ATAC-seq, синий). f Erg fl / fl ( n = 4) и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ( n = 7) биологически независимых образцов: B220 + B-клетки, Gr1 + Mac1 + миелоидные клетки и CD3 + Т-клеточные анализы крови , среднее ± стандартное отклонение; * P = 6.6e − 8 по двустороннему непарному тесту Стьюдента t (вверху слева). B-лимфоидные популяции в Erg fl / fl ( n = 9) и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ 06 = 100005 n
06 ) биологически независимые образцы: BM как отношение количества клеток к
Erg fl / fl (среднее ± стандартное отклонение, внизу слева, см. дополнительную таблицу 1 ). * P прил. = 3.5e − 6 (B220 + ), 3.5e − 3 (B220 + CD19 —), 4.9e − 10 (B220 + CD19 + ), 3.0e − 10 (IgM + IgD + ), 3.5e − 3 (IgM — , IgD — ), 1.7e − 2 (pre – proB), 4.0e − 2 (proB), 1.7e − 2 (preB) по формуле Стьюдента. хвостовой непарный тест t , исправленный с использованием модификации Холма для многократного тестирования. Типичные графики проточной цитометрии (справа) с указанием среднего процента жизнеспособных клеток. Исходные данные представлены в файле исходных данных.
Чтобы определить, играет ли Erg роль в лимфоидном развитии, мышей, несущих floxed аллели Erg ( Erg fl / fl , рис.), Скрещивали с трансгенными мышами Rag1Cre , которые эффективно удаляли аллели Floxed. в CLP и T- и B-коммитированных клетках-предшественниках 22 , но имеют нормальное лимфоидное развитие (дополнительная фиг. 2a ). В результате получается Rag1Cre T / + ; У мышей Erg Δ / Δ специфически отсутствует Erg на всем протяжении лимфопоэза (рис., Дополнительный рисунок 2b ). В то время как количество эритроцитов, тромбоцитов и других лейкоцитов было нормальным, Rag1Cre T / + ; У мышей Erg Δ / Δ обнаружен дефицит циркулирующих лимфоцитов (дополнительная таблица 2 ). Это было связано с конкретным отсутствием В-клеток; количество циркулирующих Т-клеток и предшественников тимуса не уменьшилось (фиг. , , дополнительная фиг. 2c ).
В-клетки продуцируются из клеток-предшественников костного мозга, которые проходят регулируемые стадии развития.В-лимфоидное развитие было заметно нарушено в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ мышей с proB, preB, незрелыми B и зрелыми рециркулирующими B-клетками (фракции Харди C-F, определенные в дополнительной таблице 1 ) заметно уменьшились в количестве или практически отсутствуют (рис.). Блок развития B-лимфоида был четко очевиден на стадии pre-proB (фракция Hardy A-to-B) с избыточным количеством этих клеток, присутствующих в костном мозге.
Erg возмущает дефицит V H -to-DJ H рекомбинацияДля дальнейшей характеристики онтогенетического блока линии B в Rag1Cre T / + ; Мышей Erg Δ / Δ , клетки костного мозга B220 + исследовали на предмет соматической рекомбинации Igh .В отличие от клеток из контроля Erg fl / fl мышей, B220 + клеток из Rag1Cre T / + ; Мыши Erg Δ / Δ не претерпели значительной реаранжировки гена тяжелой цепи иммуноглобулина V H -to-DJ H , хотя рекомбинация D H -to-J H была относительно сохранена (рис. .).
Локус тяжелой цепи иммуноглобулина у мышей Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ мышей.a Геномная ПЦР с использованием вырожденных праймеров (приблизительные местоположения указаны красными стрелками) к локусу Igh V H J558, V H 7183, V H Q52 сегментов для обнаружения V H для DJ H (верхняя панель) и D H — J H (средняя панель) рекомбинация с элементами управления загрузкой Mu0 (нижняя панель) в клетках BM B220 + . Представитель трех независимых экспериментов. b Внутрихромосомное расстояние между дистальным V H J558 и проксимальным V H 7183 V H семей путем флуоресцентной гибридизации in situ с ( n = 129) Igh аллелей из Erg fl / fl и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клетки proB и клетки pre – proB, соответственно. P Значение по двустороннему непарному тесту Стьюдента t . c Дифференциальные дальнодействующие взаимодействия хроматина, идентифицированные с помощью высокопроизводительного анализа конформации хроматина (in situ Hi-C) локуса Igh между клетками C57BL6 (дикого типа) proB и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клетки pre-proB с показателями взаимодействий в локусе Igh . Сниженные дальнодействующие взаимодействия в предшественниках В-клеток Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ показаны синими дугами.Связывание Erg посредством ChIP (черные полосы) через локус тяжелой цепи (розовая заливка), как указано. Указано расположение 3′-регуляторной области (3’RR, красные столбцы), энхансера iEμ (Eμ, фиолетовая полоса) и PAIR доменов (зеленые столбцы). d Схематическое изображение энхансера iEμ с делецией ядра 220 п.н. cEμ Δ и делецией μA Δ (вверху). Показатели периферической крови на B220 + , B220 + CD19 + и IgM + IgD + клеток в cEμ Δ / + ( n = 8), cEμ Δ / Δ ( n = 3) и мкА Δ / Δ ( n = 7) мышей (внизу).* P adj значение 2.6e − 5 (B220 + ), 1.8e − 5 (B220 + CD19 + ) и 9.0e − 6 (IgM + IgD + ) по Двусторонний непарный тест Стьюдента t , сравнивающий контроли cEμ Δ / Δ и cEμ Δ / + с поправкой Бенджамини Хохберга для множественного тестирования. Исходные данные представлены в файле исходных данных.
Далее мы более подробно исследовали аномалии, лежащие в основе рекомбинации Igh .Сначала мы провели флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) в локусе Igh , чтобы измерить внутрихромосомное расстояние между дистальными генами семейства V H J558 и проксимальным V H 7183 V H в качестве специфичного для клеточной стадии сокращения. локуса Igh важен для эффективной рекомбинации V (D) J 23 . Это показало, что pre-proB клетки из Rag1Cre T / + ; У мышей Erg Δ / Δ сокращение локуса было снижено по сравнению с контрольными мышами Erg fl / fl (рис.). Чтобы оценить, присутствуют ли также другие структурные пертурбации в локусе Igh , был выполнен высокопроизводительный захват конформации хроматина (in situ Hi-C). Мы выполнили дифференциальный анализ данных и выявили снижение дальнодействующих взаимодействий по локусу Igh в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre – proB клеток по сравнению с Erg fl / fl и контролями C57BL / 6 (рис.). Поскольку эти результаты также наблюдались в Pax5 дефицитных клетках 13 , 23 , отражая прямую роль Pax5 в координации структуры локуса Igh 14 , мы картировали Erg сайты связывания в локусе Igh с помощью ChIP-seq. В отличие от четко определенного связывания Pax5 с Pax5- и CTCF-ассоциированными межгенными областями (PAIR-доменами) 14 , 16 , связывание Erg с семействами V H не было идентифицировано по локусу (рис., Дополнительный рисунок 3a ). Таким образом, структурная роль Erg в поддержании множественных дальнодействующих взаимодействий и рекомбинации V H с DJ H в нормальных клетках маловероятна и не может объяснить их отсутствие в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre – proB клетки. Анализ доступности локуса Igh с помощью ATAC-seq не выявил каких-либо существенных различий между Erg-дефицитными pre-proB, proB и preB клетками и контрольными клетками (дополнительный рис. 3a ), предполагая, что потеря доступности локуса либо из-за регуляции хроматина 24 , либо из-за позиционирования периферических ядер с сайленсингом ламино-ассоциированного домена 25 не были механизмами, которые могли бы адекватно объяснить уменьшение сокращения локуса Igh , уменьшение дальнодействующих взаимодействий и потеря рекомбинации V H с DJ H в отсутствие Erg .
Потенциальная роль семейства транскрипционных факторов ETS в регуляции перестройки иммуноглобулиновых генов была предложена в результате экспериментов по изучению энхансера iEμ: комплексного цис- -активирующего элемента, расположенного в интронной области между присоединяющейся областью Igh (J H ) и константная область (Cμ), участвующие в эффективной рекомбинации V H с DJ H и транскрипции цепи Igh 26 .Предполагается, что энхансер iEμ зарождается в трехпетлевом домене на 3′-конце Igh , взаимодействуя с областью V H , чтобы сопоставлять 5′- и 3′-концы локуса тяжелой цепи 27 . Erg и его ближайший родственник член семейства ETS, Fli1, как было показано, связываются с элементом μA и трансактивируют iEμ совместно с фактором транскрипции bHLH in vitro 28 . Поэтому мы стремились определить, может ли отсутствие Erg и связывания Erg, в частности, с сайтом μA iEμ, объяснять потерю рекомбинации V H с DJ H , наблюдаемой в Rag1Cre T / +. ; Erg Δ / Δ мышей in vivo.В то время как ChIP-PCR продемонстрировала связывание Erg с энхансером iEμ, содержащим элемент μA (дополнительный рис. 3b ), мыши, у которых была удалена область μA (μA Δ / Δ ), сохранили количество циркулирующих зрелых В-клеток по сравнению с cEμ Δ / + контролирует (рис.) и интактную рекомбинацию V H -to-DJ H (дополнительный рис. 3c ). Это было в отличие от мышей cEμ Δ / Δ , у которых был удален основной элемент iEμ из 220 п.н., у которых в периферической крови наблюдалось заметное снижение циркулирующих зрелых В-клеток IgM + IgD + . сохраняя предыдущие модели 29 (рис.). Важно отметить, что ChIP-seq не демонстрировал связывания Erg с другими участками энхансера iEμ в клетках μA Δ / Δ proB (дополнительный фиг. 3d ). Вместе эти данные показывают, что хотя Erg может связываться с областью μA iEμ in vivo, делеция этой области не приводила к значительному нарушению развития B-лимфоида. Поэтому маловероятно, что связывание Erg с μA элементом iEμ могло бы объяснить потерю рекомбинации V H с DJ H , в частности, или Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ фенотип в целом.
Реаранжированный аллель
IgH обеспечивает Erg -дефицитный B-лимфопоэзУчитывая потерю рекомбинации V H -to-DJ H , связанную со структурным пертурбацией локуса Igh пре-дефицитного ErgB клеток, мы стремились восполнить потерю образования функционального транскрипта Igh μ и тем самым определить, была ли неспособность сформировать комплекс пре-BCR основной причиной онтогенетического блока в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ мышей 30 .Комплементация с функционально перестроенным аллелем Igh в моделях дефектной рекомбинации V H с DJ H , такой как делеция Rag1, Rag2 или компонентов ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-PK), которые опосредуют Рекомбинация V H с DJ H , может преодолеть блок развития до BCR 31 — 34 .
IgH Vh20tar нокаут-аллель, который экспрессирует продуктивные транскрипты Igh HEL при эндогенной регуляции локуса Igh 32 , поэтому был использован для создания мышей, у которых не было Erg . -клеточные предшественники, но будут подвергаться соответствующей стадии экспрессии перестроенной цепи Igh HEL ( Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + ).Присутствие аллеля IgH Vh20tar позволило развиваться В-клеткам в отсутствие Erg . Костный мозг Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + мышей содержали значительное количество B220 + IgM + B-клеток и, в частности, CD25 + CD19 + IgM — preB-клеток, популяция совпадала с успешным pre-BCR формация 35 , которые практически отсутствовали в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ мышей (рис.). Однако спасенные клетки preB были в меньшем количестве по сравнению с эрг эт / эт , эрг эт / эт ; IgH Vh20tar / + и Rag1Cre T / + контроли. Вероятно, это было связано с ограничением клонального репертуара, разрешенным аллелем IgH Vh20tar как преобладающим клоном Igh (рис.).
Перегруппированный аллель Igh разрешает В-лимфоидное развитие в отсутствие Erg.a Репрезентативные графики проточной цитометрии популяций BMB-лимфоидов ( n = 9 Erg fl / fl , n = 8 Erg fl / fl ; IgH ; IgH Vh20tar / + , n = 7 Rag1Cre T / + , n = 8 Rag1Cre T / + ; Erg 9000 ∆6 Erg 9000 ∆6 , n = 8 Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + биологически независимых образцов с указанием среднего процента жизнеспособных клеток; Профиль B220 / IgM из всего BM, профиль CD25 / CD19 из B220 + IgM — клеток BM. Δ P adj = 2.1e − 9 (B220 + IgM + ) и 3.5e − 4 (B220 + IgM — CD25 + CD19 + ) в сравнении Rag1Cre T / + ; эрг Δ / Δ до эрг эт / эт ; * P adj = 3.1e − 3 (B220 + IgM + ) и 3.3e − 2 (B220 + IgM — CD25 + CD19 + ) Rag1Cre Т / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + до Rag1Cre T / + ; Эрг Δ / Δ . b Доли жизнеспособных популяций В-лимфоидов селезенки (среднее ± стандартное отклонение; n = 14 Erg fl / fl , n = 10 Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ , n = 9 Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar bi + ). Δ P прил. = 2.1e − 11 (B220 + ), 5.6e − 11 (Fol), 3.3e − 5 (MZ) при сравнении Erg fl / fl с Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; * P adj = 2.1e − 10 (B220 + ), 3.2e − 8 (Fol), 3.2e − 6 (MZ) для сравнения Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ — Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + по двустороннему непарному тесту Стьюдента t , скорректированному с использованием модификации Холма для множественного тестирования.Фолликулярный, маргинальная зона MZ (см. Дополнительный рисунок 1 , дополнительный стол 1 ). c ПЦР геномной ДНК из B220 + спленоцитов для Erg (верхняя панель; fl, floxed аллель, Δ, cre-делетированный аллель), V H -to-DJ H рекомбинация V H J558, V H 7183, V H семейства Q52 (вторая панель), V H аллель 10tar (третья панель) и рекомбинация легкой цепи V κ (нижняя панель).Представитель трех независимых экспериментов. d Пролиферация с помощью анализа клеточных следов фиолетового дикого типа (C57BL / 6), Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + , Rag1Cre + / + ; Erg fl / fl и Rag1Cre T / + B220 + спленоцитов, стимулированных анти-IgM, CD40L + IL4 + IL5 (T-клеточно-зависимый) или LPS (T-клеточный -независимая) стимуляция.Средний процент жизнеспособных клеток ± стандартное отклонение для каждого показанного деления клеток. Никаких существенных различий между генотипами не наблюдалось ( P > 0,90, двусторонний дисперсионный анализ). и Типичные графики проточной цитометрии, показывающие дифференцировку CD138 + и переключение класса IgG1 спленоцитами B220 + в ответ на стимуляцию CD40L + IL4 + IL5 с использованием мечения CTV (синий, C57BL6; оранжевый, Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + ; зеленый , Erg fl / fl ; фиолетовый, Rag1Cre Rag1Cre ). f CD138 + дифференцировка и переключение класса IgG1 клеток B220 + путем деления клеток. Средний процент жизнеспособных клеток ± стандартное отклонение для каждого показанного деления клеток. Не наблюдалось значительных различий между генотипами ( P > 0,99, двусторонний дисперсионный анализ как для дифференцировки клеток CD138 + , так и для переключения IgG1). Для d , e , f n = 2–4 C57BL / 6, n = 5-6 Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + , n = 3–5 Rag1Cre + / + ; Erg fl / fl и n = 3 Rag1Cre T / + мышей. г Процент (среднее ± стандартное отклонение) циркулирующих IgM + IgD + B220 + B-клеток в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ( n = 31), Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + ( n = 17) и Erg fl / fl ( n = 9) мышей. P = 1.06e − 27 для сравнения Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ — Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + по двустороннему непарному тесту Стьюдента t . Исходные данные представлены в файле исходных данных.
Аналогично в селезенке Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + мышей наблюдали почти нормальное количество всех B-лимфоидных популяций, в отличие от заметного снижения Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ мышей (рис.). Примечательно, что рекомбинация цепи IgκL происходила в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH клеток Vh20tar / + (рис.).
Затем мы проверили, спасен ли Rag1Cre T / + ; Эрг Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + В-клетки селезенки были функциональны в отсутствие Erg . Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Спленоциты Vh20tar / + были неотличимы от контроля дикого типа в пролиферативных анализах in vitro с использованием анти-μ-стимуляции, зависимой от Т-клеток стимуляции лигандом CD40, IL4 и IL5 или независимой от Т-клеток стимуляции с использованием липополисахарида (рис. .). Rag1Cre T / + ; Эрг Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + В-клетки селезенки также были способны нормально дифференцироваться, как измерено по образованию плазматических клеток CD138 + и рекомбинации переключателя класса IgG1 (рис.). Обращающийся Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + В-клетки также экспрессировали IgD, в отличие от их Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ аналоги (рис.). Эти эксперименты продемонстрировали, что потеря функционального транскрипта Igh μ и неспособность сформировать пре-BCR комплекс были основной причиной отсутствия развития B-клеток в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ мышей.
Erg -дефицитные пре-proB клетки не экспрессируют Ebf1 и Pax5Чтобы определить механизм, с помощью которого Erg регулирует рекомбинацию V H с DJ H и образование пре-BCR, мы взяли ген экспрессионное профилирование Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клеток pre – proB.Дифференциальная экспрессия генов и генно-онтогенетический анализ дифференциально экспрессируемых генов в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre – proB по сравнению с Erg fl / fl pre – proB клетки продемонстрировали дерегулированную экспрессию множества B-лимфоидных генов (рис.). К ним относятся гены, кодирующие рецепторы клеточной поверхности или адгезии и основные компоненты комплекса pre-BCR CD19, CD22, Igll1, Vpreb1, Vpreb2, CD79a и CD79b , гены, необходимые для рекомбинации Igh , такие как Rag1 и Rag2 . и компоненты негомологичного комплекса репарации концевого соединения, связанного с рекомбинацией V (D) J: Xrcc6 (Ku70) и Lig4 , и, что важно, факторы транскрипции, участвующие в развитии B-клеток ( Ebf1, Pax5, Tcf3, Bach3, Irf4, Myc, Pou2af1, Lef1, Myb ) (рис.).
Экспрессия гена в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клетки пре-proB и связывание ДНК Erg.a Дифференциально экспрессируемые гены в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клетки pre – proB по сравнению с Erg fl / fl контролей, настроены вручную в соответствии с функцией на основе анализа GO term (см. Дополнительные данные 1 ) с количеством гены для каждой функциональной категории показаны горизонтальной осью, а выбранные гены выделены прямоугольниками. b Дифференциальная экспрессия факторов транскрипции 77 между Erg fl / fl и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клетки pre – proB, упорядоченные по logFC, с выбранными факторами транскрипции линии B, выделенными красным. c RNA-seq для локусов Ebf1 , Pax5 и Erg , с ChIP-seq для связывания Erg в клетках C57BL / 6 proB и тимусе Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ Erg-нокаутные клетки (Erg KO) для контроля участков связывания не-Erg ChIP с ДНК (см.также дополнительный рис. 4b ). Метка промотора Ebf1, Pax5, h4K4me3, метка промотора h4K27ac и энхансера в клетках proB с помощью ChiP-seq и ATAC-seq в Erg fl / fl pre-proB клеток (pre-proB), Rag1Cre Т / + ; Erg Δ / Δ pre – proB (Erg KO pre – proB) и Erg-дефицитные клетки proB (Rescue proB) и preB (Rescue preB) в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + мышей, которые развиваются с функционально перестроенным аллелем Igh , как показано.Звездочка (*) указывает связывание Erg с промоторной областью (заштриховано синим) Ebf1 и Pax5 . Связывание Erg с областями внутригенного энхансера Pax5 (заштриховано розовым) с указанным номером интрона. Дельта (Δ) указывает на связывание Pax5 с промоторной областью Erg . Связывание Ebf1 и Pax5 с областями внутригенного энхансера Erg (заштриховано розовым) с указанным номером интрона (см. Также дополнительный рисунок 4b ). d Вестерн-блоттинг на Erg, Ebf1, Pax5 и β-актин в Rag1Cre T / + , C57BL / 6 и Erg fl / fl proB и 9006 Rag1Cre Т / + ; Erg Δ / Δ пре-proB клеток (показаны по два образца каждого генотипа).Представитель двух независимых экспериментов. e Одноклеточный анализ РНК-seq (3297 клеток, {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE114793», «term_id»: «114793»}} GSE114793), показывающий Графики t-распределенного стохастического встраивания соседей (tSNE) популяций CLP, pre-proB и CD19 + proB и preB, демонстрирующие условную экспрессию Erg , Ebf1 и Pax5 в отдельных клетках траектории линии B ( см. также дополнительный рисунок 5 ).Исходные данные представлены в файле исходных данных.
