1.<span Times New Roman"">
Введение.Биотехнологияв воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеет особое значение.Крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих. Поэтому отодной коровы можно получить в лучшем случае одного теленка в год, в то время,как в её яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов),представляющих огромный генетический резерв. Кардинальное решение проблемыускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционнымспособам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый рядбиотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследованийрепродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствование приемовманипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В перспективебиотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводствавысокопродуктивных животных и целых популяций.
Впоследнее время приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов,которая рассматривается как эффективный метод биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных.Некоторые вопросы трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота рассмотреныв данной курсовой работе.
2. <span Times New Roman"">
Отбор доноров.Вбольшинстве случаев в качестве коров-доноров отбирают матерей потенциальныхплеменных быков. Благодаря этому обеспечивается высокий селекционныйдифференциал. Оценка и отбор коров-доноров, выделенных в группу матерей быков,проводят в два этапа. На первом этапе племенная ценность донора оценивается поглавным признакам молочного скота — по уровню молочной продукции ижирномолочности. На втором этапе, когда отобраны доноры с высокой племеннойценностью по главным признакам, число признаков в зависимости от цели селекциирасширяется. К ним относят форму вымени и сосков, свойства молокоотдачи,резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества.
Нужноиметь в виду, что оценка коровы-донорапо родословной и собственной продуктивности является не окончательной, так какв этом случае не учитывается эффект расщепления и рекомбинации генов. Поэтомуокончательно оценивать корову-донора можно только при получении и оценке еепотомства.
Высокиезатраты на получение телят путем трансплантации эмбрионов обусловливаютнеобходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можно получатьбольшое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившимв течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность.Исследованиями установлено, что потенциальные коровы-доноры с хорошими иустойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрасположенностьюк воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые двамесяца.
Межотельныйпериод является интегральным показателем воспроизводительной способности коров.Его составные части: сервис-период и период стельности.
Сервис-периодболее точно и намного раньше, чем интервал между отелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительнойфункции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляциисоставляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однакоанализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестройпороды, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеетвысокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.
Сервис-периодв основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интерваламежду первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Высокопродуктивныхкоров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Этообусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охотаклинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.
Первоеосеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельныйпериод. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второгоосеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, апродолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Дляоценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качествепотенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры какоплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильнойтехнике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемостькоров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.
Важнымпоказателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения,т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осемененияхарактеризуется высокой степенью изменчивости — коэффициент вариабельностиможет достигать 70%. Существенное влияние на изменчивость индекса осемененияоказывают такие факторы, как продолжительность периода от отела до первогоосеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющаяспособность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группупотенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случаепотенциальная корова-донор должна иметь индекс осеменения равный 1. Укоров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения(мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половыхорганов).
Через15-20 суток после отела ветеринарный специалист методом ректальной пальпацииконтролирует у потенциальной коровы-донора состояние половых органов, чтобыисключить такие нарушения воспроизводительной функции как киста яичника,гипофункция, воспаление яичниковой связки, эндометриты.
3. <span Times New Roman"">
Суперовуляция.Важнымзвеном в современной биотехнологии трансплантации эмбрионов крупного рогатогоскота является гормональноевызывание суперовуляции у коров-доноров. В группудоноров переводят только тех коров, которые положительно реагируют на введениегормонов. Для стимуляции множественной овуляции используют гонадотропин СЖК всочетании с простагландинами и другими биологически активными веществами[3].Этот способ, как показывает практика, позволяет вызвать суперовуляцию примерноу 70% коров.
Однимиз существенных недостатков этого способа суперовуляции является крайне высокаястепень вариабельности числа овуляций, даже при использовании одной и той жеконцентрации гонадотропина СЖК. Она составляет от 0 до 50 овуляций на однукорову-донора. Оптимальным результатом суперовуляции является выход из яичникав воронку яйцепровода 10-20 яйцеклеток.
Shelton,J.N. [7], подытоживая результаты исследований, пришел к выводу, что на инъекции гонадотропинов 25-35%коров-доноров не реагируют, а у положительно реагирующих коров (3 и болееовуляций) вариабельность реакции яичника настолько велика, что становитсяневозможным надежное планирование программы пересадки эмбрионов. Kenneth, L.W. [4]считает, что с учетом имеющейся изменчивости лишь половина коров,реагирующих на введение гонадотропинов, может дать 4-5 эмбрионов, пригодных длятрансплантации. Следовательно, в основном эмбрионы можно получить менее чем отполовины первоначально тщательно отобранных потенциальных коров-доноров.
Посовременному представлению реакция коров на суперовуляцию в значительнойстепени определяется количеством и качеством фолликулов яичников во время ихстимуляции гонадотропинами. Экспериментально было доказано, что во времясуперовуляции для получения хорошей реакции необходимо наличие определенногоколичества малых антральных фолликулов, чувствительных к гонадотропной стимуляции.Недостаток таких фолликулов, или напротив, наличие больших по размеруфолликулов снижают уровень реакции или она вообще отсутствует. Это можетсвидетельствовать об интраовариальном регулировании процесса суперовуляции.Поскольку фолликулы растут асинхронно, то в каждый период инъекциягонадотропинов будет оптимальной лишь для ограниченного числа фолликулов.
Кромеразмера фолликула, на реакцию введения гонадотропинов существенное влияниеоказывает интенсивность митотического индекса, которая у нормального фолликулаповышается при формировании полости. Установлено что высокий митотическийиндекс неатретических фолликулов положительно коррелирует с интенсивностьюсуперовуляции.
Имеютсяданные, свидетельствующие о том, что на реакцию гонадотропинов отвечают толькоте малые антральные фолликулы, размеры которых не превышают 2 мм. Установленочто такие фолликулы гормонально активны и быстро овулируют.
Атретическиефолликулы с высоким митотическим индексом, напротив, не овулируют, а послепрохождения фазы лютеинизации подвергаются её воздействию и имитируют наличиежёлтого тела.
Следовательно,для эффективной суперовуляции решающим является физиологическое состояние фолликулов в лютеиальной фазе яичника.
Анализработы станций по пересадке эмбрионов показал, что хорошими донорами можносчитать коров, которые после многократных суперовуляций имеют хорошую реакциюяичника и производят большое число пригодных для пересадки эмбрионов за одновымывание. Однако лишь небольшая часть доноров обнаруживает повторную реакциюяичников после вызывания суперовуляции. В основном же коровы-доноры нерегулярноотвечают на повторную гормональную обработку, поэтому количество овуляций ивыход эмбрионов не являются стабильными.
Дляоценки предрасположенности, или потенциальной изменчивости коров на пригодностьв качестве доноров, были рассчитаны вариансы признаков, на основе которых былопределен коэффициент повторяемости. Рассчитанные коэффициенты повторяемостипризнаков предрасположенности коров в качестве доноров колебались в пределах17.3-23.3%. Это свидетельствует о том, что по итогам оценки за первое вымываниеэмбрионов надежность повторного результата составит лишь 20%. Следовательно, пооценке признака пригодности за первое вымывание эмбриона невозможно достоверносудить о пригодности коровы в качестве донора.
Изменчивостьпригодности коров в качестве доноров включает наследственные и ненаследственныефакторы. Причем вклад ненаследственных факторов значительно выше вкладафакторов генетических.
Отмечено,что прекращение кормления донора после обработки гонадотропинами достоверноуменьшает реакцию яичника на введение гормонов. Для суперовуляции и получениябиологически полноценных эмбрионов необходимо обеспечить полноценное кормлениедонора, сбалансированное не только по основным питательным веществам, ноособенно по аминокислотам и микроэлементам. Кормление доноров должно бытьтаким, чтобы они находились в хорошем физиологическом состоянии.
Дляполучения суперовуляции наиболее широкое распространение во многих странах мираполучил ГСЖК с простагландинами.
Хорошихрезультатов суперовуляции можно ожидать, когда к моменту инъекчии гонадотропинав яичниках коровы функционирует желтое тело диаметорм 1.5 см. При наличии водном из яичников развитого фолликуладиаметром 10 мм полиовуляция снижается. Интенсивность множественной овуляциитакже снижается когда кроме хорошо развитого желтого тела в яичнике находитсяразвитый фолликул, фолликулярная или лютеиновая киста. Следовательно,эффективность суперовуляции в большой степени определяется физиологическимсостоянием яичников.
Начисло овуляций существенное влияние оказывает интервал между временем введенияГСЖК и началом половой охоты. Определен оптимальный интервал, во время которогоможно получить наибольшее количество овуляций, он составляет 4-7 суток. Приуменьшении этого срока до 1-3 суток число овуляций существенно снижается, а приувеличении свыше 7 суток, хотя число овуляций возрастает, но формируютсябиологически неполноценные яйцеклетки.
Наивысшийэффект суперовуляции достигается при введении ГСЖК между 10-12 сут эстральногоцикла (середина лютеальной фазы) и через 48 часов простагландина F2a(или его аналога),вызывающего регрессию желтого тела, половую охоту и овуляцию. В течение 48часов после инъекции простагландина у 95% коров-доноров происходит полиовуляциясо всеми признаками эструса. При этом доноры могут быть осеменены только всжатые сроки. Установлено, что после такой технологии гормональной обработкикоров происходит в среднем 10 овуляций, а оплодотворяемость яйцеклетокдостигает 80%.
Другимгормональным препаратом с суперовуляционным действием являетсяфолликулостимулирующий гормон ФСГ. Суперовуляцию можно вызвать введениемочищенного ФСГ или его комбинации с лютеинизирующим гормоном ЛГ в соотношении5:1. В отличие от гонадотропина СЖК ФСГ вводят не однократно, а многократно.
Обобщениемногочисленных работ по использованию гонадотропина СЖК и ФСГ показало, чтонаблюдается либо одинаковая реакция яичников коров на оба гонадотропина, либоотмечается лучшая реакция при введении гонадотропина ФСГ.
Какотмечалось, следует иметь в виду, что многократная суперовуляция подверженабольшей вариабельности. Поэтому не все коровы-доноры имеют одинаковуюпредрасположенность к многократной суперовуляции. Для эффективной многократнойсуперовуляции необходим тщательный отбор доноров по ряду показателей этогопризнака.
Взаключение следует отметить, что гормональная стимуляция яичников коров,вызывающая полиовуляцию, связана с активизацией метаболических процессов удоноров. Поэтому для протекания нормальных процессов оогенеза, оплодотворения ибиологически полноценного формирования и развития зиготы коров-доноровнеобходимо обеспечить биологически активными веществами (витамины, незаменимыеаминокислоты). Кроме того, для этой цели используют препарат селевит.
