Министерство образования РФ
Волгоградский Государственный Технический Университет
Кафедра промышленной экологии и безопасности жизнедеятельности
Реферат на тему:
Биотехнология антибиотиков
Выполнила:
студентка гр. ХТ-441
Щепетнова М.Н.
Проверила:
проф. Владимцева И.В.
Волгоград 2011г.
Содержание
Введение………………………………………………………………………….….3
1. Технология получения антибиотиков…………………………………………...4
1.1 Общие сведения о производстве антибиотиков…………………………….....4
1.2 Стерилизация питательных сред……………………………………………….5
1.3 Подготовка посевного материала……………………………………………....7
1.4 Методы культивирования продуцентов антибиотиков……………………….8
1.5 Ферментеры……………………………………………………………………...9
1.6 Развитие продуцента антибиотика в ферментерах……………………………11
1.7 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотиков……………………………………………..13
1.8 Сушка, контроль и расфасовка препарата……………………………………..15
2. Применение антибиотиков……………………………………………………….16
Заключение…………………………………………………………………………...18
Список использованных источников……………………………………………….19
Введение
Антибиотики - самый большой класс фармацевтических препаратов, которые синтезируются микроорганизмами. Некоторые из антибиотиков используют в сельском хозяйстве против различных сельскохозяйственных вредителей, другие - в медицинских целях.
В настоящее время микроорганизмы продуцируют десятки видов соединений - аминокислот, антибиотиков, белков, витаминов, липидов, Микробиологический синтез различных веществ играет ключевую роль в биотехнологическом производстве. Начало современной промышленной микробиологии было положено в 40-х годах, когда наладили производство пенпциллинов методами ферментациинуклеиновых кислот, полисахаридов, пигментов, сахаров, ферментов и т. д.
После установления высоких лечебных свойств первого антибиотика — пенициллина сразу же возникла задача организации производства его в больших количествах. На первом этапе промышленное получение этого препарата носило примитивный, экономически нерентабельный характер. Выращивание продуцента антибиотика осуществлялось на средах, находящихся в небольших сосудах при поверхностном культивировании гриба. Процесс развития гриба продолжался 8—10 суток. Такой способ культивирования гриба при большой затрате труда давал низкий выход антибиотика, и себестоимость препарата была очень высокой. Безусловно, такое получение антибиотика не могло удовлетворить запросы медицины. В результате был предложен метод глубинного выращивания гриба в ферментерах или танках — при продувании воздуха и перемешивании культуральной жидкости. [1]
Из данного примера можно сделать вывод, что биотехнология антибиотиков весьма сложное, но в тоже время необходимое производство. Технологию получения антибиотиков нужно совершенствовать, а совершенствование невозможно без изучения основных стадий получения антибиотиков, а также анализа всех процессов, происходящих на них.
1. Технология получения антибиотиков
1.1 Общие сведения о производстве антибиотиков
Успехи антибиотической отрасли промышленности и качество выпускаемой продукции определяются уровнем основных стадий технологического процесса. Промышленное получение антибиотиков — это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий.
1) Стадия биосинтеза антибиотика. Это основная биологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии — создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика.
Высокая результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента антибиотика, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма, в том числе стоимости применяемых предшественников, а также общих энергетических затрат на процессы, связанные с развитием продуцента антибиотического вещества.
2) Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации. Эффективность стадии во многом определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, местом основного накопления биологически активного вещества (в культуральной жидкости или внутриклеточно).
3) Стадия выделения и очистки антибиотика. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного места накопления антибиотического вещества применяются различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используются следующие: экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка.
Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первом этапе работы приходится иметь дело с небольшой концентрацией (не более 1%) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах концентрация антибиотического вещества увеличивается до 20—30%. Все это требует применения различных емкостей и различных объемов используемых реагентов.
4) Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка. Особенность стадии определяется очень высокими требованиями к качеству конечного продукта. При химической очистке антибиотических веществ необходимо соблюдать высокую чистоту помещений, оборудования, проводить систематическую дезинфекцию их. В случае выпуска антибиотиков, предназначенных для инъекций, препараты должны быть стерильными: получение таких антибиотических препаратов, приготовление различных лекарственных форм, дозировка и упаковка должны осуществляться в асептических условиях.
