Контрольная работа по биологии бактерии: Контрольная работа по биологии «Бактерии» (6 класс)

Контрольная работа по биологии «Бактерии» (6 класс)

Тест: Бактерии

Вариант 1.

Выбери вариант с правильным ответом.

1. Наука изучающая микроскопические организмы называется:

А) микология; Б) микробиология; В) бактериология; Г) цитология.

2. Бактерии, имеющие форму палочки, называются:

А) кокки; Б) спириллы; В) вибрионы; Г) бациллы.

3. Организмы, не имеющие оформленного ядра, относятся к:

А) многоядерным; Б) прокариотам; В) эукариотам.

4. Бактерии, которые питаются органическими веществами живых организмов, называются:

А) сапрофиты; Б) хемотрофы; В) фототрофы; Г) паразиты.

5. Материнская клетка бактерий при размножении делится:

А) на две новые клетки; Б) на три новые клетки; В) на четыре новые клетки; Г) на множество клеток.

6. Анаэробы – это бактерии, которые живут в среде:

А) бескислородной; Б) кислородной; В) то в кислородной, то в бескислородной; Г) им это безразлично.

7. Некоторые виды бактерий способны десятки лет сохранять жизнеспособность, так как они:

А) имеют постоянную форму тела; Б) участвуют в круговороте веществ; В) питаются органическими веществами; Г) при неблагоприятных условиях образуют спору.

8. Чем обогащают почву клубеньковые бактерии:

А) соединениями азота; Б) соединениями серы; В) углекислым газом; Г) кислородом.

9. К мерам борьбы с болезнетворными бактериями не относятся:

А) соблюдение правил личной гигиены; Б) термическая обработка пищи и воды; В) прививки и вакцины; Г) употребление овощей прямо с грядки.

10. Молочную кислоту образуют:

а) цианобактерии в) молочнокислые бактерии

б) азотофиксирующие бактерии г) болезнетворные бактерии

Выберите номера с правильными суждениями.

1. Бактерии – одноклеточные организмы.

2. Многие бактерии благодаря наличию жгутиков подвижны.

3. Все бактерии имеют форму палочек.

4. Большинство видов бактерий питаются готовыми органическими веществами.

5. Все бактерии- паразиты растений, животных, грибов. человека.

6. Все бактериальные клетки имеют ядро.

7. Солнечный свет благоприятен для жизни бактерий.

8. Все бактерии при неблагоприятных условиях образуют спору.

9. Все бактерии не могут жить без доступа кислорода

10. Капусту можно квасить благодаря жизнедеятельности молочнокислых бактерий.

Дополни предложения:

1. Палочковидные бактерии называются …

2. Изучением строения и особенностей жизнедеятельности бактерий занимается наука — … .

Тест: Бактерии

Вариант 2.

Выбери вариант с правильным ответом.

1. Аэробы – это бактерии, которые живут в среде:

А) бескислородной; Б) кислородной; В) то в кислородной, то в бескислородной; Г) им это безразлично.

2.Клубеньковые бактерии способны усваивать:

а) азот в) водород

б)кислород г) углерод

3. Бактерии – паразиты питаются:

а) органическими веществами живых организмов

б) органическими веществами отмерших организмов

в) неорганическими веществами

г) водой и минеральными веществами

4. Сине – зеленые (цианобактерии) способны к фотосинтезу, так как:

а) живут в почве в) паразитируют на других бактериях

б) имеют хлорофилл г) имеют большие размеры

5. Органические вещества из неорганических создают:

а) бактерии- сапрофиты в) цианобактерии (сине-зеленые)

б) бактерии – паразиты г) азотофиксирующие бактерии

6.Для чего нужны споры бактериям?

а) для переживания неблагоприятных условий

б) для передвижения по воде

в) для питания

г) для борьбы с животными

7. Бактерии – это:

а) многоклеточные организмы

б) одноклеточные организмы

в) одноклеточные организмы, не имеющие оформленного ядра.

г) клетка, имеющая только форму палочки

8. Возбудитель туберкулеза относиться

а) к почвенным бактериям

б) к бактериям гниения

в) к болезнетворным бактериям

г) к молочнокислым бактериям

 9. Бациллы это:

а) палочковидные бактерии

б) шаровидные бактерии

в) дугообразные бактерии

г) извитые бактерии

 10в. К симбиотическим бактериям относят:

а) клубеньковые

б) почвенные

в) болезнетворные

г) молочнокислые

Выберите номера с правильными суждениями

1.Природе и хозяйственной деятельности гнилостные бактерии наносят только вред.

2. Без бактерий в природе не происходило бы разложение растительных и животных остатков и превращение их в неорганические вещества.

3. Бактерии могут жить только во влажной среде.

4. У бактерий отсутствует ядро.

5. Бациллы — это округлые по форме бактерии.

6. Все бактерии — гетеротрофны.

7. Бактерии-аэробы обитают только в кислородной среде.

8. Бактерии относят к прокариотам.

9. Бактерии самые древние обитатели нашей планеты.

10. Бактерии встречаются всюду.

Дополни предложения:

1. В благоприятных условиях бактериальная клетка делиться каждые…минут.

2. По типу питания болезнетворные бактерии относят к ….

Вариант 1

Часть 1: 1-б, 2-г, 3-б, 4-г, 5-а, 6-а, 7-г, 8-а, 9-г, 10-в

Часть 2: 1,2.4,8,10.

Часть 3: 1-бациллы, 2-бактериалогия

Вариант 2

Часть 1: 1-б, 2-а, 3-а, 4-б, 5-в, 6-а, 7-в, 8-в, 9-а,10-а

Часть 2: 2,4,7,8,9,10

Часть 3: 1-20-30 мин, 2-гетеротрофам

Контрольная работа по теме «Бактерии. Грибы»

5 класс. Контрольная работа  по теме:  Бактерии. Грибы.

Вариант 1.

Тест.  Задания с выбором одного верного ответа.

1. Главное отличие грибов от растений состоит в том, что они:

       1) имеют клеточное строение,

       2) поглощают из почвы воду и минеральные соли,

       3) бывают как одноклеточными, так и многоклеточными,

       4) не содержат в клетках хлоропластов и хлорофилла.

2. Сходство жизнедеятельности грибов и животных проявляется в том, что они:

       1) всасывают минеральные вещества поверхностью гиф,

       2) питаются готовыми органическими веществами,

       3) ведут неподвижный образ жизни и расселяются при помощи спор,

       4) растут в течение всей жизни.

3. Органоиды, отсутствующие в клетках грибов – это:

       1) хлоропласты,    2) ядро,        3) оболочка,          4) цитоплазма.

4.  Для приготовления антибиотиков в промышленности используют:

       1) дрожжи,       2) плесень,       3) грибы-трутовики,       4) шляпочные грибы.

5. Дрожжи используют в хлебопечении:

       1) как источник витаминов,

       2) для обезвреживания вредных примесей,

       3) для получения пористого, лёгкого хлеба и ускорения выпечки,

       4) для более длительного хранения хлеба.

6. Что представляют собой шляпка и ножка гриба?

       1) клетки, содержащие хлоропласты,       2) микоризу,

       3) плодовое тело,       4) организм гриба.

7. Клетки бактерий отличаются от клеток других организмов тем, что не имеют:

а) оболочки  б) жгутиков  в) ядра  г )цитоплазмы

8. Бактерии – очень древние организмы, так как они:

а) маленькие по размеру б) одноклеточные

в) появились на Земле 3,5 млрд. лет назад г) имеют форму палочки

9. Клетки бактерий делятся через каждые:

а) 20 мин.  б) 35 мин.  в) 60 мин. г) 15 мин.

10. В неблагоприятных условиях бактерии превращаются в:

а) кокки  б) споры  в) почки  г) половые клетки

11. Нуклеиновая кислота у бактерий расположена:

а) в ядре  б) прямо в цитоплазме  в) с споре  г) в жгутике

12. Превращают остатки мертвых организмов в перегной:

а) почвенные бактерии  б) кисломолочные бактерии  в) болезнетворные бактерии

13. Йогурт, кефир, творог люди получают с помощью:

а) гнилостных бактерий  б) кисломолочных бактерий  в) дрожжей

Часть В: 1.Выберите 3 правильных утверждения из 6:

1. Нуклеиновая кислота (ДНК) бактерий находится в ядре.

2. Многие бактерии передвигаются с помощью жгутика.

3. Все бактерии имеют палочковидную форму.

4. В неблагоприятных условиях бактерии активны  быстро растут.

5. Деятельность древних бактерий привела к образованию самородной серы.

6. Спора – это толстая оболочка, которая образуется у бактерий при неблагоприятных условиях жизни.

Ответы: ____________

 

2. Ответьте на вопросы:

1. На какие царства учёные разделяют живую природу?

2. Какова роль грибов в природе?

 

Часть С. Сделайте рисунок и подпишите части строения шляпочного гриба, как взаимодействуют наземная и подземная части между собой.

Контрольная работа по теме: «Грибы. Бактерии» 5 класс

Вариант 2

Тест. Задания с выбором одного верного ответа.

1. Взаимодействие дерева и гриба-трутовика является примером:

       1) паразитизма,       2) симбиоза,       3) конкуренции,          4) комменсализма.

2. Грибы являются:

       1) отдельной группой царства растений,

       2) симбиозом растений и бактерий,

       3) особой группой царства животных,

       4) отдельным царством живых существ.

3. Тонкие, бесцветные многоклеточные нити, образующие грибницу, называются:

       1) корневые волоски,        2) гифы,        3) ситовидные трубки,         4) спорангии.

4. Функция плодовых тел шляпочных грибов состоит:

       1) в поглощении воды и минеральных веществ,

       2) в запасании органических веществ,

       3) в образовании органических веществ,

       4) в образовании спор.

5. Признак сходства грибов и растений:

       1) образование гликогена,

       2) наличие пластид,

       3) образование крахмала,

       4) поглощение веществ из почвы путём всасывания.

6. Для производства лекарственного препарата пенициллина с помощью биотехнологии в специальных условиях выращивают:

       1) бактерии,       2) водоросли,    3) вирусы,   4) плесневые грибы.

7.  Клетки бактерий отличаются от клеток других организмов тем, что не имеют:

а) оболочки  б) жгутиков  в) ядра  г )цитоплазмы

8. Бактерии – очень древние организмы, так как они:

а) маленькие по размеру б) одноклеточные

в) появились на Земле 3,5 млрд. лет назад г) имеют форму палочки

9. Клетки бактерий делятся через каждые:

а) 20 мин.  б) 35 мин.  в) 60 мин. г) 15 мин.

10. В неблагоприятных условиях бактерии превращаются в:

а) кокки  б) споры  в) почки  г) половые клетки

11. Нуклеиновая кислота у бактерий расположена:

а) в ядре  б) прямо в цитоплазме  в) с споре  г) в жгутике

12. Превращают остатки мертвых организмов в перегной:

а) почвенные бактерии  б) кисломолочные бактерии  в) болезнетворные бактерии

13. Йогурт, кефир, творог люди получают с помощью:

а) гнилостных бактерий  б) кисломолочных бактерий  в) дрожжей

Часть В: 1.Установите соответствие между частями гриба и их функциями, запишите ответы:

 

А) Состоит из шляпки и ножки Б) Служит для образования спор В) Оплетает корни дерева Г) Состоит из множества ветвящихся нитей Д) Находится над землей

1. Плодовое тело 2. Грибница

2. Ответьте письменно на следующие  вопросы:

1. Какова роль бактерий в природе?

2. Назовите меры по предупреждению отравления грибами.

 

Часть С.  Сделайте рисунок и подпишите части строения  бактерии.

 

 

Ответы

Вариант 1

1	4
2	2
3	1
4	2
5	3
6	3
7	В
8	В
9	А
10	Б
11	Б
12	А
13	Б
В1	256
В2	1)животные, растения, бактерии, грибы 2) СИМБИОЗ – польза деревьям, ДРОЖЖИ – изготовление кондитерских изделий, и прежде всего хлебопекарное производство, ПЕННИЦИЛ – лекарство, ТРУТОВИК – наружный паразит.
Часть С

Вариант 2

1	1
2	4
3	2
4	2
5	4
6	4
7	В
8	В
9	А
10	Б
11	Б
12	А
13	Б
В1	11221
В2	1) Бактерии очень широко распространены в природе. Они населяют почву, выполняя роль разрушителей органического вещества — остатков погибших животных и растений. Бактерии очищают поверхность планеты от гниющих остатков, преобразуя органические молекулы в неорганические, таким образом возвращая химические элементы в биологический круговорот. Важное значение имеет и азотфиксирование — связывание азота воздуха и перевод его в форму, доступную для усвоения растениями, которым азот абсолютно необходим для жизнедеятельности. Способностью к азотофиксации обладают, например, клубеньковые бактерии, поселяющиеся в корешках бобовых растений. 2) -Собирайте и покупайте только такие грибы, о которых вам хорошо известно, что они съедобные. -Не собирайте грибы, если не уверены, что знаете их – какими бы аппетитными они не казались. -Не собирайте грибы вблизи транспортных магистралей, на промышленных пустырях, бывших свалках, в химически и радиационно опасных зонах. -Не собирайте неизвестные грибы, особенно с цилиндрической ножкой, в основе которой есть утолщение «клубень», окруженный оболочкой. -Не собирайте грибы с поврежденной ножкой, старые, вялые, червивые или покрытые слизью.
Часть С

 

Контрольная работа по теме «Грибы, бактерии» | Тест по биологии (6 класс) на тему:

Контрольная работа по теме «Бактерии, грибы, лишайники».

1 вариант.

Часть А. Выберите один правильный ответ.

1. Какая группа организмов самая древняя на нашей планете?

А. растения                        В. лишайники

Б. грибы                                Г. бактерии

2. Где заключена наследственная информация бактерий?

А. в ядре                                В. в кольцевой хромосоме

Б. в ядрышке                        Г. в вакуоли

3. Как называются бактерии, для жизни которых не нужен кислород?

А. анаэробы                        В. эфемероиды

Б. аэробы                                Г. склерофиты

4. Что отличает строение клетки бактерии от строения растительной клетки?

А. имеется клеточная мембрана                        В. отсутствие ядра

Б. способность к фотосинтезу                                Г. имеется ядро

5. Как называются округлые бактерии?

А. бациллы                        В. спириллы

Б. кокки                                Г. вибрионы

6. В клетках каких бактерий содержится хлорофилл?

А. сапрофитов                        В. патогенных

Б. симбионтов                        Г. цианобактерий

7. Грибы – это представители:

А. сапрофитов                В. самых древних организмов

Б. автотрофов                Г. растений

8. Что образуется при сожительстве мицелия гриба и корней растений?

А. микропиле                В. зигота

Б. микориза                Г. ризоиды

9. Как грибы поглощают питательные вещества?

А. корневыми волосками                В. микропиле

Б. устьицами                                Г. всей поверхностью тела

10. Какой гриб оказал огромную помощь в развитии медицины?