4. <span Times New Roman"">
Осеменение коров-доноров.Результатысуперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблемаоплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все ещёостается открытой. Как показывают результаты исследований, только 60-65%эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся врезультате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либонеоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии илидегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной.
Дляискусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму тольковыдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Какотмечалось, надежным критерием наследственных качеств быка служит коэффициентповторяемости, т.е. коэффициент регрессии будущих дочерей быка на числофактически имеющихся дочерей. Если генетическое превосходство дочерей быка,выраженное величиной отклонения от сверстниц, умножить на коэффициентповторяемости, то полученная величина будет характеризовать генетическоепревосходство будущих дочерей быка, или предсказанную разность. Предсказаннаяразность является одним из наиболее объективных качеств быка, разработанных всовременной селекции молочного скота.
Дляискусственного осеменения коров-доноров следует использовать, как правило,сперму производителей 1-й племенной категории, т.е. таких, племенная ценностькоторых превышает среднюю популяционную величину на два стандартных отклонения.В этом случае существенно повышаются темпы селекции и улучшается племеннаяценность новой генерации.
Племеннойподбор быков-производителей и коров-доноров осуществляется по заказному илицелевому спариванию родителей. В его основе должен лежать принципиндивидуального подбора в соответствии с селекционной программойсовершенствования существующих или создания новых пород, типов и линий.
Требованияк оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной дляосеменения коров-доноров, должна быть значительно выше, чем при оплодотворенииостальных коров. Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов, наряду с использованиемвысококачественной спермы, необходимо определить сроки половой охоты для своевременногопроведения искусственного осеменения. Как правило, коров с гормональновызванной половой охотой осеменяют дважды: первый раз при начале появленияполовой охоты и второй — через 12-24 часа.
Внашей стране коров-доноров искусственно осеменяют дважды в день с интервалом10-12 часов каждый раз двумя-тремя дозами замороженной спермы. Так как присуперовуляции повышается число овулировавших яйцеклеток, в каждой дозе спермыдолжно быть не менее 50 млн подвижных спермиев.
День,в который проводится искусственное осеменение коровы-донора, считается датойоплодотворения. С этого дня начинается отсчет развития эмбрионов in vivoдо их извлечения.
5. <span Times New Roman"">
Извлечение и оценка эмбрионов.Эффективностьметода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов.Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут бытьизвлечены тремя способами: после убоя коровы-донора; хирургическим;нехирургическим.
Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора.Самым простым и надежным способом извлечения эмбрионов является убойкоровы-донора. Этот способ практиковался только на первых этапах освоенияметода трансплантации. В настоящее время из-за потери генетически ценнойкоровы-донора он не используется.
Извлечение эмбриона хирургическим способом.Важным моментом, обеспечивающим эффективность извлечения эмбрионов, являетсяопределение стадии их развития и места положения в поовых путях коровы-донора.Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионыизвлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения (До). Имеется несколькоспособов хирургического извлечения эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища,лапаротомия по белой линии живота и лапаротомия в области голодной ямки.
Хирургическийспособ извлечения эмбрионов является трудоемким, дорогостоящим и, что особенноважно, им нельзя пользоваться многократно. В настоящее время хирургическийспособ извлечения применяется в редких случаях, главным образом в научныхцелях.
Извлечение эмбрионов нехирургическим способом.Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключаетсяв простоте манипуляций. Для этого не требуется специального операционногопомещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственныхусловиях. С селекционной точки зрения, при правильном применениинехирургического способа воспроизводительная способность доноров не нарушается,что позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров дляполучения от них большого числа потомков.
Вобщем виде извлечение эмбрионов нехирургическим методом происходит по следующейсхеме. Коров-доноров обследуют на наличие желтых тел, чистят и моют,ограничивают рацион и кратность кормления, а за сутки прекращают кормление ипоение. Перед самым извлечением эмбрионов дезинфицируют наружные половые органыкоров-доноров. Извлекают эмбрионы под местной анестезией. В рог матки вводятпродезинфицированный двухканальный резиновый или пластмассовый катетер снадувным баллончиком, в который нагнетают 10-155 куб см воздуха. Выход из рогаматки закрывают, надувая воздухом тонкостенный резиновый баллончик. Затем в рогвводят промывную жидкость и осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы отстенок матки. В качестве промывной среды применяют PBSдо 500 мл. Этот состависпользуется и для кратковременного культивирования эмбрионов.
Вымываниеповторяют 5-8 раз. Основную часть эмбрионов извлекают в первых трех-четырехсмывах. Промывание в обоих рогах матки, включая введение катетеров,продолжается 20-50 минут. За это время можно извлечь более 50% эмбрионов,находящихся на стадии морулы или бластоцисты.
Послевымывания эмбрионов в матку вводят раствор антибиотика с целью антисептики.
Вомногих странах разработаны различные устройства для нехирургического извлеченияэмбрионов. В нашей стране в ряде институтов ВАСХНИЛ успешно освоенынехирургические методы извлечения, позволяющие получать 60% от числаовулировавших яйцеклеток. Нужно иметь в виду, что в среднем из вымытыхяйцеклеток до 25% оказываются неоплодотворенными или дезинтегрированными.Причины выхода биологически неполноценных зигот до сих пор окончательно невыяснены.
Кратковременное культивирование и хранениеэмбрионов. Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимися напредимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения до введенияв рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. В этот период нужно создатьоптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологических качеств.Кратковременное хранение эмбрионов дает также возможность транспортировать их вдругие хозяйства.
Эмбрионыкрупного рогатого скота можно сохранить путем пересадки их в яйцепровод самокдругих видов млекопитающих. Лучше всего обеспечивается нормальноепредимплантационное развитие эмбрионов коров в яйцепроводе крольчих.Установлено, что эмбрионы коровы в яйцепроводе крольчихи могут успешноразвиваться до стадий, пригодных для трансплантации реципиентам, т.е. до морулыи бластоцисты. Недостатком этого метода является его трудоемкость и возможныепотери зигот при их переносе. В настоящее время широкое распространение получилметод краткосрочного хранения эмбрионов invitro.
Послеизвлечения и оценки на жизнеспособность эмбрионы переносят в питательные средыс температурой 37 градусов. Большинство сред, в которых культивируют и хранятэмбрионы, включают растворы солей, аминокислоты с бикарбонатным ионом какбуферным агентом, обеспечивающим pHв пределах 7.2-7.6.Проведенные исследования показали, что продолжительность культивирования безпотери биологических качеств эмбрионов возможна до 95 часов.
Впоследние годы проводятся исследования по краткосрочному хранению эмбрионов in vitroпри их охлаждении ниже 37 градусов. Разработка этого метода имеет большоепрактическое значение, т.к. позволяет существенно упростить манипуляции сэмбрионами и надежнее обеспечивает их транспортировку.
Оценка эмбрионов. Оценка эмбрионовкрупного рогатого скота производится несколькими методами. Наибольшеераспространение получил морфологический метод. Установлено, что результатыимплантации эмбрионов зависят от того, насколько полно оценена способностьоплодотворенных яйцеклеток к развитию.
Поморфологическим признакам и эмбриональной стадии развития, эмбрионы можноклассифицировать на пригодные инепригодные к трансплантации. При морфологической оценке эмбрионов основноевнимание обращают на фрмулу зиготы, состояние её зоны пеллюцида, числобластомеров, равномерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта.
Кромеморфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек ицитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологическойоценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионыот погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценкижизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования изамораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDAи DAP1через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определениеспособности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живыебластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA,но не флюоресцируют послеинкубации в DAP1.У погибших эмбрионов или бластомеров реакцииобратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособностьэмбрионов под микроскопом.
Ряд авторов предлагаетиспользовать синьку Эванса. В живых эмбрионах при температуре 37 градусов еюокрашивается только зона пеллюцида, которую затем обесцвечивают в раствореРингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомерах.
Как считает М. И. Прокофьев[2],могут быть гистохимические методы оценки жизнеспособности эмбрионов, основанныена специфических реакциях структурных элементов и веществ клеток к витальным ифлюоресцентным красителям. Такие реакции протекают очень интенсивно и быстро,что позволяет ускорить процесс оценки эмбрионов.
Однако следует учитывать,что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшает основной метод оценкиэмбрионов — морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками приоценке жизнеспособности эмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток,величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида.Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однороднойокраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерносформированной зоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве.
Важнейшим критерием дляоценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы сзамедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и другихманипуляций.
При оценке качества эмбрионав нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих показателей:соответствия стадии развития эмбриона его возрасту; правильности формыпрозрачной оболочки и ее целостности; равномерности дробления бластомеров,состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлинового пространства.
Наиболее пригодными длятрансплантации являются эмбрионы, извлеченные из матки коровы-донора на 7-8сутки после первого осеменения. Как показывают результаты исследований ипрактика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные для трансплантацииреципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты. Эти эмбрионыиспользуют для пересадки гормонально подготовленным коровам-реципиентам.
Выбраковке подлежатдегенерированный неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можнообнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодныедля трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признакамикоторых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разнаявеличина бластомеров, нарушение межклеточной связи.
В стадии поздней бластоцистынепригодные для трансплантации эмбрионы характеризуются деформацией иослаблением бластомеров, разрывом межклеточных связей и целостности зоныпеллюцида.
6. <span Times New Roman"">
Пересадка эмбрионов реципиентам.Вкачестве реципиентаотбирают гинекологически здоровых коров последвух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основнымпоказателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные,племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, уреципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первогоосеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донораотбирают 5-6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качествереципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племеннымикондициями.
Основнымусловием хорошего приживления эмбрионовслужит синхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов. Разницаво времени в проявлении половой охоты не должна превышать 24 ч, оптимальные жерезультаты получаются при разнице не более 12 часов.
Присовременном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживать эмбрионысразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки.
Внастоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим инехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождениеэмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационногопериода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый периодэмбрионального развития — имплантационный. При естественном теченииэмбрионального периода зародый на стадии морулы или бластоцисты находится вверхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для егоаппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, чтопересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечиваетсяхирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит впериод диэструса место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менееточно.
Эффективностьхирургического способа пересадки эмбриона составляет 60-70%, а число телят — 3-4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середина 70-хгодов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применениехирургического метода сдерживается сложностью проведения операций впроизводственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, иневозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10-15лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическимспособом.
Принехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты иэкономичности, является возможность многократного использования реципиента.Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако всеони основаны на одном принципе — введении эмбриона в рог матки через шейку,вследствие чего этот способ назван также цервикальным.
Послепересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за реципиентами, обращаяособое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты.