Ebf1 и Pax5 имеют решающее значение для спецификации линии B 5 и обслуживания 36 , 37 и действуют совместно для регулирования генной сети на ранних этапах судьбы B-клеток 9 . Поскольку мы наблюдали с потерей Erg, снижало экспрессию нескольких критических генов линии B, ранее идентифицированных как контролируемые Ebf1 и / или Pax5 , например CD19 , Vpreb1 и Igll1 ( Инжир.), мы предположили, что Erg может играть важную роль в регуляции экспрессии этих двух основных факторов транскрипции и их мишеней. Чтобы определить, связывает ли Erg регуляторные области гена Ebf1 и / или Pax5 и напрямую регулирует их экспрессию, мы провели анализ ChIP-seq в клетках proB дикого типа и ATAC-seq для оценки доступности локусов в Ebf1 и Локусы Pax5 при отсутствии Erg в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre – proB клетки и proB и preB клетки, спасенные с помощью нокаутного аллеля IgH Vh20tar .Это продемонстрировало прямое связывание Erg с проксимальной (β) областью промотора Ebf1 38 , а также с промотором Pax5 и Pax5 лимфоид-специфическим энхансером интрона 5 12 (рис. ). , Дополнительный рисунок 4b ). Прямое связывание Erg с этими регуляторными областями вместе с отсутствием транскрипции Ebf1 и Pax5 в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre-proB клеток и потеря белка Ebf1 и Pax5 в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ по вестерн-блоттингу (рис.), продемонстрировали, что Erg является прямым регулятором транскрипции Ebf1 и Pax5 . Важно отметить, что потеря экспрессии Ebf1 и Pax5 произошла при сохранении экспрессии других известных регуляторов экспрессии Ebf1 , а именно Foxo1 , Spi1, Tcf3 и Ikzf1 (дополнительный рис. ), и оба локуса Ebf1 и Pax5 остались доступными для ATAC-seq в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre – proB клеток (рис.). Подтверждая наблюдение, что Erg, Ebf1 и Pax5 могут образовывать скоординированную транскрипционную сеть, промоторная область Erg была напрямую связана с Pax5, а энхансерная область Erg была связана с Pax5 и Ebf1 (рис.).
Чтобы лучше понять роль Erg, Ebf1 и Pax5 в траектории линии B-клеток, была исследована одноклеточная последовательность РНК CLP, pre-proB и CD19. + proB и preB популяции (GSE 114793, рис. ). В соответствии с другим нашим анализом (рис.), наблюдалось увеличение экспрессии Erg в клетках CLP, pre-proB и proB (рис.), при этом идентичность популяций proB и preB подтверждена анализом дополнительных генов линии B (дополнительный рис. 5 ). Важно отметить, что экспрессия Erg предшествовала экспрессии Ebf1 и Pax5 на траектории линии B, причем экспрессия Ebf1 и Pax5 возрастала на более поздних стадиях proB и preB. Взятые вместе, эти данные строго подтверждают апикальную роль Erg в инициации экспрессии Ebf1 и Pax5 во время раннего развития B-клеток.
Регуляторная сеть ко-зависимых генов
Erg , Ebf1 и Pax5Как мы наблюдали связывание Ebf1 и Pax5 с цис -регуляторными областями локуса Erg (рис.), Мы определили Ebf1 и Pax5 могут регулировать экспрессию гена Erg в предшественниках B-клеток путем изучения общедоступного набора данных, в котором Ebf1 ( Ebf1 Δ / Δ ) или Pax5 ( Pax5 Δ) был удален (рис.). Удаление Ebf1 или Pax5 привело к снижению экспрессии Erg (рис.), Причем влияние Ebf1 оказалось более сильным. Затем мы сравнили изменения экспрессии генов в Ebf1 Δ / Δ клетках pre – proB и Pax5 Δ / Δ клеток proB с генами, регулируемыми Erg в клетках pre – proB. Как можно было бы предсказать, если бы Erg, Ebf1 и Pax5 были компонентами ко-зависимой регуляторной сети генов, этот анализ показал очень значимую корреляцию в изменениях экспрессии генов, наблюдаемых с делецией Ebf1 или Pax5 в клетках pre-proB и proB и наблюдаемые с делецией Erg в пре-proB клетках.Это было отмечено для генов с пониженной регуляцией в Erg, Ebf1 и Pax5-дефицитных клетках, в частности (рис.).
Экспрессия гена в Ebf1 — и Pax5 -дефицитных клетках и спасение Erg -дефицитных pre-proB клеток.a Тепловая карта 100 самых вариабельных генов дикого типа (WT, n = 3) proB, Ebf Δ / Δ ( n = 3) pre – proB, Pax5 Δ / Δ ( n = 3) ячеек proB с примененной иерархической кластеризацией. b Экспрессия Erg , Ebf1, Pax5 , Foxo1 и Tcf3 в диком типе ( n = 3), Ebf1 Δ / Δ () n = Pax5 Δ / Δ ( n = 3) клеток (RPKM, показано среднее ± стандартное отклонение). * По сравнению с диким типом по двустороннему непарному тесту Стьюдента t , экспрессия Erg : P = 2,56e-4 и 4,65e-3; Ebf1 выражение: P = 1.28e − 4 и 1.48e − 4; Pax5 выражение: P = 1,32e-6 и 1,68e-6; Foxo1 выражение: P = 7,46e-4 и 2,09e-3; и экспрессия Tcf3 : P = 5.01e-4 и 6,85e-4 в Ebf1 Δ / Δ и Pax5 Δ / Δ клеток соответственно. c Графики обогащения штрих-кода, отображающие сильно ассоциированные сигнатуры экспрессии генов вниз (вертикальные синие полосы) и вверх (вертикальные красные полосы) регулируемых генов в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre– Клетки proB по сравнению с клетками Ebf1 Δ / Δ pre – proB (вверху) и Pax5 Δ / Δ proB (внизу).Гены расположены в порядке (слева направо) в Ebf1 Δ / Δ или Pax5 Δ / Δ клетках от наиболее отрицательной до наиболее активной. Ось X: умеренная t-статистика в Ebf1 Δ / Δ или Pax5 Δ / Δ по сравнению с диким типом. Тест набора генов с помощью камеры 55 подтвердил корреляцию, значения P показаны для генов с повышенной и пониженной регуляцией. d Репрезентативные графики проточной цитометрии и процентное содержание (среднее ± стандартное отклонение) клеток GFP + B220 + и CD19 + из клон-отрицательных Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ BM, трансдуцированные контролем MSCV ( n = 3), MSCV-Ebf1 ( n = 3) или MSCV-Pax5 ( n = 3) ретровирусов GFP + , культивированных на стромальных клетках OP9 с IL-7 , SCF и Flt3-лиганд.* P adj = 1,14e − 2 для MSCV-Ebf1 и 2,20e − 4 для MSCV-Pax5 (GFP + B220 + ) и 8,86e − 3 для MSCV-Ebf1 (GFP + CD19 + ), двусторонний непарный тест Стьюдента t с модификацией Холма для множественного тестирования по сравнению с MSCV. e V H -to-DJ H рекомбинация V H J558, V H 7183, V H сегментов Q52 (верхняя панель) с элементами управления загрузкой Mu0 (нижняя панель) в B220 + -обогащенная линия — отрицательная C57BL / 6 ( n = 2), Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ( n = 2) и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ BM, трансдуцированные ретровирусами MSCV-Ebf1 ( n = 2) или MSCV-Pax5 ( n = 2). f Экспрессия выбранных генов B-клеток (RPKM) с помощью RNA-seq в клетках B220 + C57BL / 6 proB ( n = 2), Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клеток pre – proB ( n = 2) и Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клеток, трансдуцированных с помощью MSCV-Ebf1 ( n = 2) или MSCV-Pax5 ( n = 2) ретровирусов. Limma с двусторонним регулированием P значение: * P adj <0.05 по сравнению с C57BL / 6; Δ P adj <0,05 по сравнению с Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ . См. Файл исходных данных для отдельных значений P adj . n количество биологически независимых образцов. Исходные данные представлены в файле исходных данных.
Наконец, чтобы подтвердить, что Ebf1 и Pax5 были регуляторами транскрипции ниже Erg, трансдукция Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ пре-proB клеток с MSCV-управляемыми конструкциями для конститутивной сверхэкспрессии Ebf1 и Pax5 .Этот эксперимент продемонстрировал восстановление экспрессии B220 с помощью сверхэкспрессии Ebf1 или Pax5 в Erg-дефицитных клетках (рис.). Примечательно, что частичное восстановление экспрессии CD19 и рекомбинация V H с DJ H наблюдались при сверхэкспрессии Ebf1 , тогда как при сверхэкспрессии Pax5 спасения не наблюдалось (фиг.). Анализ РНК-seq клеток с дефицитом Erg , трансдуцированных векторами экспрессии Ebf1 или Pax5 , показал, что сверхэкспрессия Ebf1 может спасти экспрессию нескольких генов-мишеней транскрипционной сети, включая Pax5 , гены, участвующие в пре- Передача сигналов BCR (например, Vpreb1 , Vpreb2, CD79a, CD79b, CD22 и CD19 ), гены, участвующие в рекомбинации V-to-DJ H (например, Rag1 , Rag2 ), а также транскрипция из локуса Igh ( Ighv1-5 , Ighv1-7 , Ighv1-4 ).В отсутствие Ebf1 , только сверхэкспрессия Pax5 индуцировала экспрессию гораздо более ограниченного набора этих генов-мишеней (фиг.). Следовательно, эти данные предполагают, что Pax5 лежит ниже Ebf1 и поддерживает модель, в которой Ebf1 способствует роли Pax5 в развитии B-клеток 11 . Эти находки также согласуются с иерархической моделью Erg, Ebf1 и Pax5, формирующей взаимозависимую транскрипционную сеть, которая совместно регулирует критические гены-мишени, необходимые для рекомбинации V H к DJ H и передачи сигналов пре-BCR.
Erg совместно связывает общие гены-мишени Ebf1 и Pax5
Поскольку экспрессия нескольких генов B-клеток нарушена в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre-proB клеток, включая те, с которыми Ebf1 и Pax5, как было показано, напрямую связываются и регулируются, мы исследовали возможность совместного связывания Erg общих генов-мишеней для усиления генной сети Ebf1 и Pax5, используя полногеномный анализ участков связывания ДНК Erg в клетках proB.Как и ожидалось, наиболее обогащенным мотивом, лежащим в основе связывания Erg, был мотив ETS. Однако значительное обогащение Ebf1-, E2A-, Pax5 — и Foxo1 -связывающих мотивов также было идентифицировано в пределах 50 п.н. от сайтов связывания Erg (рис.), Что позволяет предположить, что Erg действует совместно с другими факторами транскрипции, чтобы регулируют экспрессию целевого гена в зависимой генной сети. Анализ связывания каждого из Erg, Ebf1 и Pax5 с регуляторными областями генов, которые дифференциально экспрессировались в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre-proB клеток.Этот анализ выявил значительное перекрывание сайтов связывания Erg-, Ebf1 и Pax5 в пределах 5 т.п.н. от сайта начала транскрипции (TSS) генов, дифференциально экспрессируемых в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клеток pre – proB по сравнению с контрольными клетками pre – proB (рис.). Взятые вместе, эти данные предоставили дополнительные убедительные доказательства существования регуляторной сети генов, в которой Erg необходим для инициации и поддержания экспрессии Ebf1 и Pax5 на стадии развития клеток pre-proB, а также для усиления экспрессии генов-мишеней внутри сети за счет кооперативного связывания и совместной регуляции генов-мишеней с Ebf1 и Pax5.
Erg-опосредованная регуляторная сеть генов Ebf1 и Pax5.a Обнаружение всего геномного мотива HOMER, лежащего в основе связанных с Erg областей в клетках proB. b Тепловая карта связывания Erg, Ebf1 и Pax5 с дифференциально экспрессируемыми генами в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клетки pre – proB, сосредоточенные вокруг сайта начала транскрипции (TSS) ± 5,0 кБ (см. Дополнительные данные 2 для всех аннотированных сайтов связывания ChIP). c Связывание Erg, Ebf1 и Pax5 с аннотированными областями генов, дифференциально экспрессируемых между Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ и Erg до fl / fl –ProB клетки. d Экспрессия гена РНК-seq в CD19, Igll1, VpreB1 и CD79a локусов , с ChIP-seq связывания Erg, Ebf1 и Pax5, промоторной меткой h4K4me3, промотором h4K27ac и энхансерной меткой в клетках proB дикого типа , и ATAC-seq Erg fl / fl ячеек pre – proB, Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre – proB (Erg KO pre– proB) и Erg-дефицитные клетки proB (Rescue proB) и preB (Rescue preB) в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + Спасено мышей с функционально перестроенным аллелем Igh .Промоторы связывания Erg, Ebf1 и / или Pax5 (синяя заливка). Связывание Erg, Ebf1 и / или Pax5 с участками энхансера (розовая заливка). e Erg-зависимая транскрипционная сеть Ebf1 и Pax5 в клетках proB со связыванием каждого транскрипционного фактора с аннотированными промоторными, проксимальными и дистальными участками генов дифференциально экспрессируемых генов в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ клетки pre – proB (полный список в дополнительных данных 2 ). f Краткое изложение Erg-зависимой транскрипционной сети Ebf1 и Pax5 в рекомбинации V H к DJ H и образованию пре-BCR.
Чтобы далее очертить непосредственно регулируемые гены-мишени в Erg-зависимой транскрипционной сети Ebf1 и Pax5, мы предприняли картирование связывания ChIP-seq Erg, Ebf1 и Pax5 с Erg-зависимыми генами на стадии развития pre-proB клеток. Большинство этих генов-мишеней продемонстрировало прямое комбинаторное связывание Erg, Ebf1 и / или Pax5 с аннотированными областями промотора, энхансерными / предполагаемыми энхансерными областями тела гена или предполагаемыми дистальными энхансерными областями этих генов (рис.). Детальное изучение нескольких ключевых генов-мишеней, экспрессия которых полностью зависела от Erg в пре-proB-клетках, выявило прямое связывание Erg с областями промотора и энхансера для нескольких компонентов пре-BCR, включая CD19 , Igll1, Vpreb1 и CD79a . Это происходило при координированном связывании Ebf1 и Pax5 с регуляторными областями этих генов 15 (рис.). Кроме того, была идентифицирована непрямая регуляция Erg в локусе Rag1 / Rag2 с подавлением экспрессии факторов транскрипции, которые связывают и регулируют промотор Rag2 , такой как Pax5 , Lef1 и c-Myb в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre – proB клеток (рис.) 39 , а также прямое связывание Erg с консервативным B-клеточным специфическим энхансером Erag 40 (дополнительная фигура 4a, b ). Важно отметить, что потеря экспрессии Rag1 и Rag2 в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre-proB клеток происходило, в то время как экспрессия Foxo1 , положительного регулятора локуса 41 , относительно поддерживалась (дополнительный рис. 4а ).
Затем была картирована регуляторная сеть гена, опосредованная Erg-Ebf1-Pax5, с использованием каждого гена-мишени, экспрессия которого нарушена в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre-proB клеток, которые были напрямую связаны с Erg, Ebf1 и / или Pax5 в промоторных, проксимальных или дистальных областях гена, чтобы обеспечить полное представление этой генной сети (рис.). Это подчеркивает взаимозависимые роли этих факторов транскрипции во множестве клеточных процессов, необходимых для В-лимфопоэза.
Важное наблюдение, вытекающее из наших данных, заключалось в том, что B-лимфоидный онтогенетический блок возникает в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ pre-proB клетки могут быть преодолены с предоставлением реаранжированного функционального аллеля Igh Vh20tar. Это свидетельствует о том, что после обхода контрольной точки до BCR Erg больше не является критическим для дальнейшего развития и функционирования B-клеток, включая рекомбинацию V L J L Igl и образование BCR (рис.). Действительно, за пределами контрольной точки до BCR произошло повторное появление экспрессии Ebf1 и Pax5 (рис.), А также экспрессия генов-мишеней сети Ebf1 и Pax5 (рис. Рис. 4a ) в Erg-дефицитном Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + proB и preB клетки, спасенные с помощью аллеля Vh20tar. Это соответствовало паттерну экспрессии Erg в траектории линии B (рис.и) и определяет роль Erg как четко специфичного для стадии регулятора раннего развития B-клеток.
Обсуждение
В этом исследовании мы исследовали роль транскрипционного фактора Erg в B-лимфопоэзе. Наши исследования показывают, что экспрессия Erg на стадии развития CLP инициирует транскрипционную сеть, состоящую из Erg, Ebf1 и Pax5, в пре-proB и proB клетках, чтобы регулировать V H -to-DJ H Igh рекомбинацию и сигнализация pre-BCR (рис., Рис. ).
Эта важная роль Erg в развитии B-клеток была продемонстрирована на мышах, у которых Erg было удалено в ходе лимфопоэза, что обнаружило блокаду развития на стадии пре-proB-клеток, что было связано с глубокими дефектами в V H . рекомбинация -to-DJ H , организация локуса Igh и транскрипционные изменения в нескольких генах B-клеток, включая потерю экспрессии Ebf1 и Pax5 . Комбинируя RNA-seq, ChIP-seq и исследования комплементации генов, мы смогли определить взаимозависимую транскрипционную сеть между Erg, Ebf1 и Pax5 с прямым связыванием Erg с проксимальным (β) промотором Ebf1 , с которым Pax5, Ets1 и Pu.1 также кооперативно связывают 38 , а также связывают Erg с промотором Pax5 и областью мощного энхансера интрона 5, двумя критическими регуляторными элементами, необходимыми для правильной инициации транскрипции Pax5 в раннем развитии B-клеток 12 . Эти данные подтверждают модель (рис.), В которой повышенная экспрессия Erg от CLP необходима для инициации и поддержания экспрессии Ebf1 и Pax5 в клетках pre-proB и proB, чтобы установить взаимозависимую B-лимфоидную генная регуляторная сеть.
Вместе Erg, Ebf1 и Pax5 непосредственно совместно регулируют экспрессию множества генов, которые ранее были идентифицированы как прямые транскрипционные мишени Ebf1 и Pax5 (рис.). Прямое связывание Erg с промоторами генов сигнального комплекса пре-BCR, таких как Igll1 , VpreB и CD79a , устанавливает Erg в качестве регулятора транскрипции генов-мишеней в этой сети. Помимо Rag1 и Rag2 , мы также идентифицировали сетевую регуляцию экспрессии Xrcc6 , гена, кодирующего субъединицу Ku70 ДНК-зависимого холофермента протеинкиназы (ДНК-PK), который связывает двухцепочечные разрывы ДНК во время V ( D) J-рекомбинация 42 и Lig4 , кодирующие XRCC4-ассоциированную ДНК-лигазу, которая необходима для соединения концов ДНК во время V (D) J-рекомбинации 43 (дополнительный рис. 4а, б ). Наряду с прямым стимулированием Erg экспрессии Pax5 , структурного регулятора локуса Igh , этих находок достаточно, чтобы объяснить Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ фенотип, в котором рекомбинация V H с DJ H была потеряна. Вместе с потерей экспрессии компонентов комплекса пре-BCR мы можем заключить, что развитие В-клеток было заблокировано как следствие делеции Erg из-за коллапса Erg-опосредованной транскрипционной сети.
Важно отметить повторное появление экспрессии Ebf1 и Pax5 за контрольной точкой до BCR в Igh — спасено Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ; IgH Vh20tar / + клеток proB и preB, а также экспрессия генов-мишеней Ebf1 и Pax5. Это демонстрирует, что Erg является стадий-специфическим регулятором раннего развития B-клеток с появлением Erg-независимой генной сети Ebf1 и Pax5 на более поздних стадиях развития B-клеток, как только клоны прошли через контрольную точку пре-BCR.Это позволило бы рекомбинации цепи IgL V L к J L и образованию BCR протекать в преВ-клетках, в которых также снижена эндогенная экспрессия Erg (фиг. И). Регуляторы транскрипции экспрессии Ebf1 и Pax5 во время этих более поздних стадий развития В-клеток еще предстоит определить.
Erg, , однако, имеет решающее значение для инициации и поддержания экспрессии Ebf1 и Pax5 в клетках pre – proB и proB (рис.), организующие транскрипционную сеть, необходимую для раннего развития B-клеток. В этой роли Erg не только координирует транскрипционные функции Ebf1 и Pax5, но также напрямую связывает и активирует критические гены-мишени, необходимые для перехода через контрольную точку пре-BCR.
