Компетенции обучающегося, формируемые в результате освоения занятия: ОК-7 Способен получать и обрабатывать информацию из различных источников, готов интерпретировать, структурировать и оформлять её в доступном для других виде;

ПК-7 Умеет использовать технические средства для измерения основных параметров технологических процессов, свойств сырья, полуфабрикатов и качество готовой продукции, организовывать и осуществлять технологический процесс производства продукции питания;

ПК-30 Умеет проводить исследования по заданной методике и анализировать результаты экспериментов.

Цель занятия: ознакомить студентов с рецептами и методиками приготовления питательных сред, с методами культивирования микроорганизмов. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды.

Формирование:

Знание: требований, предъявляемых к питательным средам, классификацию питательных сред, методов культивирования микроорганизмов и фаз роста микроорганизмов

Умение: приготовить питательные среды, применять методы культивирования

Владение: техникой посевов микроорганизмов на питательные среды, методами культивирования микроорганизмов

Материалы и оборудование: колбы, воронки, марля, гигроскопическая вата, пробирки с ватными пробками, градуированные пипетки различной емкости, электроплитка, набор полуфабрикатов питательных сред, весы, чашки Петри, пробирки, бактериологические петли, стеклянные шпатели, анаэростат, эксикатор, термостат, стерильные пипетки Пастера, презентации, плакаты.

Содержание и методика работы

Требования, предъявляемые к питательным средам

В среде должны быть все необходимые для роста и развития химические элементы;
Среда должна быть сбалансирована по химическому составу. Это значит, что соотношение химических элементов питательной среды и главным образом соотношение органогенных элементов - С:N должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке;
Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку. Для грибов эта влажность обеспечивается содержанием влаги в субстрате не менее 12 %, для бактерий – не менее 20 %.
Среда должна иметь определенное значение рН среды. Среди микроорганизмов различают ацидофилы (кислотолюбивые микроорганизмы), алкалофилы (щелочелюбивые микроорганизмы) и нейтрофилы (лучше всего растут в нейтральной среде с рН около 7,0). К ацидофилам относятся грибы и дрожжи. Большинство бактерий – нейтрофилы, для которых активная кислотность среды около 4 ед. рН является губительной. Следует помнить, что при стерилизации среды и в процессе культивирования микроорганизмов, кислотность среды может сильно изменяться. Во избежание изменения рН в среду добавляют буферные системы (например: фосфатный буфер), СаСО3 (для нейтрализации образующихся в результате культивирования органических кислот), вещества органической природы, обладающие буферными свойствами (например: аминокислоты, полипептиды, белки) и др.;
Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки.
Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом (rh3), определяющим насыщение ее кислородом. По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначить любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rh3=41, насыщенный водородом rh3=0. Облигатные анаэробы размножаются при rh3 не выше 5, аэробы – не ниже 10.
Среды должны быть стерильными, что обеспечивает рост чистых культур микроорганизмов.

studfiles.net

4 Простые и сложные методы окраски

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание пре-

паратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

При сложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода. На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Этапы дифференцированного окрашивания по Граму:

Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.
Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.
Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.
Препарат быстро промывают водой (как описано выше).
Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).
Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
микроскопируют с иммерсионной системой.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.

Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий.

Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса. В основе метода лежит негативное контрастирование. Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка. По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Вопросы для самоконтроля

1 Перечислите основные морфологические типы клеток микроорганизмов.

2 Охарактеризуйте схематичное строение бактериальной клетки.

3 Перечислите этапы приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, охарактеризуйте их.

5 Классифицируйте используемые в микробиологии красители, охарактеризуйте их.

Практическое занятие 4

Цель: ознакомление с методикой приготовления фиксированных препаратов, простыми и сложными методами окраски; ознакомление с морфологией и цитологией различных микроорганизмов.