А. дрожжи                В. мухомор

Б. мукор                        Г. пеницилл

11. Защитными приспособлениями бактериальной клетки являются

А. Клеточная стенка                В. Жгутики

Б. Ворсинки                        Г. капсула

12. Споры бактерий – это приспособление к:

А. размножению                                                В, распространению

Б. переживанию неблагоприятных условий                Г. питанию

Часть В

В1. Соотнесите названия бактерий с их формой.

А) кокки                                            1) спиралевидные

Б) бациллы                                       2) в виде запятой

В) вибрионы                                     3) палочковидные

Г) спириллы                                     4) шарообразные

В2.  Установите соответствие между особенностями строения и организмом, для которого они характерны.

А) мукор                                       1) Образует плодовое тело из пенька и шляпки                                  

Б) дрожжи                                    2) Состоит из одной многоядерной клетки.

В) подберёзовик                          3) Тело состоит из одной или нескольких клеток.

                                                       4) Размножается почкованием.

                                                      5 )Грибница с корнями растений образует  микоризу

                                                       6) Появляется в виде плесени.

                                                        7)Споры созревают в шляпке

Часть С.

1. Что общего у растений и гриба?
2. Какова роль грибов в природе и жизни человека?

Контрольная работа по теме «Бактерии, грибы, лишайники».

2 вариант.

Часть А. Выберите один правильный ответ.

1. Бактерии – это представители:

А. Эукариот                        В. эфемероидов

Б. прокариот                        Г. склерофитов

2. Какая часть клетки бактерии придает ей форму, выполняет защитную и опорную функции?

А. клеточная оболочка                В. клеточная стенка

Б. клеточная мембрана

3. Как называются бактерии, для жизни которых необходим кислород?

А. аэробы                        В. ксерофиты

Б. анаэробы                  Г. суккуленты

4. Что общего в клеточном строении бактерии и растения?

А. одинаковый размер клеток                В. подвижная цитоплазма

Б. наличие ядра                                Г. наличие мембранных органелл

5. Как называется форма бактерий в виде запятой?

А. спириллы                        В. бациллы

Б. кокки                        Г. вибрионы

6. Как называются бактерии, живущие в корнях бобовых растений?

А. гниения                                В. клубеньковые

Б. молочно — кислые                        Г. болезнетворные

7. Как называются бактерии. Живущие внутри другого организма и вызывающие заболевания?

А. цианобактерии                        В. симбионты

Б. сапрофиты                                Г. паразиты

8. Какие бактерии особенно важны для получения сметаны и простокваши?

А. железобактерии                        В. патогенные

Б. серобактерии                        Г. молочно – кислые

9. Какие грибы используют в хлебопечении?

А. пеницилл                        В. мукор

Б. дрожжи                        Г. рыжик

10. В чем состоит отличие грибов от животных?

А. содержание хитина                                В. запас углеводов в виде гликогена

Б. гетеротрофный способ питания                   Г.способность расти в течении всей жизни

11. Как называются грибы, мирно уживающиеся с различными видами растений?

А. паразиты                                В. сапрофиты

Б. симбионты                                  Г. хищники

12. Как называется наука, изучающая грибы?

А. ботаника                                В. экология

Б. палеоботаника                                 Г. Микология

Часть В1.Объедините название гриба и группу грибов к которой они принадлежат.

Название гриба А.Мукор Б.Бледная поганка В.Пеницилл Г. Мучнистая роса Д.Подберёзовик Е.Мухомор Ж. Дрожжи З.Трутовик И.Лисичка В2. Соотнесите название бактерии с её способом питания  А.Бактерии гниения                                                          1.Паразиты Б.Молочно-кислые бактерии                                            2. Симбионты В.Болезнетворные бактерии                                             3.Сапрофиты Г.Азотфиксирующие бактерии С1.В чём отличия грибов от растений? С2.В чём роль бактерий в природе и жизни человека?	Группа грибов 1.Съедобные грибы 2.Ядовитые грибы 3.Плесневые грибы 4.Грибы-паразиты

Ключ ответов

1 вариант.

Часть А.

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
г	в	а	в	б	г	а	б	г	Г
11	12	13	14	15	16
в	б	в	б	г	б

Часть В.

1. Бациллы.
2. Бесполое: спорами и вегетативное – частью гифов гриба, половое – особыми половыми клетками.

а	б	в	г	д	е	ж	з	и	к
1	2	3	4	2	4	3	1	4	3

Часть С.

Рост в течение всей жизни, прикрепленный образ жизни, питание путем всасывания питательных веществ из почвы, размножение половым и вегетативным путем.

2 вариант.

Часть А.

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
б	в	а	в	г	в	г	г	б	а
11	12	13	14	15	16
б	г	б	а	б	а

Часть В.

1. Кокки.
2. Слоевищем, половое – особыми клетками водорослей и гриба.

а	б	в	г	д	е	ж	з	и	к
3	2	3	4	2	2	3	4	1	1

Часть С.

Растения пионеры суши, подготавливают почву для других растений, корм для оленей, изготовление краски, лакмуса, используются в медицине и парфюмерной промышленности, имеются съедобные лишайники.

Царство Грибы (итоговая контрольная работа). Биология. 5 класс. Дидактический материал

Вариант I

Часть №1

Выберите из четырёх предложенных вариантов ответов только один и его номер запишите в бланке ответов.

1. Клетка грибов в отличие от клетки бактерий имеет
   а) клеточные стенки
   б) ядро
   в) цитоплазму
   г) вакуоль
2. Основное условие для среды обитания грибов – это наличие в ней
   а) воды
   б) минеральных веществ
   в) органических веществ
   г) перегноя.
3. Тело гриба, напоминающее тонкие белые нити, называют
   а) плодовое тело
   б) мицелий, или грибница
   в) грибокорень
   г) спорангий
4. Шляпочные грибы состоят из
   а) шляпки
   б) ножки
   в) грибницы
   г) все ответы верны
5. Снабжает осину водой с растворёнными веществами
   а) опёнок
   б) белый гриб
   в) груздь
   г) подосиновик.
6. Портит продукты питания
   а) мукор
   б) пеницилл
   в) дрожжи
   г) свинушка
7. Грибы делят на пластинчатые и трубчатые исходя из
   а) строения нижнего слоя шляпки
   б) строения ножки
   в) мицелия гриба
   г) образования спор.
8. Выберите номер рисунка, изображающего пеницилл.

№1

№2

№3

№4

9. Как называется орган, в котором гриб образует споры?
   а) грибница
   б) спорангий
   в) ножка (пенёк)
   г) микориза.

Часть №2

Выберите три правильных ответа из шести.

1. Выберите признаки, общие для грибов и растений.
   а) клетки имеют плотную оболочку
   б) питаются только готовыми органическими веществами
   в) растут всю жизнь
   г) питательные вещества всасывают всей поверхностью грибницы
   д) клетки не имеют пигментов
   е) оболочки клеток состоят из хитина.
2. Выберите представителей грибов-симбионтов
   а) подберёзовик
   б) маслёнок
   в) мукор
   г) сыроежка
   д) гриб-рогатик
   е) подосиновик
3. Выберите названия ядовитых грибов
   а) опенок
   б) бледная поганка
   в) сатанинский гриб
   г) мухомор
   д) шампиньон
   е) трюфель

Часть №3

Соотнесите представителей грибов и способ их питания

А) Подосиновик Б) Опёнок В) Гриб-трутовик Г) Почвенный гриб

1) Сапрофит 2) Паразит 3) Хищник 4) Симбионт.

Кратко сформулируйте правила сбора грибов.

Часть №4

Дополните предложения предложенными словами.

1. Между определёнными видами деревьев и грибов существует тесная взаимополезная связь — …
2. При этом нити грибницы плотно полетают корень дерева и даже врастают в него образуя…
3. Через неё гриб получает от дерева…, а дерево от гриба… .

Слова для дополнения текста:  вода, микориза (грибокорень), спорангий, органические вещества, симбиоз, хитин, головня.

Часть №5

Назовите грибы, изображенные на рисунке. К какой группе грибов они относятся? Чем они отличается друг от друга? Каково их значение в жизни человека?

Решите ситуацию: собирая грибы в лесу вы встретили неизвестный гриб. Ваши действия?

Часть №6 Практическая работа

С помощью микроскопа определите вид гриба на микропрепарате. Результат сообщите учителю.

Вариант II

Часть №1

Выберите из четырёх предложенных вариантов ответов только один и его номер запишите в бланке ответов.

1. Численность царства грибов
   а) 10 тысяч видов
   б) 50 тысяч видов
   в) 100 тысяч видов
   г) 1 миллион видов.
2. В плодовых телах грибов образуются
   а) семена
   б) споры
   в) гаметы
   г) питательные вещества.
3. Выберите номер рисунка, изображающего дрожжи.

№1

№2

№3

№4

4. Грибница у грибов может быть
   а) одноядерной одноклеточной
   б) одноядерной многоклеточной
   в) многоядерной одноклеточной
   г) все ответы верны.
5. Одноклеточный мицелий и шаровидные спорангии у гриба
   а) мукора
   б) дрожжей
   в) пеницилла
   г) головни.
6. Хлеб, пиво, вино человек получает с помощью гриба
   а) трутовика
   б) мукора
   в) пеницилла
   г) дрожжей.
7. Для грибов не характерен способ размножения
   а) семенами
   б) спорами
   в) вегетативно (кусочками грибницы)
   г) половым путём.
8. На картофеле и томатах паразитирует гриб
   а) спорынья
   б) фитофтора
   в) головня
   г) трутовик
9. Съедобный гриб – это
   а) мухомор
   б) груздь
   в) бледная поганка
   г) ложный опёнок

Часть №2

Выберите три правильных ответа из шести.

1. Выберите признаки, общие для грибов и животных.
   а) клетки имеют плотную оболочку
   б) питаются только готовыми органическими веществами
   в) растут всю жизнь
   г) питательные вещества всасывают всей поверхностью грибницы
   д) клетки не имеют пигментов
   е) оболочки клеток состоят из хитина.
2. Выберите примеры значения грибов в жизни человека
   а) вызывают болезни кожи, волос, ногтей
   б) портят продукты питания
   в) участвуют в образовании перегноя
   г) образуют симбиоз с деревьями
   д) участвуют в круговороте веществ
   е) являются источником лекарственных веществ
3. Выберите названия грибов-сапрофитов
   а) подберёзовик
   б) маслёнок
   в) мукор
   г) сыроежка
   д) дрожжи
   е) подосиновик

Часть №3

Соотнесите номера на рисунке и названия частей гриба и сделайте обозначения к рисунку. Кратко сформулируйте правила сбора грибов.

Часть №4

Дополните предложения предложенными словами.

1. Грибница пеницилла… , в отличии от мукора, у которого грибница… .
2. Споры у пеницилла созревают в метельчатых, а у мукора – в шаровидных… .
3. Из спор пеницилла человек получает лекарственное вещество, убивающее бактерии… .

Слова для дополнения текста: мицелий, грибокорень, одноклеточная, многоклеточная, спорангиях, антибиотик, лишай.

Часть №5

Объясните, что изображает рисунок? К какому типу питания относят данный гриб? Что образуется при прорастании нитей грибницы ы корень дерева? Какое значение для гриба и дерева имеет данная связь? Решите ситуацию: на обед были варёные грибы. У вашего друга разболелся живот, его лихорадит и тошнит. Ваши действия?

Часть №6 Практическая работа

С помощью микроскопа определите вид гриба на микропрепарате. Результат сообщите учителю.

Бланк ответов для итоговой работы «Царство Грибы».   Вариант I

Фамилия, Имя, _________________________________________________________________________

Часть №1 Выберите один правильный ответ из четырёх (9баллов)

Номер задания	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Вариант ответа

Часть №2 Выберите три правильных ответа из шести.(6 баллов)

Номер задания	1	2	3
Варианты ответов

Часть №3 Соотнесите представителей грибов и способ их питания.(3 балла)

Правила сбора грибов___________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________

Часть №4 Дополните предложения предложенными словами.(3 балла)

№ ПРЕДЛОЖЕНИЯ	1	2	3
Пропущенное слово

Часть №5 Задание со свободным ответом. (15 баллов)

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

Часть №6 Практическая работа (5 баллов)

Балл (определит учитель)______

Критерии оценки (для самоконтроля):

5 – 42-36 баллов

4 – 35-30 баллов

3 – 29-21 балл

2 – 20 и меньше.

Бланк ответов для итоговой работы «Царство Грибы».   Вариант II

Фамилия, Имя, _________________________________________________________________________

Часть №1 Выберите один правильный ответ из четырёх (9 баллов)

Номер задания	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Вариант ответа

Часть №2 Выберите три правильных ответа из шести.(6 баллов)

Номер задания	1	2	3
Варианты ответов

Часть №3 Соотнесите номера на рисунке и названия частей гриба.(3 балла)

№1	№2	№3	№4

Правила сбора грибов___________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________

Часть №4 Дополните предложения предложенными словами. (3 балла).

№ ПРЕДЛОЖЕНИЯ	1	2	3
Пропущенное слово

Часть №5 Задание со свободным ответом.(15 баллов)

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________

Часть №6 Практическая работа (5 баллов)

Балл (определит учитель)______

Критерии оценки (для самоконтроля):

5 – 42-36 баллов

4 – 35-30 баллов

3 – 29-21 балл

2 – 20 и меньше.

Контрольная работа по теме «Бактерии, грибы, водоросли»

Контрольная работа №2 (Бактерии, грибы, водоросли)

1 вариант

1. задание. Выберите один правильный ответ.

1. Плодовое тело подосиновика образуется:

1. грибницей 2) побегом 3) корнями 4) стебле

1. Плодовое тело гриба подберёзовика состоит из:

1) корней 2) почек 3) побегов 4) шляпки и ножки

3. Плесень, или белый налёт, на хлебе образует:

1) шляпочный гриб 2) дрожжи 3) гриб мукор 4) бактерии

4. Пекарские дрожжи представляют собой:

1) бактерии 2) растения 3) грибы 4) животных

5. Самые древние обитатели нашей планеты – это:

1) грибы 2) бактерии 3) растения 4) животные

6. Наследственный материал клетки расположен непосредственно в цитоплазме у:

1) грибов 2) бактерий 3) растений 4) животных

7. Бактериальную клетку от окружающей среды отделяет:

1) цитоплазма 2) ядерная оболочка 3) жгутик 4) наружная мембрана

8. Бактериальные клетки размножаются:

1) спорами 2) участками цитоплазмы 3) жгутиками 4) делением клетки

9. Верны ли следующие утверждения?

А. Бактериальные клетки могут иметь различную форму.

Б. Кефир получают, используя бактерии брожения.

1) верно только А 2) верны оба суждения 3) верно только Б 4) неверны оба суждения

10. Снаружи живую клетку покрывает:

1) цитоплазма 2) мембрана 3) хлоропласт 4) ядро

2 задание. 1) Установите соответствие между особенностью жизнедеятельности организмов и их принадлежностью к царству живой природы.