Методы
Мыши
Мыши, несущие Erg tm1a (KOMP) wtsi репортерный аллель «нок-первый» 44 ( Erg KI , KOMP), были получены с помощью Knockout Project нацеливание в ES-клетки.Мыши с условным нокаутным аллелем Erg ( Erg fl ), у которых была вырезана кассета IRES-LacZ, были получены путем скрещивания мышей Erg KI с трансгенными мышами Flpe 4521. . Rag1Cre мышей 46 , у которых Cre-рекомбиназа экспрессируется во время лимфопоэза со стадии CLP 22 , скрещивали с Erg fl мышей, чтобы получить мышей, лишенных Erg в лимфоузлах ( Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ ) и Rag1Cre + / + ; Erg fl / fl ( Erg fl / fl ) контролирует.Мыши, несущие перестроенную тяжелую цепь иммуноглобулина IgH Аллель Vh20tar 47 , были подарком профессора Роберта Бринка. Мыши cEμ Δ / Δ и μΑ Δ / Δ были созданы лабораторией MAGEC (Институт медицинских исследований Уолтера и Элизы Холл) 48 на фоне C57BL / 6J. Для генерации cEμ Δ мышей, 20 нг / мкл cas9 мРНК, 10 нг / мкл sgRNA (GTTGAGGATTCAGCCGAAAC и ATGTTGAGTTGGAGTCAAGA) и 40 нг / мкл донора олиго (CAAGCTAAAATTAAAAGGTTGAACTCAATAAGTTAAAAGAGGACCTCTCCAGTTTCGGCTCAACTCAACATTGCTCAATTCATTTAAAAATATTTGAAACTTAATTTATTATTGTTAAAA) вводили в цитоплазму оплодотворенных эмбрионов на стадии одноклеточных .Для генерации мка Δ мышей, 20 нг / мкл мРНК cas9, 10 нг / мкл sgRNA (GAACACCTGCAGCAGCTGGC) и 40 нг / мкл олиго-донора (GCTACAAGTTTACCTAGTGGTTTTATTTTCCCTTCCCCAAATAGCCTTGCCACATGACCTGCCAGCTGCTGCAGGTGTTCTGGTTCTGATCGGCCATCTTGACTCCAACTCAACATTGCT) вводили в цитоплазму оплодотворенных эмбрионов на стадии одной клетки. Двадцать четыре часа спустя эмбрионы на двухклеточной стадии были перенесены в яйцеводы псевдобеременных самок мышей. Жизнеспособное потомство было генотипировано секвенированием следующего поколения. На некоммерческие уникальные материалы распространяются Соглашения о передаче материалов.Мышей содержали вместе в барьерном помещении и анализировали в возрасте от 6 до 18 недель. Использовали мышей-самцов и самок. Праймеры и условия ПЦР, используемые для генотипирования, представлены в дополнительной таблице 3 . Это исследование было проведено в соответствии с Австралийским кодексом по уходу и использованию животных в научных целях, опубликованным Австралийским национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям. Эвтаназию проводили путем индукции CO 2 или смещения шейного отдела позвоночника. Экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Института медицинских исследований Уолтера и Элизы Холл.
Первичная культура клеток
предшественников B-клеток были получены из костного мозга, который был истощен с использованием биотинилированных антител Ter119, Mac1, Gr1, CD3, CD4 и CD8, микрогранул против биотина и колонок LS (Miltenyi Biotec) и культивировался на Стромальные клетки OP9 в среде Дульбекко, модифицированной Исков (Gibco, Invitrogen) с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной телячьей сыворотки (Gibco, Invitrogen), 50 мкМ β-меркаптоэтанола, а также интерлейкина-7 мыши (10 нг / мл) при 37 ° C в 10% CO 2 в течение 7 дней.В-клетки селезенки очищали путем отрицательной селекции с использованием набора для выделения В-клеток (Miltenyi Biotec) 49 , и чистоту подтверждали проточной цитометрией перед маркировкой Cell Trace Violet (CTV; Life technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Меченые клетки высевали из расчета 5 × 10 4 клеток на лунку и культивировали в течение 90 часов.
Гематология
Кровь собирали в пробирки, содержащие ЭДТА (Sarstedt), и анализировали на анализаторе Advia 2120 (Bayer).
Проточная цитометрия
Суспензии отдельных клеток из костного мозга, лимфатических узлов или селезенки были приготовлены в сбалансированном солевом растворе (BSS-CS: 0,15 М NaCl, 4 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2 , 1 мМ MgSO 4 , 1 мМ KH 2 PO 4 , 0,8 мМ K 2 HPO 4 и 15 мМ HEPES с добавлением 2% [об. / Об.] Бычьей телячьей сыворотки). Анализ крови проводили после лизиса эритроцитов в забуференном 156 мМ NH 4 Cl. Окрашивание проводили с использованием биотинилированных или конъюгированных с флуорохромом антител, специфичных к мышиным антигенам Ter119 (Ly-76), CD41 (MWReg30), Gr1 (Ly6G и Ly6C), Mac1 (CD11b), NK1.1, CD11c (N418), CD45R / B220 (RA3-6B2), CD19 (1D3), CD3 (17A2), CD4 (GK1.5), CD8a (53.6.7), Sca1 (Ly6A / E, D7), cKit (CD117, ACK4 или 2B8), CD150 (TC15-12F12.2), CD105 (MJ7 / 18), CD16 / 32 (24G2), CD127 (A7R34), CD135 (A2F10), Ly6D (49-h5), CD21 / CD35 (7G6), CD23 (B3B4), CD93 (AA4.1), CD24 (M1 / 69), CD43 (S7), CD45.2 (S450-15-2), CD45.1 (A20), IgM b (AF6-78), IgD (11-26 c.2a), CD138 (281,2), IgG1 (X56), CD25 (3C7), CD44 (IM7). Для вторичного окрашивания использовали стрептавидин PE-Texas-Red (Invitrogen). См. Дополнительную таблицу 4 для получения информации о разведениях антител и каталожных номерах коммерческих антител.Анализ FACS-Gal выполняли с использованием теплой гипотонической нагрузки флуоресцеинди-β-D-галактопиранозида (молекулярные зонды) на отдельные клетки 50 с последующим иммунофенотипированием с использованием соответствующих поверхностных антигенов, как определено в дополнительной таблице 1 . Клетки анализировали с использованием проточного цитометра LSR II или FACS Canto (Becton Dickinson) или сортировали с помощью проточного цитометра FACSAria II (Becton Dickinson) после окрашивания антител и отбора клонов или истощения с использованием антибиотиновых шариков и колонок LS (Miltenyi Biotec).Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 8.8.7, Tree Star).
Культура B-клеток селезенки
Очищенные и меченные CTV B-клетки селезенки культивировали либо с AffiniPure F (ab ‘) 2 Фрагмент козьего антитела против мышиного IgM µ-цепочки (20 мкг / мл; Jackson Immunoresearch), CD40L ( собственного производства 51 ) с добавлением IL4 (10 нг / мл; системы R&D) и IL5 (5 нг / мл; системы R&D) для оценки Т-клеточно-зависимых ответов или LPS (25 мкг / мл; Difco ), чтобы оценить независимые от Т-клеток ответы и проанализировать с помощью проточной цитометрии.
Анализ общедоступных наборов данных RNA-seq
файлов FASTQ, содержащих профили RNA-seq клеток pre-proB из Ebf1 Δ / Δ ({«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text «:» GSM2879293 «,» term_id «:» 2879293 «}} GSM2879293, {» type «:» entrez-geo «,» attrs «: {» text «:» GSM2879294 «,» term_id «:» 2879294 «}} GSM2879294, {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSM2879295», «term_id»: «2879295»}} GSM2879295), ячейки pro-B от Pax5 Δ / Δ ( {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSM2879296», «term_id»: «2879296»}} GSM2879296, {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSM2879297», «term_id»: «2879297»}} GSM2879297, {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSM2879298», «term_id»: «2879298 «}} GSM2879298) и контрольные популяции мышей дикого типа ({» type «:» entrez-geo «,» attrs «: {» text «:» GSM2879299 «,» term_id «:» 2879299 «}} GSM2879299, { «type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSM2879300», «term_id»: «2879300»}} GSM2879300, {«type»: «entrez-geo», «attrs»: { «text»: «GSM2879301», «term_id»: «2879301»}} GSM2879301).Считывания были сопоставлены с геномом mm10 с использованием функции выравнивания Rsubread, а счетчики считываний суммировались на уровне гена, как и для первичных образцов (см. Дополнительные методы) 52 . Гены были отфильтрованы из последующего анализа с использованием функции edgeR filterByExpr, и размеры библиотек были нормализованы TMM. Подсчеты были преобразованы в log2-CPM, и отношение среднего отклонения оценивалось с использованием функции voom в limma 53 . Тепловые карты были созданы с использованием тепловой карты.2 функции в gplots. Гены были протестированы на дифференциальную экспрессию с использованием линейного моделирования в limma 3.38.2 54 . Тестирование генного набора проводилось с использованием камеры 55 , а графики штрих-кода были созданы с помощью limma.
Для анализа одиночной РНК-seq необработанные подсчеты, соответствующие одноклеточной РНК-seq мышиных CLP дикого типа, pre-proB и лимфоидные предшественники CD19 + B клетки были загружены из репозитория Gene Expression Omnibus, тип доступа {» «:» entrez-geo «,» attrs «: {» text «:» GSE114793 «,» term_id «:» 114793 «}} GSE114793.Необработанные подсчеты фильтровали для удаления генов с низкой экспрессией и клеток с низким качеством клеток. Затем счетчики считывания были нормализованы на L1, так что сумма значений выражений для каждой ячейки была равна 1. Размеры библиотеки затем нормализовались по среднему количеству на ячейку. Затем были рассчитаны нормализованные счетчики считывания с использованием алгоритма MAGIC 56 (Rmagic v 1.4.0) с настройками t = 11, k = 30 с другими параметрами, установленными на значения по умолчанию. Визуализация tSNE первых 20 основных компонентов вмененных значений была получена с помощью Rtsne (v 0.15) пакет со следующими параметрами: параметр сложности = 80, импульс 0,5 для первых 250 итераций и конечный импульс 0,8. Скорость обучения tSNE была установлена на 200 с коэффициентом преувеличения 12. Инициализация PCA была отключена. Весь анализ проводился в R версии 3.6.1.
Анализ ATAC-seq
ATAC-seq 57 был проведен на отсортированных популяциях pre – proB, proB и preB. Вкратце, 5 × 10 4 ядер были фрагментированы обработкой ультразвуком в течение 30 минут при 37 ° C, и ДНК была очищена перед амплификацией с индексирующими праймерами (HiFi Ready Mix, Kapa Biosciences) в течение 13 циклов ПЦР с последующей оценкой качества с помощью Bioanalyser.Были отобраны библиотеки высокого качества (150–700 пар оснований) и секвенированы с использованием высокопроизводительного набора пар оснований на конце 75 на NextSeq 500 (Illumina) до минимум 50 миллионов считываний. Считывания ATAC-seq были сопоставлены с геномом mm10 с использованием Bowtie2 58 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml, по состоянию на 6 марта 2017 г.). Пиковый вызов был выполнен с использованием MACS2 59 . Пересечения генетических координат выполнялись с помощью Bedtools (http: // bedtools.readthedocs.io/en/latest/, по состоянию на 6 марта 2017 г.). Тепловые карты уникальных пиков были созданы с использованием pHeatmap в R. Эти данные были депонированы в базе данных Gene Expression Omnibus (номер доступа {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE132852», «term_id» «:» 132852 «}} GSE132852).
Визуализация данных RNA-seq, ChIP-seq и ATASeq
ФайлыRNA-seq, ChIP-seq и ATAC-seq были преобразованы в файлы BigWig с помощью deepTools (версия 2) 60 и загружены в Cyverse (www .cyverse.org) для визуализации в UCSC Genome Browser 61 (genome.ucsc.edu).
Анализ генной сети
Картирование всех пиков Ebf1-, Pax5- и Erg-ChIP-seq с дифференциально экспрессируемыми генами в Rag1Cre T / + ; Erg Δ / Δ были идентифицированы пре-proB клетки в пределах 10 kb от TSS. Пики внутри тела гена были обозначены как «проксимальные мишени», пики, перекрывающие TSS, были помечены как регулируемые промотором мишени, пики менее 3 т.п.н. выше или ниже TSS были помечены как предполагаемые регулируемые промотором мишени, пики более чем на 3 т.п. нижестоящие TSS были обозначены как предполагаемые дистальные мишени.Аннотации генов онтогенеза (GO) дифференциально экспрессируемых генов были выполнены и подверглись экспертной ручной корректировке. Сеть была построена с использованием пакета CRAN 62 и экспортирована в Cytoscape 63 для настройки с использованием пакета RCy3 64 R / Bioconductor.
Анализ Hi-C
Для анализа Hi-C in situ 13 , 65 библиотеки первичных иммунных клеток были созданы в биологических дубликатах для каждого генотипа.Illumina NextSeq 500 использовался для секвенирования библиотек с считыванием парных концов 80 пар оснований для создания библиотек размером от 42 до 100 миллионов допустимых пар считывания. Каждый образец был выровнен по геному mm10 с использованием пакета diffHic v1.14.0 66 , который использует cutadapt v0.9.5 67 и bowtie2 v2.2.5 58 для выравнивания. Полученный файл BAM был отсортирован по имени чтения, команде FixMateInformation из пакета Picard v1.117 (https://broadinstitute.github.io/picard/), повторяющиеся чтения были отмечены, а затем повторно отсортированы по имени. Было определено, что пары считывания являются свисающими концами и удалялись, если пары обращенных внутрь или наружу считываний на одной и той же хромосоме были разделены менее чем на 1000 п.н. для обращенных внутрь чтения и 6000 п.н. для обращенных наружу считываний. Пары чтения с размером фрагмента более 1000 п.н. удалялись. Оценка ошибки выравнивания была получена путем сравнения местоположения на карте 3′-сегмента каждого считываемого химерного фрагмента с таковым 5′-сегмента его партнера.Ошибка картирования была определена как присутствующая, если два сегмента не были обращены внутрь и разделены менее чем на 1000 п.н., и около 1–2%, по оценкам, имели ошибки. Дифференциальные взаимодействия (ДВ) между тремя разными группами были обнаружены с помощью пакета diffHic 66 . Пары считывались в пары бункеров 100 кбит / с. Бины отбрасывались, если обнаруживались на половых хромосомах, содержали менее 10, содержали геномные области, занесенные в черный список, как определено ENCODE для mm10 68 , или находились в центромерной или теломерной области.Фильтрация пар бинов выполнялась с использованием функции filterDirect, где пары бинов сохранялись только в том случае, если их средняя интенсивность взаимодействия более чем в 5 раз превышала частоту фонового лигирования. Частоту лигирования оценивали по межхромосомным парам бинов из матрицы подсчета пар бинов 500 кб. Подсчеты были нормализованы между библиотеками с использованием подхода на основе лесса. Тесты для DI были выполнены с использованием структуры квази-правдоподобия (QL) 69 пакета edgeR.Матрица дизайна была построена с использованием макета, в котором указывалась группа ячеек, к которой принадлежала каждая библиотека, и пол мыши. Зависимый от среднего тренд был подогнан к отрицательным биномиальным дисперсиям с помощью функции EstimationDisp. Обобщенная линейная модель (GLM) была приспособлена к счетчикам для каждой пары бинов 70 , и дисперсия QL была оценена из отклонения GLM с помощью функции glmQLFit. Затем дисперсии QL были сжаты до второй тенденции, зависящей от среднего, с использованием надежной эмпирической стратегии Байеса 71 .Значение P было вычислено относительно нулевой гипотезы для каждой пары бинов с использованием теста QL F . P Значения были скорректированы для множественного тестирования с использованием метода Бенджамини – Хохберга. DI был определен как пара бункеров с вероятностью ложного обнаружения (FDR) ниже 5%. DI, смежные в пространстве взаимодействия, были объединены в кластеры с помощью функции diClusters для создания кластерных DI. DI объединялись в кластер, если они перекрывались в пространстве взаимодействия, до максимального размера кластера 1 Мбит / с.Порог значимости для каждой пары бинов был определен таким образом, чтобы FDR на уровне кластера находился на уровне 5%. Статистика кластера была рассчитана с использованием пакета csaw v1.16.0 72 . Перекрытия между некластеризованными парами бинов и геномными интервалами были выполнены с использованием пакета InteractionSet 73 . Пледы были построены с использованием контактных матриц и функции plotHic из пакета Sushi R 74 .Цветовая палитра была взята из пакета viridis (https://github.com/sjmgarnier/viridis, доступ 30 марта 2018 г.), а диапазон интенсивностей цвета на каждом графике был масштабирован в соответствии с размером библиотеки образца. Функция plotBedpe пакета Sushi использовалась для построения некластеризованных DI в виде дуг, где показатель z , показанный на вертикальном доступе, был рассчитан как -log 10 ( p -значение). Эти данные были депонированы в базе данных Gene Expression Omnibus (номер доступа {«type»: «entrez-geo», «attrs»: {«text»: «GSE133246», «term_id»: «133246»}} GSE133246).
Флуоресцентная гибридизация in situ
Культивированные предшественники В-клеток ресуспендировали в гипотоническом 0,075 М растворе KCl и нагревали до 37 ° C в течение 20 мин. Клетки осаждали и ресуспендировали в смеси метанол: ледяная уксусная кислота в соотношении 3: 1 (об. / Об.). Фиксированные клетки помещали на покрытые полизином слайды Shandon TM (ThermoFisher Scientific) и сушили на воздухе. Клетки гибридизовали с зондами FISH (Creative Bioarray) при 37 ° C в течение 16 часов под покровным стеклом, закрытым Fixogum (Marabu), после денатурации при 73 ° C в течение 5 минут.Клетки промывали при 73 ° C в 0,4 × SSC / 0,3% NP 40 в течение 2 минут, затем 2 × SSC / 0,1% NP 40 в течение менее 1 минуты при комнатной температуре и сушили на воздухе в темноте и снимали крышку. . Изображения ядер получали на инвертированном конфокальном объективе Zeiss LSM 880 с иммерсионным масляным объективом с числовой апертурой 63 × / 1,4. Затем были захвачены Z-стопки изображений с использованием режима лямбда-сканирования, 405-го и многополосного светоделителя (488/561/633). Использовались следующие лазерные линии: 405, 488, 561 и 633 нм. Спектральные данные регистрировали с интервалом 8 нм.Во всех случаях изображения были настроены с размером пикселя 70 нм и интервалом 150 нм для z-стека. Отдельные контроли красителя, использующие ту же конфигурацию, были захвачены, и спектры импортированы для спектрального разделения с использованием программного обеспечения Zen (Zen 2.3, Zeiss Microscopy). Несмешанные данные затем деконволюционировали с помощью инструмента пакетной экспрессии в профессиональном программном обеспечении Huygens (Scientific Volume Imaging). Изображения анализировали с помощью программного обеспечения TANGO 75 после линейной деконволюции. Ядерные границы были выделены в TANGO с использованием фонового ядерного сигнала в канале Aqua.Был применен трехмерный медианный фильтр, и трехмерное изображение спроецировано с максимальной проекцией двумерного изображения для обнаружения ядер с использованием метода треугольника для автоматического определения порога в ImageJ 76 . Были заполнены дыры в двоичных изображениях и реализована двухмерная процедура разделения соприкасающихся ядер с использованием реализации 2D-водораздела ImageJ. Двухмерные границы обнаруженных ядер были расширены в трехмерном пространстве, и внутри каждой трехмерной ограниченной области была применена пороговая обработка треугольника для обнаружения ядерной границы в трехмерном пространстве.Полученные изображения от иммунофлуоресцентных зондов сначала были отфильтрованы с использованием трехмерного медианного и трехмерного фильтра «tophat» для улучшения пятноподобных структур с последующим применением плагина TANGO «spotSegmenter» с сохранением для анализа только четырех лучших пятен с самой высокой интенсивностью. Пятна, идентифицированные TANGO, были вручную проверены по исходному иммунофлуоресцентному изображению, чтобы идентифицировать и записать правильное расстояние, вычисленное TANGO между иммунофлуоресцентными зондами aqua и 5-Rox для обоих аллелей Igh в ядре.
Статистический анализ
Непарные двусторонние тесты Стьюдента t использовали с использованием GraphPad Prism (программное обеспечение GraphPad), если не указано иное. Если не указано иное, значение P <0,05 считалось значимым.
Подробная информация об используемых реактивах и программных пакетах представлена в дополнительной таблице 4 .
Вклад авторов
Концептуализация, A.P.N., M.S.Y.L, A.J.K., T.M.J., M.A.D., R.S.A., K.R., D.M.T., G.K.S., M.J.D., S.L.N. и W.S.A .; Методология, A.P.N., M.S.Y.L, C.C.B., O.G., T.M.J., T.B., A.J.K., M.J.H., M.A.D., R.S.A., K.R., D.M.T., G.K.S., M.J.D., S.L.N. и W.S.A .; Расследование, A.P.N., H.D.C., S.H., K.B., T.M.J., M.S.Y.L., C.C.B., O.G., Y.C.C., T.B., L.D., C.D.H., H.I., S.M., E.V., A.J.K., R.F., A.G., T. Формальный анализ, A.P.N., H.D.C., S.H., M.S.Y.L., O.G., C.C.B., Y.C.C. T.B., K.R., M.J.D., S.L.N; Письмо — Оригинальный проект, A.P.N .; Письмо — обзор и редактирование, A.P.N., H.D.C., S.H., M.S.Y.L., A.J.K., G.K.S., S.L.N. и W.S.A .; Финансирование Приобретение, A.P.N. и W.S.A .; Надзор, A.P.N., M.A.D., D.M.T., G.K.S., M.J.D., S.L.N. и W.S.A.