Дляустановления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов:визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главнымобразом путем ректальной пальпации.
Важнымзвеном селекционно-племенной работы является достоверность установленияистинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов отгенетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить погруппам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4недель до 4 месяцев.
Существеннойпричиной, снижающей эффективность нехирургической пересадки эмбрионов, являетсявозможное повреждение эндометрия при введении катетера. В то же время обобщениерезультатов исследований по нехирургической пересадке эмбрионов показывает, чтоэффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будетвведен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение.
Однакона этот счет имеется и другая точка зрения [7]: что конструкция приборовсущественно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Этирезультаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора,качеством и стадией развития эмбрионов.
Вцелом же следует отметить, что нехирургический метод пересадки эмбрионовобеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50-60%, а применение маточныхрелаксантов перед пересадкой — до 75%. Это существенно выше, чем прихирургическом методе. Технология нехирургического метода трансплантации сходнас искусственным осеменением коров и продолжается 3-5 минут, или 15-20 пересадокв час.
Особоговнимания заслуживает приём, ĎĐÉÓÁÎÎŮĘ× ŇÁÂĎÔĹ Sertich P.L.[6],заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов,по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективностьтрансплантации. Этот приём может быть применен для повышения частоты рожденияразнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров,особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е.селекцией).
Результатыпроведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадкадополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выходноворожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог маткичастота двоен составляет в среднем 55-60%, вместо 2% при естественноммногоплодии коров.
Можнопересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной корове, но вконтрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки. Средняяприживляемость эмбрион
www.ronl.ru
1.<span Times New Roman"">
Введение.Биотехнологияв воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеет особое значение.Крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих. Поэтому отодной коровы можно получить в лучшем случае одного теленка в год, в то время,как в её яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов),представляющих огромный генетический резерв. Кардинальное решение проблемыускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционнымспособам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый рядбиотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследованийрепродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствование приемовманипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В перспективебиотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводствавысокопродуктивных животных и целых популяций.
Впоследнее время приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов,которая рассматривается как эффективный метод биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных.Некоторые вопросы трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота рассмотреныв данной курсовой работе.
2. <span Times New Roman"">
Отбор доноров.Вбольшинстве случаев в качестве коров-доноров отбирают матерей потенциальныхплеменных быков. Благодаря этому обеспечивается высокий селекционныйдифференциал. Оценка и отбор коров-доноров, выделенных в группу матерей быков,проводят в два этапа. На первом этапе племенная ценность донора оценивается поглавным признакам молочного скота — по уровню молочной продукции ижирномолочности. На втором этапе, когда отобраны доноры с высокой племеннойценностью по главным признакам, число признаков в зависимости от цели селекциирасширяется. К ним относят форму вымени и сосков, свойства молокоотдачи,резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества.
Нужноиметь в виду, что оценка коровы-донорапо родословной и собственной продуктивности является не окончательной, так какв этом случае не учитывается эффект расщепления и рекомбинации генов. Поэтомуокончательно оценивать корову-донора можно только при получении и оценке еепотомства.
Высокиезатраты на получение телят путем трансплантации эмбрионов обусловливаютнеобходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можно получатьбольшое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившимв течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность.Исследованиями установлено, что потенциальные коровы-доноры с хорошими иустойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрасположенностьюк воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые двамесяца.
Межотельныйпериод является интегральным показателем воспроизводительной способности коров.Его составные части: сервис-период и период стельности.
Сервис-периодболее точно и намного раньше, чем интервал между отелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительнойфункции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляциисоставляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однакоанализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестройпороды, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеетвысокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.
Сервис-периодв основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интерваламежду первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Высокопродуктивныхкоров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Этообусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охотаклинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.
Первоеосеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельныйпериод. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второгоосеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, апродолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Дляоценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качествепотенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры какоплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильнойтехнике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемостькоров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.
Важнымпоказателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения,т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осемененияхарактеризуется высокой степенью изменчивости — коэффициент вариабельностиможет достигать 70%. Существенное влияние на изменчивость индекса осемененияоказывают такие факторы, как продолжительность периода от отела до первогоосеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющаяспособность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группупотенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случаепотенциальная корова-донор должна иметь индекс осеменения равный 1. Укоров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения(мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половыхорганов).
Через15-20 суток после отела ветеринарный специалист методом ректальной пальпацииконтролирует у потенциальной коровы-донора состояние половых органов, чтобыисключить такие нарушения воспроизводительной функции как киста яичника,гипофункция, воспаление яичниковой связки, эндометриты.
3. <span Times New Roman"">
Суперовуляция.Важнымзвеном в современной биотехнологии трансплантации эмбрионов крупного рогатогоскота является гормональноевызывание суперовуляции у коров-доноров. В группудоноров переводят только тех коров, которые положительно реагируют на введениегормонов. Для стимуляции множественной овуляции используют гонадотропин СЖК всочетании с простагландинами и другими биологически активными веществами[3].Этот способ, как показывает практика, позволяет вызвать суперовуляцию примерноу 70% коров.
Однимиз существенных недостатков этого способа суперовуляции является крайне высокаястепень вариабельности числа овуляций, даже при использовании одной и той жеконцентрации гонадотропина СЖК. Она составляет от 0 до 50 овуляций на однукорову-донора. Оптимальным результатом суперовуляции является выход из яичникав воронку яйцепровода 10-20 яйцеклеток.
Shelton,J.N. [7], подытоживая результаты исследований, пришел к выводу, что на инъекции гонадотропинов 25-35%коров-доноров не реагируют, а у положительно реагирующих коров (3 и болееовуляций) вариабельность реакции яичника настолько велика, что становитсяневозможным надежное планирование программы пересадки эмбрионов. Kenneth, L.W. [4]считает, что с учетом имеющейся изменчивости лишь половина коров,реагирующих на введение гонадотропинов, может дать 4-5 эмбрионов, пригодных длятрансплантации. Следовательно, в основном эмбрионы можно получить менее чем отполовины первоначально тщательно отобранных потенциальных коров-доноров.
Посовременному представлению реакция коров на суперовуляцию в значительнойстепени определяется количеством и качеством фолликулов яичников во время ихстимуляции гонадотропинами. Экспериментально было доказано, что во времясуперовуляции для получения хорошей реакции необходимо наличие определенногоколичества малых антральных фолликулов, чувствительных к гонадотропной стимуляции.Недостаток таких фолликулов, или напротив, наличие больших по размеруфолликулов снижают уровень реакции или она вообще отсутствует. Это можетсвидетельствовать об интраовариальном регулировании процесса суперовуляции.Поскольку фолликулы растут асинхронно, то в каждый период инъекциягонадотропинов будет оптимальной лишь для ограниченного числа фолликулов.
Кромеразмера фолликула, на реакцию введения гонадотропинов существенное влияниеоказывает интенсивность митотического индекса, которая у нормального фолликулаповышается при формировании полости. Установлено что высокий митотическийиндекс неатретических фолликулов положительно коррелирует с интенсивностьюсуперовуляции.
Имеютсяданные, свидетельствующие о том, что на реакцию гонадотропинов отвечают толькоте малые антральные фолликулы, размеры которых не превышают 2 мм. Установленочто такие фолликулы гормонально активны и быстро овулируют.
Атретическиефолликулы с высоким митотическим индексом, напротив, не овулируют, а послепрохождения фазы лютеинизации подвергаются её воздействию и имитируют наличиежёлтого тела.
Следовательно,для эффективной суперовуляции решающим является физиологическое состояние фолликулов в лютеиальной фазе яичника.
Анализработы станций по пересадке эмбрионов показал, что хорошими донорами можносчитать коров, которые после многократных суперовуляций имеют хорошую реакциюяичника и производят большое число пригодных для пересадки эмбрионов за одновымывание. Однако лишь небольшая часть доноров обнаруживает повторную реакциюяичников после вызывания суперовуляции. В основном же коровы-доноры нерегулярноотвечают на повторную гормональную обработку, поэтому количество овуляций ивыход эмбрионов не являются стабильными.
Дляоценки предрасположенности, или потенциальной изменчивости коров на пригодностьв качестве доноров, были рассчитаны вариансы признаков, на основе которых былопределен коэффициент повторяемости. Рассчитанные коэффициенты повторяемостипризнаков предрасположенности коров в качестве доноров колебались в пределах17.3-23.3%. Это свидетельствует о том, что по итогам оценки за первое вымываниеэмбрионов надежность повторного результата составит лишь 20%. Следовательно, пооценке признака пригодности за первое вымывание эмбриона невозможно достоверносудить о пригодности коровы в качестве донора.
Изменчивостьпригодности коров в качестве доноров включает наследственные и ненаследственныефакторы. Причем вклад ненаследственных факторов значительно выше вкладафакторов генетических.
Отмечено,что прекращение кормления донора после обработки гонадотропинами достоверноуменьшает реакцию яичника на введение гормонов. Для суперовуляции и получениябиологически полноценных эмбрионов необходимо обеспечить полноценное кормлениедонора, сбалансированное не только по основным питательным веществам, ноособенно по аминокислотам и микроэлементам. Кормление доноров должно бытьтаким, чтобы они находились в хорошем физиологическом состоянии.
Дляполучения суперовуляции наиболее широкое распространение во многих странах мираполучил ГСЖК с простагландинами.
Хорошихрезультатов суперовуляции можно ожидать, когда к моменту инъекчии гонадотропинав яичниках коровы функционирует желтое тело диаметорм 1.5 см. При наличии водном из яичников развитого фолликуладиаметром 10 мм полиовуляция снижается. Интенсивность множественной овуляциитакже снижается когда кроме хорошо развитого желтого тела в яичнике находитсяразвитый фолликул, фолликулярная или лютеиновая киста. Следовательно,эффективность суперовуляции в большой степени определяется физиологическимсостоянием яичников.
Начисло овуляций существенное влияние оказывает интервал между временем введенияГСЖК и началом половой охоты. Определен оптимальный интервал, во время которогоможно получить наибольшее количество овуляций, он составляет 4-7 суток. Приуменьшении этого срока до 1-3 суток число овуляций существенно снижается, а приувеличении свыше 7 суток, хотя число овуляций возрастает, но формируютсябиологически неполноценные яйцеклетки.
Наивысшийэффект суперовуляции достигается при введении ГСЖК между 10-12 сут эстральногоцикла (середина лютеальной фазы) и через 48 часов простагландина F2a(или его аналога),вызывающего регрессию желтого тела, половую охоту и овуляцию. В течение 48часов после инъекции простагландина у 95% коров-доноров происходит полиовуляциясо всеми признаками эструса. При этом доноры могут быть осеменены только всжатые сроки. Установлено, что после такой технологии гормональной обработкикоров происходит в среднем 10 овуляций, а оплодотворяемость яйцеклетокдостигает 80%.