Особенность жизнедеятельности: Царство живой природы:

А) Питаются путём заглатывания пищевых 1) грибы

частиц 2) Животные

Б) Неограниченный рост у большинства организмов

В) Активное передвижение

Г) Питаются путём всасывания веществ

Д) Неподвижны, ведут прикреплённый образ жизни

2) Закончите предложения, используя слова из словарика:

1. Тело растений имеет строение…

2. При делении из одной клетки получаются…

3. Живые клетки…

Словарик: А. Две. Б. Дышат. В. Клеточное

3 задание. В чем заключается значение водорослей в медицине?

Контрольная работа №2 (Бактерии, грибы, водоросли)

2 вариант

1 задание. Выберите один правильный ответ.

1. Биологи объединяют все грибы в систематическую группу:

1) род 2) царство 3) отдел 4) семейство

2. Основная часть гриба боровика – это:

1) корень 2) споры 3) стебель 4) грибница

3. Грибы размножаются с помощью: 1) спор 2) семян 3) гамет 4) спермиев

4. Плесневый гриб пеницилл человек использует для получения:

1) продуктов питания 2) красителей 3) лекарств 4) одежды

5. Верны ли следующие утверждения?

А. Грибы размножаются спорами или участками грибницы.

Б. Между корнями дерева и грибницей шляпочного гриба устанавливается взаимосвязь.

1) верно только А 2) верны оба суждения 3) верно только Б 4) неверны оба суждения

6. Одноклеточные организмы объединены в царство:

1) грибов 2) растений 3) бактерий 4) животных

7. Оформленное ядро отсутствует в клетке:

1) грибов 2) бактерий 3) растений 4) животных

8. Жгутик бактерий представляет собой органоид для:

1) передвижения 2) запасания белка 3) размножения 4) перенесения неблагоприятных условий

9. Споры бактерий служат для:

1) питания 2) размножения 3) дыхания 4) перенесения неблагоприятных условий

10. Верны ли следующие утверждения?

А. Самородная сера и природный газ образовались в результате деятельности бактерий.

Б. Болезнетворные бактерии поражают только тело человека и не встречаются в организме растений и животных.

1) верно только А 2) верны оба суждения 3) верно только Б 4) неверны оба суждения

2 задание. 1) Установите соответствие между особенностью жизнедеятельности и группой организмов.

Особенность жизнедеятельности: Группа организмов:

А) Образуют органические вещества на свету 1) Шляпочные грибы

Б) Размножаются спорами 2) Растения

В) Размножаются семенами

Г) Питаются, поглощая готовые питательные вещества

Д) Образуют газовый состав воздуха, выделяя кислород

2) Заполните таблицу, используя слова и предложения из словарика.

Жизнедеятельность бактериальной клетки

Процесс жизнедеятельности бактерий	Как осуществляется
1) Передвижение
2) Перенесение неблагоприятных условий
3) Размножение

Словарик: А. Путём деления надвое. Б. С помощью жгутика. В. В виде спор.

3 задание. В чем заключается значение водорослей в сельском хозяйстве?

Царство Бактерии. Царство Растения. Царство Грибы.

1. Грибы относят в отдельное царство потому что:

а) Несут в себе признаки и растения и животного

б) Не имеют ядра

в) Могут паразитировать на других организмах

1. Растения, тело которых разделено на органы называют:

а) высшими

б) низшими

1. Тело низших растений представлено:__________________________________________________________________

2. Самое простое строение у организмов царства:

а) Растения

б) Животные

в) Бактерии

г) Грибы

1. Где находится генетическая информация в бактериальной клетке:

а) В цитоплазме

б) В ядре

в) В центриолях

г)В рибосомах

1. Какие органоиды характерны ТОЛЬКО для растительной клетки:

а) Ядро

б) Цитоплазма

в) Рибосомы

г) Пластиды

1. Белые нити, из которых состоит тело гриба:

а) Гиф

б) Мицелий

в Дрожжи

1. С помощью чего борются с заболеваниями, вызванными бактериальными возбудителями?_______________________________

2. Родоначальник науки о растениях:____________________

3. Определите, какой организм из перечисленных имеет автотрофный тип питания:

а) Медведь

б) Мухомор

в) Ромашка

г)Дождевой червь

1. Грибы изучает наука:

а) Микология

б) Биология

в) Бактериология

г) Зоология

1. Как называют бактерии имеющие шарообразную форму клеток?

а
) Спириллы

б ) Вибрионы

в) Бациллы

г ) Кокки

1. П риведите примеры споровых растений______________________________________________________________________________________________________________

2. Органы растений, принимающие участие в половом размножении называют:__________________________________________

3. К акое вещество находится в клеточной стенке гриба?_________________

4. Н аука, изучающая лишайники:_________________

5. Организмы, имеющие в клетке оформленное ядро:

а) Прокариоты

б) Эукариоты

1. Какие из перечисленных лишайников являются самыми распространенными?

а) Кустистые

б) Накипные

в) Листоватые

1. Накаком рисунке изображена клетка низшего гриба?

А

) Б)

1. Симбиоз между грибами и определенными видами деревьев называется:_____________________________

2. Какие из низших грибов используются в выпечке?

а) мукор

б) пеницилл

в) дрожжи

1. Верны ли данные утверждения?

А) «Лишайники являются индикаторами загрязнения окружающей среды».

Б) «Основным кормом северных оленей является лишайник под названием «ягель»». 

а) Верно только А

б) Верно только Б

в) Оба варианта верны

г) Оба варианта неверны

1. Соотнесите грибы и тип их шляпочного строения:

а) шампиньон

б) подосиновик 1. Трубчатый

в) рыжик 2. Пластинчатый

г) бледная поганка

д) масленок

1. Подпишите все части внутреннего строения лишайника:

Ключи:

1.А

2.А

3. Слоевищем или талломом

4. В

5. А

6. Г

7. А

8. Антибиотики

9. Теофраст

10. В

11.А

12. Г

13. Мхи, Хвощи, Папоротники, Водоросли

14. Генеративными

15. Хитин

16. Лихенология

17. Б

18. Б

19. А

20. Микориза

21. В

22. В

23. 21221

24.(сверху вниз) верхний корковый слой, зона водорослей, гифы грибницы, нижний корковый слой, ризоиды

Адрес публикации: https://www.prodlenka.org/metodicheskie-razrabotki/446466-kontrolnaja-rabota-po-biologija-6-klass-tema

Контрольная работа «Жизнь на Земле. Бактерии. Протисты. Грибы. Лишайники» 7 класс

Контрольную работу разработал учитель биологии

ГУО «Средняя школа № 21 г. Бобруйска» Шикуть Екатерина Александровна

Контрольная работа № 1

«Жизнь на Земле. Бактерии. Протисты. Грибы. Лишайники»

Вариант 2

Уровень 1

1. Найдите среди изображённых на рисунке грибов дрожжи.

а б в г

2. Какая структура инфузории туфельки обозначена под цифрой 5?

А) порошица

Б) стигма

В) сократительная вакуоль

Г) ядро

Уровень 2

3. Закончите предложение:

а) бактерии округлой формы называются……

б) бактерии, портящие продукты питания, по способу гетеротрофного питания являются…

в) при половом размножении хламидомонады при слиянии двух гамет образуется…

г) болезни, вызываемые грибами у животных и людей называются….

Уровень 3

4. Отметьте знаком «+» верные утверждения, «-» — неверные:

а) бактериальная спора по размеру меньше клетки.

б) споры и цисты у протистов выполняют одинаковые функции.

в) деление – половое размножение у амёбы обыкновенной.

г) отсутствие сократительной вакуоли у хлореллы связано с наличием клеточной стенки.

д) головнёвые грибы образуют органы спороношения в виде чёрных рожков.

е) наиболее распространёнными в природе лишайниками являются кустистые.

Уровень 4

5. Установите соответствие:

1. гриб А) мукор I) автотрофы

2. бактерия Б) хламидомонада II) гетеротрофы

3. протист В) пармелия

4. лишайник Г) анабена

Уровень 5

6. Составьте цепь питания: муха, паук, укроп, синица, гнилостная бактерия.

7. Какие условия необходимы для существования любой экосистемы?

Понимание бактерий — предметный тест GRE: биология

Если вы считаете, что контент, доступный через Веб-сайт (как определено в наших Условиях обслуживания), нарушает или другие ваши авторские права, сообщите нам, отправив письменное уведомление («Уведомление о нарушении»), содержащее в информацию, описанную ниже, назначенному ниже агенту. Если репетиторы университета предпримут действия в ответ на ан Уведомление о нарушении, оно предпримет добросовестную попытку связаться со стороной, которая предоставила такой контент средствами самого последнего адреса электронной почты, если таковой имеется, предоставленного такой стороной Varsity Tutors.

Ваше Уведомление о нарушении прав может быть отправлено стороне, предоставившей доступ к контенту, или третьим лицам, таким как в качестве ChillingEffects.org.

Обратите внимание, что вы будете нести ответственность за ущерб (включая расходы и гонорары адвокатам), если вы существенно искажать информацию о том, что продукт или действие нарушает ваши авторские права. Таким образом, если вы не уверены, что контент находится на Веб-сайте или по ссылке с него нарушает ваши авторские права, вам следует сначала обратиться к юристу.

Чтобы отправить уведомление, выполните следующие действия:

Вы должны включить следующее:

Физическая или электронная подпись правообладателя или лица, уполномоченного действовать от их имени; Идентификация авторских прав, которые, как утверждается, были нарушены; Описание характера и точного местонахождения контента, который, по вашему мнению, нарушает ваши авторские права, в \ достаточно подробностей, чтобы позволить репетиторам университетских школ найти и точно идентифицировать этот контент; например нам требуется а ссылка на конкретный вопрос (а не только на название вопроса), который содержит содержание и описание к какой конкретной части вопроса — изображению, ссылке, тексту и т. д. — относится ваша жалоба; Ваше имя, адрес, номер телефона и адрес электронной почты; а также Ваше заявление: (а) вы добросовестно полагаете, что использование контента, который, по вашему мнению, нарушает ваши авторские права не разрешены законом, владельцем авторских прав или его агентом; (б) что все информация, содержащаяся в вашем Уведомлении о нарушении, является точной, и (c) под страхом наказания за лжесвидетельство, что вы либо владелец авторских прав, либо лицо, уполномоченное действовать от их имени.

Отправьте жалобу нашему уполномоченному агенту по адресу:

Чарльз Кон Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, Suite 300
St. Louis, MO 63105

Или заполните форму ниже:

Идентификация бактерий | Безграничная микробиология

Химические анализы, радиоизотопные методы и микроэлектроды

Существует множество доступных тестов и анализов, которые используются для помощи в идентификации бактерий в различных условиях.

Цели обучения

Сравните различные тесты, которые можно использовать при изучении микробов

Основные выводы

Ключевые моменты

• В химических анализах, используемых для идентификации бактерий, используются различные компоненты микроорганизмов, включая структурные, клеточные и метаболические индикаторы.
• Радиоизотопные методы включают использование радиоизотопов для определения конкретных метаболических путей, используемых бактериями, путем отслеживания поглощения и распада определенных питательных веществ, меченных радиоактивностью.
• Микроэлектроды обычно используются для идентификации бактерий, особенно патогенных бактерий, в качестве средства идентификации биологических компонентов в различных средах путем объединения с биодатчиками.

Ключевые термины

• пептидогликан : полимер гликана и пептидов, обнаруженный в стенках бактериальных клеток.

В области микробиологии существуют специальные тесты или анализы, используемые для количественного и качественного измерения компонентов микроорганизмов.Эти анализы часто используются для идентификации бактерий. Для этой цели используются три основных типа: химические анализы, радиоизотопные методы и использование микроэлектродов. Ниже приводится обзор этих методологий.

Химические анализы

Химические анализы используются для идентификации и определения химических компонентов в микроорганизмах. Многие из этих анализов проверяют конкретные клеточные компоненты и могут пересекаться с химическим анализом, который фокусируется на точном химическом составе.

Окрашивание по грамму

Примеры химических анализов включают классический тест на грамположительные или грамотрицательные бактерии с помощью окрашивания по Граму. Окрашивание по Граму используется для дифференциации бактерий на любую из этих групп Грама. Метод окрашивания по Граму основан как на химических, так и на физических свойствах стенок бактериальных клеток и тестах на присутствие пептидогликана.

Окрашивание по Граму : Пример химического анализа, используемого для идентификации бактерий.

Окислительный — Ферментация Тест на глюкозу

Тест O-F используется для определения того, каким образом бактерии способны метаболизировать углеводы, такие как глюкоза. Два основных механизма, с помощью которых бактерии могут получать энергию, включают окисление глюкозы и ферментацию лактозы. Этот конкретный анализ определяет, какой метод используют бактерии, культивируя бактерии в различных условиях.

Испытания на гидролиз

Процесс гидролиза характеризуется способностью химически расщеплять молекулу путем добавления воды.Для идентификации бактерий используются многочисленные тесты, включающие тестирование на гидролиз определенных веществ. Эти тесты включают гидролиз крахмала, липидов, казеина и желатина. В основе этих тестов лежит идентификация и определение того, есть ли у микроба необходимые ферменты и молекулы для разрушения, и использование этих специфических молекул в качестве источников энергии для роста клеток.

Радиоизотопные методы

Радиоизотопы — это особые типы изотопов, излучающие радиоактивность.Изотопы элемента различаются количеством нейтронов в их ядрах. В области микробиологии было использовано радиоизотопов

Микроэлектроды

Электроды характеризуются системой электрических проводников, которые используются для контакта с неметаллической частью цепи. Что касается микробиологии и идентификации бактерий, микроэлектроды обычно используются для идентификации патогенных бактерий в различных условиях. Микроэлектроды могут действовать как биодатчики и обнаруживать определенные биологические компоненты микробов.

Стабильные изотопы

Стабильные изотопы — это атомы, которые не являются радиоактивными, другими словами, они не собираются терять нейтроны и самопроизвольно распадаться.

Цели обучения

Продемонстрируйте, как изотопы используются для идентификации бактерий

Основные выводы

Ключевые моменты

• Термин изотоп относится к количеству нейтронов, содержащихся в определенном элементе.
• Элементы с одинаковым именем всегда должны иметь одинаковое количество протонов, но количество нейтронов может меняться.
• Добавление или вычитание нейтронов из атома не изменяет элементных свойств, но может изменить некоторые из его свойств (например, сделать его более радиоактивным).
• Хотя количество нейтронов в конкретном атоме может меняться, существует определенный порог, когда атому дается больше нейтронов, чем может удержать его ядерная сила. На данный момент атом считается нестабильным.
• Атом будет продолжать терять нейтроны или распадаться, пока снова не станет стабильным. Стабильный изотоп — это химический изотоп, который не является радиоактивным.