Разработанные варианты CRISPR-Cas12a и гибридные руководства ДНК-РНК обеспечивают надежное и быстрое тестирование COVID-19
Характеристика ферментов Cas12a с различными гРНК
Мы стремились оценить эффективность различных комплексов РНП Cas12a во флуоресценции транс -расщепление (рис.1a) и сравните их с тем, что используется в системе DETECTR 17 , где LbCas12a дикого типа был спарен с 20-нуклеотидной (нт) гРНК, нацеленной на N-ген SARS-CoV-2 (в данном документе называемой N-Mam гРНК ) (Рис. 1б). Для создания новых гРНК мы выровняли геномы SARS-CoV-2 и других родственных коронавирусов и выбрали шесть дополнительных сайтов-мишеней (O1, O2, S1, S2, S3 и N1), которые не только содержали соседний мотив протоспейсера TTTV (PAM ) для Cas12a, но также сильно различались между коронавирусами (дополнительный рис.1). Мы также очистили пять различных ферментов Cas12a для тестирования. Чтобы оценить возможность развертывания диагностического анализа на основе CRISPR в внелабораторных условиях (например, в домашних условиях), мы сначала провели реакции расщепления при комнатной температуре с использованием синтетических фрагментов ДНК. Флуоресценцию контролировали в течение 30 минут в считывающем устройстве для микропланшетов (рис. 1с и дополнительный рис. 2-4). Для гРНК N-Mam мы наблюдали, что, хотя LbCas12a может обнаруживать SARS-CoV-2 с минимальной перекрестной реактивностью для SARS-CoV или MERS-CoV, как и ожидалось, другие четыре фермента Cas12a работали аналогично, а enAsCas12a давала еще более высокую флуоресценцию. сигнала, чем LbCas12a в присутствии субстрата SARS-CoV-2.ГРНК N-Mam также была не самой идеальной для LbCas12a. Коллатеральная активность LbCas12a в комплексе с гРНК S3 была примерно вдвое выше, чем у того же фермента в комплексе с гРНК N-Mam в присутствии SARS-CoV-2. S2-гРНК также генерировала более сильные сигналы флуоресценции, чем N-Mam-гРНК, когда была спарена с LbCas12a, а также с AsCas12a, enAsCas12a и enRVR. Среди всех протестированных ферментов enAsCas12a продемонстрировал самую высокую коллатеральную активность с гРНК S2 в присутствии SARS-CoV-2.В целом минимальная длина спейсера для гРНК в нашем диагностическом анализе оказалась равной 20nt. Когда мы сократили длину спейсера для N-Mam или S2 гРНК до 18nt или 19nt, побочная активность всех нуклеаз Cas12a была снижена.
Рис. 1: Оценка различных комбинаций Cas12a-gRNA при комнатной температуре (24 ° C).a Схема флуоресцентного анализа расщепления транс . Здесь репортер представляет собой флуорофор, связанный с гасителем коротким фрагментом оцДНК.GRNA запрограммирована на распознавание определенного локуса генома SARS-CoV-2. В отсутствие вируса репортерная молекула не повреждена, и поэтому флуоресценция не наблюдается. Однако, когда присутствует вирус, Cas12a RNP будет связываться и расщеплять свою запрограммированную мишень, становиться гиперактивируемой и разрывать линкер между флуорофором и гасителем, тем самым генерируя сигнал флуоресценции. b Организация генома SARS-CoV-2. Гены, кодирующие структурные белки, обозначены зелеными прямоугольниками, а гены, кодирующие вспомогательные белки, обозначены голубыми прямоугольниками.Хотя ORF10 аннотирован в геноме, в настоящее время нет доказательств его экспрессии 71 . Расположение новых гРНК показано розовыми полосами под генами, а локус N-Mam показан красной полосой. c Измерения флуоресценции с использованием микропланшетного ридера после 30 мин реакции расщепления. 1E11 копии соответствующей ДНК-мишени присутствовали в 50 мкл реакции. Все показания были нормализованы к контролю без матрицы (NTC) в начале эксперимента. ГРНК N1 дала неожиданный результат, в результате чего она запускала побочную активность AsCas12a и его вариантов без матрицы.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [N-Mam, O1, O2, S2, S3], 4 [S1] или 6 [N1] биологических повторений). d Последовательности идеально согласованных (PM) или несовпадающих (MM) спейсеров, нацеленных на локус N-Mam. Каждая несовпадающая позиция обозначается жирной красной буквой. e Тепловая карта, показывающая толерантность различных ферментов Cas12a к несовпадающим гРНК N-Mam. Показания флуоресценции имеют шкалу от 0 до 1, где 1 — это максимальное полученное измерение, а 0 — фоновый сигнал для NTC в начале эксперимента. f Последовательности идеально согласованных (PM) или несовпадающих (MM) спейсеров, нацеленных на локус S2. Каждая несовпадающая позиция обозначается жирной красной буквой. г Тепловая карта, показывающая толерантность различных ферментов Cas12a к несовпадающим гРНК S2. Показания флуоресценции имеют шкалу от 0 до 1, где 1 — это максимальное полученное измерение, а 0 — фоновый сигнал для NTC в начале эксперимента. Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Затем мы проверили, как несовпадения на границе раздела гРНК-субстрат могут влиять на сигнал флуоресценции.Мы создали десять новых gRNAs, нацеленных на локус N-Mam, каждая из которых несла единственную точечную мутацию в различных местах вдоль спейсера (рис. 1d). Из анализа расщепления trans мы обнаружили, что LbCas12a очень чувствителен к несовершенному спариванию оснований между гРНК и целевым субстратом, поскольку любое несоответствие вдоль спейсера снижает выход флуоресценции до почти фоновых уровней, в то время как AsCas12a и его варианты были способны выдерживать некоторые несоответствия (рис. 1e и дополнительный рис.5). В частности, enAsCas12a оказался наиболее устойчивым к несоответствию единичных нуклеотидов среди пяти протестированных ферментов. Чтобы проверить результаты, мы создали десять дополнительных gRNAs, нацеленных на локус S2, каждая из которых несла точечную мутацию в разных положениях вдоль спейсера (рис. 1f). Интересно, что мы обнаружили, что отдельные несовпадения в локусе S2 влияют на коллатеральную активность всех эндонуклеаз Cas12a намного меньше, чем таковые в локусе N-Mam (Fig. 1g и Supplementary Fig. 6). Тем не менее, enAsCas12a снова продемонстрировал самую высокую толерантность к точечным мутациям, в то время как LbCas12a дикого типа снова оказался наиболее чувствительным к несовершенному спариванию оснований между гРНК и ее целевым субстратом.Мы далее подтвердили плохую толерантность LbCas12a к несоответствию, создав больше несовпадающих (MM) gRNAs, нацеленных на локус S3, и обнаружили, что побочная активность LbCas12a была значительно снижена для всех новых MM gRNAs (Supplementary Fig. 7).
Дальнейшая характеристика enAsCas12a с помощью гРНК S-гена
До сих пор мы выполнили обнаружение CRISPR-Cas при комнатной температуре (24 ° C), чтобы имитировать нелабораторные условия, но мы задавались вопросом, сможет ли наш диагностический анализ существенно работать. лучше при более оптимальной температуре реакции (37 ° C), а также если наши наблюдения о том, что enAsCas12a является более устойчивым ферментом, все еще сохраняются при более высокой температуре.Следовательно, мы повторили эксперименты по нацеливанию на S2 при 37 ° C. С помощью идеально подобранной (PM) гРНК мы наблюдали, что сигнал флуоресценции в нашем анализе расщепления trans увеличивался примерно в два раза быстрее при 37 ° C в присутствии предполагаемой матрицы SARS-CoV-2 для всех тестируемых ферментов и достигал гораздо более высокие уровни после 30 минут реакции, при этом демонстрируя небольшую перекрестную реактивность для SARS-CoV и MERS-CoV (рис. 2а и дополнительный рис. 8). Кроме того, профиль активности при наличии различных точечных мутаций оставался сходным, при этом enAsCas12a, как и прежде, демонстрировал лучшую устойчивость к несоответствию (рис.2b и дополнительный рис. 8). Следовательно, наши результаты показывают, что наш анализ на основе CRISPR следует проводить при 37 ° C, если требуется более быстрый результат, и что enAsCas12a является более подходящим ферментом для использования в диагностическом тесте, который устойчив к мутациям вирусного генома и внутриклеточному редактированию РНК. .
Фиг. 2: Активность и толерантность к несоответствию enAsCas12a с различными гРНК, нацеленными на S-ген.a Измерения флуоресценции для одной S2 гРНК в комплексе с различными нуклеазами Cas12a после 30 мин реакции расщепления trans при 37 ° C.По сравнению с более ранними результатами, полученными при 24 ° C, перекрестная реактивность для SARS-CoV или MERS-CoV все еще отсутствовала при более высокой температуре, но сигнал флуоресценции для SARS-CoV-2 был примерно в два раза выше. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). b Тепловая карта, показывающая толерантность различных ферментов Cas12a к несовпадениям в целевом сайте S2, когда анализ расщепления trans проводили при 37 ° C. Показания флуоресценции имеют шкалу от 0 до 1, где 1 — это максимальное полученное измерение, а 0 — фоновый сигнал для NTC в начале эксперимента. c Измерения флуоресценции enAsCas12a в комплексе с различными гРНК, нацеленными на S-ген SARS-CoV-2, после 30 мин реакции расщепления при 37 ° C. 1E11 копии ДНК присутствовали в 50 мкл реакции. Две из гРНК (S4 и S8) запускали побочную активность enAsCas12a без матрицы. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 [S9], 5 [S4, S5, S6, S7, S11, S14], 6 [S8, S10, S12, S13] или 7 [S15] биологических повторений). d Буферизация побочной активности enAsCas12a против SNV с помощью второй гРНК.Измерения флуоресценции здесь проводили через 30 мин реакции расщепления при 37 ° C. S6-гРНК использовали вместе с идеально согласованной (PM) или несовпадающей (MM10) S2-гРНК в отсутствие или в присутствии 0,1 М глицина. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [с глицином] или 4 [без глицина] биологических повторностей). (n.s. не значимо, P > 0,2; двусторонний тест Стьюдента t -тест). e Аналитический предел обнаружения (LoD) для enAsCas12a в комплексе как с гРНК S6, так и с идеально согласованной (PM) или несовпадающей (MM10) гРНК S2.Различные копии фрагментов РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут с использованием начального набора праймеров LAMP (0,2 мкМ каждого замещающего праймера, 1,6 мкМ каждого внутреннего праймера. и 0,8 мкМ каждого праймера петли). Затем проводили реакцию обнаружения Cas при 37 ° C, при этом измерения флуоресценции проводили через 10 мин. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 6 [2E6] или 7 [другие числа копий] биологических повторений). Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Хотя enAsCas12a проявляет более высокую толерантность к несовпадению, чем другие протестированные нуклеазы, на его активность все же могут заметно влиять несовпадения в определенных положениях вдоль интерфейса гРНК-мишень (например, MM10). Следовательно, чтобы еще больше повысить устойчивость анализа к вариантным нуклеотидам, мы попытались объединить две или более гРНК с этим ферментом. S2-гРНК хорошо работала с enAsCas12a, но сконструированная нуклеаза показала слабую активность расщепления trans как с S1, так и с S3-гРНК.Следовательно, мы провели скрининг дополнительных направляющих, нацеленных на область, окружающую локус S2, так что, когда мы объединили модуль обнаружения CRISPR с этапом изотермической амплификации, потребуется только один набор праймеров. На основе геномных последовательностей каждая из вновь созданных gRNA была в высшей степени уникальной для SARS-CoV-2 (дополнительный рисунок 9) и охватывала более 99,5% изолятов, аннотированных в GISAID, без несоответствий, вставок или делеций (инделек) (дополнительные данные) 2). По результатам флуоресцентного анализа расщепления trans , гРНК S6 оказалась наиболее многообещающим кандидатом, поскольку она проявляла наивысшую активность на мишени для SARS-CoV-2 с небольшой перекрестной реактивностью для SARS-CoV и MERS-CoV (рис.2c и дополнительный рис. 10).
Затем мы оценили, может ли вновь идентифицированная гРНК S6 устранить несоответствие в локусе S2. С этой целью мы собрали нуклеазу enAsCas12a как с гРНК S6, так и с идеально согласованной (PM) или несовпадающей (MM10) гРНК S2. Из анализа флуоресценции транс--расщепления с синтетической ДНК в качестве субстрата мы обнаружили, что не было значительной разницы в коллатеральной активности между гРНК S2 PM и гРНК S2 MM10, когда присутствовала гРНК S6 ( P > 0.2, двусторонний тест Стьюдента t ) (рис. 2d и дополнительный рис. 11). Кроме того, введение в реакцию глицина, который, как сообщалось, улучшает однореакторный тест STOPCovid 22 , также не оказывал значительного влияния на модуль обнаружения Cas.
Затем мы попытались объединить RT-LAMP с нашим модулем обнаружения двух гРНК CRISPR и сравнить чувствительность анализа в отсутствие или при наличии несоответствия в локусе S2. Мы протестировали три набора праймеров LAMP и обнаружили один набор, который хорошо амплифицировался даже при небольшом вводе (дополнительный рис.12). С этим выбранным набором праймеров мы провели RT-LAMP на вариабельных копиях синтетических матриц РНК SARS-CoV-2, транскрибированных in vitro (IVT), при 65 ° C в течение 15 минут перед использованием амплифицированных продуктов сразу в нашем trans — анализ расщепления. В целом, мы не обнаружили очевидной разницы в чувствительности между гРНК S2 PM и гРНК S2 MM10 при одновременном развертывании гРНК S6 (рис. 2e и дополнительный рис. 13). Взятые вместе, наши результаты демонстрируют, что использование двух гРНК может повысить надежность CRISPR-Dx в отношении присутствия вариантных нуклеотидов.
Буферизация реакции LAMP против вариантных нуклеотидов
Помимо модуля обнаружения Cas, мутации или редактирование вирусного генома также могут влиять на стадию изотермической амплификации. Следовательно, мы стремились определить, какие праймеры LAMP были более восприимчивыми к несовпадениям в их сайтах связывания. Оригинальный метод основан на двух внутренних праймерах, известных как FIP и BIP, и двух праймерах смещения, известных как F3 и B3, которые в совокупности нацелены на шесть различных областей в матрице ДНК (рис.3а). Мы предположили, что несовпадения на 3’-конце каждого праймера могут влиять на удлинение ДНК-полимеразой Bst. Поэтому мы протестировали реакцию RT-LAMP с праймерами с идеальным соответствием (PM) или праймерами с несовпадением (MM), расположенными на первом, втором или третьем нуклеотиде с 3’-конца (рис. 3b). Более того, поскольку несовершенное спаривание оснований может также влиять на удлинение свободного 3′-конца гантельной ДНК, генерируемой во время LAMP (рис. 3a), мы дополнительно протестировали реакцию с праймерами FIP или BIP, несущими несовпадение на своих 5′-концах (рис. .3б). За реакцией RT-LAMP следили в режиме реального времени с помощью флуоресцентного красителя. Наши эксперименты показали, что несовпадения двух смещающих праймеров не оказали заметного влияния на этап амплификации (рис. 3c). Напротив, несовпадения на 3 ’концах FIP и BIP, а также на 5’ конце FIP значительно снижали скорость амплификации ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t ).
Рис. 3: Оценка и повышение надежности LAMP.a Схема ЛАМПЫ.Шесть различных областей в целевом локусе (F1, F2, F3, B1, B2 и B3) распознаются четырьмя коровыми праймерами, у которых есть черная стрелка на их 3 ’концах, что означает удлинение ДНК-полимеразой. FIP представлен темно-зеленым прямоугольником, соединенным с наклонным светло-голубым прямоугольником. BIP представлен темно-коричневым прямоугольником, соединенным со скошенным светло-фиолетовым прямоугольником. Кроме того, праймер замещения F3 представлен красным прямоугольником, а праймер замещения B3 представлен оранжевым прямоугольником.Буква «c», добавленная к имени каждого региона, указывает на обратную комплементарную последовательность. После процесса оптимизации LAMP мы включили роевые праймеры, последовательности которых эквивалентны F1c и B1c. Более того, чтобы продемонстрировать, как несовпадение на 5’-конце FIP может повлиять на реакцию LAMP, мы добавили желтую звездочку, чтобы отслеживать прогрессирование несовпадения. b Протестированы последовательности праймеров LAMP. Несоответствия обозначены жирными красными буквами. c Полосовая диаграмма, показывающая, как несоответствие между праймерами LAMP и их сайтами связывания влияет на скорость изотермической амплификации.RT-LAMP выполняли при 65 ° C в приборе реального времени с 20000 копий синтетической РНК, соответствующей S-гену SARS-CoV-2. Значения порога цикла (Ct) были получены прибором с использованием настроек по умолчанию. Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют среднее значение ( n = 3 [F3 MM, B3 MM] или 4 [PM, FIP (3 ‘) MM, BIP (3’) MM, FIP (5 ‘) ММ, BIP (5’) MM, NTC] биологические реплики). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Полосовая диаграмма, показывающая восстановление реакции LAMP с помощью усеченных праймеров и ДНК-полимеразы высокого качества Q5 в присутствии несовпадений на 3 ’концах FIP и BIP. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 4 [FIP PM + tPM + Q5, BIP PM + tPM + Q5], 5 [PM, PM + Q5, FIP MM + tPM + Q5, FIP PM + tPM, BIP MM + tPM + Q5, BIP PM + tPM] или 6 [FIP MM, FIP MM + Q5, FIP MM + tPM, BIP MM, BIP MM + Q5, BIP MM + tPM, NTC ] биологические реплики). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . e Полосная диаграмма, показывающая восстановление реакции LAMP с помощью усеченных праймеров и ДНК-полимеразы высокого качества Q5 в присутствии несовпадающего на 5 ’конце FIP. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 4 биологических повтора). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t .Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Затем мы стремились разработать или применить стратегии для повышения устойчивости реакции LAMP против потенциальных вариантных нуклеотидов. Мы рассудили, что, поскольку MM1 вызывает наибольшее снижение эффективности амплификации, использование праймера FIP или BIP, который был усечен прямо на конце, позволило бы вообще избежать наиболее опасного несоответствия (рис. 3b). Действительно, использование смеси исходных внутренних праймеров и усеченных праймеров (tPM-3 или tPM-5) привело к значительному улучшению скорости амплификации ( P <0.05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 3г, д). Кроме того, мы отметили, что ДНК-полимераза Bst не обладает экзонуклеазной активностью 3’-к-5 ’и, таким образом, столкнется с трудностями при удлинении любой ДНК с несовпадениями на 3’ конце. Одним из возможных решений было добавление в реакцию LAMP небольшого количества высокоточной ДНК-полимеразы, которая обладала способностью корректировать считывание и, таким образом, могла помочь удалить любые несовпадающие основания на 3’-конце 49 . Действительно, мы обнаружили, что добавление 0,15U высокоточной полимеразы действительно привело к значительному увеличению скорости реакции, несмотря на наличие концевых несовпадений в FIP или BIP ( P <0.05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 3г, д). Примечательно, что в случае несовпадений на 3 ’концах внутренних праймеров наблюдалось еще большее улучшение эффективности амплификации, когда две стратегии усеченных праймеров и высокоточной ДНК-полимеразы использовались вместе (фиг. 3d). В совокупности наши результаты показывают, что мы можем повысить устойчивость реакции LAMP против вариантных нуклеотидов с помощью двух наборов внутренних праймеров (полноразмерных и tPM-3) и высокоточной полимеразы.
Стратегии повышения чувствительности LAMP
Важным показателем, используемым для оценки эффективности диагностического анализа, является его чувствительность. Хотя наш анализ содержал функции для обработки SNV в вирусном геноме, мы отметили, что по мере уменьшения числа копий с 2E6 до 2, чувствительность теста также монотонно снижалась (рис. 2e и дополнительный рис. 13). Следовательно, мы стремились повысить чувствительность нашего анализа.
Во-первых, мы проверили, как вариации концентраций праймеров могут влиять на реакцию LAMP.Мы сосредоточились на праймерах смещения (F3 и B3) и внутренних праймерах (FIP и BIP), которые были частью исходной установки LAMP. В качестве входных данных использовали 20 копий матрицы РНК, и реакцию отслеживали в приборе в реальном времени с флуоресцентным красителем (рис. 4а). В целом мы заметили, что удвоение концентрации F3, FIP или BIP ухудшило производительность нашего CRISPR-Dx. Напротив, когда мы увеличили количество B3 в два раза, чувствительность анализа незначительно улучшилась: 75% (9 из 12) повторов показали успешную амплификацию.Это могло быть связано с тем, что праймер B3, предоставленный программным обеспечением для проектирования PrimerExplorer (https://primerexplorer.jp/e/), был неоптимальным.