Другимгормональным препаратом с суперовуляционным действием являетсяфолликулостимулирующий гормон ФСГ. Суперовуляцию можно вызвать введениемочищенного ФСГ или его комбинации с лютеинизирующим гормоном ЛГ в соотношении5:1. В отличие от гонадотропина СЖК ФСГ вводят не однократно, а многократно.
Обобщениемногочисленных работ по использованию гонадотропина СЖК и ФСГ показало, чтонаблюдается либо одинаковая реакция яичников коров на оба гонадотропина, либоотмечается лучшая реакция при введении гонадотропина ФСГ.
Какотмечалось, следует иметь в виду, что многократная суперовуляция подверженабольшей вариабельности. Поэтому не все коровы-доноры имеют одинаковуюпредрасположенность к многократной суперовуляции. Для эффективной многократнойсуперовуляции необходим тщательный отбор доноров по ряду показателей этогопризнака.
Взаключение следует отметить, что гормональная стимуляция яичников коров,вызывающая полиовуляцию, связана с активизацией метаболических процессов удоноров. Поэтому для протекания нормальных процессов оогенеза, оплодотворения ибиологически полноценного формирования и развития зиготы коров-доноровнеобходимо обеспечить биологически активными веществами (витамины, незаменимыеаминокислоты). Кроме того, для этой цели используют препарат селевит.
4. <span Times New Roman"">
Осеменение коров-доноров.Результатысуперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблемаоплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все ещёостается открытой. Как показывают результаты исследований, только 60-65%эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся врезультате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либонеоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии илидегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной.
Дляискусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму тольковыдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Какотмечалось, надежным критерием наследственных качеств быка служит коэффициентповторяемости, т.е. коэффициент регрессии будущих дочерей быка на числофактически имеющихся дочерей. Если генетическое превосходство дочерей быка,выраженное величиной отклонения от сверстниц, умножить на коэффициентповторяемости, то полученная величина будет характеризовать генетическоепревосходство будущих дочерей быка, или предсказанную разность. Предсказаннаяразность является одним из наиболее объективных качеств быка, разработанных всовременной селекции молочного скота.
Дляискусственного осеменения коров-доноров следует использовать, как правило,сперму производителей 1-й племенной категории, т.е. таких, племенная ценностькоторых превышает среднюю популяционную величину на два стандартных отклонения.В этом случае существенно повышаются темпы селекции и улучшается племеннаяценность новой генерации.
Племеннойподбор быков-производителей и коров-доноров осуществляется по заказному илицелевому спариванию родителей. В его основе должен лежать принципиндивидуального подбора в соответствии с селекционной программойсовершенствования существующих или создания новых пород, типов и линий.
Требованияк оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной дляосеменения коров-доноров, должна быть значительно выше, чем при оплодотворенииостальных коров. Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов, наряду с использованиемвысококачественной спермы, необходимо определить сроки половой охоты для своевременногопроведения искусственного осеменения. Как правило, коров с гормональновызванной половой охотой осеменяют дважды: первый раз при начале появленияполовой охоты и второй — через 12-24 часа.
Внашей стране коров-доноров искусственно осеменяют дважды в день с интервалом10-12 часов каждый раз двумя-тремя дозами замороженной спермы. Так как присуперовуляции повышается число овулировавших яйцеклеток, в каждой дозе спермыдолжно быть не менее 50 млн подвижных спермиев.
День,в который проводится искусственное осеменение коровы-донора, считается датойоплодотворения. С этого дня начинается отсчет развития эмбрионов in vivoдо их извлечения.
5. <span Times New Roman"">
Извлечение и оценка эмбрионов.Эффективностьметода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов.Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут бытьизвлечены тремя способами: после убоя коровы-донора; хирургическим;нехирургическим.
Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора.Самым простым и надежным способом извлечения эмбрионов является убойкоровы-донора. Этот способ практиковался только на первых этапах освоенияметода трансплантации. В настоящее время из-за потери генетически ценнойкоровы-донора он не используется.
Извлечение эмбриона хирургическим способом.Важным моментом, обеспечивающим эффективность извлечения эмбрионов, являетсяопределение стадии их развития и места положения в поовых путях коровы-донора.Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионыизвлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения (До). Имеется несколькоспособов хирургического извлечения эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища,лапаротомия по белой линии живота и лапаротомия в области голодной ямки.
Хирургическийспособ извлечения эмбрионов является трудоемким, дорогостоящим и, что особенноважно, им нельзя пользоваться многократно. В настоящее время хирургическийспособ извлечения применяется в редких случаях, главным образом в научныхцелях.
Извлечение эмбрионов нехирургическим способом.Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключаетсяв простоте манипуляций. Для этого не требуется специального операционногопомещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственныхусловиях. С селекционной точки зрения, при правильном применениинехирургического способа воспроизводительная способность доноров не нарушается,что позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров дляполучения от них большого числа потомков.
Вобщем виде извлечение эмбрионов нехирургическим методом происходит по следующейсхеме. Коров-доноров обследуют на наличие желтых тел, чистят и моют,ограничивают рацион и кратность кормления, а за сутки прекращают кормление ипоение. Перед самым извлечением эмбрионов дезинфицируют наружные половые органыкоров-доноров. Извлекают эмбрионы под местной анестезией. В рог матки вводятпродезинфицированный двухканальный резиновый или пластмассовый катетер снадувным баллончиком, в который нагнетают 10-155 куб см воздуха. Выход из рогаматки закрывают, надувая воздухом тонкостенный резиновый баллончик. Затем в рогвводят промывную жидкость и осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы отстенок матки. В качестве промывной среды применяют PBSдо 500 мл. Этот состависпользуется и для кратковременного культивирования эмбрионов.
Вымываниеповторяют 5-8 раз. Основную часть эмбрионов извлекают в первых трех-четырехсмывах. Промывание в обоих рогах матки, включая введение катетеров,продолжается 20-50 минут. За это время можно извлечь более 50% эмбрионов,находящихся на стадии морулы или бластоцисты.
Послевымывания эмбрионов в матку вводят раствор антибиотика с целью антисептики.
Вомногих странах разработаны различные устройства для нехирургического извлеченияэмбрионов. В нашей стране в ряде институтов ВАСХНИЛ успешно освоенынехирургические методы извлечения, позволяющие получать 60% от числаовулировавших яйцеклеток. Нужно иметь в виду, что в среднем из вымытыхяйцеклеток до 25% оказываются неоплодотворенными или дезинтегрированными.Причины выхода биологически неполноценных зигот до сих пор окончательно невыяснены.
Кратковременное культивирование и хранениеэмбрионов. Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимися напредимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения до введенияв рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. В этот период нужно создатьоптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологических качеств.Кратковременное хранение эмбрионов дает также возможность транспортировать их вдругие хозяйства.
Эмбрионыкрупного рогатого скота можно сохранить путем пересадки их в яйцепровод самокдругих видов млекопитающих. Лучше всего обеспечивается нормальноепредимплантационное развитие эмбрионов коров в яйцепроводе крольчих.Установлено, что эмбрионы коровы в яйцепроводе крольчихи могут успешноразвиваться до стадий, пригодных для трансплантации реципиентам, т.е. до морулыи бластоцисты. Недостатком этого метода является его трудоемкость и возможныепотери зигот при их переносе. В настоящее время широкое распространение получилметод краткосрочного хранения эмбрионов invitro.
Послеизвлечения и оценки на жизнеспособность эмбрионы переносят в питательные средыс температурой 37 градусов. Большинство сред, в которых культивируют и хранятэмбрионы, включают растворы солей, аминокислоты с бикарбонатным ионом какбуферным агентом, обеспечивающим pHв пределах 7.2-7.6.Проведенные исследования показали, что продолжительность культивирования безпотери биологических качеств эмбрионов возможна до 95 часов.
Впоследние годы проводятся исследования по краткосрочному хранению эмбрионов in vitroпри их охлаждении ниже 37 градусов. Разработка этого метода имеет большоепрактическое значение, т.к. позволяет существенно упростить манипуляции сэмбрионами и надежнее обеспечивает их транспортировку.
Оценка эмбрионов. Оценка эмбрионовкрупного рогатого скота производится несколькими методами. Наибольшеераспространение получил морфологический метод. Установлено, что результатыимплантации эмбрионов зависят от того, насколько полно оценена способностьоплодотворенных яйцеклеток к развитию.
Поморфологическим признакам и эмбриональной стадии развития, эмбрионы можноклассифицировать на пригодные инепригодные к трансплантации. При морфологической оценке эмбрионов основноевнимание обращают на фрмулу зиготы, состояние её зоны пеллюцида, числобластомеров, равномерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта.
Кромеморфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек ицитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологическойоценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионыот погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценкижизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования изамораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDAи DAP1через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определениеспособности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живыебластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA,но не флюоресцируют послеинкубации в DAP1.У погибших эмбрионов или бластомеров реакцииобратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособностьэмбрионов под микроскопом.
Ряд авторов предлагаетиспользовать синьку Эванса. В живых эмбрионах при температуре 37 градусов еюокрашивается только зона пеллюцида, которую затем обесцвечивают в раствореРингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомерах.
Как считает М. И. Прокофьев[2],могут быть гистохимические методы оценки жизнеспособности эмбрионов, основанныена специфических реакциях структурных элементов и веществ клеток к витальным ифлюоресцентным красителям. Такие реакции протекают очень интенсивно и быстро,что позволяет ускорить процесс оценки эмбрионов.
Однако следует учитывать,что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшает основной метод оценкиэмбрионов — морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками приоценке жизнеспособности эмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток,величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида.Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однороднойокраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерносформированной зоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве.
Важнейшим критерием дляоценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы сзамедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и другихманипуляций.
При оценке качества эмбрионав нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих показателей:соответствия стадии развития эмбриона его возрасту; правильности формыпрозрачной оболочки и ее целостности; равномерности дробления бластомеров,состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлинового пространства.
Наиболее пригодными длятрансплантации являются эмбрионы, извлеченные из матки коровы-донора на 7-8сутки после первого осеменения. Как показывают результаты исследований ипрактика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные для трансплантацииреципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты. Эти эмбрионыиспользуют для пересадки гормонально подготовленным коровам-реципиентам.
Выбраковке подлежатдегенерированный неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можнообнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодныедля трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признакамикоторых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разнаявеличина бластомеров, нарушение межклеточной связи.