Ключевые термины

• изотоп : Любая из двух или более форм элемента, в которых атомы имеют одинаковое количество протонов, но разное количество нейтронов в их ядрах. Как следствие, атомы одного и того же изотопа будут иметь одинаковый атомный номер, но другое массовое число (атомный вес).
• атом : Наименьшее возможное количество вещества, которое все еще сохраняет свою идентичность как химический элемент, который, как теперь известно, состоит из ядра, окруженного электронами.
• Радиоактивный : частица, которая имеет спонтанное излучение ионизирующего излучения в результате ядерной реакции или непосредственно в результате разрушения нестабильного ядра.

Изотопы

Термин изотоп относится к количеству нейтронов, содержащихся в определенном элементе. Одноименные элементы (например, кислород) всегда должны иметь одинаковое количество протонов, но количество нейтронов может меняться. Добавление или вычитание нейтронов из атома не меняет элементных свойств, но может изменить некоторые из его свойств (например, сделать его более радиоактивным).

Стабильные изотопы

Хотя количество нейтронов в конкретном атоме может меняться, существует определенный порог, когда атому дается больше нейтронов, чем может удержать его ядерная сила. В этот момент нейтроны начинают высвобождаться. Выброс также известен как распад. В это время атом считается «нестабильным». «Атом будет продолжать терять нейтроны, пока снова не станет стабильным. Стабильный изотоп — это химический изотоп, который не является радиоактивным. Бывают случаи, когда у атомов нет стабильных изотопов, поэтому они продолжают терять нейтроны, а затем протоны и электроны, пока не станут полностью другим элементом.Исследования показали, что существует 80 элементов с одним или несколькими стабильными изотопами. Из них 26 имеют только один стабильный изотоп, который также известен как моноизотопный. Элементом с наиболее стабильными изотопами является олово, которое состоит из 10 стабильных изотопов.

Таблица изотопов : Это таблица, которая представляет распад атома с образованием различных изотопов.

Расширения

Знания о стабильных изотопах важны во многих областях. Ученые использовали информацию по этим темам в ботанических и биологических исследованиях растений, а также в экологических и биологических исследованиях.Кроме того, некоторые ученые использовали соотношение изотопов кислорода для восстановления исторической температуры атмосферы. Эта работа особенно важна в связи с нашей текущей озабоченностью изменением климата / глобальным потеплением.

Услуги лабораторных исследований по микробиологии и клеточной биологии

Emery Pharma предлагает следующие микробиологические услуги:

Тест на минимальную ингибирующую (МИК), минимальную бактерицидную (МБК) и минимальную фунгицидную концентрацию (МФК):

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) — это тип анализа чувствительности к противомикробным препаратам.Он используется для определения минимальной концентрации противомикробного агента, необходимой для подавления видимого роста микроорганизмов в бульоне или агаре. Emery Pharma предлагает широкий спектр анализов МИК, включая макро- и микроразбавление в бульоне, дисковую диффузию и разведение в агаре.

Анализ MBC и MFC используется для определения самой низкой концентрации противомикробных агентов, которая приводит к гибели микробов. MBC является комплементарным к MIC, и анализ MBC обычно проводят после анализа MIC при макро- или микроразбавлении, чтобы определить, являются ли противомикробные агенты бактерицидными или бактериостатическими.

Противовирусные анализы на основе суспензии бетакоронавируса — Тест ASTM E1052:

Emery Pharma предлагает антивирусные анализы на основе суспензии с использованием бета-коронавируса OC43 (ATCC VR-1558). Наши антивирусные тесты на основе суспензии против OC43 могут быть адаптированы либо для прямой инактивации вируса, либо для анализа защиты клеток. При прямой инактивации тестируемое вещество непосредственно инактивирует вирус OC43, тогда как в тесте на защиту клеток клетки-хозяева предварительно обрабатывают тестируемым веществом, затем заражают вирусом OC43, чтобы оценить, защищает ли тестируемое вещество клетки-хозяева от инфекции.

Кинетический анализ Time-Kill:

Кинетический анализ Time-Kill Kinetics используется для оценки скорости уничтожения микроорганизмов антимикробным агентом, которая осуществляется путем измерения количества жизнеспособных микроорганизмов, оставшихся в различные моменты времени после воздействия противомикробного агента. Emery Pharma предлагает тесты на время уничтожения антисептиков (то есть короткие интервалы между временными точками порядка минут), а также тестируемые соединения антибиотиков (то есть более длинные интервалы между временными точками порядка часов).

Тестирование биопленки:

Биопленки образуются микроорганизмами, включая бактерии и грибы, для прилипания и защиты клеток. Микробные биопленки, производимые бактериями, делают большинство доступных в настоящее время антибиотиков неэффективными, создавая «щит», через который антибиотики не могут проникнуть. Чтобы проверить способность соединения проникать через бактериальную биопленку, мы предлагаем анализ минимальной концентрации уничтожения биопленки (MBEC) в качестве услуги для наших клиентов, чтобы проверить способность тестируемого соединения проникать через бактериальную биопленку.

Анализ MBEC используется для определения концентрации противомикробного агента, который проникает в бактериальные биопленки и уничтожает их. Emery Pharma предлагает анализ MBEC на основе микропланшета с крышкой с колышками, преимуществом которого является высокая консистенция биопленки и возможность тестировать диапазон концентраций за один анализ. В дополнение к тесту MBEC, Emery Pharma предлагает разработку индивидуального протокола антибиотикопленки, чтобы найти решение, которое наилучшим образом соответствует потребностям клиента.

Исследование устойчивости к антибиотикам:

«Исследования развития устойчивости к антибиотикам» используется для характеристики способности микроорганизмов развивать устойчивость к противомикробным препаратам с использованием как одноэтапных, так и многоступенчатых методов.Emery Pharma предлагает как одноэтапные анализы для определения частоты мутации противомикробного агента, так и многоступенчатые последовательные пассажи микробов в модели последовательного пассажа.

Тест на цитотоксичность:

Тесты на цитотоксичность используются для определения токсичности тестируемого соединения для клеток млекопитающих и являются важной частью определения того, может ли соединение быть жизнеспособным кандидатом в лекарство. Emery Pharma предлагает как количественные, так и качественные анализы, такие как тесты элюции MTT и MEM соответственно.

Исследование синергии противомикробных препаратов — тестирование в шахматном порядке:

Тестирование синергизма противомикробных препаратов методом шахматной доски используется для определения влияния комбинации антибиотиков на эффективность по сравнению с их индивидуальной антимикробной активностью. Исследования синергизма можно дополнительно оценить с помощью кинетического анализа времени уничтожения для определения скорости уничтожения комбинаций.

Анализ постантибиотического эффекта:

Emery Pharma предлагает анализ постантибиотического эффекта для определения способности противомикробного препарата подавлять рост бактерий даже после удаления препарата из культуры.

РЕСУРСЫ:

Инвентаризация бактерий

Опись грибов

Реестр вирусов

Антибиотики:

Различные бактерии

Метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA)

Биология — противомикробные агенты — Бирмингемский университет

Устойчивость к антибиотикам признана одной из величайших проблем, стоящих перед человечеством. Сегодня это большая область исследований для ученых, а для ученых завтрашнего дня она станет еще больше.Если вы надеетесь стать одним из тех ученых будущего, вам сначала нужно понять микробиологию и овладеть техникой асептики.

Антибиотики — это особый тип противомикробных агентов — они убивают или ограничивают рост микроорганизмов. Противомикробные средства не ограничиваются антибиотиками; химические вещества, такие как отбеливатель или спирт, убивают бактерии, как и физические процессы, такие как нагревание или ионизирующее излучение. Однако антибиотики стали жизненно важным инструментом в нашей борьбе с инфекционными заболеваниями с тех пор, как Александр Флеминг впервые открыл пенициллин в 1928 году.Из-за широкого распространения (и неправильного использования) антибиотиков и быстрой эволюции бактерий появились устойчивые штаммы, такие как MRSA (устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus ), распространенная инфекция, передаваемая в больницах. Как и в случае со многими бактериями, S. aureus не обязательно является патогенным организмом, но в неправильной части тела он может быть опасным, а без лечения может быть смертельным.

Антибиотики часто обладают особым механизмом действия, который позволяет им убивать бактерии, например, пенициллин ингибирует белки, которые перекрестно связывают слой пептидогликана в стенке бактериальной клетки.Пенициллин наиболее эффективен против грамположительных бактерий, поскольку их клеточные стенки в основном состоят из пептидогликана, а не грамотрицательных бактерий, которые также имеют липополисахаридный и белковый слой. Когда клетка пытается делиться, она не может восстановить клеточную стенку пептидогликана, тогда она не может поддерживать тургорное давление, и клетка будет «всплывать» или лизироваться. Чтобы бороться с этим, бактерии разработали ряд средств защиты, включая ферменты «пенициллиназы», ​​которые делают пенициллин неэффективным, модифицируя белки, на которые действует пенициллин, или даже разрабатывают мембранные насосы, которые активно удаляют пенициллин из бактериальной клетки.

Другие противомикробные агенты, как правило, обладают более широким действием, чем антибиотики, что может сделать их менее уязвимыми для развития резистентности. Отбеливатель, например, очень хорошо убивает бактерии, так как хлорноватистая кислота оказывает на ферменты такое же воздействие, как и тепло. Антимикробный агент, содержащийся в чесноке, аллицин, подавляет действие широкого спектра ферментов. Однако, как отбеливатель очень токсичен для людей и других животных, чеснок токсичен не только для бактерий. Он обладает противогрибковой, антипаразитарной и противовирусной активностью; он может быть токсичным даже для животных, которые хуже его переваривают, чем люди.

Как мы проверяем противомикробные препараты?

Как можно протестировать противомикробные препараты?

Как освоить асептическую технику?

Хорошая асептическая техника — основа безопасной и эффективной работы в лаборатории. Перекрестное загрязнение образцов может испортить часы кропотливой работы в лаборатории и, при работе с потенциально опасными организмами, нанести вред здоровью человека. Хотя в школе вы вряд ли когда-либо будете работать с особо вредными штаммами бактерий, большинство бактерий потенциально могут причинить вред, если они получат доступ к участкам тела, где им быть не должно.

Есть несколько основных принципов разработки эффективных методов асептики. Во-первых, убедитесь, что вы всегда носите правильные средства индивидуальной защиты. Ваш учитель должен посоветовать вам подходящее защитное снаряжение, но помните, что оно не только защищает вас, но и защищает ваш эксперимент от заражения. Во-вторых, помните, что время всегда является фактором, и ключ к хорошей асептической технике — работать эффективно, а не быстро. Если у вас нет под рукой жизненно важного оборудования, вы увеличиваете риск заражения открытой чашки Петри, поэтому обо всем позаботьтесь заранее, чтобы избежать задержек.Наконец, правильно подготовьте рабочее место и оборудование. Закройте окна, чтобы избежать сквозняков, и всегда используйте горелку Бунзена, чтобы втягивать потоки воздуха вверх и в сторону от рабочей зоны. Убедитесь, что вы дезинфицируете каждую поверхность до и после, а также каждую часть оборудования при каждом использовании. Сочетание пламени Бунзена и спирта — эффективный способ стерилизации металлического оборудования, такого как проволочные петли или пинцет. Если вашу скамейку сложно дезинфицировать, вы можете подумать о том, чтобы накрыть ее более легко дезинфицируемым материалом для работы.

Вы можете увидеть, как Крис использует пламя Бунзена на изображении выше, чтобы убедиться, что потоки воздуха направляются вверх и от чашки Петри, над которой он работает. Чтобы сделать снимок, он держит чашку Петри, но лучшая асептическая техника — поставить чашку на скамейке так, чтобы крышка была легко доступна поблизости; по крайней мере, он носит правильные средства индивидуальной защиты! Он также должен использовать спирт и пламя Бунзена для стерилизации металлических пинцетов после каждого использования.

Лабораторные признания

В подкасте «Лаборатория исповеди» исследователи рассказывают о своем лабораторном опыте в контексте практических экзаменов A Level. В этом выпуске мы рассмотрим использование лабораторной посуды и использование антимикробной асептической техники.

Как выглядит задержка роста?

Если вы выполнили эксперимент правильно, с применением хорошей асептической техники и точных серийных разведений, вы должны увидеть чистые области или «зоны ингибирования» вокруг дисков с антимикробным агентом.Размер этой зоны ингибирования показывает, насколько эффективно противомикробный агент убивает бактерии или ингибирует их рост, и можно ожидать, что более крупные зоны будут обнаружены вокруг более высоких концентраций противомикробного агента. Надеюсь, на вашем контрольном диске, содержащем только воду, не должно быть зоны торможения.

В зависимости от используемого противомикробного агента можно ожидать различных уровней ингибирования роста. Возвращаясь к примеру с пенициллином, мы ожидаем гораздо большего ингибирования роста S.aureus , чем на E. coli , так как S. aureus является грамположительным, а E. coli — грамотрицательным. Однако, используя широкий спектр противомикробных средств, таких как отбеливатель, мы ожидаем, что рост обеих бактерий будет подавляться одинаково.

Бактерии могут обойтись даже с противомикробными средствами широкого действия, такими как отбеливатель. Существует особый класс белков, называемых белками теплового шока (HSP), которые вырабатываются в ответ на стрессовые условия, включая тепло и воздействие токсинов.Эти белки «сопровождают» другие клеточные белки и помогают защитить их от повреждений, и недавно было показано, что один, называемый HSP33, защищает бактерии от концентраций отбеливателя, которые обычно убивают тех, у кого этот белок отсутствует. Возможность выжить в условиях окружающей среды, убивающих другие микроорганизмы, является огромным селективным преимуществом, поэтому быстрое развитие устойчивости микроорганизмов всегда будет проблемой для человеческих популяций.

Следующие шаги …

Эти ссылки предоставлены только для удобства и в информационных целях; они не означают одобрения или одобрения Бирмингемским университетом какой-либо информации, содержащейся на внешнем веб-сайте.Бирмингемский университет не несет ответственности за точность, законность или содержание внешнего сайта или последующих ссылок. Пожалуйста, свяжитесь с внешним сайтом для получения ответов на вопросы относительно его содержания.

Вариабельность в тестировании на противомикробные препараты | Лаборатория Microchem

Введение

Научные области, такие как физика и математика, считаются точными науками. Биология, в том числе микробиология, другая. Микробиологические системы обладают большим количеством неконтролируемых переменных, что приводит к увеличению сложности эксперимента и снижению точности эксперимента.Большое количество переменных, задействованных в данном микробиологическом исследовании, возникает из-за присущей живым системам сложности. Каждая переменная вносит определенную степень ошибки, которая, в зависимости от системы, может распространяться линейно или нелинейно. Чем больше переменных задействовано, тем больше ошибок ожидается, что приведет к изменению результатов данного исследования. Практикующие микробиологи привыкли — и даже рассчитывают — на такую ​​вариативность в своих исследованиях. Однако клиенты лаборатории Microchem иногда бывают озадачены или удивлены, поскольку ожидают, что все науки дадут точные и точные результаты.В этой статье обсуждаются причины присущей вариабельности при тестировании на противомикробные препараты.