Материалы и оборудование: микроскопы биологические, предметные и покровные стекла, спиртовки, бактериальные петли, иммерсионное масло, стерильные пипетки, пинцеты, фильтровальная бумага, спички, палочки ватные гигиенические, маркеры, стерильные чашки Петри, на группу – в 50 мл колбе стерильная водопроводная вода, дистиллированная вода для промывки, промывалки, кюветы, мостики, набор готовых растворов красок в штативе, спирт 960 , пипетки, настои из естественных материалов: мяса, гороха и т.д.

studfiles.net

Окраска микроорганизмов

Окраска микроорганизмов — наиболее распространенный в микробиологии комплекс методов и приемов, применяемый для обнаружения и идентификации микроорганизмов с помощью микроскопа. В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы при микроскопическом исследовании. Окраска микроорганизмов позволяет изучить морфологические особенности микробов, а иногда точно определить их вид, например некоторые микробы — одинаковые по морфологии — различно окрашиваются с помощью одних и тех же сложных методов окраски. Окраска микроорганизмов представляет собой физико-химический процесс соединения химических компонентов клетки с краской. В ряде случаев различные части микробной клетки (ядро, цитоплазма) избирательно окрашиваются различными красителями. Наиболее пригодными для окраски микроорганизмов являются анилиновые краски, главным образом основные и нейтральные, кислые краски менее пригодны.

Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов: 1) приготовление мазка; 2) высушивание мазка; 3) фиксацию мазка; 4) окраску; 5) высушивание.

Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка —1—2 см2.

Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки.

Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира — по Никифорову). После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску сливают и препарат промывают водой.

Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную — фуксин, или синюю — метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1—2 мин.), метиленовый синий — медленнее (3—5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и может долго храниться.

Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.

Наибольшее практическое значение имеет окраска по Граму (см. Грома метод окраски) и окраска по Цилю.

Метод окраски по Цилю является основным для окраски кислотоустойчивых бактерий. Здесь применяются два красителя: карболовый фуксин Циля и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, все некислотоустойчивые формы — в синий.

Метод Бениньетти является одним из способов окраски жгутиков. Протрава и окраска одним из красящих растворов, составляемых ex tempore (по мере надобности): I — сульфат цинка — 1 г, танин — 10 г, дистиллированная вода — 100 мл и II — насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета. Смешивают 5 мл раствора I и 3 мл раствора II, наносят на препарат, нагревают до появления паров, промывают водой, высушивают и рассматривают.

Из других сложных методов применяется так называемый негативный способ Бурри (см. Бурри метод), способ Гинса для выявления капсул (см. Гинса метод) и ряд других. См. также Бактериологическое исследование.

Окраска микроорганизмов — комплекс методов изучения структуры и морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур или исследуемого материала. Окраска микроорганизмов — важный диагностический прием, позволяющий установить морфологические особенности микроба, а также различить морфологически идентичные микроорганизмы, которые по-разному красятся при использовании одних и тех же методов окраски.

Окраска микроорганизмов — сложный физико-химический процесс, механизм которого в деталях еще не изучен. В основе окраски микроорганизмов лежит взаимодействие отдельных структур бактерии с красителем. Следовательно, результат окраски микроорганизмов зависит от химического и физического строения микробов, свойств красителя, способа приготовления препарата и метода обработки им микроба. Для окраски микроорганизмов используют основные, кислые и нейтральные красители. У основных красителей окрашивающим началом служит катион, а анион бесцветен; у кислых, наоборот, красящая часть молекулы является анионом. Образующиеся при диссоциации основных красителей катионы соединяются со структурами бактерий, обладающими кислыми свойствами; освобождающиеся анионы кислых красителей соединяются со структурами микроорганизма, имеющими основные свойства.

В обычных средах бактерии имеют отрицательный поверхностный заряд, в их цитоплазме и ядре имеются соединения кислой природы. Поэтому основные красители, у которых красящая часть молекулы заряжена положительно, обладают большим сродством к бактерии и чаще применяются в микробиологии, чем кислые красители, обычно используемые для контрастной окраски фона препарата. У нейтральных красителей красящими являются и катионы, и анионы (краска Романовского — Гимзы).

Фиксированные бактерии окрашиваются лучше живых, так как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана живой клетки ограничивают проникновение в нее красителя. Для витальной окраски микроорганизмов (окраски живых микроорганизмов) красители применяют в больших разведениях (1:10 000— 1:100 000), чтобы избежать артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя на живые микроорганизмы. Чаще всего для витальной окраски микроорганизмов пользуются метиленовым сипим, нейтральным красным и др. Препараты для микроскопии готовят методом раздавленной капли. (см.) или висячей капли (см.).