В стадии поздней бластоцистынепригодные для трансплантации эмбрионы характеризуются деформацией иослаблением бластомеров, разрывом межклеточных связей и целостности зоныпеллюцида.
6. <span Times New Roman"">
Пересадка эмбрионов реципиентам.Вкачестве реципиентаотбирают гинекологически здоровых коров последвух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основнымпоказателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные,племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, уреципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первогоосеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донораотбирают 5-6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качествереципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племеннымикондициями.
Основнымусловием хорошего приживления эмбрионовслужит синхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов. Разницаво времени в проявлении половой охоты не должна превышать 24 ч, оптимальные жерезультаты получаются при разнице не более 12 часов.
Присовременном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживать эмбрионысразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки.
Внастоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим инехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождениеэмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационногопериода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый периодэмбрионального развития — имплантационный. При естественном теченииэмбрионального периода зародый на стадии морулы или бластоцисты находится вверхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для егоаппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, чтопересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечиваетсяхирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит впериод диэструса место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менееточно.
Эффективностьхирургического способа пересадки эмбриона составляет 60-70%, а число телят — 3-4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середина 70-хгодов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применениехирургического метода сдерживается сложностью проведения операций впроизводственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, иневозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10-15лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическимспособом.
Принехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты иэкономичности, является возможность многократного использования реципиента.Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако всеони основаны на одном принципе — введении эмбриона в рог матки через шейку,вследствие чего этот способ назван также цервикальным.
Послепересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за реципиентами, обращаяособое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты.
Дляустановления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов:визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главнымобразом путем ректальной пальпации.
Важнымзвеном селекционно-племенной работы является достоверность установленияистинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов отгенетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить погруппам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4недель до 4 месяцев.
Существеннойпричиной, снижающей эффективность нехирургической пересадки эмбрионов, являетсявозможное повреждение эндометрия при введении катетера. В то же время обобщениерезультатов исследований по нехирургической пересадке эмбрионов показывает, чтоэффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будетвведен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение.
Однакона этот счет имеется и другая точка зрения [7]: что конструкция приборовсущественно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Этирезультаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора,качеством и стадией развития эмбрионов.
Вцелом же следует отметить, что нехирургический метод пересадки эмбрионовобеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50-60%, а применение маточныхрелаксантов перед пересадкой — до 75%. Это существенно выше, чем прихирургическом методе. Технология нехирургического метода трансплантации сходнас искусственным осеменением коров и продолжается 3-5 минут, или 15-20 пересадокв час.
Особоговнимания заслуживает приём, ĎĐÉÓÁÎÎŮĘ× ŇÁÂĎÔĹ Sertich P.L.[6],заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов,по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективностьтрансплантации. Этот приём может быть применен для повышения частоты рожденияразнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров,особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е.селекцией).
Результатыпроведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадкадополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выходноворожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог маткичастота двоен составляет в среднем 55-60%, вместо 2% при естественноммногоплодии коров.
Можнопересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной корове, но вконтрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки. Средняяприживляемость эмбрион
www.ronl.ru
Тема: «Трансплантация эмбрионов»
Содержание.
Введение.
Одним из основных направлений дальнейшего развития молочного и мясного скотоводства страны является интенсивное использование маточного поголовья крупного рогатого скота, особенно, с высоким генетическим потенциалом продуктивности. Однако воспроизводство крупного рогатого скота представляет собой весьма сложный биологический процесс, так как этому виду животных свойственны одноплодие, длительный период репродуктивного цикла и низкие темпы размножения.
Научные достижения в области изучения репродуктивной функции самок животных привели к разработке нового биотехнического метода интенсивного воспроизводства и селекции крупного рогатого скота - метода трансплантации эмбрионов, что стало основой ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных. С его помощью можно получать от одной генетически выдающейся коровы-донора несколько десятков или даже сотен эмбрионов и высокоценных потомков, что позволяет быстро размножить и распространить ценный генетический материал выдающихся представителей по генотипу в целях селекции популяции (А.В.Квасницкий и др., 1988; Б.П.Завертяев,1989; Ф.И.Осташко,1995 и другие). Полагают также, что трансплантация эмбрионов позволит не только повысить производство животноводческой продукции, но и возможно станет одним из средств оздоровления сельскохозяйственных животных от ряда инфекционных заболеваний.
В сложившейся ситуации метод трансплантации эмбрионов открывает огромные возможности в разведении и воспроизводстве крупного рогатого скота как с целью повышения эффективности племенной работы.
Трансплантация эмбрионов открывает огромные перспективы ускорения темпов селекционного прогресса в животноводстве. С внедрением в практику разведения животных метода искусственного осеменения резко возросли масштабы использования высокоценных племенных производителей для получения потомства, между тем как влияние маточного поголовья на селекционный процесс осталось прежним. Так, от коровы за всю ее жизнь получают 3-6 потомков, между тем как потомство от быков - улучшателей исчисляется десятками и сотнями тысяч голов.
Современная технология трансплантации эмбрионов позволяет получить от коровы - рекордистки за ее жизнь несколько десятков телят, расширяет возможности обмена генетическим материалом между странами и континентами. Транспортировка эмбрионов несравненно проще и дешевле, чем животных; к тому же отпадают ветеринарные проблемы, поскольку прочная оболочка непроницаема как для бактерий, так и для вирусов. США, Канада, Англия, Новая Зеландия осуществляют экспорт эмбрионов в десятки стран мира.
В молочном скотоводстве крупномасштабное воздействие метода эмбриопересадок на генетических прогресс достигнуто путем комплектования центров и станций исскуственного осеменения быками - трансплантатами, полученными от наиболее выдающихся родителей плановых пород.
Расчеты показывают, что трансплантация эмбрионов усиливает ежегодный генетический прогресс в животноводстве на 3%.
Метод трансплантации эмбрионов в перспективе может быть использован для создания генофонда редких и исчезающих пород животных.
Разработка техники культивирования ооцитов позволяет получить потомство от животных, выбывших из эксплуатации.
Технологические этапы трансплантации эмбрионов:
2. Эффективность различных способов полиовуляции у коров.
2.1. Отбор коров – доноров и реципиентов.
Эффективность применения метода трансплантации эмбрионов во многом зависит от клинического и физиологического состояния коров, их способности реагировать на экзогенные гонадотропины и выделять достаточное число качественных зародышей. Следовательно, одним из наиболее существенных моментов в технологии трансплантации эмбрионов, способных повысить эффективность метода является отбор доноров и реципиентов.
Исходя из того, что донор - животное высокой племенной ценности, то первое, на что обращают внимание при их отборе - это молочная продуктивность, которая за ряд лактаций должна быть на 50-60% выше стандарта данной породы, а содержание жира в молоке - на20% и более. Число учитываемых признаков может быть расширено в зависимости от поставленных селекционных целей. Например, содержание белка в молоке, пригодность к машинному доению (форма вымени, скорость молокоотдачи), крепость конституции, экстерьер и т.д. Племенная ценность донора, наряду с оценкой собственного генотипа, должна подтверждаться продуктивностью родителей. Коровы-доноры должны иметь известное происхождение, подтвержденное документально по системам групп крови. В большинстве случаев в качестве доноров используют лактирующих или выбракованных коров (не связанных с гинекологической патологией), в возрасте от 4 до 8 лет, живой массой 500-650 кг, с удоем по наивысшей лактации не ниже 7 тыс. кг молока, жирностью 3,7% и более.
Не менее важным, а может и определяющим фактором при отборе доноров является состояние репродуктивных органов. Поэтому для гормональной обработки следует отбирать животных не ранее, чем через 2,5-3 месяца после отела. При этом уменьшение размеров матки до физиологически необходимых размеров не может служить гарантией готовности давать эмбрионы высокого качества. Такой гарантией может быть только проведение клинического обследования предполагаемого донора, которое при необходимости дает возможность определить направление восстановления функций размножения на основе экзогенной гормонотерапии.
Целесообразно проводить разовую индукцию полиовуляции потенциальных доноров с целью выяснения ответной реакции яичников на введение гонадотропина, после чего делается окончательное заключение о пригодности животного к использованию в технологии трансплантации. Коровы и телки с положительной ответной суперовулирующей реакцией (10 и более овуляций) и давшие не менее 4-х жизнеспособных эмбриона за первую обработку переводятся в группу постоянных доноров.
Оптимальный интервал между повторными обработками животных - 60-70 дней, в этом случае от донора можно извлекать эмбрионы до 5 раз в год. В технологии трансплантации эмбрионов коров-доноров с уровнем реакции полиовуляции до 6 желтых тел можно использовать повторно через 35-45 дней.
Дополнительными критериями отбора животных для трансплантации эмбрионов являются гормональный статус и метаболическая активность потенциальных доноров. Для получения от донора не менее 10 овуляций и 6 жизнеспособных эмбрионов необходимо, чтобы в крови коров содержание эстрадиола было на уровне 15,4 пг/мл, тестостерона - 0,18 нг/мл, ЛГ - 1,46 МЕ/л на 0-й день полового цикла, а также прогестерона - от 2,0 до 5,0 нг/мл (в среднем 3,55) и ЛГ - 1,54 МЕ/л на 10-й день полового цикла. Вызывание суперовуляции может быть эффективным при содержании в крови холестерина не менее 3,55 ммоль/л, β-каротина - 8,88 мкмоль/л, витамина А - 4,36 мкмоль/л, активность аланинаминотрансферазы не ниже 0,24 мкмоль/л.(4)
Сервис-период более точно и намного раньше, чем интервал между отелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительной функции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однако анализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.
Сервис-период в основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интервала между первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Высокопродуктивных коров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.
Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельный период. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второго осеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Для оценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры как оплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильной технике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемость коров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.
Важным показателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения, т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осеменения характеризуется высокой степенью изменчивости - коэффициент вариабельности может достигать 70%.
Существенное влияние на изменчивость индекса осеменения оказывают такие факторы, как продолжительность периода от отела до первого осеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющая способность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группу потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случае потенциальная корова-донор должна иметь индекс осеменения равный 1. У коров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения (мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половых органов).
В качестве реципиентов используются телки случного возраста (16-18 месяцев) не представляющие племенной ценности, живой массой 380-400 кг. Не рекомендуется использовать телок с низкой живой массой.
Реципиенты должны быть клинически здоровы, внутренние и наружные половые органы хорошо развиты, половой цикл должен соответствовать физиологическим параметрам. При ректальном исследовании матка и яичники реципиента должны находиться в тазовой полости. Шейка матки должна быть четко выражена, длиной 7-12 см, диаметром 2,5-3,0 см. Длина рогов матки от 20 до 35 см. Яичники должны иметь округлую или овальную форму, плотную консистенцию, размер 3х2 см у коров и 2,0х1,5 см у телок.