Исследования на людях как окно в разнообразие микробиологических исследований

Большинство людей понимают, насколько сложно измерить влияние одной переменной среди многих других в контексте исследований на людях. Например, рассмотрим клинические исследования, в которых крупные испытания, основанные на многообещающих небольших доклинических исследованиях, часто терпят неудачу (1). Если бы биологические эксперименты можно было точно воспроизвести, не потребовались бы масштабные испытания.В некоторых случаях трудно воспроизвести даже результаты крупномасштабных испытаний. Или рассмотрите исследование, проведенное, чтобы определить, вызывает ли использование мобильного телефона рак мозга. Из более чем дюжины проведенных исследований примерно одна треть указывает на то, что использование сотового телефона увеличивает риск опухолей мозга, примерно треть исследований показывает, что сотовые телефоны не влияют на образование опухолей, а остальные указывают на то, что использование сотового телефона защищает людей от опухолей головного мозга. . В таких исследованиях исследователи пытаются выделить влияние одной переменной среди тысяч потенциальных переменных, присущих исследуемым биологическим системам, от географического положения до химического воздействия на генетику.

Хотя бактерии и грибы не так сложны, как люди и животные, они способны выполнять широкий спектр химических превращений и чувствительны к незначительным изменениям в экспериментальной среде. Небольшие изменения в окружающей среде могут влиять на белки и другие молекулы внутри и на клетках, вызывая химические, физические и биологические реакции (2, 3, 4, 5). И хотя отдельный микроорганизм менее сложен, чем отдельный человек, они размножаются гораздо быстрее и в большинстве исследований исчисляются миллиардами или триллионами.Как и люди, бактерии и грибы не всегда ведут себя предсказуемо при изучении.

Причину вариабельности в исследованиях эффективности противомикробных препаратов можно условно разделить на три части: тест-система (например, микроорганизм и условия окружающей среды), ученый (-и), проводящий исследование, и тестируемое вещество.

Переменные в тестовой системе

Каждая часть тестовой системы, которая включает микроорганизмы, тестовые поверхности или реакционный сосуд, а также различные условия окружающей среды, включает множество переменных, и каждая из них может влиять на результат исследования.Температура и влажность являются важными факторами, поскольку они могут сильно различаться в разных испытательных лабораториях или даже ежедневно в одной и той же лаборатории. Большинство стандартизованных методов тестирования пытаются контролировать эти различия, задавая узкий температурный диапазон, в котором необходимо культивировать бактерии (например, 36 ° C ± 2 ° C), или требуя, чтобы тестируемое вещество выдерживалось при постоянной температуре во время исследования. Однако эти диапазоны часто устанавливаются научным консенсусом; скудные эмпирические данные свидетельствуют о том, что диапазоны достаточно узкие, чтобы ограничить вариабельность от исследования к исследованию.Различия в условиях окружающей среды влияют на микроорганизмы, заставляя их вносить важный вклад в вариативность исследования.

Бактерии, выращенные в жидких культурах (и грибы, выращенные на агаре), неоднородны. Клетки проходят разные стадии роста за свою короткую жизнь, и некоторые клетки в культуре могут быть более восприимчивыми к исследуемому веществу, чем другие. Бактерии, некоторые в большей степени, чем другие, также имеют тенденцию образовывать скопления, которые могут защитить бактерии внутри группы от суровых условий тестирования или даже самого тестируемого вещества.В попытке контролировать этот источник изменчивости некоторые методы тестирования требуют нескольких субкультур микроорганизма, прежде чем его можно будет использовать, а некоторые методы включают шаги, предназначенные для уменьшения, но не полного устранения скоплений микроорганизмов. Существует мало доказательств того, что множественные субкультуры уменьшают вариабельность и, безусловно, приводят к более старым культурам. Более старые культуры имеют другой клеточный состав, чем более свежие культуры, и поэтому могут по-разному реагировать на противомикробные препараты.Кроме того, во многих официальных методах тестирования ничего не говорится о том, инкубируются ли бактериальные культуры статически или динамически. Поскольку динамически инкубируемые культуры подвергаются большему газообмену, их физиология отличается от статически выращиваемых бактерий (6).

Штамм исследуемого тест-микроорганизма также может повлиять на результат. В Соединенных Штатах Агентство по охране окружающей среды (EPA) пытается минимизировать этот источник изменчивости в максимально возможной степени, рекомендуя использование определенных бактериальных и грибковых штаммов (7).Например, существует более 50 различных штаммов бактерии Staphylococcus aureus, перечисленных на веб-сайте ATCC (American Type Culture Collection), некоммерческого центра биологических ресурсов, который занимается распространением стандартных эталонных микроорганизмов. Каждый из этих штаммов проявляет разные генетические свойства и потенциально по-разному реагирует при воздействии одного и того же тестируемого вещества. Поэтому EPA рекомендует только один конкретный штамм S. aureus (S. aureus ATCC 6538) для тестирования дезинфицирующих и дезинфицирующих средств.Несмотря на все усилия, уровень изменчивости внутри штамма плохо изучен. Например, хорошо известно, что штамм S. aureus ATCC 6538 может присутствовать как в виде белых, так и в виде желтых колоний на одной и той же чашке с агаром, что указывает, по крайней мере, на умеренный уровень фенотипических (визуально очевидных) отклонений от одной колонии этого организма к другой. следующие

Другой важной причиной изменчивости является микробиологическая питательная среда и используемые условия выращивания. Различные марки сред, используемых в разных лабораториях, в каждой из которых используется разная лабораторная вода, могут содержать разное количество минералов и питательных веществ или иметь разные значения pH и, следовательно, могут по-разному влиять на физиологию и метаболизм бактерий (3).Опять же, EPA пытается контролировать это, рекомендуя определенные питательные среды. Однако среды различаются в зависимости от стандартного метода, и большинство крупных лабораторий делают питательные среды в лаборатории, поэтому каждая партия будет немного отличаться друг от друга. Учтите, что автомобили работают по-другому, разница в октановом числе топлива составляет всего пару процентов. Учитывая, что питательная среда буквально трансформируется микроорганизмами в большее количество микроорганизмов, само собой разумеется, что микроорганизмы будут по-разному размножаться в питательных средах, которые немного отличаются.К сожалению, влияние незначительных различий в составе питательной среды на микробный состав и размножение недостаточно изучено и не до конца изучено.

Изменчивость, вызванная оператором

Как упоминалось ранее, люди — сложные существа. Несмотря на все усилия ученых, люди не будут выполнять одно и то же движение дважды подряд. В исследованиях, в которых участвуют такие движения, как распыление дезинфицирующего средства или протирание тестовой поверхности, это добавляет вариативности, которой вряд ли можно избежать.Каждый раз при манипуляциях с тестовыми образцами или тестовыми поверхностями они будут обрабатываться немного по-другому. Большинство методов, используемых в Соединенных Штатах для регистрации дезинфицирующих средств, включают своего рода изменчивые манипуляции с исследуемым веществом со стороны ученого. Другие примеры экспериментальной изменчивости, вызванной действиями оператора, включают в себя инокуляцию испытательных поверхностей, которые различаются от оператора к оператору и от одной испытательной поверхности к другой.

Небольшие изменения в пипетировании и смешивании культур, инокуляции носителей, высушивании микроорганизмов на тестовой поверхности или обработке тестовой поверхности делают тест еще более разнообразным.Хорошим примером является испытание бактерицидных спреев AOAC, модифицированное для салфеток. В этом тесте стеклянные носители с высушенными бактериями обрабатываются тестовой салфеткой. Разные ученые применяют разное давление на салфетку и имеют несколько разные способы удерживания салфетки. Признавая это как большой потенциальный источник экспериментальной изменчивости, EPA недавно провело семинар, чтобы обсудить лучший способ протирания, складывания и удержания салфетки во время исследований. Такие факторы, как давление, используемое при протирке, трудно, если не невозможно, стандартизировать, и они представляют собой пример изменчивости тестовой системы.

Изменчивость, вызванная испытуемым веществом

Третьим потенциальным источником изменчивости является само тестируемое вещество. Дезинфицирующие средства подобны любым другим химическим веществам; на их стабильность и активность могут влиять многие факторы. Например, необходимо учитывать возраст исследуемого вещества. Как и другие химические вещества, активные ингредиенты дезинфицирующих средств имеют период полураспада, на который влияют такие факторы, как pH и температура (8). Кроме того, период полураспада дезинфицирующего средства, такого как отбеливатель, будет намного меньше, чем период полураспада четвертичного дезинфицирующего средства, и может варьироваться в зависимости от контейнера, в котором оно хранится, или от того, как часто его смешивают.

В попытке оценить этот элемент изменчивости исследуемого вещества для новых заявлений о дезинфицирующем средстве EPA исторически требовало, чтобы тестировались три разных партии дезинфицирующего средства, одна из которых должна была быть не менее 60 дней. Это требование было введено потому, что одно и то же дезинфицирующее средство может работать по-разному при тестировании в разном возрасте. Однако теперь EPA, похоже, ослабляет это требование в обмен на то, что производители тестируют свои продукты при искусственно низких уровнях концентрации активного ингредиента.Независимо от текущей политики Агентства по охране окружающей среды, производителям антимикробных веществ важно проводить тесты на стабильность, чтобы определить активность своего продукта с течением времени, поскольку возраст продукта так тесно связан с активностью.

EPA ввело требование о тестировании трех разных партий противомикробного агента, поскольку разные партии могут незначительно отличаться по своему составу и, следовательно, по активности. Дезинфицирующие средства редко состоят только из одного ингредиента. Чаще всего это смеси активных и неактивных ингредиентов в разных концентрациях.Различия между партиями дезинфицирующих средств могут быть вызваны либо изменчивостью в процессе производства, либо различиями между активными ингредиентами. Хотя компании стремятся поддерживать качество и состав своих противомикробных продуктов на одном уровне, небольшие различия, вызванные такими факторами, как различный персонал или разные условия окружающей среды, приведут к незначительным различиям между каждой партией. Таким образом, тестирование трех партий, а не одной, повышает надежность исследования и гарантирует, что ожидаемые небольшие различия в составе ингредиентов не повлияют на эффективность противомикробного средства.

Синтез дезинфицирующего или другого противомикробного агента может быть сложным процессом, в котором несколько химикатов добавляются друг к другу для создания конечного продукта. Порядок, в котором они добавляются, может повлиять на результат конечного продукта, поскольку химические вещества могут вступать в реакцию, как только они вступают в контакт друг с другом. Это может привести к изменению концентраций реагентов, изменению состава дезинфицирующего средства. Поэтому важно учитывать порядок добавления ингредиентов при оценке вариабельности эффективности противомикробного вещества.

Некоторые дезинфицирующие средства предназначены для разбавления. Чаще всего их разбавляют для испытаний на противомикробную эффективность с использованием так называемой жесткой воды, состав которой готовится на месте в лабораториях по проверке эффективности и по содержанию минералов аналогичен водопроводной воде. Известно, что жесткость воды (как содержание кальция в миллионных долях) снижает эффективность противомикробных растворов, причем некоторые из них подвержены большему воздействию, чем другие. Поэтому дезинфицирующие средства, которые продаются потребителю для разбавления, обычно испытываются с водой определенной жесткости (например,грамм. 300 частей на миллион). Можно ожидать, что дезинфицирующее средство будет действовать по-разному, если вода, используемая для разбавления, имеет разные уровни жесткости, и это добавляет еще один уровень вариативности, если в исследованиях используются разные партии жесткой воды лабораторного производства.

Противомикробные препараты бывают всех видов и форм. Они могут быть жидкими или вязкими, их можно наносить на твердую поверхность или интегрировать в текстиль. Некоторые формы более подвержены изменчивости, чем другие. Для жидких противомикробных препаратов важно то, как жидкость покрывает поверхность, покрытую микроорганизмами, и это еще один потенциальный источник вариативности исследования.Вообще говоря, жидкости с низким поверхностным натяжением (с поверхностно-активными веществами) превосходят жидкости без поверхностно-активных веществ, если при прочих равных условиях.

Вязкое вещество сложнее смешать с микроорганизмами, чем жидкое вещество, что может увеличить степень ошибки. Например, проверка эффективности консерванта или USP <51> — это методы тестирования, на которые влияет эта переменная. Эти методы используются для проверки эффективности консервантов в образцах, таких как кремы или лосьоны, путем инокуляции контрольных микроорганизмов и наблюдения за их жизнеспособностью в течение 1-4 недель.Более вязкое вещество также труднее отбирать, что может еще больше увеличить вариабельность.

Поверхностно-активные вещества полезны для поверхностей, покрытых или пропитанных антимикробными средствами. Поверхностно-активные вещества часто необходимы для облегчения распространения бактерий на гидрофобных твердых поверхностях и текстильных изделиях. Это важно, поскольку гидрофобные свойства поверхностей могут вызвать расслоение микробного посевного материала, препятствуя взаимодействию некоторых бактерий с антимикробным покрытием.В то же время поверхностно-активное вещество или детергент, содержащий жидкие антимикробные вещества, будет демонстрировать улучшенное покрытие исследуемой поверхности по сравнению с веществами, не содержащими этих дополнительных ингредиентов, что приведет к снижению эффективности.

Другая проблема может возникнуть, когда во время производства противомикробные вещества неравномерно наносятся на твердые поверхности или текстиль. Это может привести к тому, что некоторые части одного и того же тестового образца будут более противомикробными, чем другие, что приведет к различиям в снижении количества микробов.Это пример источника изменчивости вне контроля лаборатории и, возможно, вне контроля производителя.

Другими факторами, которые могут влиять на активный ингредиент, являются добавки для культивирования, такие как «почва» (требуется для одноэтапных дезинфицирующих средств) или кровь, в которой некоторые микроорганизмы должны расти (9). При воздействии бактериального или грибкового инокулята активность тестируемого вещества может быть снижена за счет самогашения с течением времени. Чем выше исходный посевной материал, тем больше эффект.По причинам, описанным выше, получение одинакового количества микроорганизмов на каждом носителе невозможно, что добавляет еще один источник вариабельности в исследованиях антимикробной эффективности.

Изменчивость из неизвестных источников

Обсуждался ряд известных причин изменчивости, но, возможно, существуют и другие источники изменчивости, которые столь же существенны, но неизвестны микробиологам. Например, однажды ученые могут обнаружить, что определенные тестовые организмы задействуют защитный механизм для определенных дезинфицирующих средств в присутствии других представителей того же штамма, но только если они выращиваются в присутствии света.Или это может быть случай, когда конкретный микроорганизм — например, E. coli ATCC 11229 — мутирует с гораздо большей скоростью, чем другие бактерии, до такой степени, что для двух лабораторий почти невозможно сравнить результаты после всего несколько субкультур. Существуют прецеденты для таких «неизвестных» источников изменчивости, например, когда было показано, что некоторые бактерии восстанавливаются после УФ-повреждения при инкубации с включенным светом, но не при инкубации в темноте (теперь считается, что это явление вызвано репарацией ДНК бактерий. фермент фотолиаза).

Какой уровень вариабельности следует ожидать в тесте на эффективность противомикробных препаратов?