В современных условиях производства антибиотиков необходимо принимать меры к максимальному снижению себестоимости препаратов. Для этого необходимо:
1) внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов — продуцентов антибиотиков;
2) создание и обеспечение самых благоприятных условий развития продуцента антибиотика на относительно дешевых средах;
3) широкое использование математических методов планирования процесса развития организма и электронно-вычислительной техники с целью оптимизации и моделирования условий его культивирования, обеспечивающих максимальный выход антибиотика;
4) применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с автоматизированными контролирующими устройствами основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика. [3]
1.2 Стерилизация питательных сред
Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда. В зависимости от природы используемого микроорганизма в качестве источника углерода возможно применение различных субстратов. Например, для получения пенициллина лучшим источником углерода и энергии является глюкоза и лактоза; грамицидина – глицерин и соли янтарной кислоты; стрептомицина и неомицина – глюкоза. [2] Среда должна соответствовать определенным требованиям:
1) обеспечивать максимальное образование антибиотика;
2) состоять из относительно дешевых компонентов;
3) иметь хорошую фильтрующую способность;
4) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков.
Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.
Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до определенной температуры (120—130°С) непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30—60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27—30°С.
За время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, происходит разрушение значительного числа микроорганизмов. Хорошо известно, что для нагревания до температуры стерилизации больших объемов среды и затем ее охлаждения требуется больше времени, чем для маленьких объемов, а поэтому время, затрачиваемое на поддержание наиболее высокой стерилизующей температуры в больших объемах, может быть меньшим, чем для небольших объемов с тем же эффектом стерилизации.
Наилучший эффект стерилизации и сохранения термолабильных веществ среды получается в том случае, если стерилизация проводится при более высокой температуре и за более короткое время.
Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонку, через которую пропускается острый пар. Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и происходит быстрый ее нагрев. Среда в колонку подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.
Среда, нагретая в колонке до температуры около 130°, поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125—130°С. Время выдержки зависит от состава среды и составляет 5—10 минут. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30—35°С (на выходе) и поступает в ферментер.
Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим:
1) при непрерывном методе стерилизации каждый элементарный объем среды находится при высокой температуре короткое время;
2) благодаря более высоким температурам стерилизации и короткой экспозиции деструкция компонентов питательной среды минимальна;
3) процесс стерилизации всего объема питательной среды растянут во времени, этим обеспечивается более равномерная разгрузка котельной;
4) процесс легко контролируем и управляем.
При применении в качестве отдельных компонентов субстрата термолабильных веществ их, как правило, следует стерилизовать отдельно в условиях более мягкого режима. [4]
1.3 Подготовка посевного материала
Подготовка посевного материала — одна из ответственнейших операций в цикле биотехнологического метода получения антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментере, так и биосинтез антибиотика. Продуцент антибиотика обычно выращивается на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала — процесс многоступенчатый. Микроорганизм предварительно выращивают на агаризированной среде в пробирке, затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2—3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой инокулятор, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор, откуда и производят посев в основном ферментере. Для посева в основной ферментер используют от 5 до 10 объемных процентов посевного материала (инокулята). Однако в случае получения пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях, рисовых зернах или пшене, засевают сразу в инокулятор. [3]
turboreferat.ru
Министерство образования и науки Украины
Днепропетровский государственный аграрный университет
Кафедра физиологии и биохимии
Реферат на тему:
Биотехнология антибиотиков
Выполнил:
студент гр. ВМ 1А-11
Комшелюк Р.А.
Днепропетровск 2013г
Введение
Антибиотики - самый большой класс фармацевтических препаратов, которые синтезируются микроорганизмами. Некоторые из антибиотиков используют в сельском хозяйстве против различных сельскохозяйственных вредителей, другие - в медицинских целях.
В настоящее время микроорганизмы продуцируют десятки видов соединений - аминокислот, антибиотиков, белков, витаминов, липидов, Микробиологический синтез различных веществ играет ключевую роль в биотехнологическом производстве. Начало современной промышленной микробиологии было положено в 40-х годах, когда наладили производство пенпциллинов методами ферментациинуклеиновых кислот, полисахаридов, пигментов, сахаров, ферментов и т. д.