Исследованиями выявлена зависимость приживляемости зародышей от морфофункционального состояния органов воспроизведения реципиентов. У телок-реципиентов с нормально развитой половой системой уровень стельности в среднем составляет 57%, в то время как при отклонениях в развитии половой системы - 20%.
При отборе потенциальных реципиентов следует также учитывать параметры половой цикличности. В качестве реципиентов следует использовать телок с продолжительностью полового цикла 19-22 дня, поскольку у животных с менее (16-18) или более (23-26дней) продолжительным циклом отмечено достоверное снижение приживляемости зародышей на 15-20%.
При отборе потенциальных реципиентов для трансплантации существенное значение имеет определение качества желтого тела животного. Если на яичнике реципиента пальпируется желтое тело отличного качества (размер 1,0-1,5 см, выступает над поверхностью яичника, имеет грибовидную форму) или хорошего качества (размер 0,7-1,0 см, округлая или грибовидная форма), то уровень приживляемости зародышей составляет 53-57%. При удовлетворительном желтом теле (размер 0,5 см, округлая форма) уровень стельности находится в пределах 28-30%. Не рекомендуется использовать для пересадки эмбриона реципиента, на яичниках которого имеется одновременно желтое тело и фолликул до 1,0 см.
Для более объективной оценки функциональной активности яичников и снижения эмбриональной смертности при трансплантации, наряду с диагностированием качества желтых тел, следует проводить определение концентрации стероидных гормонов и биохимических показателей крови реципиентов на 6-7 день естественного или индуцированного полового цикла.
Пересадку эмбрионов следует проводить реципиентам, независимо от качества желтого тела, с уровнем прогестерона в крови от 2,0 до 4,9 нг/мл. Соотношение прогестерона к эстрадиолу должно быть 1:10. В случае использования телок в качестве реципиентов с уровнем прогестерона свыше 5 нг/мл приживляемость снижается на 10-17%, а с уровнем ниже 2,0 нг/мл - на 25-30%. Содержание холестерина должно быть в пределах от 2,60-3,90 мкмоль/л, β-каротина - 12,2-17,3 мкмоль/л.
myunivercity.ru
Введение.
Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеет особое значение. Крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих. Поэтому от одной коровы можно получить в лучшем случае одного теленка в год, в то время, как в её яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), представляющих огромный генетический резерв. Кардинальное решение проблемы ускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционным способам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый ряд биотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследований репродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствование приемов манипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В перспективе биотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных и целых популяций.
В последнее время приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов, которая рассматривается как эффективный метод биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных. Некоторые вопросы трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота рассмотрены в данной курсовой работе.
Отбор доноров.
В большинстве случаев в качестве коров-доноров отбирают матерей потенциальных племенных быков. Благодаря этому обеспечивается высокий селекционный дифференциал. Оценка и отбор коров-доноров, выделенных в группу матерей быков, проводят в два этапа. На первом этапе племенная ценность донора оценивается по главным признакам молочного скота - по уровню молочной продукции и жирномолочности. На втором этапе, когда отобраны доноры с высокой племенной ценностью по главным признакам, число признаков в зависимости от цели селекции расширяется. К ним относят форму вымени и сосков, свойства молокоотдачи, резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества.
Нужно иметь в виду, что оценка коровы-донора по родословной и собственной продуктивности является не окончательной, так как в этом случае не учитывается эффект расщепления и рекомбинации генов. Поэтому окончательно оценивать корову-донора можно только при получении и оценке ее потомства.
Высокие затраты на получение телят путем трансплантации эмбрионов обусловливают необходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можно получать большое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам,сохранившим в течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность. Исследованиями установлено, что потенциальные коровы-доноры с хорошими и устойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрасположенностью к воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые два месяца.
Межотельный период является интегральным показателем воспроизводительной способности коров. Его составные части: сервис-период и период стельности.
Сервис-период более точно и намного раньше, чем интервал между отелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительной функции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однако анализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.
Сервис-период в основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интервала между первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Высокопродуктивных коров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.
Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельный период. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второго осеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Для оценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры как оплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильной технике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемость коров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.
Важным показателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения, т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осеменения характеризуется высокой степенью изменчивости - коэффициент вариабельности может достигать 70%. Существенное влияние на изменчивость индекса осеменения оказывают такие факторы, как продолжительность периода от отела до первого осеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющая способность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группу потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случае потенциальная корова-донор должна иметь индекс осеменения равный 1. У коров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения (мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половых органов).
Через 15-20 суток после отела ветеринарный специалист методом ректальной пальпации контролирует у потенциальной коровы-донора состояние половых органов, чтобы исключить такие нарушения воспроизводительной функции как киста яичника, гипофункция, воспаление яичниковой связки, эндометриты.
Суперовуляция.
Важным звеном в современной биотехнологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота является гормональноевызывание суперовуляции у коров-доноров. В группу доноров переводят только тех коров, которые положительно реагируют на введение гормонов. Для стимуляции множественной овуляции используют гонадотропин СЖК в сочетании с простагландинами и другими биологически активными веществами [3]. Этот способ, как показывает практика, позволяет вызвать суперовуляцию примерно у 70% коров.
Одним из существенных недостатков этого способа суперовуляции является крайне высокая степень вариабельности числа овуляций, даже при использовании одной и той же концентрации гонадотропина СЖК. Она составляет от 0 до 50 овуляций на одну корову-донора. Оптимальным результатом суперовуляции является выход из яичника в воронку яйцепровода 10-20 яйцеклеток.
Shelton, J.N. [7], подытоживая результаты исследований, пришел к выводу, что на инъекции гонадотропинов 25-35% коров-доноров не реагируют, а у положительно реагирующих коров (3 и более овуляций) вариабельность реакции яичника настолько велика, что становится невозможным надежное планирование программы пересадки эмбрионов. Kenneth, L.W. [4] считает, что с учетом имеющейся изменчивости лишь половина коров, реагирующих на введение гонадотропинов, может дать 4-5 эмбрионов, пригодных для трансплантации. Следовательно, в основном эмбрионы можно получить менее чем от половины первоначально тщательно отобранных потенциальных коров-доноров.
По современному представлению реакция коров на суперовуляцию в значительной степени определяется количеством и качеством фолликулов яичников во время их стимуляции гонадотропинами. Экспериментально было доказано, что во время суперовуляции для получения хорошей реакции необходимо наличие определенного количества малых антральных фолликулов, чувствительных к гонадотропной стимуляции. Недостаток таких фолликулов, или напротив, наличие больших по размеру фолликулов снижают уровень реакции или она вообще отсутствует. Это может свидетельствовать об интраовариальном регулировании процесса суперовуляции. Поскольку фолликулы растут асинхронно, то в каждый период инъекция гонадотропинов будет оптимальной лишь для ограниченного числа фолликулов.
Кроме размера фолликула, на реакцию введения гонадотропинов существенное влияние оказывает интенсивность митотического индекса, которая у нормального фолликула повышается при формировании полости. Установлено что высокий митотический индекс неатретических фолликулов положительно коррелирует с интенсивностью суперовуляции.
Имеются данные, свидетельствующие о том, что на реакцию гонадотропинов отвечают только те малые антральные фолликулы, размеры которых не превышают 2 мм. Установлено что такие фолликулы гормонально активны и быстро овулируют.
Атретические фолликулы с высоким митотическим индексом, напротив, не овулируют, а после прохождения фазы лютеинизации подвергаются её воздействию и имитируют наличие жёлтого тела.
Следовательно, для эффективной суперовуляции решающим является физиологическое состояние фолликулов в лютеиальной фазе яичника.
Анализ работы станций по пересадке эмбрионов показал, что хорошими донорами можно считать коров, которые после многократных суперовуляций имеют хорошую реакцию яичника и производят большое число пригодных для пересадки эмбрионов за одно вымывание. Однако лишь небольшая часть доноров обнаруживает повторную реакцию яичников после вызывания суперовуляции. В основном же коровы-доноры нерегулярно отвечают на повторную гормональную обработку, поэтому количество овуляций и выход эмбрионов не являются стабильными.
Для оценки предрасположенности, или потенциальной изменчивости коров на пригодность в качестве доноров, были рассчитаны вариансы признаков, на основе которых был определен коэффициент повторяемости. Рассчитанные коэффициенты повторяемости признаков предрасположенности коров в качестве доноров колебались в пределах 17.3-23.3%. Это свидетельствует о том, что по итогам оценки за первое вымывание эмбрионов надежность повторного результата составит лишь 20%. Следовательно, по оценке признака пригодности за первое вымывание эмбриона невозможно достоверно судить о пригодности коровы в качестве донора.
Изменчивость пригодности коров в качестве доноров включает наследственные и ненаследственные факторы. Причем вклад ненаследственных факторов значительно выше вклада факторов генетических.
Отмечено, что прекращение кормления донора после обработки гонадотропинами достоверно уменьшает реакцию яичника на введение гормонов. Для суперовуляции и получения биологически полноценных эмбрионов необходимо обеспечить полноценное кормление донора, сбалансированное не только по основным питательным веществам, но особенно по аминокислотам и микроэлементам. Кормление доноров должно быть таким, чтобы они находились в хорошем физиологическом состоянии.
Для получения суперовуляции наиболее широкое распространение во многих странах мира получил ГСЖК с простагландинами.
Хороших результатов суперовуляции можно ожидать, когда к моменту инъекчии гонадотропина в яичниках коровы функционирует желтое тело диаметорм 1.5 см. При наличии в одном из яичников развитого фолликула диаметром 10 мм полиовуляция снижается. Интенсивность множественной овуляции также снижается когда кроме хорошо развитого желтого тела в яичнике находится развитый фолликул, фолликулярная или лютеиновая киста. Следовательно, эффективность суперовуляции в большой степени определяется физиологическим состоянием яичников.
На число овуляций существенное влияние оказывает интервал между временем введения ГСЖК и началом половой охоты. Определен оптимальный интервал, во время которого можно получить наибольшее количество овуляций, он составляет 4-7 суток. При уменьшении этого срока до 1-3 суток число овуляций существенно снижается, а при увеличении свыше 7 суток, хотя число овуляций возрастает, но формируются биологически неполноценные яйцеклетки.