Чтобы рассмотреть обычные уровни изменчивости, мы должны сначала рассмотреть широкий диапазон количества микроорганизмов в исследовании с течением времени. Например, тест на разбавление с использованием AOAC может использовать почти 1 триллион микроорганизмов вначале как часть первоначального инокулята для пеницилиндров, но после теста он будет сокращен до 3 выживших клеток. Эти цифры сильно отличаются от результатов исследований, скажем, популяций волков в Йеллоустонском парке

.

Соответственно, микробные популяции обычно выражаются не в линейной шкале, а в логарифмической шкале.Легкий способ понять логарифмическую шкалу — рассматривать ее как степень 10. Например, логарифм (логарифм) 10 000 по основанию 10 равен 4 (= 104). Четырехлогарифмическое сокращение будет означать, что выжила только одна бактериальная (или грибковая) клетка из 10 000, что равно процентному сокращению 99,99%. Сокращение на три журнала соответствует уменьшению на 99,9%, сокращение на два журнала соответствует снижению на 99%, а сокращение на один журнал соответствует 90%.

В мире микробов разница между 1 и 4 журналами велика, особенно если вы начинаете с чисел, таких как 1 миллион клеток.Уменьшение на один логарифм все равно оставит 100000 живых клеток, в то время как четырехлогарифмическое сокращение снизит это число до 10. На первый взгляд снижение на 40% или 50% может показаться хорошими результатами, но на самом деле количество микробов не уменьшается на значительная сумма. Например, EPA требует сокращения не менее 99,9% (или 3 log) для теста с дезинфицирующим средством, не контактирующим с пищевыми продуктами. Для теста с дезинфицирующим средством, контактирующим с пищевыми продуктами, это снижение увеличивается до 99,999% (или 5 log). С учетом всего этого, вариативность от 50% до 90% является довольно распространенным явлением.Как показывает опыт, для испытаний подвески отклонение 0,5 логарифма является обычным, в то время как для испытаний на поверхности это число увеличивается до 1 логарифма, а иногда и больше.

Однако у этого есть свои преимущества. Если экспериментальные повторы выполняются разными учеными и / или в разные дни и результаты исследования одинаковы, это указывает на низкий уровень вариабельности и повышает надежность результатов, делая их более значимыми.

Что можно сделать, чтобы уменьшить влияние изменчивости?

Как правило, экспериментальные результаты должны быть воспроизводимыми, чтобы быть значимыми.Теперь, когда мы знаем, что вариабельность биологических систем невозможно избежать, что можно сделать, чтобы уменьшить ее влияние на значимость? Лучшая стратегия повышения вероятности воспроизводимости исследования — это выбрать лабораторию с опытными микробиологами и вниманием к контролю вариабельности, а затем повысить надежность экспериментов за счет большего количества повторений в исследованиях. Увеличение количества повторов или отдельных измерений снижает вклад ошибок (4).Хорошим примером этого является метод использования-разбавления AOAC или тест на бактерицидные спреи AOAC. Для первоначальной регистрации дезинфицирующего средства EPA требует, чтобы оба этих теста были выполнены с 60 носителями, из которых 59 должны пройти тест, что дает уровень достоверности 95%. Такое большое количество повторов гарантирует, что положительный или отрицательный результат не случился случайно.

Артикул:

• Lowenstein, P.R. and M.G. Кастро, Неопределенность перевода доклинических экспериментов в клинические испытания.Почему большинство клинических испытаний фазы III терпят неудачу? Curr Gene Ther, 2009. 9 (5): с. 368-74.
• Шапиро, Р. и Л. Коуэн, Температурный контроль микробного развития и вирулентности: молекулярные механизмы микробного измерения температуры. МБио, 2012. 3 (5).
• Mceldowney, S. и M. Fletcher, Влияние условий роста и характеристик поверхности водных бактерий на их прикрепление к твердым поверхностям. Журнал общей микробиологии, 1986. 132 (2): p. 513-523.
• Casadevall, A.и F.C. Клык, Воспроизводимая наука. Infect Immun, 2010. 78 (12): с. 4972-5.
• Giacomini, A., et al., Условия эксперимента могут повлиять на воспроизводимость анализа бета-галактозидазы. FEMS Microbiol Lett, 1992. 79 (1-3): p. 87-90.
• Степанович, С. и др., Влияние динамических условий на образование биопленок стафилококками. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2001. 20 (7): p. 502-4.
• http://www.epa.gov/ocspp/pubs/frs/publications/Test_Guidelines/series810.htm
• Макдоннелл, Г.и А.Д. Рассел, Антисептики и дезинфицирующие средства: активность, действие и устойчивость. Clin Microbiol Rev, 1999. 12 (1): p. 147-79. 9. Руано М., Дж. Эль-Аттракше и П. Вильегас, Сравнение эффективности дезинфицирующих средств, используемых в коммерческом птицеводстве. Авиан Дис, 2001. 45 (4): с. 972-7.

Допплеровская визуализация выявляет бактериальную инфекцию живой ткани

Экспериментальные принципы и функциональная визуализация

Скорость внутриклеточной динамики колеблется в пределах трех порядков от десятков нанометров в секунду (ползание клеток, метастазы, пузыри, апоптотические тела) ^{29,30 , 31,32} до десятков микрон в секунду (органеллы, везикулы, митохондрии) ^33,34,35,36 с соответствующими доплеровскими частотами от 10 мГц до 10 Гц ¹⁹ .Преобразование внутриклеточной скорости в доплеровскую частоту для геометрии обратного инфракрасного рассеяния: \ ({\ Delta} \ omega _ {\ mathrm {D}} = \ vec q \ cdot \ vec v \), где \ (q = 4 \ pi n / \ lambda _0 \) — это переданный импульс, а v — внутриклеточная скорость. Глубокие субгерцы для самых медленных движений позволяют обнаружить относительные сдвиги доплеровской частоты менее чем на одну часть из 10 ¹⁶ Гц. Такие сверхнизкочастотные доплеровские сдвиги обнаруживаются с помощью фазочувствительной сверхстабильной цифровой голографии в сочетании с низкокогерентным инфракрасным светорассеянием для захвата сложных спектров частот биений от динамических спеклов ^37,38 .Доплеровские сигналы отбираются с помощью когерентного стробирования и выделяются на оптические секции на глубину до миллиметра внутри живой ткани. Многократное рассеяние света от движущихся внутриклеточных компонентов составляет доплеровские сдвиги частоты (суммируемые в экспоненциальных фазах), чтобы производить флуктуации с высоким динамическим диапазоном, соответствующие континууму частот доплеровских биений с центром на нулевой частоте (изотропный внутриклеточный перенос).

Конфигурация оптической системы с когерентным стробированием показана на рис.1а. Интерферометр Маха – Цендера согласовывает длину оптического пути регулируемого эталонного плеча для достижения нулевой разности хода относительно света, рассеянного с выбранной глубины внутри образца ткани. Опорная и сигнальная волны падают вне оси на матрицу пикселей CMOS под небольшим углом, создавая пространственные несущие полосы на матрице. Камера находится в плоскости Фурье оптической системы и записывает голограмму в области Фурье с частотой кадров 25 кадров в секунду. В конце 14-часового эксперимента голограммы восстанавливаются с использованием двумерных пространственных преобразований Фурье.Покадровые кадры образца ткани преобразуются во временные ряды, которые анализируются в частотной области и суммируются для получения спектров мощности флуктуаций. Существует несколько режимов BDI, включая оптическую когерентную визуализацию (OCI), которая фиксирует структурные свойства образца, визуализацию с контрастом подвижности (MCI), которая отображает доплеровскую активность объемно в 3D или 4D (покадровая съемка), спектроскопию динамики ткани (TDS). ), который формирует частотно-временные спектрограммы, которые отслеживают спектральные изменения во времени, и спектроскопическое изображение динамики тканей (TDSI), которое является TDS с пространственным разрешением (см. «Методы» и исх. ³⁹ ).

Рис. 1: Конфигурация системы биодинамической визуализации.

a Экспериментальные принципы и установка внутриклеточной доплеровской спектроскопической визуализации. Живой образец (сфероид опухоли или биопсия) оптически срезают с помощью обратно рассеянного инфракрасного света с низкой когерентностью на цифровой камере в плоскости Фурье с использованием внеосевой цифровой голографической системы Маха-Цендера. Свет с низкой когерентностью разделяется светоделителем (BS1) на объектное и опорное плечо. Обратно рассеянный свет собирается системой 4- f (L1 и L2) и формирует изображение на плоскости изображения (IP).Линза Фурье (L3) переносит изображение на плоскость Фурье (FP). b Рассеяние света от динамических внутриклеточных процессов генерирует динамические спеклы, которые изменяются, когда опухолевые сфероиды инокулируются различными бактериальными штаммами. c Цифровая голограмма в области Фурье восстанавливается до плоскости изображения с помощью быстрого преобразования Фурье. Нулевой порядок находится в центре, а две боковые полосы первого порядка — по диагонали. Красный прямоугольник показывает увеличенную часть спекла плоскости изображения. d Увеличенное восстановленное спекл-изображение. e Интенсивность динамических спеклов колеблется во времени в разных местах P1, P2 и P3.

Ключевым элементом этого метода, применяемого к бактериальной инфекции, является использование трехмерных часовых поясов живых тканей субмиллиметрового масштаба, которые представляют собой живую матрицу для поддержки и динамического реагирования на бактериальную инвазию всего лишь 10 ³ жизнеспособных бактериальных патогенов. на дозор диаметром 500 микрон или около одной бактерии на 100 эпителиальных клеток.В свете, рассеянном инфицированной живой тканью, преобладает доплеровское рассеяние от клеточных компонентов ткани, а не от самих бактерий. Таким образом, дозорные не только делают видимым действие инфекции, но и передают изменения во внутриклеточной динамике, вызванные инфекцией. Обратимый характер реакции этой системы, например, когда антибиотики применяются для подавления инфекции и внутриклеточная динамика возвращается к нормальному поведению, является уникальной особенностью этой дозорной системы.

Стражи представляют собой трехмерную культуру живой ткани, выращенную из биологически релевантных клеточных линий (АТСС) в многоклеточные сфероиды. Рост сфероидов хорошо воспроизводится и может генерировать большое количество повторов для анализов на многолуночных планшетах. Трехмерная природа сфероидов является важной характеристикой, поскольку обычная двумерная культура ткани не может воспроизвести важные фенотипические свойства для биологически значимых анализов ^40,41,42 . В исследовании заражения патогенами пищевого происхождения ( Salmonella enterica серовар Enteritidis типа фага (PT) 21, Listeria monocytogenes , Listeria innocua и Escherichia coli ), о которых сообщалось здесь, использовалась линия клеток аденокаромы толстой кишки DLDcin-1. для выращивания многоклеточных сфероидов с характеристиками эпителиальной ткани толстой кишки, которая является важной мишенью для этих патогенов.Рост сфероидов DLD-1 описан в разделе «Методы» и в дополнительной информации.

Штамм E. coli , используемый в этом исследовании, представляет собой генно-инженерный штамм O157: H7, из которого был удален ген токсина Shiga, а также добавлены гены устойчивости к зеленому флуоресцентному белку (GFP) и ампициллину ⁴³ . Штаммы S. enterica и L. monocytogenes являются естественными фенотипами, которые могут инфицировать клетки млекопитающих и пролиферировать.В случае S. enterica бактерии проникают в клетки-хозяева, модулируя клеточную мембрану, чтобы вызвать поглощающее движение, вызывающее интернализацию бактерий. L. monocytogenes физически проникает через стенки клеток млекопитающих и синтезирует актиновые филаменты, чтобы получить движущую силу для распространения от клетки к клетке. С другой стороны, L. innocua представляет собой неинвазивный штамм рода Listeria , который используется в качестве отрицательного контроля при экспериментальном сравнении патогенности.

Биодинамическая визуализация бактериальной инвазии в ткани

Изображения оптической когерентности (OCI) усредняются по 2048 кадрам для создания карт OCI. Карты OCI сфероидов опухоли показаны на рис. 2а до и через 6 часов после заражения DLD-1 для четырех бактериальных штаммов E. coli , S. enterica , L. monocytogenes и L. innocua при экспозиции 10 ⁷ КОЕ на лунку. Соответствующие временные характеристики средней яркости обратного рассеяния (BB) показаны на рис.2c. Пролиферирующие бактерии при инфекции увеличивают яркость. Заражение E. coli дает сильнейшее увеличение яркости, поскольку пролиферирующая масса бактерий увеличивает неоднородность показателя преломления снаружи по отношению к телам клеток ⁴⁴ . Самый слабый эффект BB наблюдается у L. innocua , что немного выше контрольного уровня из-за неэффективной скорости распространения ⁴⁵ . Два патогенных штамма L. monocytogenes и S.enterica показывают промежуточное увеличение BB со временем.

Рис. 2: Примеры сфероидов многоклеточной опухоли DLD-1 до и после инфицирования.

a Изображения оптической когерентности (OCI) оптических средних срезов сфероидов DLD-1, показывающие яркость обратного рассеяния до (слева) и через 6 часов (справа) заражения 10 ⁷ бактериальных КОЕ на лунку. Наиболее сильное увеличение яркости обратного рассеяния (BB) происходит для E. coli (обратите внимание на второй столбец OCI). b Контрастные изображения подвижности (MCI) для тех же образцов.Рост бактерий вызывает сильное ингибирование допплеровской активности для E. coli (обратите внимание на вторую колонку MCI) и умеренное ингибирование допплеровской активности для Listeria monocytogenes и Salmonella enterica серовара Enteritidis. Медленно размножающийся Listeria innocua показывает наименьший эффект. Масштабная линейка применяется ко всем пятнистым изображениям. c Временная эволюция BB как функция времени после инокуляции (красная пунктирная линия). Заражение E.coli вызывает большое увеличение BB. d Динамический диапазон (DR) спектральной плотности изменяется немонотонно как функция времени. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку.

Ключевым биодинамическим показателем является временной контраст спеклов, количественно определяемый как нормализованное стандартное отклонение яркости обратного рассеяния, которое выражает общую доплеровскую активность ткани и отображается в виде изображений с контрастом подвижности (MCI). MCI до и через 6 ч после заражения четырьмя штаммами бактерий показаны на рис.2b. Снижение MCI при бактериальной инфекции представляет собой комбинацию увеличения BB и изменения допплеровской активности. Общий эффект инфекции заключается в подавлении внутриклеточной динамики, которая может быть частично связана с конкуренцией бактерий за одни и те же питательные вещества или связана с действием побочных продуктов метаболизма бактерий (дополнительное примечание 2.2). Динамический диапазон (ДР) спектральной плотности — еще один маркер, оценивающий изменение динамики. Динамический диапазон определяется как логарифм отношения спектральной амплитуды на самой низкой частоте (10 мГц) к спектральной амплитуде на частоте Найквиста (12.5 Гц). Амплитуда на частоте Найквиста также называется «полом Найквиста», что является еще одним полезным динамическим маркером. Пол Найквиста увеличивается, когда увеличивается высокоскоростной транспорт, например, вызванный переносом органелл или пузырьков. Повышение пола Найквиста уменьшает динамический диапазон, если нет соответствующего увеличения амплитуды на самой низкой частоте. С другой стороны, динамический диапазон увеличивается, если динамика около 0,01 Гц в низкочастотном диапазоне содержит увеличенную долю внутриклеточных компонентов, которые движутся медленно.DR рассчитывается путем усреднения первых 5 спектральных компонентов по сравнению со средним значением последних 5 спектральных компонентов. Изменения динамического диапазона относительно средних значений до инокуляции показаны на рис. 2d. Повышенный динамический диапазон после инокуляции наблюдался для E. coli , S. enterica и L. innocua , но не для L. monocytogenes . Немонотонное поведение может представлять собой последовательные «волны» инфекции или конкуренции за питательные вещества.