Рис. 4: Методы повышения чувствительности LAMP.Полосная диаграмма , показывающая, как на чувствительность к LAMP влияет концентрация используемых праймеров. Мы протестировали различные концентрации вытесняющих праймеров и внутренних праймеров. RT-LAMP выполняли при 65 ° C в приборе реального времени с 20 копиями матрицы РНК, соответствующей S-гену SARS-CoV-2.Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение (n = 7 [1X, 2X F3, 2X FIP, 2X BIP], 10 [1X без tPM], 12 [2X B3] или 15 [NTC] биологические реплики). b Полосовая диаграмма, показывающая, как чувствительность LAMP изменялась 0,1 М глицином. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20 копиями матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 3 [NTC] или 6 [с шаблоном] биологических повторов). Значение P было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . c Полосовая диаграмма, показывающая, как чувствительность LAMP была изменена при использовании праймеров роя или стебля. Зеленая рамка разделяет четыре основных праймера, которые были включены в каждый эксперимент. Концентрации каждого вытесняющего праймера, внутреннего праймера, праймера петли, праймера роя и праймера стебля составляли 0,2, 1,6, 0,8, 1,6 и 1,6 мкМ соответственно. RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 5 [рой, стержень в , петля + стержень в , NTC для цикла + рой] или 7 [цикл, цикл + рой , NTC для петли] биологических реплик).Значение P- было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Дальнейшее рассечение праймеров стебля. На полосовой диаграмме показано влияние различных праймеров для стебля на чувствительность к LAMP. Здесь каждая реакция содержала праймеры замещения (0,2 мкМ каждый), внутренние праймеры (1,6 мкМ каждый) и праймеры петли (0,8 мкМ каждый). Кроме того, он также может содержать либо два дополнительных праймера для роя, либо один или два дополнительных праймера для стебля (с концентрацией каждого дополнительного праймера, равной 1.6 мкМ). RT-LAMP выполняли при 65 ° C с 20000 копий матрицы РНК. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 3 [NTC] или 4 [с шаблоном] биологических повторов). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . e Аналитическая LoD для enAsCas12a в комплексе как с гРНК S6, так и с гРНК PM или MM10 S2. RT-LAMP выполняли при 65 ° C в течение 15 минут в оптимизированных условиях, которые включали удвоение концентрации B3 до 0.4 мкМ, используя как полноразмерные, так и усеченные 1nt внутренние праймеры (1,6 мкМ каждый), включая праймеры роя (1,6 мкМ каждый), и добавляя 0,15 ЕД полимеразы Q5 и 0,1 М глицина в каждую реакцию. Показаны показания флуоресценции с использованием микропланшетного ридера после 10 мин реакции расщепления при 37 ° C. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 5 [2E6] или 6 [другие числа копий] биологических копий). f Аналитическая LoD для enAsCas12a, когда в вирусной матрице присутствовала мутация S254F.Нуклеаза была собрана либо с гРНК S2 отдельно, либо с гРНК S2 и S6. Эти гРНК были разработаны таким образом, чтобы полностью соответствовать эталонному геному SARS-CoV-2. RT-LAMP выполняли при 65 ° C в течение 15 минут в оптимизированных условиях. Показаны показания флуоресценции через 10 мин реакции расщепления при 37 ° C. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 5 биологических повторов). г Эксперименты, аналогичные f , за исключением того, что использовали другой репортер и в каждую пробирку с образцом добавляли индикаторную полоску после 10 минут реакции расщепления.Полосы на щупах появились через 2 мин. Красная стрелка указывает на тестовые полосы, а зеленая стрелка указывает на контрольные полосы. Отношение интенсивности тестовой полосы к интенсивности контрольной полосы указано под каждым щупом. Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Ферментная инженерия может улучшить производительность LAMP. Следовательно, во-вторых, мы сравнили несколько различных коммерчески доступных полимераз Bst, а именно Bst2.0, Bst3.0 (мутантная полимераза с внутренней активностью обратной транскриптазы) и Turbo Bst (полимераза, слитая с дополнительным ДНК-связывающим доменом), используя наша установка RT-LAMP (дополнительный рис.14). В то время как один только Bst3.0 работал хуже, чем исходный мастер-микс Bst2.0, который мы использовали, Bst3.0 с добавлением отдельной обратной транскриптазы значительно улучшал кинетику реакции ( P <0,01, односторонний показатель Стьюдента t -контрольная работа). Однако мы заметили, что комбинация Bst3.0 и дополнительной обратной транскриптазы очень склонна к ложной амплификации, давая сигнал флуоресценции даже в отсутствие матрицы. Более того, мы обнаружили, что хотя Turbo Bst также незначительно улучшал кинетику реакции, он также был значительно более подвержен ложной амплификации, чем Bst2.0 ( P <0,01, односторонний тест Стьюдента t -тест). Поэтому мы сохранили использование мастермикса Bst2.0 для последующих экспериментов.
В-третьих, мы спросили, может ли использование химических добавок повысить чувствительность LAMP. Недавнее исследование показало, что глицин и таурин могут улучшить кинетику одноразового теста STOPCovid 22 . Однако неясно, происходит ли улучшение в реакции RT-LAMP или в модуле обнаружения Cas. Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели реакцию RT-LAMP только с одним из двух химикатов или без них.В целом, наши данные показали, что добавление глицина увеличивало чувствительность RT-LAMP, причем более 90% (11 из 12) повторов показали успешную амплификацию 20 копий вирусной матрицы (рис. 4b). Добавление таурина также улучшало чувствительность анализа аналогично глицину, хотя использование обоих химических веществ вместе не имело синергетического эффекта (дополнительный рисунок 15). Помимо глицина и таурина, в другом исследовании сообщалось, что диметилсульфоксид (ДМСО) увеличивает чувствительность и специфичность реакций LAMP 50 .Сероорганическое соединение также часто используется в ПЦР для разрушения вторичных структур GC-богатых матриц. Однако мы обнаружили, что как 2,5%, так и 5% ДМСО вместо этого оказывали ингибирующее действие на LAMP (дополнительный рисунок 16). Двигаясь вперед, мы включили глицин в наш анализ, поскольку он обычно обнаруживается в лабораториях.
В-четвертых, мы задались вопросом, обеспечат ли альтернативные схемы реакции LAMP более высокую чувствительность. Хотя самый ранний метод LAMP основывался на четырех ядерных праймерах 8 , в последующих исследованиях были описаны улучшения этого метода за счет добавления новых наборов праймеров.Наиболее часто добавляемый набор праймеров представляет собой «петлевые праймеры» (LF и LB), которые нацелены на области одноцепочечных петель в гантелевых структурах, образующихся во время реакции 51 . Петлевые праймеры поставляются с четырехъядерными праймерами с помощью программного обеспечения для проектирования PrimerExplorer. Кроме того, два других набора праймеров, которые могут быть добавлены, включают «стеблевые праймеры», которые нацелены на одноцепочечную область между F1 / F2 / F3 и B1 / B2 / B3 (рис. 3a) 52 , и «роевые праймеры» ”, Которые отжигаются с цепью матрицы, противоположной цепи FIP или BIP, чтобы обнажить сайты связывания для внутренних праймеров 53 .Поэтому мы протестировали новые стволовые праймеры и праймеры для роев в сочетании с нашим предыдущим набором праймеров LAMP, нацеленных на S-ген SARS-CoV-2. Данные из нашей первоначальной серии экспериментов показали, что, хотя добавление стеблевых праймеров (Stem в ) было вредным для реакции RT-LAMP, возможно, из-за короткой области, доступной между F1 / F2 / F3 и B1 / B2 / B3, добавление Роевые праймеры значительно улучшили кинетику реакции ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t -тест) (рис.4в). Примечательно, что это улучшение наблюдалось только тогда, когда праймеры «роя» использовали с праймерами ядра и праймерами петли. Когда праймеры петли были опущены, амплификация произошла намного позже, чем наша первоначальная установка RT-LAMP, что указывает на то, что праймеры роя не могут заменить праймеры петли. Затем мы изучили конструкцию наших стержневых праймеров (Stem в ) и заметили, что они указывают друг на друга своими 3’-концами, конкурирующими за связывание с матрицей. Таким образом, мы протестировали каждый из праймеров индивидуально, а также оценили другую пару стеблевых праймеров (стержень из ), которые указывали друг от друга.Наши результаты показали, что один только праймер Stem в праймере , а также праймеры Stem из были способны улучшить кинетику реакции LAMP в различной степени (фиг. 4d). Более того, добавление одного или двух стержневых праймеров к смеси праймеров core, loop и swarm не улучшило кинетику LAMP (дополнительный рис. 17). Поэтому, двигаясь вперед, мы не стали продолжать изучение стеблевых праймеров и сосредоточились в основном на праймерах петель и роя. Наш последний набор праймеров LAMP высокоспецифичен для SARS-CoV-2, как показано выравниванием последовательностей нескольких коронавирусных геномов (дополнительный рис.18).
Мы оценили, могут ли оптимизированные условия LAMP вместе с нашим модулем обнаружения CRISPR с двумя гРНК (S2 и S6) улучшить чувствительность анализа и приспособиться к точечным мутациям. В отличие от исходных условий LAMP без каких-либо праймеров или глицина (рис. 2e и дополнительный рис. 13), мы обнаружили, что сигнал флуоресценции не падал так сильно с уменьшением количества матрицы РНК, когда мы использовали оптимизированные условия (рис. 4e и Дополнительный рис. 19а). Аналитический предел обнаружения (LoD) составлял 20 копий на реакцию с нашими оптимизированными условиями, независимо от отсутствия или присутствия несоответствия в локусе S2.Эта чувствительность была дополнительно подтверждена анализом бокового потока (дополнительный рисунок 19b), который представляет собой удобную бумажную платформу для считывания результатов (дополнительный рисунок 20).
Вместо того, чтобы искусственно создавать несовпадения в gRNA, мы стремились оценить надежность нашего анализа с реальной мутацией в матрице-мишени с использованием PM gRNAs. С этой целью мы выбрали известную мутацию S254F в S-гене 54,55,56,57 , которая потенциально может мешать связыванию гРНК S2.При нацеливании мутантной вирусной РНК с enAsCas12a в комплексе только с гРНК S2 мы наблюдали низкие уровни флуоресценции, которые близки к фону для количества копий матрицы до 2E6 (фиг. 4f и дополнительный фиг. 21). Напротив, нацеливание на мутантную матрицу S254F как с гРНК S2, так и с S6 давало гораздо более высокие сигналы флуоресценции. Мы дополнительно подтвердили эти результаты с помощью анализа бокового потока, в котором положительный результат теста был четко получен с двумя гРНК, даже когда присутствовали только 20 копий мутантной матрицы (рис.4г). В совокупности данные показывают, что наш анализ устойчив к вариантным нуклеотидам в вирусной мишени и может обнаруживать низкие копии SARS-CoV-2.
Обнаружение вирусной РНК в образцах общей РНК человека
Оценив эффективность нашего теста VaNGuard с чистыми синтетическими РНК, мы затем попытались оценить наш анализ в более реалистичных ситуациях. В частности, мы задавались вопросом, может ли РНК SARS-CoV-2 все еще обнаруживаться в большом пуле человеческой РНК. Во-первых, мы добавили 20000 копий вирусной РНК, транскрибированной in vitro, в 10 нг общей РНК, экстрагированной из различных линий клеток человека, а затем провели RT-LAMP в оптимизированных условиях с последующим анализом расщепления флуоресценции trans как с S2, так и с помощью S6 гРНК (рис.5а и дополнительный рис. 22). Наши данные показали, что присутствие сложного пула РНК человека не оказало значительного влияния на сигнал флуоресценции анализа ( P > 0,2, односторонний тест Стьюдента t -тест). Мы также проверили, может ли присутствие человеческой РНК и геномной ДНК вместе помешать обнаружению вируса, но не наблюдали заметной потери сигнала флуоресценции.
Рис. 5: Оценка теста VaNGuard в более реалистичных условиях.a 20000 копий синтетических фрагментов РНК SARS-CoV-2 были добавлены к 10 нг общей РНК, экстрагированной из различных иммортализованных линий клеток человека, для имитации инфекции в различных типах клеток [HEK293T: предшественник надпочечников, A549: легкие, PC9: легкое, HCC2279: легкое, HL60: кровь (промиелоциты), THP-1: кровь (моноциты), U937: кровь (моноциты), K562: кровь (гранулоциты / эритроциты) и Jurkat: кровь (Т-клетки)]. Чистые синтетические вирусные РНК использовали в качестве контроля. Контрольные образцы или образцы РНК с добавками служили входными данными для RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 15 минут.Затем проводили реакцию обнаружения Cas при 37 ° C, через 30 мин проявлялась флуоресценция. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [все, кроме контроля и РНК HEK293T], 6 [контроль] или 7 [РНК HEK293T] биологических повторностей). Не было значительной потери сигнала в присутствии РНК человека (н.у .: не значимо, P > 0,2; односторонний тест Стьюдента t -тест). b Аналитическая LoD для матрицы двойной мутантной РНК S254F N234N либо сама по себе, либо в смеси с 10 нг общей РНК человека из клеток HCC2279.Различные копии синтетической вирусной матрицы (с РНК человека или без нее) использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 15 мин. Затем проводили реакцию обнаружения Cas при 37 ° C, через 10 мин проявлялась флуоресценция. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. (n = 4 биологических повтора). c Аналитическая LoD для очищенной синтетической РНК-матрицы SARS-CoV-2 дикого типа в присутствии 2 или 4 мкл UTM. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). d Аналитическая LoD для матрицы двойной мутантной РНК дикого типа (WT) или S254F N234N, смешанной с 10 нг общей РНК человека из клеток HCC2279 в присутствии 2 мкл UTM.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Во-вторых, мы спросили, повлияет ли присутствие сложного пула человеческой РНК на чувствительность нашего анализа на COVID-19, если вирусная последовательность была изменена или изменена. С этой целью мы создали синтетический вирусный шаблон, содержащий не только мутацию S254F, но и вторую молчащую мутацию N234N, которая была обнаружена по крайней мере в десяти секвенированных изолятах SARS-CoV-2 со всего мира (дополнительные данные 2).В то время как первая мутация может влиять на распознавание мишени с помощью гРНК S2, вторая мутация может влиять на связывание мишени с помощью гРНК S6. Мы исследовали чувствительность нашего анализа, используя эту двойную мутантную вирусную матрицу либо отдельно, либо в пуле общей человеческой РНК из линии клеток легких HCC2279. Обнадеживает то, что мы обнаружили, что LoD оставался на уровне 20 копий на реакцию в обоих случаях (рис. 5b и дополнительный рис. 23), что подчеркивает надежность нашего теста VaNGuard против известных мутаций в вирусной РНК даже в присутствии полной человеческой РНК.
В-третьих, поскольку использование образцов пациентов напрямую без дополнительного этапа выделения РНК уменьшит время и стоимость диагностического теста, мы исследовали, могут ли различные среды для сбора образцов влиять на производительность нашего анализа (дополнительный рис. 24). Поразительно, но всего 1 мкл имеющегося в продаже реагента SAFER Sample было достаточно, чтобы полностью заблокировать реакцию RT-LAMP. Напротив, до 4 мкл универсальной транспортной среды (UTM) можно было переносить с незначительным снижением кинетики RT-LAMP.Реакция изотермической амплификации также может вместить до 4 мкл QuickExtract, хотя и в меньшей степени, чем UTM. Тем не менее, когда мы изучали влияние UTM на весь рабочий процесс RT-LAMP-CRISPR, мы заметили, что 4 мкл UTM явно снижают чувствительность нашего теста VaNGuard по сравнению с всего 2 мкл этой широко используемой среды сбора (рис. 5c и Дополнительный рис.25). Следовательно, мы заключаем, что до 2 мкл (или менее 10% объема) UTM может быть добавлено в наш анализ без каких-либо неблагоприятных последствий для его работы.Впоследствии мы исследовали чувствительность анализа с использованием вирусной матрицы дикого типа или двойного мутанта, смешанной с общей РНК из клеток HCC2279 в 2 мкл UTM, и обнаружили, что наличие двух мутаций в сайтах связывания гРНК все еще не ухудшало LoD нашего анализ (рис. 5d и дополнительный рис. 26). В целом, наши результаты показывают, что образцы пациентов в небольшом количестве UTM могут использоваться непосредственно в нашем тесте VaNGuard, не влияя на его устойчивость к SNV в шаблоне.
Условия реакции, влияющие на коллатеральную активность enAsCas12a
В наших предыдущих анализах бокового кровотока, хотя положительные результаты тестов были получены для образцов, содержащих не менее 20 копий синтетической РНК SARS-CoV-2, мы заметили, что тестовые полосы были относительно слабыми по сравнению с контрольные полосы (рис.4g и дополнительный рис. 19b). Мы предположили, что мы могли бы использовать неоптимальный буфер (буфер 3.1) для анализа, опосредованного enAsCas12a. Следовательно, мы протестировали альтернативный реакционный буфер (буфер 2.1) вместе с различной продолжительностью теста и более высокими концентрациями Cas12a RNP (рис. 6a). В целом, мы наблюдали, что реакции в исходном буфере показали более медленную кинетику, чем реакции в альтернативном буфере. Например, интенсивность тестовой полосы после 20 минут в буфере 3.1 была достигнута примерно за 10 минут в буфере 2.1. Более того, увеличение концентрации Cas12a RNP по крайней мере на 50% также усиливало тестовый сигнал. Поэтому мы повторно оценили чувствительность нашего теста VaNGuard с использованием буфера 2.1 и матриц РНК SARS-CoV-2, транскрибированных in vitro (рис. 6b). Более сильные тестовые полосы наблюдались от 2 до 2E6 копий вирусных матриц дикого типа и мутантного S254F с реакцией обнаружения Cas, выполняемой всего за 10 мин.
Рис. 6: Оптимизация условий реакции для enAsCas12a.a Оценка различных экспериментальных условий, включая разные концентрации enAsCas12a и разную продолжительность реакции расщепления.1X указывает 65 нМ. 2E6 копии синтетической РНК SARS-CoV-2 дикого типа служили входными данными для RT-LAMP. b Обнаружение последовательности SARS-CoV-2 дикого типа или мутантного S254F с использованием гРНК S2 и S6. Различные копии фрагментов РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 15 мин. Затем реакцию обнаружения Cas проводили при 37 ° C в течение 10 мин в буфере 2.1 с DTT перед добавлением щупа в каждую реакционную пробирку. c Систематическое тестирование различных реакционных буферов и температур для стадии обнаружения Cas.Здесь enAsCas12a в комплексе только с гРНК S2 использовали в анализе 50 мкл trans -расщепления с 2E11 копиями матрицы ДНК, соответствующей S-гену SARS-CoV-2. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [41 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C только Tango, 60 ° C без DTT и NTC], 4 [37 ° C, 55 ° C все, кроме только Tango], или 6 [60 ° C с DTT] биологические повторы). d Предварительная оценка нашего теста VaNGuard с оставшимися образцами пациентов. Значение Ct 30 было оценено как эквивалент 500 копий вируса.RT-LAMP выполняли при 65 ° C в течение 15 минут, затем реакцию обнаружения Cas проводили при 37 ° C в течение 10 минут в CutSmart с DTT. Каждый клинический образец тестировался дважды с помощью тест-полосок. e Повторное тестирование пилотного набора клинических образцов РНК с использованием считывания флуоресценции. RT-LAMP проводили при 65 ° C в течение 15 мин. Впоследствии 4 мкл продуктов LAMP (из 25 мкл) использовали для анализа расщепления trans , который проводили при 37 ° C в приборе реального времени, где измерения проводились каждую минуту.Показания флуоресценции для всех шести клинически отрицательных образцов оставались низкими на протяжении всего эксперимента. Кроме того, показания флуоресценции для пяти из шести клинически положительных образцов показали явное экспоненциальное увеличение со временем. Оставшийся положительный образец (RP6), который содержал 14 копий вируса, давал сигналы флуоресценции, которые были лишь немного выше сигналов отрицательных образцов. Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Ободренные этими результатами, мы систематически исследовали условия реакции, при которых очищенный белок enAsCas12a был активен in vitro.В частности, мы протестировали четыре различных буфера с дитиотреитолом (DTT) или без него в диапазоне температур с использованием гРНК S2 с enAsCas12a (рис. 6c и дополнительный рис. 27). Неожиданно мы обнаружили, что enAsCas12a был активен в нашем анализе расщепления транс при всех испытанных температурах. В целом сконструированный фермент показал лучшие результаты в буферах, содержащих ацетатные соли (CutSmart и Tango), чем в буферах, содержащих хлоридные соли (Buffer 2.1 и Buffer 3.1). При 37 ° C CutSmart с DTT оказался лучшим буфером для использования с enAsCas12a, а при 60 ° C Tango оказался наиболее подходящим.Добавление DTT помогло в определенных условиях реакции, например CutSmart при 37 ° C (дополнительный рисунок 28). Мы также подтвердили, что DTT требуется в буфере CutSmart для enAsCas12a для оптимального функционирования при 37 ° C с использованием гРНК S6 (дополнительный рисунок 29).
Впоследствии мы применили наш диагностический анализ к экспериментальному набору оставшихся образцов РНК, взятых из мазков из носоглотки (NP) пациента, которые ранее были проанализированы с помощью qRT-PCR в больнице (рис. 6d). Мы выбрали образцы, которые демонстрировали диапазон значений Ct, и выполнили этап обнаружения Cas при 37 ° C в буфере CutSmart с DTT.Все шесть образцов, которые были отрицательными при анализе qRT-PCR, также оказались отрицательными при анализе бокового потока, что свидетельствует о 100% специфичности нашего теста VaNGuard. Кроме того, пять из шести инфицированных образцов дали очевидные положительные результаты на индикаторных полосках, а оставшийся образец дал тестовую полосу, нормализованная интенсивность которой была лишь немного выше фоновой. Мы подтвердили результаты, повторив тест на том же наборе образцов пациентов, используя вместо этого считывание флуоресценции на приборе в реальном времени (рис.6д). Следовательно, наш анализ, по-видимому, смог обнаружить SARS-CoV-2 в клинических образцах РНК, содержащих не менее 93 копий вируса, что соответствовало пороговому значению цикла (Ct) 32,42 для используемого набора qRT-PCR.