После установления высоких лечебных свойств первого антибиотика — пенициллина сразу же возникла задача организации производства его в больших количествах. На первом этапе промышленное получение этого препарата носило примитивный, экономически нерентабельный характер. Выращивание продуцента антибиотика осуществлялось на средах, находящихся в небольших сосудах при поверхностном культивировании гриба. Процесс развития гриба продолжался 8—10 суток. Такой способ культивирования гриба при большой затрате труда давал низкий выход антибиотика, и себестоимость препарата была очень высокой. Безусловно, такое получение антибиотика не могло удовлетворить запросы медицины. В результате был предложен метод глубинного выращивания гриба в ферментерах или танках — при продувании воздуха и перемешивании культуральной жидкости. [1]
Из данного примера можно сделать вывод, что биотехнология антибиотиков весьма сложное, но в тоже время необходимое производство. Технологию получения антибиотиков нужно совершенствовать, а совершенствование невозможно без изучения основных стадий получения антибиотиков, а также анализа всех процессов, происходящих на них.
1. Технология получения антибиотиков
Общие сведения о производстве антибиотиков
Успехи антибиотической отрасли промышленности и качество выпускаемой продукции определяются уровнем основных стадий технологического процесса. Промышленное получение антибиотиков — это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий.
1) Стадия биосинтеза антибиотика. Это основная биологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии — создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика.
Высокая результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента антибиотика, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма, в том числе стоимости применяемых предшественников, а также общих энергетических затрат на процессы, связанные с развитием продуцента антибиотического вещества.
2) Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации. Эффективность стадии во многом определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, местом основного накопления биологически активного вещества (в культуральной жидкости или внутриклеточно).
3) Стадия очистки антибиотика. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного места накопления антибиотического вещества применяются различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используются следующие: экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка.
Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первом этапе работы приходится иметь дело с небольшой концентрацией (не более 1%) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах концентрация антибиотического вещества увеличивается до 20—30%. Все это требует применения различных емкостей и различных объемов используемых реагентов.
4) Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка.
Методы культивирования продуцентов антибиотиков
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается.
Можно указать четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.
1) Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.
2) Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня.
3) Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго — в третий.
Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов происходит более рациональное использование емкостей.
4) Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков.
В основе этого метода лежит то, что развитие микроорганизма происходит в условиях непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. [5]
Ферментеры
Для изучения условий образования антибиотиков и производства этих биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются ферментеры — специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов антибиотиков.
Ферментер — это довольно сложный аппарат, в котором создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза им антибиотика. В этих целях ферментер снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами.
Обеспечение культур микроорганизмов кислородом осуществляется в основном следующими способами: пропусканием воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием; встряхиванием культуральной среды, находящейся в колбах, на специальных качалках; выращиванием микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды. [6]
Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого-биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.
Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.
В современных ферментерах контрольно-измерительная аппаратура соединена с электронно-вычислительной машиной, что позволяет автоматически контролировать весь биосинтетический процесс по заданной программе.
В зависимости от характера проводимых работ используются различного типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные, производственные.
химическая очистка антибиотиков
Основными методами очистки антибиотиков являются следующие.
Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации.
Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда их ионов называют катионитами или анионитами. Антибиотик (как отрицательно заряженный ион) будет сорбироваться на катионитной смоле и наоборот. Адсорбированный на смоле антибиотик десорбируют, в результате чего получают значительно очищенный и концентрированный препарат. Затем раствор этого препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом на смоле осядут примеси, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку.
Метод осаждения. Антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок; последний с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают. Образовавшееся соединение растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают.
Одна из стадий химической очистки антибиотиков — концентрирование полученных растворов; достигается отгонкой большей части растворителя, как правило, в высоком вакууме.
Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение, прежде всего для улучшения качества получаемого антибиотика и увеличения выхода препарата.
Сушка
После выделения и химической очистки антибиотика необходимо удалить из полученного препарата свободную и связанную воду.
Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют методы обезвоживания препаратов.
Лиофильная сушка антибиотиков — широко распространенный прием; проводится при сравнительно низких температурах (—8, —12°С).
Высушивание с применением распылительной сушилки — прогрессивный метод при работе с большими количествами антибиотика; раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков протекает в течение нескольких секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют свойств.
Метод взвешенного слоя или сушка в вакуум-сушильных шкафах применяется для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов.