Флуктуационные допплеровские спектры ткани DLD-1 до инфицирования и через 6 часов после инфицирования показаны на рис. 3а для четырех бактериальных штаммов. Спектральная мощность на средних частотах от 0,1 до 1 Гц во всех случаях подавляется инфекцией. Соответствующие частотно-временные спектрограммы показаны на рис. 3б. Спектрограммы рассчитываются с использованием ¹⁶

$$ D \ left ({\ nu, \, t} \ right) = \ log S \ left ({\ nu, \, t} \ right) — \ log S \ влево ({\ nu, \, t_0} \ right) $$

(1)

, где S — спектральная плотность мощности, ν — доплеровский сдвиг частоты, а t ₀ — базовое время, когда бактерии вносятся пипеткой в ​​лунку.Спектральные плотности мощности были нормализованы по интенсивности или по нулевой сумме для получения относительной динамической плотности и изменения формы спектра, соответственно (дополнительные рисунки 1 и 2). Базовый спектр ткани DLD-1 устанавливается за 1,5 часа до инокуляции (заражения) бактериями, а относительное изменение спектральной мощности отслеживается в течение 6 часов после заражения. Спектрограммы для всех бактерий показывают подавленные спектральные плотности (снижение внутриклеточной динамики), хотя S.enterica показывает небольшое усиление высоких частот при слабом подавлении низких частот. Влияние бактериальной инфекции на динамику тканей чрезвычайно заметно. Спектральные изменения, вызванные бактериальной инфекцией при начальной дозе 10 ⁶ КОЕ / лунку, в два-пять раз больше, чем обычно наблюдаемые при цитостатических или цитотоксических эффектах лекарств (обычно <30%) в той же клеточной линии ⁴⁶ .

Рис. 3: Спектральные ответы различных бактерий.

a Изменения доплеровских спектров (нормализованная интенсивность) для четырех штаммов бактерий с начальными нагрузками 10 ⁶ КОЕ на лунку.Средние частоты подавляются во всех случаях с наиболее сильным эффектом от E. coli . Высокочастотный пол Найквиста (связанный с транспортом органелл) заметно увеличивается для S. enterica . Значения для N — это количество повторных образцов, используемых в среднем. Погрешность спектральных амплитуд составляет ± 4%. b Соответствующие спектрограммы генерируются с использованием уравнения. (2). После установления базовой линии образцы инокулируют (красная пунктирная линия).Контуры (по 10 на каждом графике) помогают показать общие тенденции.

Как показано на рис. 3, временная эволюция спектрограмм показывает разные реакции DLD-1 на разные бактериальные инфекции. E. coli и L. monocytogenes вызывают сильнейшее спектральное усиление на низких частотах (реологическая полоса, связанная с изменениями формы клеток и гибелью клеток) ³⁵ . Инфекция S. enterica показывает более слабое спектральное усиление на низкой частоте, но показывает умеренное усиление на более высоких частотах (связанное с транспортом органелл).В дополнение к этим механистическим эффектам, растущие бактерии истощают ограниченные ресурсы ростовой среды и увеличивают концентрацию CO ₂ , которая изменяет уровень pH в ростовой среде, что может нарушить клеточную динамику ⁴⁷ (дополнительная таблица 1). Патогенный S. enterica интернализуется и реплицируется внутри хозяйских клеток, вызывая активный перенос органелл для репликации, что согласуется с высокочастотным усилением. Временные отклики происходят медленно, и контурные линии показывают тенденции спектральных сдвигов.Стандартные отклонения спектральных откликов в повторностях образца ( N = 68, 36, 12 и 13 соответственно) для всех частотных диапазонов составляют σ _{контроль} = 0,01, σ _{E. coli} = 0,30, σ _{S. enterica} = 0,03, σ _{L. monocytogenes} = 0,08 и σ _{L. innocua} = 0,01.

Покадровая спектроскопическая визуализация динамики тканей

Спектроскопическая визуализация тканевой динамики (TDSI) выполняет TDS на небольших группах пикселей и применяет линейные фильтры для извлечения динамической спектральной информации, такой как зависящие от времени изменения в органеллах или реологических полосах (см. Раздел «Методы») ³⁹ .Выходные данные линейных фильтров создают карту динамической информации по оптическому сечению образца. Фильтры спектрального рисунка отслеживают изменения спектральной формы, которые связаны с механистическими изменениями в ткани (такими как изменение средней внутриклеточной скорости), и генерируются спектроскопические изображения динамики ткани (TDSI), которые отображают эти механистические эффекты в оптическом сечении. образца. Примеры TDSI от инфекции бактериальными штаммами показаны на рис.4.Линейный фильтр в этом примере — это полином Лежандра первого порядка, который фиксирует сдвиг частот в красный или синий цвет в группе пикселей. Сдвиги связаны со снижением или увеличением средней внутриклеточной скорости соответственно. Контроль (рис. 4b, верхний ряд) показывает небольшой сдвиг в синий цвет во внешних областях сфероидов опухоли, сопровождаемый небольшим сдвигом в красную область в центральной области. Центральная область более крупных сфероидов (примерно полмиллиметра) относительно гипоксична, и ограничения транспорта могут снизить концентрацию питательных веществ.Заражение (рис. 4b, нижний ряд) E. coli , S. enterica и L. monocytogenes вызывает голубые сдвиги, связанные с высокоскоростной динамикой. Два инвазивных штамма, S. enterica и L. monocytogenes , демонстрируют самые сильные синие сдвиги, которые равномерно заражают весь сфероид через 5 часов, что согласуется со способностью этих бактерий вторгаться и колонизировать объемные ткани. E. coli демонстрирует лишь незначительное повышение активности в центральной области в течение длительного времени, а доминирующие синие сдвиги ограничиваются внешней областью, что согласуется с более слабой способностью E.coli для проникновения в объем живой ткани. Неинвазивный (и непатогенный) штамм L. innocua неотличим от контроля (без инфекции). Сдвиги начинаются во внешних областях сфероида и перемещаются внутрь в течение нескольких часов по мере распространения инфекции, как показано на рис. 4c для профилей среднего спектрального сдвига, с красными смещениями во внутреннем ядре и синими смещениями во внешней оболочке, которая двигаться внутрь в течение нескольких часов.

Рис. 4: Типичные случаи тканеодинамических спектроскопических изображений (TDSI) бактериальной инвазии 10 ⁷ КОЕ в сфероид опухоли аденокарциномы толстой кишки DLD.

a Используемый здесь линейный фильтр измеряет сдвиг формы спектра в красный или синий цвет (нормализация с нулевой суммой). Необработанный контроль показывает небольшой синий сдвиг (синий цвет) во внешних слоях (R1) и небольшой красный сдвиг (красный цвет) в ядре (R2) в течение всего эксперимента (5 ч). b L. innocua неотличима от контроля. S. enterica и L. monocytogenes демонстрируют сильные голубые сдвиги по всему объему в пределах 300 м после заражения.Синий сдвиг для E. coli занимает промежуточное положение между патогенными штаммами и контролем. Масштабная линейка применяется ко всем остальным пятнистым изображениям в b . c Одномерные графики TDSI вдоль оси L в a . Группа патогенов ( L. monocytogenes и S. enterica ) демонстрирует голубые сдвиги по всему объему. Ось y представляет относительное изменение средней доплеровской частоты (частота излома спектра). Два патогенных штамма вызывают примерно 15% -ное увеличение внутриклеточных скоростей.

Альфа-спектроскопия Леви

Устойчивые по Леви распределения вероятностей (показанные на рис. 5a) играют центральную роль в теории вероятностей и применяются с возрастающей регулярностью к физическим системам, которые выбирают из распределений с тяжелыми хвостами ⁴⁸ . Например, прогулки Леви (рис. 5b – d) с распределением Леви длин пути или времен сохранения представляют собой случайные прогулки, которые имеют расходящееся среднеквадратическое смещение и, как было установлено, описывают различные процессы в биологических науках ⁴⁸ , включая поведение при кормлении которые могут извлечь выгоду из прогулок Леви для оптимизации стратегий поиска ^9,49,50 , движения бактерий ^8,51 и миграции Т-клеток ⁵² .Недавние данные свидетельствуют о том, что прогулки Леви регулируют внутриклеточные движения ^53,54,55 . Это представляет особый интерес при использовании нами доплеровского рассеяния света для исследования живой ткани. Мы разработали новую меру динамического отклика живой ткани на основе фазочувствительного BDI и функций распределения вероятностей (PDF) фазовых изменений в 40-миллисекундных окнах (см. Раздел «Методы»). Главный параметр симметричного распределения Леви известен как параметр «альфа». Когда α = 2, тогда распределение Леви идентично гауссовскому со сходящимися моментами.Когда α = 1, распределение Леви идентично лоренцевой форме линии, также известной как распределение Коши. Первые моменты расходятся для всех α <2 и расходятся быстрее, когда альфа приближается к распределению Коши с наиболее тяжелыми хвостами. Тяжелые хвосты означают сильные выбросы крупных и редких событий. PDF фазовых флуктуаций в здоровой ткани DLD-1 показан на рис. 5e с наилучшим соответствием распределениям Гаусса ( α = 2) и Коши ( α = 1) и распределению Леви с α = 1. .6 (наилучшее соответствие), демонстрируя четкие доказательства коллективных свойств Леви внутриклеточной динамики образца ткани DLD-1 (дополнительный рис. 5).

Рис. 5: Статистика Леви в живых тканях и аномальные случайные блуждания, связанные с полетами Леви.

a Вероятности Леви. Процессы Леви с меньшим альфа имеют более частые баллистические движения и менее баллистичны с большим альфа. b — d Примеры случайных блужданий Леви, демонстрирующие тяжелый хвост постоянных длин. e PDF ткани DLD-1 с показателем Леви α = 1,6. f PDF ткани, инфицированной L. monocytogenes (10 ⁷ КОЕ / лунка), демонстрируя измеримый сдвиг до α = 1,4 всего за 1,5 часа. г Временные сдвиги показателей Леви для нескольких образцов, инфицированных четырьмя штаммами бактерий. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку. Для соответствия данным использовалась логистическая функция.

Полеты Леви позволяют проводить «альфа-спектроскопию Леви» бактериальной инфекции на основе фазочувствительного BDI, включая влияние бактериальной инфекции на показатель степени Леви-альфа.Пример показан на фиг. 5f для сфероидов опухоли DLD-1, инфицированных L. monocytogenes . Всего через 30 м после заражения произошло заметное изменение PDF. Исходный PDF до заражения имеет распределение Леви с показателем Леви α = 1,6, который уменьшается до α = 1,4 (более «похожий на Коши») после заражения. Более низкие значения альфа относятся к более тяжелым хвостам и более сильным выбросам в PDF, что, возможно, связано с увеличенной продолжительностью сохранения переноса, вызванной внутренним движением патогенных бактерий.Изменение значений альфа для нескольких реплик образцов, реагирующих на четыре изученных здесь бактериальных штамма, показано на рис. 5g. Быстрый сдвиг альфа Леви для случая инокуляции L. monocytogenes согласуется с быстрой инвазией L. monocytogenes ^6,7,14 . У других штаммов альфа Леви снижается медленнее. Наибольшее снижение наблюдается для E. coli , у которого также было значительное увеличение яркости обратного рассеяния для этой бактерии при 10 ⁷ КОЕ / лунку.

Антибиотический ответ бактериальной инфекции

Стражи живой ткани используются в качестве динамического субстрата для изучения чувствительности к антибиотикам и устойчивости к ним. Предыдущие исследования BDI в разработке лекарств и персонализированной медицине классифицировали реакцию живых образцов биопсии от пациентов, включенных в клинические испытания, на чувствительные или устойчивые когорты ²² . В текущем контексте микробиологии тестовые образцы представляют собой увековеченные дозорные DLD-1, которые действуют как динамические субстраты, на которых можно наблюдать динамические эффекты инфекции и наблюдать, как инфекция реагирует на лечение антибиотиками.Цель состоит в том, чтобы определить биодинамические спектральные характеристики, которые коррелируют с эффективностью антибиотика.

Пример лечения антибиотиками показан на рис. 6 для E. coli при начальной нагрузке 10 ⁶ КОЕ на лунку, заражая тканевых дозорных DLD-1 и затем обработанных ампициллином и ципрофлоксацином (широкополосные антибиотики). Штамм E. coli , используемый для анализа устойчивости к антибиотикам, обладает устойчивостью к ампициллину, что позволяет бактериям выжить до дозы 50 мкг / мл ампициллина ^43,56 .Напротив, ципрофлоксацин подавляет пролиферацию E. coli , поскольку устойчивость к ампициллину не связана с устойчивостью к ципрофлоксацину ⁵⁷ . Во время инокуляции дозорные DLD-1 подвергаются воздействию 10 ⁶ КОЕ на лунку E. coli . BDI отслеживает спектр заражения DLD-1 E. coli в течение 4,5 часов, за это время три различных обработки применяются к дозорным DLD-1 в отдельных лунках: питательная среда (контроль), ампициллин (50 мкг / мл), и ципрофлоксацин (3.5 мкг / мл) ⁵⁶ . Спектрограммы зависимости от времени показаны на рис. 6 для трех обработок. В верхнем ряду показаны ответы для зараженных дозорных DLD-1. Пунктирная красная линия — время посева бактерий, а пунктирная черная линия — время применения антибиотика. В нижнем ряду показаны ответы контрольных образцов DLD-1 без бактериальной инфекции. Элементы управления аналогичны для всех обработок, демонстрируя умеренное повышение средней частоты в ответ на обработку, которая включает пополнение питательной среды питательными веществами.Сторожевые DLD-1 с бактериальной инфекцией демонстрируют широкополосное подавление активности в тканях. Применение ампициллина малоэффективно (для этого резистентного к ампициллину штамма), в то время как ципрофлоксацин устраняет бактериальную инфекцию и возвращает ткань в состояние, сравнимое с контролем.

Рис. 6: Изменение во времени спектральной плотности дозорных DLD-1.