Наивысший эффект суперовуляции достигается при введении ГСЖК между 10-12 сут эстрального цикла (середина лютеальной фазы) и через 48 часов простагландина F2a (или его аналога), вызывающего регрессию желтого тела, половую охоту и овуляцию. В течение 48 часов после инъекции простагландина у 95% коров-доноров происходит полиовуляция со всеми признаками эструса. При этом доноры могут быть осеменены только в сжатые сроки. Установлено, что после такой технологии гормональной обработки коров происходит в среднем 10 овуляций, а оплодотворяемость яйцеклеток достигает 80%.
Другим гормональным препаратом с суперовуляционным действием является фолликулостимулирующий гормон ФСГ. Суперовуляцию можно вызвать введением очищенного ФСГ или его комбинации с лютеинизирующим гормоном ЛГ в соотношении 5:1. В отличие от гонадотропина СЖК ФСГ вводят не однократно, а многократно.
Обобщение многочисленных работ по использованию гонадотропина СЖК и ФСГ показало, что наблюдается либо одинаковая реакция яичников коров на оба гонадотропина, либо отмечается лучшая реакция при введении гонадотропина ФСГ.
Как отмечалось, следует иметь в виду, что многократная суперовуляция подвержена большей вариабельности. Поэтому не все коровы-доноры имеют одинаковую предрасположенность к многократной суперовуляции. Для эффективной многократной суперовуляции необходим тщательный отбор доноров по ряду показателей этого признака.
В заключение следует отметить, что гормональная стимуляция яичников коров, вызывающая полиовуляцию, связана с активизацией метаболических процессов у доноров. Поэтому для протекания нормальных процессов оогенеза, оплодотворения и биологически полноценного формирования и развития зиготы коров-доноров необходимо обеспечить биологически активными веществами (витамины, незаменимые аминокислоты). Кроме того, для этой цели используют препарат селевит.
Осеменение коров-доноров.
Результаты суперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все ещё остается открытой. Как показывают результаты исследований, только 60-65% эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся в результате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либо неоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии или дегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной.
Для искусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму только выдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Как отмечалось, надежным критерием наследственных качеств быка служит коэффициент повторяемости, т.е. коэффициент регрессии будущих дочерей быка на число фактически имеющихся дочерей. Если генетическое превосходство дочерей быка, выраженное величиной отклонения от сверстниц, умножить на коэффициент повторяемости, то полученная величина будет характеризовать генетическое превосходство будущих дочерей быка, или предсказанную разность. Предсказанная разность является одним из наиболее объективных качеств быка, разработанных в современной селекции молочного скота.
Для искусственного осеменения коров-доноров следует использовать, как правило, сперму производителей 1-й племенной категории, т.е. таких, племенная ценность которых превышает среднюю популяционную величину на два стандартных отклонения. В этом случае существенно повышаются темпы селекции и улучшается племенная ценность новой генерации.
Племенной подбор быков-производителей и коров-доноров осуществляется по заказному или целевому спариванию родителей. В его основе должен лежать принцип индивидуального подбора в соответствии с селекционной программой совершенствования существующих или создания новых пород, типов и линий.
Требования к оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной для осеменения коров-доноров, должна быть значительно выше, чем при оплодотворении остальных коров. Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов, наряду с использованием высококачественной спермы, необходимо определить сроки половой охоты для своевременного проведения искусственного осеменения. Как правило, коров с гормонально вызванной половой охотой осеменяют дважды: первый раз при начале появления половой охоты и второй - через 12-24 часа.
В нашей стране коров-доноров искусственно осеменяют дважды в день с интервалом 10-12 часов каждый раз двумя-тремя дозами замороженной спермы. Так как при суперовуляции повышается число овулировавших яйцеклеток, в каждой дозе спермы должно быть не менее 50 млн подвижных спермиев.
День, в который проводится искусственное осеменение коровы-донора, считается датой оплодотворения. С этого дня начинается отсчет развития эмбрионов in vivo до их извлечения.
Извлечение и оценка эмбрионов.
Эффективность метода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть извлечены тремя способами: после убоя коровы-донора; хирургическим; нехирургическим.
Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора. Самым простым и надежным способом извлечения эмбрионов является убой коровы-донора. Этот способ практиковался только на первых этапах освоения метода трансплантации. В настоящее время из-за потери генетически ценной коровы-донора он не используется.
Извлечение эмбриона хирургическим способом. Важным моментом, обеспечивающим эффективность извлечения эмбрионов, является определение стадии их развития и места положения в поовых путях коровы-донора. Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения (До). Имеется несколько способов хирургического извлечения эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища, лапаротомия по белой линии живота и лапаротомия в области голодной ямки.
Хирургический способ извлечения эмбрионов является трудоемким, дорогостоящим и, что особенно важно, им нельзя пользоваться многократно. В настоящее время хирургический способ извлечения применяется в редких случаях, главным образом в научных целях.
Извлечение эмбрионов нехирургическим способом. Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключается в простоте манипуляций. Для этого не требуется специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственных условиях. С селекционной точки зрения, при правильном применении нехирургического способа воспроизводительная способность доноров не нарушается, что позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров для получения от них большого числа потомков.
В общем виде извлечение эмбрионов нехирургическим методом происходит по следующей схеме. Коров-доноров обследуют на наличие желтых тел, чистят и моют, ограничивают рацион и кратность кормления, а за сутки прекращают кормление и поение. Перед самым извлечением эмбрионов дезинфицируют наружные половые органы коров-доноров. Извлекают эмбрионы под местной анестезией. В рог матки вводят продезинфицированный двухканальный резиновый или пластмассовый катетер с надувным баллончиком, в который нагнетают 10-155 куб см воздуха. Выход из рога матки закрывают, надувая воздухом тонкостенный резиновый баллончик. Затем в рог вводят промывную жидкость и осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы от стенок матки. В качестве промывной среды применяют PBS до 500 мл. Этот состав используется и для кратковременного культивирования эмбрионов.
Вымывание повторяют 5-8 раз. Основную часть эмбрионов извлекают в первых трех-четырех смывах. Промывание в обоих рогах матки, включая введение катетеров, продолжается 20-50 минут. За это время можно извлечь более 50% эмбрионов, находящихся на стадии морулы или бластоцисты.
После вымывания эмбрионов в матку вводят раствор антибиотика с целью антисептики.
Во многих странах разработаны различные устройства для нехирургического извлечения эмбрионов. В нашей стране в ряде институтов ВАСХНИЛ успешно освоены нехирургические методы извлечения, позволяющие получать 60% от числа овулировавших яйцеклеток. Нужно иметь в виду, что в среднем из вымытых яйцеклеток до 25% оказываются неоплодотворенными или дезинтегрированными. Причины выхода биологически неполноценных зигот до сих пор окончательно не выяснены.
Кратковременное культивирование и хранение эмбрионов. Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимися на предимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения до введения в рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. В этот период нужно создать оптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологических качеств. Кратковременное хранение эмбрионов дает также возможность транспортировать их в другие хозяйства.
Эмбрионы крупного рогатого скота можно сохранить путем пересадки их в яйцепровод самок других видов млекопитающих. Лучше всего обеспечивается нормальное предимплантационное развитие эмбрионов коров в яйцепроводе крольчих. Установлено, что эмбрионы коровы в яйцепроводе крольчихи могут успешно развиваться до стадий, пригодных для трансплантации реципиентам, т.е. до морулы и бластоцисты. Недостатком этого метода является его трудоемкость и возможные потери зигот при их переносе. В настоящее время широкое распространение получил метод краткосрочного хранения эмбрионов in vitro.
После извлечения и оценки на жизнеспособность эмбрионы переносят в питательные среды с температурой 37 градусов. Большинство сред, в которых культивируют и хранят эмбрионы, включают растворы солей, аминокислоты с бикарбонатным ионом как буферным агентом, обеспечивающим pH в пределах 7.2-7.6. Проведенные исследования показали, что продолжительность культивирования без потери биологических качеств эмбрионов возможна до 95 часов.
В последние годы проводятся исследования по краткосрочному хранению эмбрионов in vitro при их охлаждении ниже 37 градусов. Разработка этого метода имеет большое практическое значение, т.к. позволяет существенно упростить манипуляции с эмбрионами и надежнее обеспечивает их транспортировку.
Оценка эмбрионов. Оценка эмбрионов крупного рогатого скота производится несколькими методами. Наибольшее распространение получил морфологический метод. Установлено, что результаты имплантации эмбрионов зависят от того, насколько полно оценена способность оплодотворенных яйцеклеток к развитию.
По морфологическим признакам и эмбриональной стадии развития, эмбрионы можно классифицировать на пригодные и непригодные к трансплантации. При морфологической оценке эмбрионов основное внимание обращают на фрмулу зиготы, состояние её зоны пеллюцида, число бластомеров, равномерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта.
Кроме морфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологической оценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионы от погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования и замораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDA и DAP1 через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определение способности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живые бластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеров реакции обратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособность эмбрионов под микроскопом.
Ряд авторов предлагает использовать синьку Эванса. В живых эмбрионах при температуре 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида, которую затем обесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомерах.
Как считает М. И. Прокофьев [2], могут быть гистохимические методы оценки жизнеспособности эмбрионов, основанные на специфических реакциях структурных элементов и веществ клеток к витальным и флюоресцентным красителям. Такие реакции протекают очень интенсивно и быстро, что позволяет ускорить процесс оценки эмбрионов.
Однако следует учитывать, что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшает основной метод оценки эмбрионов - морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками при оценке жизнеспособности эмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток, величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида. Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве.
Важнейшим критерием для оценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы с замедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и других манипуляций.
При оценке качества эмбриона в нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих показателей: соответствия стадии развития эмбриона его возрасту; правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности; равномерности дробления бластомеров, состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлинового пространства.
Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы, извлеченные из матки коровы-донора на 7-8 сутки после первого осеменения. Как показывают результаты исследований и практика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные для трансплантации реципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты. Эти эмбрионы используют для пересадки гормонально подготовленным коровам-реципиентам.
Выбраковке подлежат дегенерированный неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можно обнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодные для трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признаками которых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разная величина бластомеров, нарушение межклеточной связи.
В стадии поздней бластоцисты непригодные для трансплантации эмбрионы характеризуются деформацией и ослаблением бластомеров, разрывом межклеточных связей и целостности зоны пеллюцида.
Пересадка эмбрионов реципиентам.
В качестве реципиентаотбирают гинекологически здоровых коров после двух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основным показателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, у реципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первого осеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донора отбирают 5-6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качестве реципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племенными кондициями.
Основным условием хорошего приживления эмбрионов служит синхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов. Разница во времени в проявлении половой охоты не должна превышать 24 ч, оптимальные же результаты получаются при разнице не более 12 часов.
При современном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживать эмбрионы сразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки.