Наиболее распространены методы окраски микроорганизмов в фиксированных препаратах. Эти методы подразделяют на простые и сложные. При простых методах применяют один краситель (например, окраску метиленовым синим, фуксином Пфейфера и др.). При сложных методах применяют несколько красителей и исследование включает несколько этапов физической и химической обработки препарата (см. Грама метод окраски, окраска по Цилю — Нельсену — см. Туберкулез; окраска по. Романовскому — Гимзе — см. Кровь и др.). Сложные методы окраски микроорганизмов используют в микробиологической диагностике для изучения строения и функций микроорганизмов. Например, при помощи окраски по Граму дифференцируют грамположительные микробы от грамотрицательных, что имеет большое значение для идентификации гонококков, менингококков, кишечных бактерий и др. Методом Циля — Нельсена; пользуются для диагностики туберкулеза и проказы, методом Ненесера — дифтерии.

В качестве примера использования окраски микроорганизмов для изучения строения и функций микроорганизмов можно указать на применение йода для выявления крахмала, виктории синей — для избирательной окраски клеточной стенки и цитоплазматиической мембраны бактерий, осмиевой кислоты — для окраски жира и т. д. Эти методы основаны на различиях в химическом строении отдельных морфологических структур микроба, избирательно окрашиваемых различными красителями.

Другие методы окраски отдельных структур микроорганизмов основаны на способности этих структур по-разному фиксировать красители, что выявляется при последующей обработке препарата спиртом, кислотой, ацетоном и др. и докрашивании контрастным красителем. Так, для обнаружения спор используют их свойство прочно фиксировать краситель и не обесцвечиваться при последующей обработке кислотой. При окраске бактерий по Граму основными красителями (генциановый фиолетовый и др.) с последующей обработкой йодом в одних микроорганизмах (грамположительные) краситель прочно фиксируется и не удаляется при обработке спиртом или ацетоном; грамотрицательные же бактерии легко обесцвечиваются. Для выявления в бактериях нуклеоида применяют метод Фейльгена. От окраски в собственном смысле следует отличать импрегнацию солями металлов, например импрегнацию солями серебра при окраске спирохет по методу Левадити (см. Сифилис).

Помимо позитивных методов окраски (краситель непосредственно действует на окрашиваемый субстрат), в микробиологии используют и негативные методы — окрашивание фона препарата. Они применяются в случае, когда микробы или их отдельные структуры плохо прокрашиваются. Классическим примером негативной окраски является Бурри метод (см.). В тех случаях, когда необходимо выявить у микроорганизма капсулу и окрасить сам микроб, негативные и позитивные методы комбинируют (см. Гинса метод).

Существует также несколько способов повышения эффективности окраски. Одни из них создают условия для проникновения красителя внутрь окрашиваемого объекта (например, при окраске спор препараты предварительно обрабатывают соляной кислотой). Другие методы, связанные с применением протрав, приводят к увеличению окрашиваемого объекта [например, применение солей таниновой кислоты для окраски жгутиков у бактерий (см. Бениньетти метод), телец Пашена — по методу Морозова и клеточной стенки — по методу Нейзи].

См. также Бактериологическая техника, Бактериологическое исследование.

www.medical-enc.ru

Реферат - Методы приготовления и окрашивания микроскопических препаратов.

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми бактериями в окрашенном и неокрашенном состоянии.

С целью изучения формы и подвижности бактерий микроскопию микроорганизмов можно проводить в живом состоянии без окрашивания. Для этого готовят мазки «раздавленная» и «висячая» капля и наблюдают их с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Приготовление мазка «раздавленная капля».На предметное стекло по центру наносят каплю или жидкой культуры или физ.раствора, в который вносят исследуемую культуру. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают с помощью покровного стекла. Затем на покровное стекло наносим каплю иммерсионного масла и микроскопируем. При фазово-контрастной микроскопии мы будем наблюдать подвижность и форму бактерий темного цвета на светлом фоне. При темнопольной микроскопии – подвижность и форму бактерий светлого цвета на темном фоне.

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют и после этого окрашивают.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой–либо одной краски (или метиленового синего или фуксина). Сложные методы предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения).

Предметные и покровные стекла, употребляемые для приготовления препаратов должны быть чистыми и хорошо обезжиренными (с помощью хозяйственного мыла).

Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле физиологического раствора и размазывают по стеклу. Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют над пламенем спиртовки (горелки), держа стекло мазком вверх, и трижды проводят через пламя спиртовки. Время фиксации не должно превышать 5-6с. Кроме жара, для фиксации используют 96 град. спирт, погружая в него мазок на 15-20мин. После фиксации мазок готов к окрашиванию.

Методика окраски по Граму.Особенностью окраски по Грамму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям. Микробы, входящие в группу грамположительных, например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Это объясняется строением клеточной стенки грамположительных бактерий. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Грамотрицательные бактерии (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний) образуют с генциановым фиололетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином в красный цвет. Клеточная стенка таких бактерий представлена тонким слоем пептидогликана.

1. На фиксированный мазок наносят раствор генцианового фиолетового на 2мин.

2. Затем сливают краситель и, не промывая мазок, наливают раствор Люголя на 1мин.

3. Сливают раствор Люголя и наносят на 30сек 96 град спирт, пока не перестанет отходить краситель.

4. Мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают в течении 2 мин раствором фуксина.

5. После чего сливают краситель, мазок промывают водой и высушивают. Грамположительные бактерии окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а грамотрицательные бактерии – в красный.

Методика окраски по Бурри-Гинсу.Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.

1. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.

2. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и фиксируют над пламенем горелки.

3. Затем промывают дистиллированной водой и красят 5-10 мин фуксином.

4. Затем вновь мазок промывают водой и высушивают. При микроскопии бактерии окрашиваются в красный цвет, фон черный, а капсулы неокрашенные.

Методика окраски по Ожешко.Этот метод служит для выявления у бактерий спор. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба, субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное – спора располагается на конце палочки.

1. На высушенный нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2мин над пламенем горелки до закипания.

2. Остывший препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем спиртовки.

3. Затем на мазок наносят раствор фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров.

4. После того как препарат остынет, обесцвечивают его 5% раствором серной кислоты, промывают водой и докрашивают метиленовым синим в течении 3-5 мин, затем промывают водой и подсушивают. Споры, окрашенные фуксином имеют красный цвет, тело микробной клетки – синий цвет.

Методика окраски по Цилю-Нильсенудля кислотоустойчивых бактерий (возбудители туберкулеза и проказы). Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.

1. Фиксированный над пламенем спиртовки мазок окрашивают в течение 3-5мин фуксином Циля с подогреванием до появления паров.

2. Дают препарату остыть, промывают водой.

3. Обесцвечивают в течение 3-5 с в 5% растворе серной кислоты.

4. Препарат промывают водой.

5. окрашивают метиленовым синим в течение 3-5 мин.

6. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов по методу Циля-Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново- красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).

Тесты по теме:

1. Метод окрашивания для выявления капсул:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

2. Метод окрашивания для выявления спор:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

3. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются по методу:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

4. Дифференциально-диагностическая окраска бактерий:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

5. Перечислить грамположительные бактерии:

а) стафилококки, клостридии

б) кишечная палочка, сальмонелла

в) стрептококки, гонококки

6. Перечислить грамотрицательные бактерии:

а) менингококки, гонококки

б) кишечная палочка, стафилококки

в) стрептококки, сальмонеллы

7. Перечислить спорообразующие бактерии:

а) сибирская язва, клостридии

б) пневмококки, стрептококки

в) клебсиелла, стафилококки

8. Перечислить капсулообразующие бактерии:

а) пневмококки, клебсиелла

б) сибирская язва, стрептококки

в) шигеллы, сальмонеллы

www.ronl.ru

методы окраски

Методы окраски мазков

Простой метод. Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Сложные методы. Включают последовательное нанесение на препарат красителей, различающихся по химическому

составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по методу Грама.

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снимают, а краситель сливают..

2. Наносят раствор Люголя на 1—2 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1—2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный.

Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комплекс протеин — рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8 :1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1:1. Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при рН 2,0—3,0, у грамотрицательных — около 5,0. После обработки раствором йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

Окраска по Граму имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и др., к грамотрицательным—гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут окрашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Граму,состоит в переобесцвечивании или недообесцвечивании мазка спиртом. В первом случае грамположительные бактерии могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамот-рицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательные бактерии могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания (см. п. 3 описания окраски по Граму).

■Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля— Нельсена.

1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3—5 мин.

2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.

3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1—2 мин для обесцвечивания.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3—5 мин.

6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества ли-пидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые окрашиваются при этом в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный цвет.

Окраска спор по методу Ожешки.

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2—3 мин.

2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают препарат по Цилю — Нельсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий.

Окраска зерен волютина по методу Нейссера.

1. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2—3 мин. 2. Наносят раствор Люголя на 10—30 с.

3. Промывают препарат водой.

4. Мазок докрашивают водным раствором везувина или хризоидина в течение 54—1 мин.

5. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие

в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет.

Обнаружение капсул по методу Бурри—Гинса.

1. Готовят препарат по Бурри: смешивают каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем готовят мазок так же, как мазки из крови; затем его высушивают и фиксируют.

2. На мазок наносят водный раствор фуксина на 1—2 мин.

3. Промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно-розовом фоне.

studfiles.net

Сложные методы окраски клеточных структур бактерий

Количество просмотров публикации Сложные методы окраски клеточных структур бактерий - 829

Структура бактерий	Метод окраски	Вид препарата
Споры	по Ожешко	споры – красные, вегетативные клетки – синие
Капсула	по Бурри-Гинсу	бесцветная капсула вокруг красного микроба, фон окрашивается в цвет туши
Клеточная стенка	у некислотоустойчивых – по Граму	грам+ – фиолетовые, грам- – красные
у кислотоустойчивых (микобактерий) – по Цилю-Нильсену	кислотоустойчивые – красные, некислотоустойчивые – синие
Жгутики	по Морозову	клетки – тёмно-коричневые, жгутики – светло-жёлтые
Нуклеоид	по Романовскому-Гимзе	нуклеоид – фиолетовый, цитоплазма – бледно-розовая
Включения	по Нейссеру	палочки – желтые, зерна волютина – синие

Сложный метод окраски по Романовскому-Гимза используют для окрашивания простейших, спирохет, ядерных элементов.

Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (5 мин) или в смеси Никифорова (15 мин), погружают в рабочий раствор (разведение 1:4) краски Романовского-Гимза (состоит из азура, эозина и метиленовой синьки) на 5-7 мин, промывают дистиллированной водой и высушивают. Каждая новая партия красителя требует отработки своего режима окраски, даже если они применяются для одного и того же биоматериала. Краситель можно использовать неоднократно, соблюдая условия хранения.

При окраске по Романовскому-Гимза цитоплазма простейших голубая, ядра красные. Боррелии сине-фиолетовые, трепонемы и лептоспиры слабо-розовые.

Правильно окрашенный по Романовскому-Гимза мазок крови имеет светло-розовую окраску; эритроциты розовые; ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с хорошо видимой структурой хроматина, хорошо выделяются ядрышки; цитоплазма нейтрофилов светло-розовая; базофильная зернистость синяя, эозинофильная - красная, нейтрофильная – сиреневая, зернистость моноцитов - нежная азурофильная.

3 этап БСМИ. Микроскопияс оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов. Микроскоп (греч. skopeo – смотрю) – оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов, не видимых невооружённым глазом. Различают световую (светлопольную, иммерсионную, темнопольную, фазово-контрастную, люминесцентную) и электронную микроскопию.

Светлопольная микроскопия – основной метод исследования клеток и тканей, в котором для освещения объекта используют лучи видимого спектра.

Рис.1. Устройство светового микроскопа

Световой микроскоп (рис. 1) имеет механическую систему и оптическую систему (объектив, окуляр, осветительное устройство). Объективы по способу использования и степени увеличения делятся на сухие - между объективом и рассматриваемым предметом находится воздух и иммерсионные(лат. immersio – погружение) – между объективом и рассматриваемым предметом находится жидкость.

Светлопольная микроскопия предназначена для изучения окрашенных препаратов. Изображение создается за счёт различий в степени поглощения света разными участками исследуемого окрашенного объекта (рис. 2). При прохождении пучка света через окрашенный препарат происходит изменение интенсивности света͵ т. е. меняется амплитуда световой волны. Такие амплитудные изменения легко улавливаются человеческим глазом.