В верхнем ряду показаны ответы спектрограммы (нормализованные по интенсивности) для зараженных дозорных DLD-1. Пунктирная красная линия — время посева бактерий, а пунктирная черная линия — время применения антибиотика.В нижнем ряду показаны ответы контрольных образцов DLD-1 без бактериальной инфекции. Инфекция E. coli вызывает широкополосное подавление активности (верхняя часть левого столбца). Лечение ампициллином (средний столбец) мало влияет на инфицированную ткань, но ципрофлоксацин (правый столбец) останавливает и обращает инфекцию, возвращая ткань к ответу, аналогичному неинфицированному контролю. Номера повторов показаны в верхнем левом углу графиков спектрограммы.

Рабочий процесс бактериальной трансформации — 4 основных шага | Thermo Fisher Scientific

Бактериальная трансформация — это ключевой этап молекулярного клонирования, целью которого является получение нескольких копий рекомбинантной молекулы ДНК.Предыдущие этапы создания рекомбинантных плазмид описаны в традиционных основах клонирования и включают в себя вставку интересующей последовательности ДНК в основу вектора. При трансформации ДНК (обычно в форме плазмиды) вводится в компетентный штамм бактерий, так что бактерии затем могут реплицировать интересующую последовательность в количествах, подходящих для дальнейшего анализа и / или манипуляций.

Четыре ключевых этапа бактериальной трансформации:

Рисунок 1.Ключевые этапы процесса бактериальной трансформации: (1) подготовка компетентных клеток, (2) трансформация клеток, (3) восстановление клеток и (4) посев клеток.

Грамотная подготовка клеток

E. coli — наиболее распространенный вид бактерий, используемый на этапе трансформации рабочего процесса клонирования. Поскольку естественная компетентность E. coli очень низкая или даже отсутствует, клетки необходимо сделать компетентными для трансформации посредством теплового шока или электропорации.

Протоколы приготовления компетентных клеток различаются в зависимости от того, будет ли достигнута трансформация посредством теплового шока или электропорации. В любом сценарии единственная свежая колония желаемого штамма берется с чашки с агаром и инокулируется в жидкую среду для заквасочной культуры (, рис. 2, ). Эту заквасочную культуру и последующую более крупную культуру тщательно контролируют на предмет активного роста путем непрерывного измерения оптической плотности при 600 нм (OD ₆₀₀ ). Для достижения высокой эффективности трансформации крайне важно, чтобы рост клеток происходил в фазе среднего логарифма во время сбора урожая, что обычно происходит при OD ₆₀₀ между 0.4 и 0,9, с оптимальным значением в зависимости от объема культуры, штамма и протокола. На всех этапах необходимо использовать стерильные инструменты и лабораторную посуду, среды и реагенты, где это необходимо или необходимо. После сбора клеток для дальнейшей обработки рекомендуется хранить все образцы, реагенты и оборудование при 0–4 ° C, чтобы повысить жизнеспособность клеток и сохранить эффективность трансформации.

Собранные клетки затем обрабатывают в соответствии с методом трансформации, будь то тепловой шок или электропорация ( Рисунок 2 ).

• Трансформация тепловым шоком: Компетентные клетки получают химическим путем путем инкубации клеток в хлориде кальция (CaCl ₂ ), чтобы сделать клеточную мембрану более проницаемой [1,2]. Для дальнейшего повышения компетентности Ca ²⁺ может быть дополнен или заменен другими катионами и реагентами, такими как марганец (Mn ²⁺ ), калий (K ⁺ ), кобальт ([Co (NH₃) ₆] ³⁺ ), рубидий (Rb ⁺ ), диметилсульфоксид (ДМСО) и / или дитиотреитол (DTT), как описано Hannah et al.(1983) [3].
• Электропорация: Собранные клетки промывают ледяной деионизированной водой несколько раз путем повторного гранулирования и ресуспендирования для удаления солей и других компонентов, которые могут мешать электропорации. После 3-4 промываний клетки окончательно осаждают и ресуспендируют в 10% глицерине для хранения [4].

Рисунок 2. Приготовление химически компетентных и электрокомпетентных клеток.

После приготовления компетентные клетки необходимо оценить на эффективность трансформации, разделить на аликвоты до небольших объемов, чтобы минимизировать циклы замораживания / оттаивания, и хранить при соответствующей температуре для поддержания жизнеспособности.Эффективность трансформации компетентных клеток обычно измеряется по поглощению субнасыщающих количеств суперспиральной интактной плазмиды (например, 10-500 пг ДНК pUC). Результаты выражаются как количество образованных колоний (трансформантов) или колониеобразующих единиц (КОЕ) на микрограмм использованной плазмидной ДНК (КОЕ / мкг) (см. Посев клеток).

Для хранения рекомендуется аликвотирование подготовленных клеток в одноразовых объемах в микроцентрифужных пробирках с завинчивающейся крышкой, поскольку каждый цикл замораживания / оттаивания снижает эффективность трансформации примерно наполовину.Компетентные клетки должны оставаться стабильными в течение примерно 6–12 месяцев при хранении при –70 ° C с минимальными колебаниями температуры. Клетки , а не следует замораживать или хранить в жидком азоте, поскольку такая практика резко снижает жизнеспособность.

Для согласованности и экономии времени готовых компетентных клеток доступны в готовых к использованию форматах из коммерческих источников. Эти компетентные клетки проходят контроль качества и тестируются на соответствие спецификациям по эффективности трансформации и генотипам.Эти препараты минимизируют вариабельность от партии к партии и значительно упрощают эффективное размножение клонированной ДНК.

Трансформация

Двумя наиболее популярными методами бактериальной трансформации являются (1) тепловой шок химически подготовленных компетентных клеток (химическая трансформация) и (2) электропорация электрокомпетентных клеток. Выбор зависит от требуемой эффективности преобразования, экспериментальных целей и доступных ресурсов (см. Выбор компетентных ячеек).Когда они готовы к стадии трансформации, компетентные клетки следует разморозить на льду и осторожно обработать, чтобы сохранить жизнеспособность. Клетки можно смешивать осторожным встряхиванием, постукиванием или пипетированием, но следует избегать встряхивания.

Обзор химического преобразования

Изучите основы трансформации, два типа компетентных клеток, способы проведения химической трансформации и советы по устранению неполадок.

Примечание: Отрицательный и положительный контроли должны быть включены в этап трансформации, чтобы оценить успех экспериментальной процедуры.

40

Контроль	Компоненты образца	Оценка
Отрицательный		Фоновое образование колоний Стабильность антибиотика (ов) в планшете
Положительные клетки Интактная плазмида, несущая желаемый селектируемый маркер (например, устойчивость к антибиотикам)
Экспериментальная	Клетки Интересующая рекомбинантная ДНК

С химически компетентными клетками , химически компетентными 90 смешивают с плазмидной ДНК и ненадолго подвергают воздействию повышенной температуры, процесс, известный как тепловой шок (, фиг. 3A, ).Сначала клетки инкубируют с ДНК на льду в течение 5–30 минут в полипропиленовой пробирке. Следует избегать пробирок из полистирола, поскольку ДНК может прилипать к поверхности, снижая эффективность трансформации. Традиционно для достижения наилучших результатов использовались трубы с круглым дном 17 x 100 мм. Использование микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл может привести к плохому распределению тепла из-за меньшего отношения поверхности к объему суспензии клеток, что может снизить эффективность трансформации на 60–90%, особенно для клеток с более высокой эффективностью.

Для успешной химической трансформации рекомендуется 50–100 мкл компетентных клеток и 1–10 нг ДНК. Когда смесь для лигирования используется в качестве трансформирующей ДНК (часто достаточно 1–5 мкл), очистка перед химической трансформацией обычно не требуется. Важно отметить, что смеси для лигирования могут приводить к эффективности трансформации всего 1-10% по сравнению с трансформацией с суперспиральной интактной плазмидной ДНК.

Тепловой шок выполняется при 37–42 ° C в течение 25–45 секунд в зависимости от используемого бактериального штамма и ДНК.Для меньших объемов ячеек в меньших трубках интервал теплового шока, который зависит от отношения поверхности к объему суспензии ячеек, должен быть уменьшен. Затем клетки, подвергшиеся тепловому шоку, возвращают в лед на ≥2 минут перед следующим этапом (, рис. 3A, ).

Рис. 3. Бактериальная трансформация с использованием (A) химически компетентных клеток и теплового шока и (B) электрокомпетентных клеток и электропорации.

Электропорация включает использование электропоратора для воздействия на компетентные клетки и ДНК короткого импульса высоковольтного электрического поля ( Рисунок 3B ).Считается, что эта обработка вызывает временные поры в клеточных мембранах, которые позволяют ДНК проникать в клетки (, рис. 4, ). Наиболее распространенным типом электрического импульса при бактериальной трансформации является экспоненциальное затухание, при котором заданное напряжение применяется и затухает в течение нескольких миллисекунд, что называется постоянной времени (, рис. 4A, ). Приложенное напряжение определяется напряженностью поля (В / см), где V — начальное пиковое напряжение, а см — измерение зазора между электродами используемой кюветы.Обычно для электропорации бактерий используются кюветы диаметром 0,1 см (объемом 20–80 мкл) и требуется напряженность поля> 15 кВ / см.

Рис. 4. (A) Экспоненциальное затухание электрического импульса. (B) Процесс электропорации.

Одной из основных проблем электропорации является искрение дуги или электрический разряд, который может снизить жизнеспособность клеток и эффективность трансформации. Возникновение дуги часто возникает в результате электропорации в проводящих буферах, например, содержащих MgCl ₂ и фосфаты.

Стратегии предотвращения образования дуги включают следующее:

• Минимизируйте ионную силу растворов ДНК и буферов электропорации. Смеси ДНК для лигирования должны быть очищены на колонке и ресуспендированы в воде или буфере ТЕ для удаления белков и солей перед электропорацией.
• Сохраняйте объем раствора ДНК на уровне не более 5% от общего объема суспензии клеток (например, 2 мкл ДНК на 40 мкл клеток).
• Избегайте уноса агара во время подготовки электрокомпетентных клеток.
• Убедитесь, что в кювете для электропорации нет пузырьков воздуха.
• Выдавите клетки прямо на дно кюветы.

После трансформации неиспользованные компетентные клетки (полученные для любого метода) можно повторно заморозить. Однако это снизит эффективность трансформации примерно на 50% для каждого цикла замораживания / оттаивания. Для достижения наилучших результатов разделите клетки после первоначальной подготовки на одноразовые объемы, чтобы свести к минимуму замораживание и оттаивание. Одноразовый формат коммерчески доступен для трансформации и восстановления в одной и той же пробирке и для исключения необходимости замораживания и оттаивания клеток.Чтобы повторно заморозить неиспользованные клетки, быстро заморозьте их на бане сухой лед / этанол в течение 5 минут и храните при –70 ° C. Избегайте замораживания или хранения клеток в жидком азоте, так как это резко снижает жизнеспособность.

---

Период восстановления клеток

После теплового шока или электропорации трансформированные клетки культивируют в жидкой среде без антибиотиков в течение короткого периода, чтобы дать возможность начать экспрессию гена (ов) устойчивости к антибиотикам из приобретенной плазмиды ( фиг. 5 ).Этот шаг улучшает жизнеспособность клеток и эффективность клонирования. Для клеток с электропорацией рекомендуется как можно скорее выращивать клетки, поскольку буферы для электропорации не предназначены для длительного выживания клеток.

На стадии восстановления трансформированные клетки культивируют в 1 мл предварительно нагретого S.O.C. среда при 37 ° C со встряхиванием при 225 об / мин в течение 1 часа. S.O.C. среда, содержащая глюкозу и MgCl ₂ , рекомендуется для максимальной эффективности трансформации [3]. Использование S.O.C. среда вместо бульона Lennox L (бульон LB) может увеличивать образование трансформированных колоний в 2-3 раза [5].Штаммы для размножения векторов бактериофага M13 не требуют этого этапа.

Рисунок 5. Рост клеток на этапе восстановления.

Советы по нанесению покрытия на ячейки

После выращивания в S.O.C. среды, клетки высевают на агар LB с подходящим антибиотиком (ами) или другими агентами для идентификации и выделения успешных трансформантов. Например, если необходимо провести скрининг на синий / белый, в чашку с агаром должны быть включены X-Gal и IPTG. Избегайте использования чашек с агаром старше нескольких недель (или дней в некоторых случаях), чтобы убедиться, что антибиотик активен.Перед посевом клеток чашки следует предварительно нагреть до благоприятной температуры роста и не допускать конденсации, чтобы предотвратить контаминацию и смешивание колоний.

Количество высеянных клеток должно давать достаточное (а также не слишком большое количество) количество отдельных, отличных колоний для дальнейшего скрининга. Клетки, культивируемые в S.O.C. Среду можно осаждать центрифугированием в течение 5 минут при 600–800 x г и ресуспендировать в меньшем объеме для посева. Для посева на 100-миллиметровую пластину обычно хорошо подходит 100–200 мкл клеточной суспензии.Если ожидается очень мало колоний, можно высеять всю клеточную суспензию. Однако, если ожидается очень большое количество колоний, суспензию клеток можно разбавить до 1: 100 в S.O.C. среды перед посевом, чтобы избежать образования бактериального газона.

Рис. 6. Пипетку Пастера можно превратить в одноразовую самодельную «хоккейную клюшку» или L-образный распределитель.

Равномерное распределение клеток на чашке с агаром имеет решающее значение для анализа колоний.Стерильная хоккейная клюшка или L-образный распределитель клеток обычно используется для распределения клеточной суспензии при осторожном вращении планшета ( Фиг.6, 7A ). Избегайте прокалывания поверхности агара при распределении клеток. В качестве альтернативы можно использовать автоклавированные стеклянные шарики (диаметром 4 мм) для распределения клеток. В этом подходе от 10 до 20 шариков помещают на пластину после нанесения суспензии клеток, и пластину осторожно вращают так, чтобы суспензия клеток распределялась по гранулам ( Рисунок 7B, ).Клетки необходимо быстро разложить до высыхания жидкой суспензии. После распределения дайте планшету высохнуть перед инкубацией в течение ночи при 37 ° C в перевернутом положении.

Рис. 7. Два распространенных метода нанесения покрытия. ( A ) Распространение с помощью стерильной хоккейной клюшки. ( B ) Распространение стерильными стеклянными шариками 4 мм и осторожным вращением чашки.

На следующий день чашки с культурой исследуют на образование колоний. Следует избегать продолжительной инкубации, поскольку она часто приводит к слиянию больших колоний и появлению более мелких, чувствительных к антибиотикам окружающих колоний (так называемых сателлитных колоний ) из-за разложения антибиотиков вокруг больших колоний.

Чтобы рассчитать эффективность трансформации, разделите количество трансформантов на количество добавленной ДНК и фактор разведения клеток (если выполнено), используя следующую формулу:

С лигированной ДНК количество ДНК, добавленной к клеткам, может также может быть определено из настройки реакции лигирования, разведения ДНК (если выполнено) и объема ДНК для трансформации, используя следующую формулу:

Пример расчета эффективности трансформации

50 нг ДНК лигируют в 20 мкл реакции.