Разработка руководств для повышения чувствительности обнаружения Cas12a
Из экспериментальной оценки клинических образцов мы заметили, что, хотя наш анализ дал положительный результат теста для инфицированного образца со значением Ct 32,42, интенсивностью тестовой полосы и сигнал флуоресценции был слабее, чем у образцов с более высокой вирусной нагрузкой (рис.6г, д). Поэтому мы спросили, можно ли повысить чувствительность модуля обнаружения Cas. С этой целью мы стремились определить, будут ли модифицированные гРНК повышать активность бесклеточного расщепления наших очищенных РНП Cas12a in vitro, поскольку в предыдущих исследованиях сообщалось, что такие гРНК могут увеличивать активность расщепления цис — и транс Нуклеазы Cas9 и Cas12a 32,58,59,60,61,62,63,64 . Во-первых, мы проверили, могут ли удлинения гРНК на ее 3’-конце увеличивать активность наших ферментов Cas12a.Мы пробовали расширения U 3 , U 8 и U 4 AU 6 , но в отличие от предыдущей работы 32,62 , мы не наблюдали заметного или последовательного улучшения активности (дополнительный рисунок 30) .
Во-вторых, мы спросили, будут ли расширения гРНК на ее 5 ’конце увеличивать побочную активность enAsCas12a. Сообщалось, что такие расширения увеличивают эффективность редактирования генов Cas12a в клетках и in vivo 63 . Мы удлинили 5 ’конец гРНК S2 на 4nt или 9nt (рис.7а). В то время как удлинение на 4 нуклеотида не привело к значительному улучшению сигнала флуоресценции в анализе расщепления trans , удлинение на 9 нуклеотидов действительно увеличило активность enAsCas12a при 37 ° C значительно ( P <0,001, односторонняя оценка Стьюдента ). t -test) (Рис. 7b и Дополнительный Рис. 31).
Рис. 7. Руководство по разработке для улучшения модуля обнаружения CRISPR.a Последовательности исходной гРНК, нацеленной на S2, и модифицированных гидов, оцениваемых в нашей работе.5-дюймовые удлинители обозначены зеленым цветом. 2’-O-метилрибонуклеотиды (2’OMe РНК) обозначены строчной буквой m перед соответствующим нуклеотидом. 2’-дезокси-2’-фтор-рибонуклеотиды (2’F РНК) показаны фиолетовым цветом. Нуклеотиды ДНК обозначены красным цветом. Фосфоротиоатные (ФС) связи отмечены звездочками. b Сравнение 5’-удлиненных гРНК с исходной гРНК, нацеленной на S2, при 37 ° C для enAsCas12a. Измерения флуоресценции здесь проводили с использованием считывающего устройства для микропланшетов после 5 мин реакции расщепления с 2E11 копиями синтетической ДНК.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 6 [S2 5’ext (+9)] или 11 [S2, S2 5’ext (+4)] биологических повторений). Значение P- было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . c Сравнение химически модифицированной gRNA с исходной S2-нацеленной gRNA при 37 ° C для enAsCas12a. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [S2 SARS, S2 MERS], 6 [S2 chem mod SARS, S2 chem mod MERS] или 8 биологических повторений [COVID-19, NTC]). Значение P было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Сравнение гибридных гидов ДНК-РНК с исходной гРНК, нацеленной на S2, при 37 ° C для различных ферментов Cas12a. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t-. e Последовательности исходной гРНК, нацеленной на S6, и модифицированных гидов, оцениваемых в нашей работе. 5-дюймовые удлинители обозначены зеленым цветом. Нуклеотиды ДНК обозначены красным цветом. f Сравнение 5’-удлиненных гРНК и руководства по гибридным ДНК-РНК с исходной S6-нацеленной гРНК при 37 ° C для enAsCas12a.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [S6 4DNA] или 4 [S6, S6 5’ext (+4), S6 5’ext (+9)] биологических повторений). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . г , ч Сравнение 5’-удлиненных гРНК и гибридных гидов ДНК-РНК с соответствующими немодифицированными гРНК при 60 ° C для enAsCas12a. Направляющие S2-targeting и S6-targeting тестировались отдельно. Измерения флуоресценции здесь проводили после г, 5 мин и ч 30 минут реакции расщепления с 2E11 копиями синтетической ДНК.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . i Оценка нашего модуля CRISPR с двумя гРНК с использованием неизмененных и модифицированных руководств. Измерения флуоресценции проводились каждые 5 минут с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Опосредованную enAsCas12a реакцию расщепления проводили при 60 ° C с 2E11 копиями синтетической ДНК. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 [S2 + S6 отрицательные контроли, S2 4DNA + S6 5’ext (+9)] или 5 [S2 + S6 COVID-19, S2 4DNA + S6 4DNA] биологических повторений).Исходные данные доступны в файле исходных данных.
В-третьих, мы спросили, будут ли гРНК, несущие дополнительные химические модификации, обеспечивать более высокую побочную активность с enAsCas12a, чем обычные гРНК. В частности, мы исследовали руководство, нацеленное на локус S2, которое содержало основания 2’-O-метил РНК, основания 2’-фтор и фосфоротиоатные связи в различных положениях (рис. 7a). Дизайн был основан на предыдущей работе, которая показала, что такое руководство дает более высокую эффективность редактирования Cas12a, чем обычная гРНК в человеческих клетках 64 .Мы обнаружили, что дополнительные химические модификации действительно повышали скорость реакции обнаружения Cas при 37 ° C ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 7c и дополнительный рис. 32).
В-четвертых, мы оценили, будут ли гибридные гиды ДНК-РНК давать более высокие побочные активности с AsCas12a и его сконструированными вариантами, чем обычные гиды, содержащие только основания РНК. С этой целью мы создали направляющие для S2-нацеливания, которые содержали две или четыре замены оснований ДНК (рис.7а). Мы начали с изменений на 3 ’конце направляющей, потому что эта область направляющей, образованная комплексом с ее мишенью, оказалась неупорядоченной в ранее решенной кристаллической структуре и, таким образом, могла быть гибкой 65 . Кроме того, мы попробовали замены в положениях 1 и 8 в спейсере, поскольку ранее было показано, что эти положения допускают несовпадения 66 . При 37 ° C оба наших гибридных гида (с двумя или четырьмя основаниями ДНК) смогли значительно увеличить коллатеральную активность AsCas12a и его сконструированных вариантов по сравнению с исходной гРНК без оснований ДНК ( P <0.05, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 7d и дополнительный рис. 33).
Мы стремились проверить влияние модификаций справочника с использованием другого целевого сайта, локуса S6. С этой целью мы создали три новых направляющих для S6 — одну гРНК с 5 ’удлинением на 4 нуклеотида, одну гРНК с 5’ удлинением на 9 нуклеотидов и одну гибридную направляющую с четырьмя заменами оснований ДНК (рис. 7e). Мы решили не заниматься химически модифицированной гРНК, потому что она была намного дороже, чем гибридная ДНК-РНК-гид, но не работала лучше.В целом, мы обнаружили, что результаты анализа транс--расщепления, проведенного при 37 ° C для локуса S6, отражают результаты для локуса S2 (рис. 7f и дополнительный рис. 34). Удлинение гРНК на 9nt на 5 ’конце или замена четырех оснований РНК основаниями ДНК значительно увеличивали побочную активность enAsCas12a ( P <0,01, односторонний тест Стьюдента t ).
Поскольку enAsCas12a оказался активным в широком диапазоне температур, мы затем попытались оценить модифицированные направляющие при 60 ° C.Для набора направляющих, нацеленных на S2, мы наблюдали, что обе гРНК с 5 ’удлинениями, а также оба гибридных ДНК-РНК-проводника демонстрируют более быструю кинетику реакции с enAsCas12a, чем исходная немодифицированная гРНК; через 5 минут они генерировали значительно более высокие сигналы флуоресценции в анализе расщепления trans ( P <0,001, односторонний тест Стьюдента t ) (рис. 7g и дополнительный рис. 35). Неожиданно, однако, две гРНК с 5 ’удлинениями вызвали побочную активность enAsCas12a даже в отсутствие матрицы, о чем свидетельствует очевидное увеличение фонового сигнала к 30 минутам времени реакции (рис.7h и дополнительный рис. 35). Аналогичные результаты были получены с тремя разными реакционными буферами. Двигаясь вперед, мы исключили эти две гРНК из дальнейшего рассмотрения. Для набора направляющих S6-targeting результаты, полученные при 60 ° C, совпадают с результатами, полученными при 37 ° C (рис. 7g, h и дополнительный рис. 36). Как гРНК с 9-нуклеотидным 5 ‘удлинением, так и гибридная направляющая значительно увеличивали скорость реакции ( P <0,05, односторонний тест Стьюдента t ), и не было неожиданного запуска коллатеральной активности enAsCas12 в отсутствие шаблона.
Впоследствии мы спросили, как одновременное развертывание двух модифицированных направляющих вместе с enAsCas12a может улучшить модуль обнаружения CRISPR. Мы сравнили исходный набор немодифицированных гРНК S2 и S6 с гибридной направляющей S2, содержащей четыре основания ДНК, объединенной либо с гРНК S6, удлиненной на 9nt на ее 5 ’конце, либо с гибридной направляющей S6, содержащей четыре основания ДНК (рис. 7i). В присутствии предполагаемого шаблона SARS-CoV-2 каждый набор модифицированных направляющих демонстрировал более быструю кинетику реакции, чем исходный набор немодифицированных гРНК, с насыщением сигнала флуоресценции в течение 5 мин.Кроме того, мы наблюдали, что модифицированные руководства полностью подавляли любую побочную активность enAsCas12a в отсутствие шаблона или в присутствии тесно связанных шаблонов SARS-CoV и MERS-CoV. В совокупности наши результаты демонстрируют, что использование модифицированных направляющих может увеличить скорость реакции обнаружения Cas и эффективно сдерживать любую нецелевую активность.
Оценка реакции квази-одного горшочка с клиническими образцами РНК
Мы задались вопросом, как мы можем улучшить полный рабочий процесс RT-LAMP-CRISPR.До сих пор мы переносили только 4 мкл продуктов LAMP в 46 мкл реакционной смеси CRISPR, чтобы минимизировать изменение буфера на этапе обнаружения Cas. Однако сама реакция LAMP имела общий объем 25 мкл, который не использовался полностью. Следовательно, мы проверили, выдерживает ли реакция CRISPR большее количество неочищенных продуктов LAMP, сохраняя при этом ее конечный объем постоянным на уровне 50 мкл (дополнительный рисунок 37). Мы обнаружили, что кинетика реакции CRISPR постепенно замедлялась с увеличением количества продуктов LAMP в ней.Сигнал флуоресценции для установки, содержащей всю 25 мкл смеси LAMP в реакции CRISPR (т.е. продукты LAMP были разбавлены 1: 1), был значительно ниже, чем сигнал для исходного рабочего процесса как при 37 ° C, так и при 60 ° C ( P <0,05, односторонний критерий Стьюдента t ). Это наводило на мысль, что какой-то неизвестный фактор в смеси LAMP может частично ингибировать фермент enAsCas12a и должен быть разбавлен. Затем мы протестировали альтернативную установку, в которой вместо переноса продуктов LAMP в реакцию CRISPR мы добавляли 50 мкл реакционной смеси CRISPR в реакционную пробирку LAMP (т.е. продукты LAMP разбавляли 1: 2). Это не только позволило нам использовать все продукты LAMP, но и помогло свести к минимуму человеческий фактор и перекрестное загрязнение, поскольку из реакционной пробирки LAMP ничего не извлекалось. Обнадеживает то, что мы обнаружили, что альтернативная установка демонстрирует кинетику реакции, аналогичную исходному рабочему процессу, и дает еще более высокий сигнал флуоресценции при насыщении.
Впоследствии мы попытались сравнить LoD исходного рабочего процесса и альтернативной установки с использованием синтетической РНК SARS-CoV-2 (рис.8а, б и дополнительный рис. 38). RT-LAMP проводили при 65 ° C, а реакцию обнаружения Cas проводили при 60 ° C. Хотя только один из трех повторов показал успешную амплификацию двух копий вирусного шаблона в исходном рабочем процессе, все реплики были успешными при альтернативной настройке. Мы повторили эксперименты с разными буферами для реакции CRISPR и получили аналогичные результаты. Кроме того, мы подтвердили, что небольшое количество UTM может быть допустимым, даже если все продукты LAMP использовались на этапе обнаружения Cas ниже по потоку (дополнительный рис.39). Поэтому, двигаясь вперед, мы приняли альтернативную установку, в которой 50 мкл РНЧ enAsCas12a в буфере Tango добавляли непосредственно в реакционную пробирку LAMP после завершения изотермической амплификации.
Рис. 8: Реализация квазиоднореакторной реакции.a Analytical LoD на основе исходного рабочего процесса. Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут. Затем реакцию расщепления проводили только на 4 мкл продуктов LAMP при 60 ° C, при этом измерения флуоресценции проводили через 10 мин с использованием считывающего устройства для микропланшетов.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). b Аналитическая нагрузка при использовании всех продуктов LAMP. После завершения RT-LAMP 50 мкл реагентов CRISPR добавляли непосредственно в каждую пробирку с образцом для реакции расщепления. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). c Полосовая диаграмма, показывающая, как изменялась чувствительность к LAMP при замене 0,1 М глицина (Gly) на 40 мМ гуанидина (Gua). RT-LAMP выполняли при 65 ° C в приборе реального времени с различными копиями синтетической РНК.Черные горизонтальные полосы между точками данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 5 биологических повторов). Значения P- были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . d Сравнение чувствительности анализа глицина и гуанидина. Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут. Затем 50 мкл реагентов CRISPR добавляли непосредственно в каждую пробирку с образцом и проводили реакцию расщепления при 60 ° C, при этом измерения флуоресценции проводили через 10 мин с использованием считывающего устройства для микропланшетов.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 8 биологических повторов). e Анализ бокового потока для оценки кинетики реакции расщепления с гуанидином в смеси для анализа. Фермент enAsCas12a образовал комплекс как с гибридным гидом S2, так и с 5’-удлиненной гРНК S6. После завершения RT-LAMP реакцию обнаружения Cas проводили при 60 ° C в течение 5, 7 или 10 минут перед добавлением щупа в каждую пробирку для образца. f Анализ бокового потока для оценки чувствительности теста VaNGuard с гуанидином в смеси для анализа.Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовали в качестве входных данных для RT-LAMP, который выполняли при 65 ° C в течение 15 минут. Затем реакцию обнаружения Cas проводили при 60 ° C в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую пробирку с образцом. г Аналитическая LoD для матрицы двойной мутантной РНК WT или S254F N234N с использованием реакции квази-одного горшка. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. Измерения флуоресценции здесь проводили через 5 мин реакции расщепления транс .Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). ч Оценка специфичности нашего теста VaNGuard. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. 1E6 копии синтетической РНК от различных респираторных вирусов были использованы в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка. Измерения флуоресценции проводились с 5-минутными интервалами с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). i Оценка с использованием клинических образцов РНК.Значения Ct были получены с использованием набора Fortitude Kit. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. 2 мкл каждого образца РНК использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. Реакцию обнаружения Cas проводили в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую пробирку с образцом. Отношение менее 0,15 в нашем тесте считалось отрицательным. Следовательно, для очищенных образцов РНК анализ бокового потока дал 0 ложноположительных и 8 ложноотрицательных результатов (RP6, RP45-51). j Ленточная диаграмма, обобщающая результаты клинической оценки нашего теста VaNGuard с использованием образцов очищенной РНК.«Да» означает, что в нашем тесте образцы оказались положительными, а «Нет» означает, что образцы оказались отрицательными. Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Пока наш проект продолжался, было опубликовано другое исследование, в котором сообщалось, что скорость и чувствительность LAMP можно повысить с помощью гуанидина 67 . Следовательно, мы стремились определить, гуанидин или глицин, которые мы включили в наш CRISPR-Dx ранее (рис. 4b), лучше подходят для анализа. Сначала мы провели только RT-LAMP и обнаружили, что гуанидин увеличивает скорость реакции более заметно, чем глицин (рис.8c). Затем мы выполнили весь анализ с гуанидином или глицином в реакционной смеси и обнаружили, что анализ с гуанидином оказался более чувствительным (рис. 8d и дополнительный рис. 40). Гуанидин позволил обнаружить 10 копий вируса в семи из восьми повторов, в то время как глицин позволил успешно обнаружить только в двух из восьми повторов. Таким образом, мы заменили глицин на гуанидин в нашем анализе и подтвердили скорость и чувствительность нашего обновленного теста с помощью индикаторных полосок (рис.8д, е).
Удивительная устойчивость enAsCas12a к температуре дала нам возможность выполнить весь рабочий процесс RT-LAMP-CRISPR за один температурный шаг. RT-LAMP до сих пор проводился при 65 ° C, в то время как реакция обнаружения Cas была протестирована только до 60 ° C. Поэтому мы задались вопросом, можно ли проводить оба этапа при одинаковой температуре. Сначала мы протестировали реакцию CRISPR при 60, 63 и 65 ° C и обнаружили, что, хотя показания флуоресценции немного уменьшились при 63 ° C, падение сигнала было более заметным при 65 ° C (дополнительный рис.41а). Затем мы оценили чувствительность нашего анализа с RT-LAMP, выполненного при немного более низкой температуре, 63 ° C, при поддержании шага CRISPR на уровне 60 ° C. 14 из 15 повторов показали успешную амплификацию 20 копий синтетической вирусной матрицы (дополнительный рисунок 41b). Наконец, мы проверили, можно ли выполнить весь рабочий процесс с помощью всего одного теплового блока, установленного на 63 ° C или 60 ° C. Продолжительность RT-LAMP была увеличена с 15 до 22 минут, чтобы приспособиться к несколько неоптимальной температуре, с которой сталкивается реакция изотермической амплификации.Примечательно, что наши анализы бокового потока показали, что положительные результаты теста могут быть получены в течение 5 минут после реакции CRISPR даже при наличии только двух копий синтетической вирусной матрицы в образце (дополнительный рис. 41c, d). Мы назвали нашу установку с одним тепловым блоком «квази-одним горшком», в которой РНЧ enAsCas12a добавлялись непосредственно в реакционную трубку LAMP без изменения температуры образца. Примечательно, что весь анализ может быть завершен в течение 30 минут (22 минуты для RT-LAMP, 5 минут для реакции расщепления trans и 2 минуты для полос, развивающихся на индикаторных полосках).
Мы спросили, будет ли квази-одна установка по-прежнему устойчивой к SNV на целевых сайтах, но при этом проявлять исключительную специфичность для SARS-CoV-2. С этой целью мы исследовали толерантность к несоответствию нашего оптимизированного анализа (enAsCas12a в комплексе с двумя гибридными направляющими ДНК-РНК) и обнаружили, что он показал аналогичную чувствительность для матрицы дикого типа и двойной мутантной матрицы S254F N234N (рис. 8g и дополнительный рис. 42). Мы дополнительно протестировали наш анализ на ряде коронавирусов и других респираторных вирусов, включая вирусы гриппа, парамиксовирусы и энтеровирусы.Флуоресценция была обнаружена только для SARS-CoV-2 в течение 30 минут, что подтвердило специфичность нашего теста (рис. 8h).
Впоследствии мы подвергли наш CRISPR-Dx клинической оценке с образцами РНК, выделенными из мазков с НП пациента, которые ранее были проанализированы с помощью qRT-PCR в больнице. Эти образцы были взяты от 45 пациентов с COVID-19 и 30 неинфицированных людей. Подобно нашему более раннему пилотному тесту (рис. 6d, e), все образцы, которые были отрицательными с помощью qRT-PCR, также оказались отрицательными в анализе бокового потока, подтверждая 100% специфичность нашего анализа (рис.8i). Кроме того, наш тест VaNGuard дал однозначный положительный результат для клинических образцов, которые имели значение Ct 33,32 или ниже при анализе qRT-PCR (рис. 8i, j). Следовательно, на основе этих клинических образцов РНК наш анализ показал LoD 50 копий на реакцию или 2 копии на микролитр.
Прямое применение теста VaNGuard к неочищенным клиническим образцам
Важным моментом для экспресс-тестов является то, могут ли они принимать образцы пациентов напрямую. Извлечение РНК обычно занимает не менее 15 минут и усложняет рабочий процесс, тем самым увеличивая время ожидания и делая тест менее пригодным для использования неподготовленными профессионалами.Поэтому мы спросили, можем ли мы использовать наш анализ непосредственно на образцах пациентов без дополнительного этапа выделения РНК. Одна из проблем с образцами пациентов — это наличие РНКаз, которые могут быстро разрушать вирусную РНК, которую мы хотим обнаружить. Чтобы инактивировать РНКазы, мы сначала попробовали протокол Hudson 16 , но обнаружили, что добавление TCEP и EDTA запускало ложную амплификацию без матрицы при значениях Ct менее 25 в большинстве повторений (дополнительный рис. 43).