Возможно применение светлопольной микроскопии и при наблюдении неокрашенных нативных препаратов, но лишь в том случае, в случае если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Рис. 2. Схема светового микроскопа для наблюдения в светлом поле зрения

При использовании сухого объектива с большим фокусными расстоянием световые лучи, идущие от зеркала через конденсор в объектив, проходят через неоднородные среды, различающиеся показателями преломления. Часть лучей отклоняется и не попадает в объектив. В результате поле зрения освещено недостаточно. Обычная световая микроскопия с сухим объективом, имеющим слабое увеличение, в микробиологии используется редко – для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 мкм).

Чтобы увеличить разрешающую способность микроскопа и исследовать более мелкие микроорганизмы, используют иммерсионную микроскопию. Иммерсионный объектив с фокусным расстоянием 1,5–3 мм (маркирован ʼʼОИʼʼ (ʼʼИОʼʼ) или ʼʼМИʼʼ (ʼʼИМʼʼ), имеет кольцевую чёрную или белую черту) погружают в каплю масла (кедрового, персикового, при их отсутствии – вазелинового), показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла.

Иммерсионное масло устраняет потери попадающих в объектив лучей

света вследствие своего одинакового со стеклом коэффициента преломления (рис. 3). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив; разрешающая способность микроскопа увеличивается.

Иногда вторую каплю иммерсионной жидкости помещают на верхнюю линзу конденсора. В редких случаях используют водную иммерсию, в данном случае устанавливают объектив ʼʼВИʼʼ.

Рис. 3. Схема хода лучей в сухой и иммерсионной системах

Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Сухие объективы могут иметь увеличение 8, 10, 20, 40, иммерсионные – 90, 100. Окуляры могут иметь увеличение 7, 10, 12, 15. Обычный световой микроскоп даёт увеличение в 100–400 раз, иммерсионный – в 1000 раз.

Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности – минимального расстояния между двумя точками, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ ещё можно различить. Невооружённый человеческий глаз имеет разрешающую способность около 100 мкм. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. В световых микроскопах с иммерсионной системой при использовании видимой части дневного света можно рассмотреть объекты около 0,2 мкм. Размеры микроорганизмов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм (чаще 0,5–10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе.

Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают контрастность изображения – различие яркостей изображения и фона. В случае если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить.

Другие методы световой микроскопиивыбираются исходя из характера и свойств изучаемых объектов.

Темнопольная микроскопия (ТПМ) – микроскопия с боковым освещением (ультрамикроскопия), позволяет обнаружить частицы размером в несколько миллимикронов, которые не видны в светлопольном микроскопе.

Принцип ТПМ.Микроскопия в тёмном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля).

Эффект тёмного поля создаётся с помощью специального темнопольного конденсора, имеющего боковую зеркальную поверхность или обычного конденсора, между линзами которого вкладывают кружок чёрной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При выходе из темнопольного конденсора основная часть лучей света не попадает в объектив. Изображение в микроскопе формируется при помощи небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата и прошедшими через объектив (рис. 4).

Рис. 4. Ход лучей в темнопольном микроскопе

При микроскопии препарата в тёмном поле зрения на верхнюю линзу конденсора наносят каплю масла, помещают препарат с предметным стеклом, на ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ наносят каплю масла. Наносить масло на обе поверхности крайне важно , чтобы при иммерсионной микроскопии проходящие лучи света не преломлялись. Можно использовать и сухую систему (объектив х40) и помещать каплю масла только на верхнюю линзу конденсора. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света͵ применяется только плоское зеркало. Вместо масла можно использовать дистиллированную воду.

В темнопольном микроскопе в нативных препаратах изучают живых неокрашенных микроорганизмов, напр., спирохет (рис. 5).

Прямые лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя. В объектив попадают лучи, отражённые исследуемым объектом. Неосвещённое поле зрения остаётся совершенно тёмным, а микроорганизмы, отражающие лучи света͵ выглядят ярко светящимися.

Рис. 5. Treponema pallidum в темнопольном микроскопе

Фазовоконтрастная (ФКМ) микроскопия позволяет исследовать нативные препараты: бесцветные, прозрачные объекты, детали строения которых оптически мало различаются (живые клетки, срезы тканей, микоплазмы).

При ФКМ используют дополнительное фазово-контрастное устройство, состоящее из фазового объектива и фазового конденсора.