Применение антибиотиков
Антибиотики широко применяются в различных сферах человеческой деятельности: медицине, пищевой и консервной промышленности, сельском хозяйстве. Открытие антибиотиков вызвало переворот в медицине. Широко известно применение антибиотиков с бактерицидным и бактериостатическим действием; благодаря антибиотикам стали излечимыми многие инфекционные заболевания (чума, туберкулез, пневмония, брюшной тиф, холера). В течение многих лет антибиотики применяют в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных, средств борьбы с болезнями животных и растений. Антибиотические вещества также широко применяют для борьбы с посторонней микрофлорой в ряде бродильных производств и в консервной промышленности. Однако нельзя не отметить, что длительное и неконтролируемое применение антибиотиков приводит к возникновению и широкому распространению в микробных популяциях R-фактора устойчивости к антибиотикам, передающегося от одной бактериальной клетки к другой при помощи плазмид в процессе коньюгации. Средствами борьбы с проявлением лекарственной устойчивости к антибиотикам является обоснованное и строго контролируемое их применение и получение новых, модифицированных антибиотических препаратов, обладающих биологической активностью к резистентным формам.
myunivercity.ru
1.4 Методы культивирования продуцентов антибиотиков
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается.
Можно указать четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.
1) Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.
2) Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня.
3) Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго — в третий.
Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов происходит более рациональное использование емкостей.
4) Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков.
В основе этого метода лежит то, что развитие микроорганизма происходит в условиях непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. [5]
1.5 Ферментеры
Для изучения условий образования антибиотиков и производства этих биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются ферментеры — специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов антибиотиков.
Ферментер — это довольно сложный аппарат, в котором создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза им антибиотика. В этих целях ферментер снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами.
Обеспечение культур микроорганизмов кислородом осуществляется в основном следующими способами: пропусканием воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием; встряхиванием культуральной среды, находящейся в колбах, на специальных качалках; выращиванием микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды. [6]
Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого-биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.
Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.
В современных ферментерах контрольно-измерительная аппаратура соединена с электронно-вычислительной машиной, что позволяет автоматически контролировать весь биосинтетический процесс по заданной программе.
В зависимости от характера проводимых работ используются различного типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные, производственные.
Лабораторные ферментеры изготовляются из стекла или нержавеющей стали и имеют, как правило, емкость не более 30 л. Обычно стерилизацию таких ферментеров производят в автоклавах. Питательную среду, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер.
Полупроизводственные ферментеры имеют емкость 100 л, выполнены из нержавеющей стали.
Производственные ферментеры. В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости — от 500 л до 50 и 100 м3.
Стерилизация полупроизводственных и производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций осуществляется перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется путем фильтрации через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем.
Использование волокнистых фильтров — широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха, причем, чем меньший диаметр имеют волокна материала, тем лучше их фильтрующая способность. [3]
1.6 Развитие продуцента антибиотика в ферментере
Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех его стадий, очень точно выполняется разработанный регламент условий развития организма — продуцента антибиотика. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды, степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляется биологический контроль, учитывается потребление организмом основных питательных компонентов субстрата: источников углерода, азота, фосфора; внимательно следят за образованием антибиотика.
Существенное внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента антибиотика в ферментере. Основная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы.
Для борьбы с пеной в ферментерах при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла, животный жир, а иногда минеральные масла, спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества.
Многие вещества (масла, жиры, спирты), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. [7]
Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения и химической очистки представлена на рисунке 1.
I — приготовление посевного материала, II — инокуляторы для наращивания посевного материала, III — стерилизатор среды для большого ферментера, IV — установка для биосинтеза антибиотика:
с — стерилизация среды в колбах, б — охлаждение и посев культуры продуцента в колбу, в — рост культуры в покое, г — рост культуры в качалке, д — инокулятор со стерильной средой, е— инокулятор со средой, засеянной культурой продуцента, ж — фильтры и компрессор, з — резервуар со сжатым воздухом, и — нагрев воздуха, к — ферментер, л — рубашка для охлаждения ферментера
Рисунок 1. Схема производства антибиотиков. [3]
1.7 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотиков
В процессе развития микроорганизмов образуемые ими антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость выделяется лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток.
У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма.
В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Выделение антибиотика из клеток микроорганизмов осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями. В случае если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют.
Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. Для процесса фильтрации применяют фильтрующие аппараты: фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги, сепараторы. Фильтр-прессы применяются для обработки больших объемов культуральной жидкости.
Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Широкое распространение в получении жидкости, освобожденной от взвешенных частиц, получил способ центрифугирования. Отделение мицелия или других взвешенных частиц можно также производить в сепараторах.
Цель химической очистки — извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответствующего применения.
Антибиотические вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенной температуры, высокой кислотности или щелочности и др.) в ряде случаев теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности.
Основными методами очистки антибиотиков являются следующие.
Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации.
Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда их ионов называют катионитами или анионитами. Антибиотик (как отрицательно заряженный ион) будет сорбироваться на катионитной смоле и наоборот. Адсорбированный на смоле антибиотик десорбируют, в результате чего получают значительно очищенный и концентрированный препарат. Затем раствор этого препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом на смоле осядут примеси, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку.
Метод осаждения. Антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок; последний с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают. Образовавшееся соединение растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают.
turboreferat.ru
Нет такого экспериментального подхода или исследовательского направления в биотехнологии, которые бы не получили применения в медицине. Вот почему столь многообразны связи между биотехнологией и самой гуманной из всех наук. Здесь мы остановимся лишь на основных моментах.
Антибиотики — это специфические продукты жизнедеятельности, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов и к злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их рост или полностью подавляющих развитие (Н. С. Егоров, 1979). Далеко не все из этих соединений, число которых приближается к 5000, допущены для применения в медицине. К важнейшим антибиотикам терапевтического назначения принадлежат следующие их классы (табл. 2).
Приведенные классы антибиотиков не исчерпывают их многообразия, список их пополняется с каждым годом. Причины неослабевающего внимания к поиску новых антибиотиков, как видно из табл. 10, связаны с токсичностью существующих антибиотиков, аллергическими реакциями, вызываемыми ими, нарастанием устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым препаратам и, помимо этого, с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых недостаточно эффективны известные ныне антибиотики. Основные пути поиска включают:
Испытание новых продуцентов. Так, с начала 80-х годов исследуют миксобактерии, продуцирующие большое количество антимикробных агентов (Н. Thierbach, N. Reichenbach, 1981).
Химическая модификация антибиотиков. Противомикроб-ные макролиды токсичны для человека. Например, гептаен амфо-терицин В, используемый по жизненным показаниям при тяжелых микозах, вызывает необратимые поражения почек. Получены метиловые эфиры амфотерицина, менее токсичные и сохраняющие противогрибковую активность. При модификации пенициллинов и цефалоспоринов используют иммобилизованные ферменты.
Таблица 2. Важнейшие классы антибиотиков терапевтического назначения (по И Г.. Егорову, 1979; Д.Ланчини, Ф Паренти, 1985)
| Класс | Типичные антибиотики | Продуценты | На кого действует | Механизм действии | Трудности терапевтического применения |
| -Лактамные | Пенициллины, це-фалоспорины | Грибы родов Реnicillium, Cephalosporum | Грамположитель-ные и грамотрицательные бактерии | Нарушение синтеза клеточной стенки | Аллергические реакции |
| Аминогликозидные | Стрептомицин, гентамицин, канамицин, тобрамицин, амикацин | Актиномицеты рода Streptomyces, бактерии родов Micromonospora. Bacillus | В основном грамотрицательные бактерии | Необратимое подавление синтеза белка | Токсическое действие на слуховой нерв и почки |
| Тетрациклины | Одноименные антибиотики | Актиномицеты рода Streptomyces | Грамположительные и грамотрицательные бактерии, риккетсии, хламидии, простейшие | Обратимое подавление синтеза белка | Распространение устойчивых штаммов |
| Макролиды | Антибактериальные: эритромицин Противогрибковые и антипротозойные: полиены | Актиномицеты рода Streptomyces То же | Грамположительные бактерии Грибы, некоторые простейшие | То же Нарушение плазматической мембраны | Токсичность |
| Полипептидные и депсипептидные | Полимиксины, грамицидины, бацитрацины | Различные микро-организмы | В основном грамотрицательные бактерии | Механизм действия различен | Высокая токсичность |
Мутасинтез. Применяют мутантные штаммы, у которых блокирован синтез отдельных фрагментов молекулы антибиотика. В среду культивирования вносят аналоги этих фрагментов. Микроорганизм использует эти аналоги для биосинтеза, в результате чего получают модифицированный антибиотик.