Мы исследовали другие варианты инактивации РНКазы, а именно обработку протеиназой К и нагревание 68,69 .В качестве моделирования мы создали лентивирус, который экспрессировал соответствующий фрагмент S-гена из SARS-CoV-2 и внес различные его количества в слюну человека. Затем мы провели реакцию RT-LAMP на искусственно созданных образцах, которые не обрабатывали, нагревали при 95 ° C только в течение 5 минут или обрабатывали протеиназой K и теплом (рис. 9a). В соответствии с недавними исследованиями 68,69 , мы обнаружили, что обработка протеиназой К и теплом, по-видимому, улучшает скорость и чувствительность RT-LAMP.Затем мы оценили LoD нашего CRISPR-Dx, используя в качестве входных данных надуманные образцы. Образцы предварительно обрабатывали протеиназой К и нагревали. Примечательно, что наш анализ смог обнаружить 40 копий лентивируса во всех повторах (рис. 9b). Важно отметить, что пропуск стадии экстракции РНК не повлиял на скорость нашего теста, так как сигнал флуоресценции насыщался через 5 минут реакции CRISPR.
Рис. 9: Применение нашего анализа VaNGuard к неочищенным образцам.a Полосная диаграмма, показывающая влияние протеиназы K и тепловой обработки на RT-LAMP, когда в качестве входных данных использовались различные копии лентивируса, экспрессирующего S-ген, в слюне.Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение (без ПК + без нагрева: n = 5 [4E5-4E6], 7 [4-4E2], 10 [4E4] или 12 [4E3 и NTC]; без PK + нагрев: n = 7 [4E5], 9 [4E6], 10 [4-4E2], 15 [4E4] или 17 [4E3 and NTC]; PK + тепло: n = 7 [4-4E2], 11 [4E5], 13 [4E6], 15 [4E4], 18 [4E3] или 20 [NTC] биологических копий). b Оценка чувствительности теста VaNGuard к неочищенному псевдовирусу. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6.Различные копии лентивируса, внесенные в слюну, обрабатывали протеиназой К и нагревали перед использованием в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка. Измерения флуоресценции проводили с 5-минутными интервалами с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). c Оценка чувствительности теста VaNGuard к неочищенному SARS-CoV-2. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. Различные копии коронавируса, продуцируемые в клетках Vero E6, вводили в клинически отрицательный UTM, обрабатывали протеиназой K и нагреванием, а затем использовали в качестве входных данных для реакции квази-одного горшка.Стадия обнаружения Cas выполнялась в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую реакционную пробирку. d Клиническая оценка с образцами мазков NP. Значение Ct 30 было оценено как эквивалент 500 копий вируса. Фермент enAsCas12a был в комплексе с гидридами гибридов S2 и S6. Каждый образец обрабатывали протеиназой К и нагревали перед тем, как 2 мкл использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. Стадия обнаружения Cas выполнялась в течение 5 минут перед добавлением щупа в каждую реакционную пробирку. e Повторный тест неправильно классифицированных образцов мазков NP с использованием удвоенного реакционного объема. 4 мкл каждого образца использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. В целом для прямых образцов пациентов анализ бокового потока дал 0 ложноположительных и 4 ложноотрицательных результата (DP16, DP18, DP20 и DP21). f Полосовая диаграмма, обобщающая результаты клинической оценки нашего теста VaNGuard с использованием неочищенных образцов тампона NP. «Да» означает, что в нашем тесте образцы оказались положительными, а «Нет» означает, что образцы оказались отрицательными.Исходные данные доступны в файле исходных данных.
Затем мы спросили, может ли наш анализ обнаруживать вирионы SARS-CoV-2 в среде для сбора образцов. С этой целью мы добавили различное количество вируса, продуцируемого клетками Vero E6, в клинически отрицательный UTM, который ранее использовался для сбора мазков у здоровых людей. После протеиназы К и термической обработки мы применили наш анализ к этим надуманным образцам и наблюдали четкие тестовые полосы на индикаторных полосках для 100 или более копий SARS-CoV-2 (рис.9в).
Впоследствии мы попытались оценить наш анализ с использованием клинических мазков NP непосредственно без какой-либо экстракции РНК. Мы получили 21 образец от пациентов с инфекцией COVID-19 и еще 21 образец от здоровых людей. Часть этих образцов ранее подвергалась экстракции РНК и qRT-PCR в диагностической лаборатории, поэтому мы могли сравнить результаты наших тестов со значениями Ct, предоставленными лабораторией. Мы обрабатывали образцы протеиназой К и нагревали перед проведением анализа бокового потока (рис.9г). Ожидается, что все клинически отрицательные образцы также оказались отрицательными в нашем тесте VaNGuard, подтверждающем его 100% специфичность. Кроме того, тест дал однозначный положительный результат для клинических образцов, которые имели значение Ct 28,98 или ниже, что соответствует 1000 или более копий на реакцию. Любопытно, что мы также заметили, что хотя наш тест, похоже, пропустил образец со значением Ct 29,42, он правильно пометил другой образец со значением Ct 30,36. Следовательно, чтобы увеличить вероятность обнаружения вируса, мы повторно протестировали пять клинически положительных образцов, которые были неправильно классифицированы, с удвоенным объемом реакции и вдвое большим объемом введенного образца (рис.9д). Однако наш тест правильно идентифицировал только один дополнительный образец со значением Ct 31,80. В целом, в отличие от более ранней клинической оценки с образцами очищенной РНК (рис. 8i, j), граница для значения Ct между положительным и отрицательным результатом в нашем тесте не была такой четкой для неочищенных образцов мазков NP (рис. 9f). Для значений Ct от 29 до 32 наш анализ может дать положительный или отрицательный результат. Эта неоднозначность может быть связана с неизвестной и потенциально сложной матрицей образца (например, слизью из носа), которая может варьироваться от образца к образцу и оказывать некоторое ингибирующее действие на ферменты анализа.Более того, степень восстановления вирусной РНК во время процесса очистки в диагностической лаборатории может быть не совсем согласованной, особенно для образцов с низкой вирусной нагрузкой. Следовательно, образец, который на самом деле имел более высокую вирусную нагрузку в исходном тампоне NP, может в конечном итоге иметь более низкое значение Ct из-за большей потери образца. Взятые вместе, наши результаты показывают, что, хотя и более сложный, наш тест VaNGuard может применяться непосредственно к образцам пациентов без дополнительной очистки РНК с LoD 1000 копий на реакцию или 40 копий на микролитр.Поскольку тампоны, использованные в нашем исследовании, были собраны в 3 мл UTM, и мы взяли только 2 мкл для нашего теста, чувствительность может быть лучше, если тампоны были собраны в меньшем объеме среды.
Включение человеческого внутреннего контроля в одну и ту же реакцию
Диагностический тест на COVID-19 должен включать человеческий внутренний контроль, чтобы убедиться, что отрицательный результат связан с отсутствием вируса, а не просто с недостаточным вводом образца. С этой целью мы стремились идентифицировать подходящий набор праймеров LAMP, нацеленных на некоторый ген домашнего хозяйства, для использования в нашем анализе.Мы проверили три набора праймеров против POP7 , четыре набора праймеров против ACTB и четыре набора праймеров против GAPDH , используя термически обработанную человеческую слюну в качестве образца (рис. 10а). Все наборы праймеров успешно давали продукты амплификации, хотя и с разной скоростью. Кроме того, несколько наборов праймеров также давали ложные побочные продукты без матрицы.
Рис. 10: Разработка человеческого внутреннего контроля для нашего теста VaNGuard.a Полосковая диаграмма, показывающая эффективность различных наборов праймеров LAMP, нацеленных на человеческий ген POP7 , ACTB или GAPDH .Праймеры, помеченные «Set1», «Set2» или «Set3», разработаны заново, в то время как праймеры, помеченные «Pub», были опубликованы 17,72,73 . 2 мкл термообработанной слюны использовали в качестве образца для ввода в RT-LAMP, которую проводили при 65 ° C в течение 40 минут в приборе реального времени. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 6 [ POP7 Pub and Set1-2, ACTB Set2-3, GAPDH Set2-3], 8 [ ACTB Set1, GAPDH Pub and Set1] или 14 [ ACTB Pub] биологических копий).Сравнения проводились относительно праймеров POP7 Pub 17 . P -значения были рассчитаны с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . b Полосовая диаграмма, показывающая влияние различных наборов человеческих праймеров на изотермическую амплификацию S-гена SARS-CoV-2. Различные копии синтетической РНК SARS-CoV-2 использовались в качестве образца для ввода в RT-LAMP, который выполнялся при 65 ° C в течение 40 минут в приборе реального времени. Черные горизонтальные полосы среди точек данных на ленточной диаграмме представляют собой среднее значение ( n = 3 [ POP7 Pub 2E5] или 6 [ POP7 Pub все, кроме 2E5, ACTB Set2] биологических реплик). c , d Оценка нашего прототипа анализа VaNGuard, содержащего человеческий внутренний контроль, с использованием c клинически отрицательных и d клинически положительных образцов мазка NP. Зеленая флуоресценция происходит от общего ДНК-связывающего красителя, а красная флуоресценция исходит от репортера Cy5-quencher, специфичного для SARS-CoV-2. Каждый образец обрабатывали протеиназой К и нагревали перед тем, как 2 мкл использовали в качестве исходных данных для реакции в квазиодном горшке. e 20 копий синтетической РНК SARS-CoV-2 были использованы в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка с различными количествами пирофосфатазы, добавленными на этапе обнаружения Cas.Измерения флуоресценции здесь проводили через 5 мин реакции расщепления транс . Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 4 биологических повтора). Значение P было рассчитано с использованием одностороннего критерия Стьюдента t . f Оценка нашего анализа с различными количествами человеческих праймеров и пирофосфатазы. Различные копии синтетической РНК, добавленные в термически обработанную слюну, использовали в качестве исходных данных для реакции квази-одного горшка. Измерения флуоресценции проводились с 5-минутными интервалами с использованием считывающего устройства для микропланшетов.Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 биологических повтора). г Клиническая оценка нашего оптимизированного анализа VaNGuard, содержащего внутренний контроль человека. В качестве входных данных использовали 2 мкл каждой пробы протеиназы К и термообработанного тампона NP. Исходные данные доступны в файле исходных данных.
В идеале внутренний контроль должен быть встроен в ту же реакционную пробирку, что и тест на COVID-19. Следовательно, затем мы оценили, будут ли человеческие праймеры мешать нашим праймерам SARS-CoV-2 в реакции RT-LAMP (рис.10b и дополнительный рис. 44). Использовали вариабельные копии синтетической вирусной РНК-матрицы. Интересно, что мы наблюдали, что несколько наборов праймеров, таких как целевые праймеры POP7 , развернутые в системе DETECTR 17 , вызвали неспецифическую амплификацию. Мы выбрали набор целевых праймеров ACTB , чтобы продолжить, потому что он не вызывал серьезных ошибок амплификации без матрицы, а наши праймеры SARS-CoV-2 LAMP продолжали хорошо амплифицироваться в его присутствии даже при низком количестве копий вирусной РНК.
Чтобы включить внутренний контроль в ту же реакционную пробирку, что и тест на COVID-19, необходимо использовать считывание флуоресценции вместо индикаторных полосок, и требуются два цвета, чтобы отличить ампликоны SARS-CoV-2 от человеческих ампликонов. Сначала мы заменили зеленый флуорофор (FAM) в репортере CRISPR на красный флуорофор (Cy5) и подтвердили, что сигнал был аналогичным (дополнительный рис. 45a). Затем мы проверили чувствительность нашего анализа, используя синтетическую вирусную РНК, добавленную в термически обработанную слюну.Реакционная смесь содержала стандартный зеленый ДНК-связывающий краситель и Cy5-репортер. Обнадеживает то, что мы наблюдали, что наш анализ может обнаружить 20 или более копий вирусной РНК даже при одновременной амплификации человеческого ACTB (дополнительный рис. 45b). Кроме того, зеленая, но не красная флуоресценция детектировалась для контрольной реакции без матрицы, если это желательно.
Впоследствии мы попытались оценить наш анализ с внутренним контролем на неочищенных клинических образцах. С этой целью мы использовали тот же набор мазков NP, который ранее оценивали с помощью щупов (рис.9г – е). Для всех отрицательных образцов qRT-PCR амплификация наблюдалась для человеческого ACTB , но не для S-гена SARS-CoV-2, как ожидалось (рис. 10c). Что касается qRT-PCR-положительных образцов, мы сосредоточились на тех, которые были правильно классифицированы в исходном анализе. Усиление наблюдалось как в зеленом, так и в красном каналах для каждого образца (рис. 10d). Однако кинетика реакции CRISPR для многих образцов была медленнее, чем ожидалось.
Мы стремились улучшить наш анализ с помощью внутреннего контроля, используя синтетическую вирусную РНК, добавленную в термически обработанную слюну в экспериментах по устранению неполадок.Во время реакции LAMP образуется большое количество пирофосфата, в результате чего магний выпадает в осадок из раствора. Мы задавались вопросом, снизит ли это со временем концентрацию ионов магния, доступных для реакции, или пирофосфат ингибирует реакцию CRISPR. Следовательно, мы проверили, улучшит ли наш тест VaNGuard добавление термостабильной пирофосфатазы. Хотя добавление до 2U пирофосфатазы, по-видимому, не улучшало RT-LAMP (дополнительный рис. 46), оно действительно значительно улучшало кинетику реакции обнаружения Cas (рис.10e и дополнительный рис. 47). Затем мы предположили, что человеческие праймеры конкурируют с праймерами SARS-CoV-2 за реагенты LAMP. Таким образом, мы исследовали эффект уменьшения вдвое количества праймеров ACTB человека в нашем анализе. В целом снижение концентрации человеческих праймеров привело к ощутимо более низкой скорости генерации зеленой флуоресценции, предположительно из-за менее эффективной амплификации ACTB (дополнительный рисунок 48). Тем не менее, это не препятствовало успешной амплификации каких-либо реплик в течение 22 минут RT-LAMP.Кроме того, мы обнаружили, что использование меньшего количества человеческих праймеров явно увеличивает чувствительность нашего анализа для SARS-CoV-2 (рис. 10f). Дальнейшее добавление 2U пирофосфатазы в реакцию обнаружения Cas также улучшило кинетику реакции.
Наконец, мы задались вопросом, как улучшенная версия нашего анализа с внутренним контролем будет работать на реальных образцах пациентов. Мы повторно оценили клинически положительные мазки NP, которые дали более слабые, чем ожидалось, сигналы красной флуоресценции в нашем более раннем двухцветном анализе (рис.10г). Кроме того, мы повторно проанализировали DN12, поскольку ранее он показал более позднюю амплификацию ACTB , чем другие клинически отрицательные образцы (рис. 10c), и поэтому мы были обеспокоены тем, что уменьшение вдвое количества человеческих праймеров может помешать внутреннему контролю работать в этом образце . Повторный тест показал, что корректировка концентраций праймера LAMP и добавление 2U пирофосфатазы позволило более надежно обнаружить SARS-CoV-2 в каждом клинически положительном мазке на NP (рис. 10g). Более того, амплификация все еще наблюдалась для гена ACTB человека, но не для S-гена SARS-CoV-2 в DN12.Взятые вместе, результаты демонстрируют, что наш тест VaNGuard, содержащий внутренний контроль в рамках той же реакции, может быть успешно применен к неочищенным клиническим образцам без экстракции РНК.
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Andrographis paniculata — однолетнее растение с горьким вкусом, распространенное на большей части Азии. В традиционной медицине он часто используется в сочетании с другими травами для лечения инфекционных заболеваний и связанных с ними лихорадок. Он также используется в народной медицине для лечения укусов змей.Андрографис продвигается в дополнительной форме для профилактики рака, лечения рака и для противодействия токсичности химиотерапии у людей. Препараты, содержащие стандартизованные экстракты андрографиса, также продаются от простуды и гриппа.
Исследования in vitro и на животных показывают, что андрографис обладает противомикробным действием (23) , противовоспалительным (26) , антиоксидантом (27) , противоопухолевым (13) (18) и антиметастатическим (15). ) объекта.
Kan Jang, стандартизированный экстракт Andrographis paniculata и Eleutherococcus senticosus, был изучен в спонсируемых производителем клинических испытаниях по облегчению респираторных симптомов от простуды и гриппа (1) (2) (3) (4) . Было обнаружено, что экстракт андрографиса полезен при лечении симптомов инфекции верхних дыхательных путей (5) . Несколько метаанализов показывают возможное преимущество A. paniculata в снижении частоты и тяжести кашля. (45) (46) .
Андрографис также оценивался на предмет выявления язвенного колита. В одном испытании те, кто получал экстракт A. paniculata в более высоких дозах, имели больше шансов достичь клинического ответа по сравнению с плацебо (47) . Другое исследование показало, что он не менее эффективен при лечении язвенного колита, чем месаламин. (6) .
В других предварительных исследованиях экстракты андрографиса снижали ревматоидные факторы и облегчали симптомы ревматоидного артрита. (7) .У пациентов с умеренной гипертриглицеридемией высокие дозы экстракта андрографиса снижали уровни триглицеридов аналогично гемфиброзилу (48) .
В доклинических исследованиях рака андрографолид проявлял активность против стволовых клеток множественной миеломы (49) , обращал резистентность к 5-ФУ в клетках колоректального рака человека (50) и модулировал опосредованную P-гликопротеином множественную лекарственную устойчивость (51) .
Кайнозойская сдвиговая тектоника и структурные ограничения Cu-Mo-порфировых и эпитермальных отложений в ходе геодинамической эволюции самого южного Малого Кавказа, Тетийского металлогенического пояса | Экономическая геология
Зангезур-Ордубадский горнорудный район на самом юге Малого Кавказа расположен в центральной части Тетийского металлогенического пояса и состоит из медно-молибденовых порфиров и эпитермальных систем Au и цветных металлов, расположенных в сложном кайнозойском Мегри-Ордубадском плутоне.Рудовмещающие структуры и магматические интрузии преимущественно приурочены к центральному коридору северо-восточного направления длиной 40 км и шириной от 10 до 12 км, расположенному между двумя региональными правосторонними разломами северо-северо-западного направления, Хуступ-Гиратахским и Сальвард-Ордубадским разломами. Анатомия и кинематика основной сети разломов согласуются с тектоникой правого сдвига, контролируемой разломами Хуступ-Гиратах и Сальвард-Ордубад, ориентированными на северо-запад.
Правосдвиговая тектоника началась в эоцене, одновременно с окончательной субдукцией Неотетиса, и контролировала внедрение Агарак, Ханкасар, Айгедзор и Дастакертский порфир Cu-Mo, Тей-Личкваз и Тертерасар, эпитермальные Au и основные металлы. депозиты.Структуры эоцена неоднократно реактивировались во время последующей эволюции неогена при переходе к постсубдукционной геодинамической обстановке. Рудоносные структуры на месторождении Cu-Mo каджаранских порфиров мирового класса в олигоцене также контролировались правосдвиговой тектоникой, а также порфировым оруденением и его эпитермальным наложением, образовавшимся в результате интрузии раннего миоцена в Личке.
Правосдвиговая тектоника от эоцена до раннего миоцена имела место во время сжатия, ориентированного с северо-востока на северо-северо-восток, связанного с конвергенцией Евразии и Аравии палеогена и последующей постколлизионной эволюцией в неогене.Реконструкция палеонапряжений указывает на серьезную реорганизацию кинематики тектонических плит с раннего миоцена, которая привела к сжатию с северо-востока на северо-запад. Эпитермальный след раннего миоцена на месторождении порфиров Каджаран и левосторонняя реактивация разломов и минерализованных структур связаны с этой поздней неогеновой реорганизацией тектонических плит.
Чувствительность к парше полевой яблони разнообразной коллекции зародышевой плазмы Malus определяет потенциальные источники устойчивости для селекции яблонь | CABI Agriculture and Bioscience
Aldwinckle HS, Forsline PL, Gustafson HL, Hokanson SC.Оценка устойчивости к парше яблони популяций Malus sieversii из Центральной Азии. HortScience. 1997; 32: 440.
Артикул Google Scholar
Бекерман Дж., Чатфилд Дж., Дрейпер Э. 33-летняя оценка устойчивости и патогенности в патосистеме яблоневой парши и яблони. HortScience. 2009. 44 (3): 599–608.
Артикул Google Scholar
Браун С., Мэлони К.Устойчивые к парше сорта (разновидности). N Y Fruit Q. 2008; 16 (4): 3–6.
Google Scholar
Коричневый СК, Мэлони К.Е. Обновленная информация о сортах яблони, брендах и клубном маркетинге. N Y Fruit Q. 2013; 21 (1): 3–10.
Google Scholar
Автобус VG, Rikkerink EH, Caffier V, Durel CE, Plummer KM. Пересмотр номенклатуры дифференциальных взаимодействий хозяин-патоген Venturia inaequalis и Malus.Анну Рев Фитопатол. 2011; 49: 391–413.
CAS Статья Google Scholar
Бирн П.Ф., Фольк Г.М., Гарднер С., Гор М.А., Саймон П.В., Смит С. Поддержание будущего селекции растений: критическая роль национальной системы зародышевой плазмы растений USDA-ARS. Crop Sci. 2018. 58 (2): 451–68.