В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим и нехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождение эмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационного периода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый период эмбрионального развития - имплантационный. При естественном течении эмбрионального периода зародый на стадии морулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит в период диэструса место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно.
Эффективность хирургического способа пересадки эмбриона составляет 60-70%, а число телят - 3-4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середина 70-х годов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применение хирургического метода сдерживается сложностью проведения операций в производственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, и невозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10-15 лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическимспособом.
При нехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты и экономичности, является возможность многократного использования реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако все они основаны на одном принципе - введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным.
После пересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты.
Для установления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главным образом путем ректальной пальпации.
Важным звеном селекционно-племенной работы является достоверность установления истинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов от генетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить по группам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4 недель до 4 месяцев.
Существенной причиной, снижающей эффективность нехирургической пересадки эмбрионов, является возможное повреждение эндометрия при введении катетера. В то же время обобщение результатов исследований по нехирургической пересадке эмбрионов показывает, что эффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будет введен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение.
Однако на этот счет имеется и другая точка зрения [7]: что конструкция приборов существенно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Эти результаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора, качеством и стадией развития эмбрионов.
В целом же следует отметить, что нехирургический метод пересадки эмбрионов обеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50-60%, а применение маточных релаксантов перед пересадкой - до 75%. Это существенно выше, чем при хирургическом методе. Технология нехирургического метода трансплантации сходна с искусственным осеменением коров и продолжается 3-5 минут, или 15-20 пересадок в час.
Особого внимания заслуживает приём, ĎĐÉÓÁÎÎŮĘ × ŇÁÂĎÔĹ Sertich P.L.[6], заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов, по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этот приём может быть применен для повышения частоты рождения разнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е. селекцией).
Результаты проведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадка дополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выход новорожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог матки частота двоен составляет в среднем 55-60%, вместо 2% при естественном многоплодии коров.
Можно пересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной корове, но в контрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки. Средняя приживляемость эмбриона осемененной корове при нехирургической подсадке составляет 50%.
Обобщая результаты экспериментов по нехирургическому методу пересадки эмбрионов, можно придти к заключению, что пересадка двух эмбрионов в два рога матки реципиента или подсадка одного предварительно осемененному реципиенту в контрлатеральный рог матки являются эффективными и перспективными методами в биотехнологии трансплантации эмбрионов.
Криоконсервация эмбрионов.
Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое заморахивание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.
Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позвозяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайными причинами.
При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90%, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится в пределах 50-55%. Однако нередко в производственных условиях при несоблюдении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации. Обосновано, что использование метода криоконсервации эмбрионов в производственных условиях является рентабельным только в том случае, если выживаемость эмбрионов после размораживания будет не менее 80%, а процент стельности коров-реципиентов составит 55-60%.
По принятой в России технологии, эмбрионы замораживают с применением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах. Эмбрионы замораживают в пробирках 50x6 мм или в ампулах вместимостью 1 мл. В пробирку или ампулу вносят 1-4 эмбриона от одного донора и 0.4 мл раствора криопротектора (1.5 М ДМСО или 10%-ный раствор глицерина). Ампулы перед замораживанием запаивают на пламени газовой горелки. Ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждениеот -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 до -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10-12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.
Практика криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота свидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.
Необходимость отбора эмбрионов диктуется еще и тем обстоятельством, что у 10% из них обнаруживается неправильное развитие, а при криоконсервации повреждаются в среднем еще 25% клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукцию интактных бластомеров, вследствие чего переживаемость и дальнейшее развитие после замораживания и оттаивания существенно нарушаются.
Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет.
Влияние трансплантации эмбрионов на генетический прогресс популяции.
Создание банков глубокозамороженной спермы и разработка методов искусственного осеменения позволили существенно увеличить интенсивность отбора быков и повысить точность оценки их племенной ценности. На базе интенсивного использования генетически ценных быков-производителей с применением искусственного осеменения коров глубокозамороженной спермой темпы селекции в популяции по сравнению с обычными увеличиваются в 2-3 раза.
В то же время генетический вклад в прогресс селекции матерей быков почти в два раза ниже вклада отцов быков. Это объясняется низкой интенсивностью селекции матерей быков и ненадежной оценкой их племенной ценности из-за получения небольшого числа потомков. Эти ограничения и призвана частично снять трансплантация эмбрионов. В настоящее время при использовании трансплантации эмбрионов от одной генетически ценной коровы можно получать двадцать телят, используя малоценных реципиентов.
Однако нередко возникает вопрос о влиянии реципиента на эмбриональное и постэмбриональное развитие трансплантата. Прямое генетическое влияние на эмбрион реципиент не оказывает, так как пересаженная зигота представляет сформированный генотип, состоящий из гаплоидных наборов хромосом истинных родителей. Отсутствие прямого генетического влияния реципиента на эмбрион подтверждают межпородные и межвидовые пересадки зигот, а также иммуногенетические исследования. В то же время, могут быть вызваны модификации трансплантата, т.е. ненаследственные изменения признаков, обусловленные влиянием организма реципиента во время стельности. В отличие от мутаций, модификации по наследству не передаются. При этом нужно иметь в виду, что характер и степень фенотипических изменений определяются генотипом эмбриона.
В статье Schaeffer, L.R [5] приведены интересные результаты, полученные при моделировании селекции молочного скота. В основе использованной модели, в которую были заложены данные о 2000 коров племенного центра, получены следующие параметры:
доля выбракованных коров по болезням 20%;
доля выбракованных коров по продуктивности 10%
доля репродукции 30%
доля коров, непригодных для трансплантации эмбрионов 20%
цель селекции - выход молочного жира 150 кг
наследуемость 0.3
фенотипическое отклонение 35 кг
генетическое превосходство первотелок 2 кг
генетическое превосходство быков 20 кг
Дополнительный генетический прогресс за генерацию на основе применения трансплантации эмбрионов показан в нижеприведенной таблице:
| Стельность, % | Число эмбрионов |
| 1 | 2 | 3 | 4 5 6 7 8 9 10 | |
| 50 a | 13.1 | 13.6 | 14.0 | 14.3 14.6 14.8 14.9 15.1 15.2 15.3 |
| b | 10.8 | 10.8 | 10.8 | 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 |
| c | 21.3 | 25.9 | 28.8 | 31.9 34.2 36.0 37.5 38.8 39.9 40.9 |
| 60 a | 13.5 | 14.0 | 14.4 | 14.8 15.1 15.4 15.6 15.7 15.9 16.0 |
| b | 10.8 | 10.8 | 10.8 | 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 |
| c | 25.0 | 29.6 | 32.8 | 36.6 39.4 41.6 43.5 45.1 46.5 47.7 |
| 70 a | 13.7 | 14.3 | 14.8 | 15.3 15.7 16.0 16.2 16.4 16.6 16.7 |
| b | 10.8 | 10.8 | 10.8 | 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 |
| c | 26.8 | 32.4 | 36.6 | 41.1 44.5 47.2 49.4 51.3 52.9 54.4 |
Обозначение:
a - генетический прогресс при трансплантации эмбрионов;
b - генетический прогресс без трансплантации эмбрионов;
c - превосходство a над b, выраженное в процентах.
Из анализа данной таблицы видно, что с увеличением пригодных для трансплантации эмбрионов и повышением процента стельности коров, генетический прогресс возрастает. Однако, этот процесс происходит нелинейно.
В этой же статье приведены данные по генетическому сдвигу молочной продукции при разных методах воспроизводства и селекции молочного скота. При этом сравнивались результаты общепринятой программы селекции, результаты трансплантации эмбрионов, и результаты трансплантации эмбрионов при интенсивном отборе быков. Результаты показаны в нижеприведенной таблице:
| Программа селекции | Племенные категории животных | Общий генетич. прогресс, кг/год |
| Традиционная, с применением искусств. осеменения: | ||||
| доля отселект. % | 4 | 20 | 6 | 90 |
| интенсивность отбора | 2.53 | 1.400 | 1.985 | 0.195 94.3 |
| Трансплантация эмбрионов, искусственное осеменение: | ||||
| доля отселект. % | 4 | 20 | 1 | 10 |
| интенсивность отбора | 2.53 | 1.400 | 2.660 | 1.755 124.8 |
| Трансплантация эмбрионов, искусственное осеменение, интенсивный отбор быков: | ||||
| доля отселект. % | 2 | 2 | 1 | 10 |
| интенсивность отбора | 2.420 | 2.420 | 2.660 | 1.755 148.2 |
Примечание: предусматривается получение 10 телят от одного донора в год; общий интервал между поколениями 22 года (Iоб=5, Iок=5, Iмб=6, Iмк=6); точность оценки племенной ценности: rоб=0.8, rок=0.8, rмб=0.6, rмк=0.6.
Из приведенных данных видно, что генетический прогресс по молочной продуктивности существенно повышается при использовании трансплантации эмбрионов, увеличивающей интенсивность селекции по материнской линии, особенно среди матерей быков. Использование трансплантации позволяет повысить темпы генетического прогресса с 94.3 до 124.8 кг молока в год, т.е. на 32%. Вместе с тем, при повышении интенсивности селекции быков-производителей в сочетании с использованием трансплантации эмбрионов, генетический прогресс повышается до 148.2 кг молока в год, т.е на 57%.
Заключение.
Трансплантация эмбрионов занимает прочное место в современных программах селекций. Метод трансплантации вместе с искусственным осеменением рассматривается как основа современной биотехнологии воспроизводства высокопродуктивных племенных животных, несмотря на относительно высокий уровень затрат при использовании этого метода. В настоящее время в России производится ежегодно более десяти тысяч эмбриопересадок, в будущем же планируется получать методом трансплантации не менее 25-30 тысяч телят ежегодно. Новые методы биотехнологии, по мнению ученых, в будущем приведут к коренному изменению в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота.
Список использованной литературы.
Завертяев Б. П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Л. «Агропромиздат», 1989.
Прокофьев М. И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных.
Л., «Наука», 1983.
Чернева И. Р. Лекции по биотехнологии и пересадке эмбрионов. Московская ветеринарная академия им. Скрябина, 1997.
Kenneth, L.W.. Embryo Cultivation//Biotechnology Magazine vol.1 #2, 1994.
Schaeffer, L.R. Effects of embryo transfer in beef cattle on genetic evaluation methodology//Journal of animal science. Oct 1989. v. 67 (10)
Sertich, P.L. Transcervical embryo transfer in performance mares//Journal of the American Veterinary Medical Association. Oct 1, 1989. v. 195 (7)
Shelton, J.N. Embryo manipulation in research and animal production.//Australian journal of biological sciences. 1988. v. 41 (1)
nreferat.ru