Фазовый объектив внутри имеет фазовую пластинку с нанесенным кольцом, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца составляет 1/2–2/3 от диаметра выходного зрачка объектива, светопропускание кольца – 10–30% исходя из типа фазового контраста.

Фазовый конденсор имеет кольцевую диафрагму с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца подбирается так, чтобы он соответствовал (или был чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.

Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Принцип ФКМ. Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света͵ наступающие при прохождении через окрашенные препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Распространение же световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения света через объект по сравнению со скоростью его распространения в окружающей среде. Эти изменения называются фазовыми, так как при этом изменяется фаза колебаний прошедшего света. Фазовые колебания света глаз не воспринимает, а наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Пучок света͵ проходя через кольцевую щель диафрагмы и объект, попадает в кольцо фазовой пластинки объектива. Лучи света отклоняются от фазовой пластинки (рис. 6). В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны.

Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, при использовании фазово-контрастного устройства невидимые фазовые изменения преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения интенсивности (яркости) света͵ которые различимы глазом.

Рис. 6. Ход лучей в фазово-контрастном микроскопе

Получаемое изображение принято называть фазово-контрастным.

Учитывая зависимость отспособа получения фазовых колец различают 2 типа фазового контраста:

а) позитивный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит ʼʼопережениеʼʼ в прямо прошедший свет.

При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне (рис. 7). Лучшие результаты наблюдаются при позитивном фазовом контрасте.

Рис. 7. Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus (позитивный фазовый контраст)

б) негативный (аноптральный) фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки из копоти или меди, поглощающей не менее 10% света. Это вносит ʼʼзапаздываниеʼʼ в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона. Аноптральная микроскопия позволяет достичь большей чёткости изображения малоконтрастных живых микроорганизмов.

ФКМпозволяет получить изображения малых прозрачных и бесцветных живых объектов (микроорганизмов, клеток).

Крупные прозрачные объекты рассеивают лучи света на небольшие углы, эти лучи проходят вместе с не отклонёнными через фазовое кольцо. Для крупных объектов фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Люминесцентная микроскопия.Еепринцип основан на использовании явления люминесценции (флюоресценции, холодного свечения) – способности некоторых веществ флюоресцировать, т. е. на доли секунд поглощать падающие на них УФ или коротковолновые (сине-фиолетовые) лучи, а затем снова испускать свет. Испускаемый свет имеет длину волны, превышающую длину волны поглощаемого света на 20–50 нм, т. е. смещен по длине волны в сторону длинноволновой области спектра. Так, к примеру, в случае если поглощается синий свет, то испускается зеленый свет. Зеленый свет преобразуется в желтый, желтый – в красно-оранжевый, а невидимое УФ- излучение – в видимый свет. Такое явление носит название ʼʼэффект Стоксаʼʼ.

Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами (акридиновым оранжевым – используют для обнаружения гонококков, аурамином – микобактерий, корифосфином – коринебактерий, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом) – для метки антител).

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета͵ и систему фильтров (рис. 8).

Рис. 8. Схематическое изображение люминесцентного микроскопа

Галогенные лампы непригодны в качестве источника света для люминесцентных исследований, так как металлическая нить накаливания преобразует большую часть потребленной электроэнергии в красный или невидимый инфракрасный свет. При этом лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, непригодный для наблюдения слабосветящихся объектов.

Для работы в свете люминесценции необходим источник света с линейчатым спектром, интенсивным в коротковолновой части. Таким спектром излучения обладают ртутные лампы, работающие по принципу газового разряда. Лампы имеют специфичное светящееся тело. В кварцевую колбу вплавлены два электрода. В зоне горения содержится небольшое количество ртути. За счёт разрядов определенной мощности высокого напряжения между электродами возникает электрическая световая дуга, которая поддерживается в ʼʼгорящемʼʼ состоянии.

Ртутная лампа излучает интенсивный свет, содержащий значительную долю УФ-излучения, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ крайне важно для наблюдения в свете люминесценции.