Артикул Google Scholar
Chevalier M, Lespinasse Y, Renaudin S. Микроскопическое исследование различных классов симптомов, кодируемых геном Vf у яблони на устойчивость к парше ( Venturia inaequalis ).Завод Патол. 1991. 40 (2): 249–56.
Артикул Google Scholar
Cornille A, Gladieux P, Smulders MJ, Roldán-Ruiz I, Laurens F, Le Cam B, Nersesyan A, Clavel J, Olonova M, Feugey L, Gabrielyan I, Zhang XG, Tenaillon MI, Giraud T. New понимание истории одомашненной яблони: вторичный вклад дикорастущей европейской яблони в геном культурных сортов. PLoS Genet. 2012; 8 (5): e1002703.
CAS Статья Google Scholar
Cornille A, Giraud T, Smulders MJ, Roldán-Ruiz I, Gladieux P.Приручение и эволюционная экология яблок. Тенденции Genet. 2014. 30 (2): 57–65.
CAS Статья Google Scholar
Кросби Дж. А., Яник Дж., Пекнольд П. К., Корбан С. С., О’Коннер П. А., Райс С. М., Гоффреда Дж., Фурдекерс А. Селекция яблок на устойчивость к парше: 1945–1990. Фруктовая порода Генет. 1992; 317: 43–70.
Google Scholar
Дуань Н, Бай И, Сун Х, Ван Н, Ма И, Ли М, Ван Х, Цзяо Ц, Легал Н, Мао Л., Ван С.Повторное секвенирование генома раскрывает историю яблока и поддерживает двухэтапную модель увеличения плодов. Nat Commun. 2017; 8 (1): 249.
Артикул CAS Google Scholar
Дарем RE, Макнил RE, Хартман-младший, Поттер Д.А., Фонтан WM. Цветущая яблоня. Univ. Кентукки, Куп. Ext. Svc. Паб. ИД-68. 1999.
Escribano P, Viruel MA, Hormaza JI. Сравнение различных методов создания основной коллекции зародышевой плазмы древесных многолетних видов с использованием простых маркеров повтора последовательностей.Тематическое исследование черимойи ( Annona cherimola , Annonaceae), малоиспользуемого субтропического фруктового дерева. Ann Appl Biol. 2008; 153: 25–32.
Артикул Google Scholar
Forsline PL, Aldwinckle HS. Естественное возникновение бактериального ожога в коллекции гермоплазмы яблони Министерства сельского хозяйства США после 10 лет наблюдения. В: IX международный семинар по бактериальному ожогу, т. 590. 2001. с. 351–7.
Forsline PL, Aldwinckle HS.Оценка популяций проростков Malus sieversii на устойчивость к болезням и садовые признаки. В: XI симпозиум eucarpia по селекции и генетике плодов, т. 663. 2003. с. 529–34.
Francl LJ. Треугольник болезней: новый взгляд на патологическую парадигму растений. Инстр. Здоровья растений. 2001. https://doi.org/10.1094/PHI-T-2001-0517-01.
Артикул Google Scholar
Гиричев В., фон Рет М., Ханке М.В., Хёфер М., Шульте Э., Флаховски Х.Оценка генетических ресурсов Rubus на их устойчивость к болезни тростника. Genet Resour Crop Evol. 2018; 65 (7): 1979–93.
CAS Статья Google Scholar
Gladieux P, Zhang XG, Afoufa-Bastien D, Sanhueza RMV, Sbaghi M, Le Cam B. О происхождении и распространении парши яблони: за пределами Центральной Азии. PLoS ONE. 2008; 3 (1): 1455.
Артикул CAS Google Scholar
Gladieux P, Zhang XG, Roldan-Ruiz I, Caffier V, Leroy T, Devaux M, van Glabeke S, Coart E, Le Cam B.Эволюция популяционной структуры Venturia inaequalis , гриба парши яблони, связанная с одомашниванием его хозяина. Mol Ecol. 2010. 19 (4): 658–74.
Артикул Google Scholar
Гонсалес-Домингес Э., Арменгол Дж., Росси В. Биология и эпидемиология видов Venturia , влияющих на плодовые культуры: обзор. Фронтальный завод им. 2017; 8: 1496. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01496.
Артикул Google Scholar
Hagan AK, Tilt KM, Williams JD, Akridge JR.Восприимчивость сортов яблони к нескольким болезням в районе побережья Мексиканского залива в Алабаме. J Environ Hortic. 2000. 18 (4): 192–6.
Артикул Google Scholar
Harshman JM, Evans KM, Allen H, Potts R, Flamenco J, Aldwinckle HS, Wisniewski NE, Norelli JL. Устойчивость к бактериальному ожогу у диких образцов Malus sieversii . Завод Дис. 2017; 101 (10): 1738–45.
Артикул Google Scholar
Hokanson SC, McFerson JR, Forsline PL, Lamboy WF, Luby JJ, Aldwinckle HS, Djangaliev AD.Сбор и обработка зародышевой плазмы дикой природы Malus в центре ее разнообразия. HortScience. 1997. 32: 173–6.
Артикул Google Scholar
Hokanson SC, Lamboy WF, Szewc-McFadden AK, McFerson JR. Вариация микросателлитов (SSR) в коллекции из видов и гибридов Malus (яблони). Euphytica. 2001. 118 (3): 281–94.
CAS Статья Google Scholar
Husson F, Josse J, Le S, Mazet J, Husson MF.Пакет «FactoMineR». 2020. https://cran.r-project.org/web/packages/FactoMineR/index.html.
Янш М., Пэрис Р., Амоако-Андох Ф, Кеулеманс В., Дэйви М. В., Пальярани Г., Тартарини С., Патокки А. Фенотипическая, молекулярная и биохимическая характеристика первого цисгенного устойчивого к парше сорта яблок «Гала». Plant Mol Biol Rep. 2014; 32 (3): 679–90.
Артикул CAS Google Scholar
Юрик WM, Янисевич WJ, Saftner RA, Vico I, Gaskins VL, Park E, Forsline PL, Fazio G, Conway WS.Идентификация образцов зародышевой плазмы дикой яблони ( Malus spp.), Устойчивых к возбудителям послеуборочной гнили Penicillium expansum и Colletotrichum acutatum . Порода растений. 2011. 130 (4): 481–6.
Артикул Google Scholar
Кассамбара А., Мундт Ф. Фактоэкстра: извлечение и визуализация результатов многомерного анализа данных. Версия пакета R. 2017; 1 (4): 2017.
Google Scholar
Kellerhals M, Bertschinger L, Gessler C.Использование генетических ресурсов в селекции яблок и для устойчивого производства фруктов. J Fruit Ornamental Plant Res. 2004; 12: 53–62.
Google Scholar
Khajuria YP, Kaul S, Wani AA, Dhar MK. Генетика устойчивости яблони к Venturia inaequalis (Wint.) Cke. Древовидные генетические геномы. 2018; 14 (2): 16.
Артикул Google Scholar
Хан М.А., Чао Т.Дикие виды яблони как источник устойчивости к бактериальному ожогу для устойчивой продуктивности яблоневых садов. N York Fruit Q. 2017; 25 (4): 13–8.
Google Scholar
Хан М.А., Чжао Й, Корбан СС. Идентификация генетических локусов, связанных с устойчивостью к бактериальному ожогу у Malus , путем комбинированного использования QTL и ассоциативного картирования. Physiol Plant. 2013. 148 (3): 344–53.
CAS Статья Google Scholar
Кутис К., Франсуа В., Николаус Б., Стейнеманн Б., Родригес Буруццо А., Мендес Морейра П., Мессмер М. Перспективы селекции и размножения органических яблок в Европе в рамках проекта LIVESEED.В: Материалы 18-й международной конференции по выращиванию органических фруктов, 19–21 февраля 2018 г. Хоэнхайм, Германия, 2018 г .; С. 104–7.
Langenfeld VT. Malus Mill .: Биология, география, систематика, филогения, эволюция. Рия Зинатне. 1970; стр.1–203.
Lateur M, Populer C. Скрининг генетических ресурсов фруктовых деревьев в Бельгии на устойчивость к болезням и другие желательные признаки. Euphytica. 1994. 77 (1–2): 147–53.
Артикул Google Scholar
Lemaire C, De Gracia M, Leroy T., Michalecka M, Lindhard-Pedersen H, Guerin F, Gladieux P, Le Cam B.Появление новых вирулентных популяций парши яблони из резервуаров несельскохозяйственных болезней. Новый Фитол. 2016; 209 (3): 1220–9.
CAS Статья Google Scholar
Leroy T., Caffier V, Celton JM, Anger N, Durel CE, Lemaire C, Le Cam B. Когда вирулентность происходит от несельскохозяйственных хозяев: эволюционные и эпидемиологические последствия интрогрессии после вторичных контактов в Venturia inaequalis . Новый Фитол.2016; 210 (4): 1443–52.
CAS Статья Google Scholar
Liang W., Dondini L, De Franceschi P, Paris R, Sansavini S, Tartarini S. Генетическое разнообразие, популяционная структура и создание основной коллекции сортов яблони из итальянской зародышевой плазмы. Plant Mol Biol Rep. 2015; 33 (3): 458–73.
CAS Статья Google Scholar
Люби Дж., Гувер Э., Петерсон М., Ларсон Д., Бедфорд Д.Морозоустойчивость в коллекции основной гермоплазмы USDA Malus . В кн .: Симпозиум Евкарпии по селекции и генетике плодов, т. 484. 1996. с. 109–14.
Luby JJ, Alspach PA, Bus VG, Oraguzie NC. Полевая устойчивость к фитофторозу в разнообразной коллекции зародышевой плазмы яблони ( Malus sp.). J Am Soc Hortic Sci. 2002. 127 (2): 245–53.
Артикул Google Scholar
MacHardy WE, Gadoury DM. Пересмотр критериев Миллса для прогнозирования периодов заражения паршой яблони.Фитопатология. 1989. 79 (3): 304–10.
Артикул Google Scholar
MacHardy WE, Gadoury DM, Gessler C. Паразитарная и биологическая пригодность Venturia inaequalis : связь со стратегиями ведения болезней. Завод Дис. 2001. 85 (10): 1036–51.
Артикул Google Scholar
McDonald BA. Как исследования популяционной биологии патогенов могут предложить стратегии управления болезнями? Пример ошпаривания ячменя ( Rhynchosporium commune ).Завод Патол. 2015; 64 (5): 1005–13.
Артикул Google Scholar
McDonald BA, Stukenbrock EH. Быстрое появление патогенов в агроэкосистемах: глобальные угрозы устойчивости сельского хозяйства и продовольственной безопасности. Philos Trans R Soc B Biol Sci. 2016; 371 (1709): 20160026.
Артикул Google Scholar
Michalecka M, Masny S, Leroy T., Puławska J. Популяционная структура Venturia inaequalis , возбудителя парши яблони, в ответ на разнородное выращивание яблони.BMC Evol Biol. 2018; 18 (1): 5.
Артикул CAS Google Scholar
Momol MT, Forsline PL, Lamboy WF, Aldwinckle HS. Устойчивость к бактериальному ожогу и садоводческая оценка популяций диких Malus из Центральной Азии. Acta Hort. 1999; 489: 229–34.
Артикул Google Scholar
Myers CT, Harvey Reissig W, Forsline PL. Восприимчивость плодов из разнообразной зародышевой плазмы яблони и яблони к атакам яблочной личинки (Diptera: Tephritidae).J Econ Entomol. 2008. 101 (1): 206–15.
Артикул Google Scholar
Норелли Дж. Л., Вишневски М., Дроби С. Идентификация QTL для устойчивости к послеуборочным болезням к Penicillium expansum в Malus sieversii . В: II международный симпозиум по открытию и разработке инновационных стратегий борьбы с послеуборочными болезнями, т. 1053. 2013. с. 199–203.
Папп Д., Сингх Дж., Гадури Д.М., Хан М.А.Новые североамериканские изоляты Venturia inaequalis могут преодолеть устойчивость к парше яблони Malus floribunda 821. Plant Dis. 2019; 104 (3): 649–55.
Артикул Google Scholar
Parisi L, Lespinasse Y, Guillaumes J, Krüger J. Новая раса Venturia inaequalis , вирулентная по отношению к яблокам, с устойчивостью за счет гена Vf . Фитопатология. 1993. 83 (5): 533–7.
Артикул Google Scholar
Parisi L, Fouillet V, Schouten HJ, Groenwold R, Laurens F, Didelot F, Evans K, Fischer C, Gennari F, Kemp H, Lateur M, Patocchi A, Thissen J, Tsipouridis C.Изменчивость патогенности Venturia inaequalis в Европе. Acta Hort. 2004. 663 (1): 107–13.
Артикул Google Scholar
Patocchi A, Frei A, Frey JE, Kellerhals M. На пути к совершенствованию селекции с помощью маркеров устойчивых к парше сортов яблони: Venturia inaequalis исследования вирулентности и стандартизация аллелей молекулярных маркеров, связанных с генами устойчивости. Мол Порода. 2009; 24 (4): 337.
CAS Статья Google Scholar
Patocchi A, Wehrli A, Dubuis PH, Auwerkerken A, Leida C, Cipriani G, Passey T, Staples M, Didelot F, Philion V, Peil A, Laszakovits H, Rühmer T, Boeck K, Baniulis D, Strasser K, Vávra R, Guerra W, Masny S, Ruess F, Le Berre F, Nybom H, Tartarini S, Spornberger A, Pikunova A, Bus V. Десять лет VINQUEST: первая идея для селекции новых сортов яблони с устойчивостью к парше. .Завод Дис. 2020; 104 (8): 2074–81.
Артикул Google Scholar
Пек Г.М., Мервин И.А., Браун М.Г., Агнелло А.М. Интегрированные и органические системы производства фруктов для ‘Liberty ’apple на северо-востоке США: системная оценка. HortScience. 2010. 45 (7): 1038–48.
Артикул Google Scholar
Potts SM, Han Y, Khan MA, Kushad MM, Rayburn AL, Korban SS.Генетическое разнообразие и характеристика основной коллекции зародышевой плазмы Malus с использованием простых повторов последовательности (SSR). Plant Mol Biol Rep. 2012; 30 (4): 827–37.
Артикул Google Scholar
R Основная команда. R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений; 2020.
Rehder A. Rosaceae. Подфам. Pomoideae. В: Сарджент К.С., редактор. Plantae Wilsonianae 2.Публикации Дендрария Арнольда, Кембридж (Массачусетс), т. 4. 1915. с. 263–345.
Schoen DJ, Brown AHD. Максимальное увеличение генетического разнообразия в основных коллекциях диких родственников сельскохозяйственных культур. В: Hodgkin T, Brown AHD, van Hintum TJL, Morales EAV, редакторы. Основные коллекции генетических ресурсов растений. Чичестер: Уайли; 1995. стр. 55–76.
Google Scholar
Schouten HJ, Brinkhuis J, van der Burgh A, Schaart JG, Groenwold R, Broggini GA, Gessler C.Клонирование и функциональная характеристика гена Rvi15 ( Vr2 ) устойчивости к парше яблони. Древовидные генетические геномы. 2014; 10 (2): 251–60.
Артикул Google Scholar
Shay JR, Williams EB. Идентификация трех физиологических рас Venturia inaequalis . Фитопатология. 1956; 46: 190–3.
Google Scholar
Vasudevan K, Vera Cruz CM, Gruissem W, Bhullar NK.Крупномасштабный скрининг зародышевой плазмы для выявления новых источников устойчивости к взрывам риса. Фронтальный завод им. 2014; 5: 505.
Артикул Google Scholar
Volk GM, Richards CM, Reilley AA, Henk AD, Forsline PL, Aldwinckle HS. Сохранение ex-situ видов, размножаемых вегетативным путем: разработка основной коллекции на основе семян для Malus sieversii . J Am Soc Hortic Sci. 2005. 130 (2): 203–10.
Артикул Google Scholar
Volk GM, Richards CM, Reilley AA, Henk AD, Reeves PA, Forsline PL, Aldwinckle HS.Генетическое разнообразие и устойчивость к болезням дикорастущего Malus orientalis из Турции и юга России. J Am Soc Hortic Sci. 2008. 133 (3): 383–9.
Артикул Google Scholar
Volk GM, Chao CT, Norelli J, Brown SK, Fazio G, Peace C, McFerson J, Zhong GY, Bretting P. Уязвимость американских генетических ресурсов яблони ( Malus ). Genet Resour Crop Evol. 2015a; 62: 765–94.
Артикул Google Scholar
Volk GM, Henk AD, Baldo A, Fazio G, Chao CT, Richards CM.Неоднородность хлоропластов и историческая примесь в пределах рода Malus . Am J Bot. 2015b; 102 (7): 1198–208.
Артикул Google Scholar
Wickham H. ggplot2: элегантная графика для анализа данных. Берлин: Спрингер; 2016.
Книга. Google Scholar
Williams EB, Kuc J. Сопротивление Malus — Venturia inaequalis .Анну Рев Фитопатол. 1969; 7 (1): 223–46.
CAS Статья Google Scholar
Xu X, Yang J, Thakur V, Roberts A, Barbara DJ. Популяционная изменчивость изолятов парши яблони ( Venturia inaequalis ) из Азии и Европы. Завод Дис. 2008. 92 (2): 247–52.
CAS Статья Google Scholar
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Страница не найдена | Институт мира США
Найдите USIP.org
Тип содержания Запись в блогеЦентрКурсЦифровая библиотека мирного процесса в Южном СуданеСобытиеВнешние новостиСтандартТема обсужденияGC — Академия LandingGC — Продвижение курсаGC — СобытиеГлоссарий TermGrantINPROL PublicationЦелевая страницаНовостиОнлайн курсСтраницаЛицаПроектыПубликацияБиблиотечный ресурсУведомление на сайте
Страны Африка-Ангола-Бенин-Ботсвана-Буркина-Фасо-Бурунди-Камерун-Кабо-Верде-Центральноафриканская Республика-Чад-Коморские Острова-Кот-д’Ивуар-Демократическая Республика Конго-Джибути-Экваториальная Гвинея-Эритрея-Эфиопия-Габон-Гана- Гвинея-Гвинея-Бисау-Кения-Лесото-Либерия-Мадагаскар-Малави-Мали-Мавритания-Маврикий-Мозамбик-Намибия-Нигер-Нигерия-Руанда-Сан-Томе и Принсипи-Сенегал-Сейшельские острова-Сьерра-Леоне-Сомали-Южная Африка-Южная Африка Судан-Судан-Свазиленд-Танзания-Гамбия-Республика Конго-Того-Уганда-Замбия-Зимбабве Америка-Антигуа и Барбуда-Аргентина-Багамы-Барбадос-Белиз-Боливия-Бразилия-Канада-Чили-Колумбия-Коста-Рика- Куба-Доминика-Доминиканская Республика-Эквадор-Сальвадор-Гренада-Гватемала-Гайана-Гаити-Гондурас-Ямайка-Мексика-Никарагуа-Панама-Парагвай-Перу-Сент-Китс и Невис-Сент-Люсия-Сент-Винсент и Гренадины-Тринидад и Тобаго-США-Уругвай-Венесуэла Азия-Афганистан-Австралия-Бангладеш-Бутан-Бруней-Бирма-Камбоджа-Китай-Фиджи-Индия-Индонезия-Япония-Казахстан-Кирибати-Кыргызстан Стан-Лаос-Малайзия-Мальдивы-Маршалловы острова-Микронезия-Монголия-Науру-Непал-Новая Зеландия-Северная Корея-Пакистан-Палау-Папуа-Новая Гвинея-Филиппины-Самоа-Сингапур-Соломоновы острова-Южная Корея-Шри-Ланка-Суринам- Таджикистан-Таиланд-Восточный Тимор-Тонга-Туркменистан-Тувалу-Узбекистан-Вануату-Вьетнам-Европа-Албания-Андорра-Армения-Австрия-Азербайджан-Беларусь-Бельгия-Босния-Герцеговина-Болгария-Хорватия-Кипр-Чехия-Дания-Эстония- Финляндия-Франция-Грузия-Германия-Греция-Гренландия-Святой Престол (Ватикан) -Венгрия-Исландия-Ирландия-Италия-Косово-Латвия-Лихтенштейн-Литва-Люксембург-Македония-Мальта-Молдова-Монако-Черногория-Нидерланды-Норвегия -Польша-Португалия-Румыния-Россия-Сан-Марино-Сербия-Словакия-Словения-Испания-Швеция-Швейцария-Турция-Украина-Соединенное Королевство Ближний Восток и Северная Африка-Алжир-Бахрейн-Египет-Иран-Ирак-Израиль и палестинские территории -Иордания-Кувейт-Ливан-Ливия-Марокко-Оман-Катар-Саудовская Аравия-Сирия-Тунис-Объединенные Арабские Эмираты-Йемен
Области проблемы Военно-гражданские отношенияАнализ и предотвращение конфликтовДемократия и управлениеЭкономика и окружающая средаОбразование и обучениеЭлекторальное насилиеХрупкость и устойчивостьГендерГлобальное здоровьеГлобальная политикаПрава человекаСправедливость, безопасность и верховенство законаМедиация, переговоры и диалогНасильственные действияМиропроцессы примирениеРелигиозность11 Сортировать
Актуальность
Дата
.