Клеточная инженерия. Получают гибридные антибиотики, например, с новыми комбинациями агликона и Сахаров.
Генетическая инженерия — введение в геном микроорганизма информации о ферменте, необходимом для модификации продуцируемого антибиотика, например его метилирования при помощи метилаз.
Важной задачей является повышение эффективности биосинтеза известных антибиотиков. Значительных результатов удалось добиться за десятилетия селекции штаммов-продуцентов с применением индуцированного мутагенеза и ступенчатого отбора. Например, продуктивность штаммов Penicillium по синтезу пенициллина увеличена в 300—350 раз. Определенные перспективы открываются в связи с возможностью клонирования генов «узких мест» биосинтеза антибиотика или в случае, если все биосинтетические ферменты кодируются единым опероном.
Многообещающим подходом служит инкапсулирование антибиотиков, в частности их включение в лигюсомы, что позволяет прицельно доставлять препарат только к определенным органам и тканям, повышает его эффективность и снижает побочное действие. Этот подход применим и для других лекарственных препаратов. Например, кала-азар, болезнь, вызываемая лейгшма-нией, поддается лечению препаратами сурьмы. Однако лечебная доза этих препаратов токсична для человека. В составе липосом препараты сурьмы избирательно доставляются к органам, пораженным лейшманией, — селезенке и печени.
Вместо антибиотика в организм человека может вводиться его продуцент, антагонист возбудителя заболевания. Этот подход берет начало с работ И. И.Мечникова о подавлении гнилостной микрофлоры в толстом кишечнике человека посредством молочнокислых бактерий. Важную роль в возникновении кариеса зубов, по-видимому, играет обитающая во рту бактерия Streptococcus mutans, которая выделяет кислоты, разрушающие зубную эмаль и дентин. Получен мутант Strept. mutans, который при введении в ротовую полость почти не образует коррозивных кислот, вытесняет дикий патогенный штамм и выделяет летальный для него белковый продукт.
studfiles.net
Антибиотики вырабатываются микроорганизмами в результате совместного действия продуктов 10 - 30 генов, что усложняет использование генно-инженерных подходов для управления их синтезом. Однако данная проблема разрешима в тех случаях, когда синтез антибиотиков определяется мультиферментными комплексами, кодируемыми одним опероном (например, в случае антибиотиков пептидной природы). Это открывает новые перспективы в биотехническом получении антибиотиков. Внедрение соответствующих генов из одного микроорганизма в клетки другого близкородственного может приводить к получению “гибридного” антибиотика, обладающего новыми свойствами. Этот подход был успешно применен в 1988 г. биохимиком Михаэлем Хопвудом в США. При объединении генов биосинтеза актинородина и медермицина был получен новый антибиотик, получивший название “медерродин”. В другом случае этот же автор создал штамм, продуцирующий “гибридный” антибиотик дигидрогранатиродив. Высокая продуктивность штаммов микроорганизмов иногда достигалась за счет увеличения в клетках количества копий генов биосинтеза антибиотика. Таким образом, удалось, например, существенно увеличить выход актинородина.
Широко применяют антибиотики в медицине, сельском хозяйстве (для лечения, а также для улучшения роста и развития молодняка), в пищевой промышленности (консервирующие средства). В 1987 г. за рубежом стоимость всех антибиотиков, использованных в качестве антибактериальных препаратов, составила 3,5 млрд. долл.; ожидается, что в 1992 г. она достигнет 4,2 млрд. долл.
В борьбе с болезнетворными бактериями вместо антибиотиков иногда используют другую бактерию - антагонист патогенного штамма. Примером может служить дикий патогенный штамм бактерии Streptococcus mutans, разрушающий зубную эмаль и дентин. При введении в ротовую полость мутантного штамма этого же вида выделяется белковый продукт, губительный для дикого штамма. В данном случае бактерии-антагонисты выступают в роли биостерилизаторов. Описаны аналогичные способы защиты сельскохозяйственных растений. В частности, это относится к инфекционному заболеванию рассады томатов, вызываемому почвенными бактериями Fusarium oxysporum. Заболевание связано с действием фузаровой кислоты, продуцируемой этими бактериями. В качестве биостерилизатора в этом случае используют клетки Pseudomonas solanactarum, способные накапливать фузаровую кислоту и этим снижать ее токсичнjt воздействие на томаты.
Природные микроорганизмы, как правило, обладают низкой продуктивностью тех веществ, производство которых необходимо. Для биотехнологии нужны высокопродуктивные штаммы микроорганизмов. Их создают методами селекции - направленного отбора спонтанных или индуцированных (химическими мутагенами или радиацией) мутантов. Получение таких штаммов занимаются иногда многие годы. В результате селекции производительность продуцентов удается увеличить в сотни или тысячи раз. Например, в работе с Penicillium методами селекции выход пенициллина был увеличен в конце концов, примерно в 10 тыс. раз по сравнению с исходным диким штаммом.
Отбору высокопроизводительных штаммов предшествуют тонкие манипуляции селекционера с генетическим материалом исходных штаммов. При этом используют весь спектр естественных способов рекомбинирования генов, известных у бактерий: конъюгацию, трансдукцию, трансформацию и другие генетические процессы. Например, конъюгация (обмен генетическим материалом между бактериями) была успешно использована при создании штамма Pseudomonas putida, способного утилизовать углеводороды нефти. Очень часто прибегают к трансдукции (перенос гена из одной бактерии в другую посредством бактериальных вирусов - бактериофагов) и амплификации (увеличение числа копий нужного гена).
Так, у многих микроорганизмов гены биосинтеза антибиотиков или их регуляторы находятся не в основной хромосоме, а в плазмидах. Путем амплификации удается увеличить число этих плазмид в клетках и существенно повысить производство антибиотиков.
Еще один подход в генетико-селекционной работе - получение генетических рекомбинантов путем слияния разных штаммов бактерий, лишенных стенок (протопластов). Так, слиянием протопластов двух штаммов Streptomyces был сконструирован новый высокоэффективный штамм-продуцент рифампицина С: мутанты Nocardia mediterranei, в которых не синтезировался рифампицин, после слияния сформировали штаммы, продуцирующие три новых рифампицина. Слияние протопластов позволяет объединять генетические материалы и таких микроорганизмов, которые в естественных условиях не скрещиваются.
Антибиотики - самый большой класс фармацевтических препаратов, которые синтезируются микроорганизмами. Некоторые из антибиотиков используют в сельском хозяйстве против различных сельскохозяйственных вредителей (например, полиоксин, баридакицин, косгалицин), другие - в медицинских целях (пенициллины, тетрациклины, цефалоспорин С и др.).
Шесть родов феламентозных грибов производят около 1000 различных антибиотиков. Много антибиотиков синтезируют актиномицеты (один только вид Streptomyces griscus производит более 50 антибиотиков). В практике реально используют небольшое число из известных пауке антибиотиков, производимых микроорганизмами. Это в первую очередь пенициллины и цефалоспорины, продуцируемые грибами родов Penicillum; стрептомицин, гентамицин, канамицин, эритромицин и тетрациклины, синтезируемые актиномицетами рода Streptomyces и бактериями родов Micromonospora и Bacillus, и некоторые другие.
До “эры” генной инженерии ценные для промышленности штаммы-продуценты антибиотиков с повышенной продуктивностью получали в основном с помощью мутагенеза и селекции природных микроорганизмов. Например, в результате селекции и улучшения техники ферментации промышленный выход пенициллина достиг 20 г/л, что в 10 тыс. раз выше уровня, который имелся в исходном штамме Penicillum chrysogenum.
Разработан также метод так называемого мутасинтеза, позволяющий получать модифицированные антибиотики. В этом случае используют мутантные штаммы-продуценты, в которых нарушен синтез определенных участков молекулы антибиотика. Для биосинтеза функционально-активного антибиотика в среду культивирования продуцента вносят аналоги этих участков. В связи с постепенным приобретением патогенными бактериями устойчивости к антибиотикам созданы методы внесения специальных модификаций в структуры антибиотиков, сохраняющие их антибактернальные эффекты. В настоящее время широко распространены полусинтетические антибиотики, например ампициллин, цефалексин, метициллин и др.
Микробиологический синтез различных веществ играет ключевую роль в биотехнологическом производстве. Начало современной промышленной микробиологии было положено в 40-х годах, когда наладили производство пенпциллинов методами ферментации. В настоящее время микроорганизмы продуцируют десятки видов соединений - аминокислот, антибиотиков, белков, витаминов, липидов, нуклеиновых кислот, полисахаридов, пигментов, сахаров, ферментов и т. д.
К многообразному миру микроорганизмов относятся прокариоты (одноклеточные организмы, не содержащие оформленных ядер) - бактерии, актиномицеты, риккетсии и низшие эукариоты (одноклеточные и многоклеточные организмы, имеющие сформированные ядра, в которых хромосомы окружены специальной пористой мембраной (липопротеидной природы), - дрожжи, нитчатые грибы, простейшие и водоросли. Из более 100 тыс. видов известных в природе микроорганизмов в биотехнологических процессах используют всего несколько сотен. Микробиологическая промышленность предъявляет к продуцентам жесткие требования, которые важны для технологии производства: высокая скорость роста, использование для жизнедеятельности дешевых субстратов и устойчивость к заражению посторонней микрофлорой.
beregrusskij.narod.ru
Одна из стадий химической очистки антибиотиков — концентрирование полученных растворов; достигается отгонкой большей части растворителя, как правило, в высоком вакууме.
Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение, прежде всего для улучшения качества получаемого антибиотика и увеличения выхода препарата. [3]
1.8 Сушка, контроль и расфасовка препарата
После выделения и химической очистки антибиотика необходимо удалить из полученного препарата свободную и связанную воду.
Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют методы обезвоживания препаратов.
Лиофильная сушка антибиотиков — широко распространенный прием; проводится при сравнительно низких температурах (—8, —12°С).
Высушивание с применением распылительной сушилки — прогрессивный метод при работе с большими количествами антибиотика; раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков протекает в течение нескольких секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют свойств.
Метод взвешенного слоя или сушка в вакуум-сушильных шкафах применяется для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов.
Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому.
Биологический контроль ставит задачей выяснение стерильности готового препарата. Для этого используют, как правило, два метода.
Первый — связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соответствующую питательную среду.
Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяется тем, что для большинства этих соединений не имеется биологических инактиваторов их биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выявляют наличие устойчивых к ним форм микроорганизмов, а также определяют возможное присутствие чувствительной микрофлоры.
Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и на другие жизненно важные функции организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности. Показатели острой токсичности являются одним из критериев качества антибиотического вещества. Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению.
Расфасовка и упаковка антибиотика — следующий этап работы. Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу. [3]
2. Применение антибиотиков
Антибиотики широко применяются в различных сферах человеческой деятельности: медицине, пищевой и консервной промышленности, сельском хозяйстве. Открытие антибиотиков вызвало переворот в медицине. Широко известно применение антибиотиков с бактерицидным и бактериостатическим действием; благодаря антибиотикам стали излечимыми многие инфекционные заболевания (чума, туберкулез, пневмония, брюшной тиф, холера). В течение многих лет антибиотики применяют в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных, средств борьбы с болезнями животных и растений. Антибиотические вещества также широко применяют для борьбы с посторонней микрофлорой в ряде бродильных производств и в консервной промышленности. Однако нельзя не отметить, что длительное и неконтролируемое применение антибиотиков приводит к возникновению и широкому распространению в микробных популяциях R-фактора устойчивости к антибиотикам, передающегося от одной бактериальной клетки к другой при помощи плазмид в процессе коньюгации. Средствами борьбы с проявлением лекарственной устойчивости к антибиотикам является обоснованное и строго контролируемое их применение и получение новых, модифицированных антибиотических препаратов, обладающих биологической активностью к резистентным формам. [2]
Заключение
В данной работе были рассмотрены основные стадии получения антибиотиков:
стадия биосинтеза антибиотика; стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации; стадия выделения и очистки антибиотика; стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка. А также были рассмотрены все основные методы (культивирования, стерилизации, очистки, выделения), которые могут применяться на данных стадиях.
На сегодняшний день основной задачей является не только усовершенствование уже существующих технологий получения антибиотиков, но и поиск новых, более действенных антибиотиков.
Следует отметить, что ведутся активные работы по развитию исследований по направленному биосинтезу разнообразных антибиотиков; расширяются работы по химическому синтезу производных этих веществ, химической модификации природных антибиотиков.
Список использованной литературы.
turboreferat.ru