В оптическую схему люминесцентного микроскопа вводят два светофильтра. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине-фиолетовый светофильтр. Размещено на реф.рфОн пропускает от источника-осветителя только сине-зелёный свет, возбуждающий люминесценцию. Вещества-флюорохромы поглощают падающие на них коротковолновые лучи, переходят в возбуждённое состояние и приобретают иной цвет. Обратный переход в нормальное состояние происходит с испусканием света с большей длиной волны. Сине-зелёный свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата͵ в связи с этим по пути к глазу наблюдателя отсекается жёлтым светофильтром.

Люминесцирующие объекты светятся ярким светом в тёмном поле зрения (рис. 9, 10). Сила их света чаще невелика, в связи с этим люминесцентную микроскопию проводят в затемнённом помещении.

Рис. 9. Micobacterium tuberculosis (желтые) в люминесцентном микроскопе

Рис. 10. Escherichia coli (синие – живые, красные – погибшие) в люминесцентном микроскопе

Преимущества люминесцентной микроскопии:

· цветное светящееся изображение микроорганизмов на чёрном фоне;

· обнаружение и установление локализации и концентрации живых и погибших микроорганизмов;

· возможность обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности изображения;

· при использовании коротких УФ лучей разрешающая способность люминесцентного микроскопа увеличивается до 0,1мкм;

· экспресс-идентификация антигенов микроорганизмов в РИФ;

· возможность исследования прозрачных и непрозрачных объектов;

· возможность исследования жизненных процессов в динамике;

· использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях, так как флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта.

Возможности оптических микроскопов ограничены чересчур большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа и бывают обнаружены только при электронной микроскопии.

Электронная микроскопия (ЭМ) предполагает использование электронного микроскопа (рис. 11), в котором для освещения объектов вместо светового пучка используются электронные лучи (поток электронов).

Целые клетки из-за своей большой толщины непрозрачны для пучка электронов. По этой причине ЭМ требует специальной подготовки объектов исследования. Материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы толщиной 30–50 нм.

Биологические объекты состоят из веществ, построенных из лёгких элементов (С, N, О, Н, Р, S), в связи с этим их изображение в электронном микроскопе слабо контрастно и в клетках можно увидеть очень мало структурных деталей. Чтобы сделать изображение более контрастным, клетки обрабатывают электронными красителями – солями тяжёлых металлов (свинца, ртути, хрома, урана, вольфрама). Так как атомы тяжёлых металлов очень сильно рассеивают электроны, то структуры клетки, поглотившие эти металлы, будут выглядеть тёмными и контрастными. В качестве индикаторов для окислительно-восстановительных ферментов в ЭМ используют теллурит калия или соли тетразолия. Эти соединения, проникая в клетки, акцептируют электроны, которые они получают от дегидрогеназ. В результате реакции эти соединения восстанавливаются и выпадают в осадок, имеющий вид электронно-плотных (тёмных на экране микроскопа) зёрнышек, глыбок, слоёв.

Таблица 3

referatwork.ru

Сравнительное изучение различных методов окраски спор бактерий, Микробиология

Курсовая работа по предмету: Микробиология (Пример)

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1.1.Споры и их функция в жизненном цикле микроорганизмов

1.2. Эндоспоры

1.3.Экзоспоры

2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1.Изготовление мазка

2.2.Окраска эндоспор

2.2.1.Окрашивание эндоспор по методу Вайсера—Хьюппе

2.2.2.Окрашивание эндоспор по методу Меллера

2.2.3. Окрашивание эндоспор малахитовым зеленым по методу Шеффера-Фултона

2.2.4.Окрашивание эндоспор по методу Ожешки (Ауески)

2.2.5. Окрашивание эндоспор по методу Битгера

2.3.Окраска экзоспор по Шеффер-Фултону

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Содержание

Выдержка из текста

После этого из культуры взяли каплю материала. Петлю вынесли из пробирки, пробирку закрыли в пламени спиртовки и поместили в штатив.

Взятый из культуры материал нанесли на обезжиренное предметное стекло и распределили по нему. Обезжиривание стекла производили непосредственно перед работой. Для этого участок стекла, на который впоследствии был нанесён препарат, обработали мылом и протерли марлей. Для полного обезжиривания можно так же прожигать стёкла в пламени горелки. После нанесения препарата на стекло оставшиеся на микробиологической петле организмы были уничтожены. Это было произведено путём однократной стерилизации петли в пламени спиртовки.

2.2.Окраска эндоспор

2.2.1.Окрашивание эндоспор по методу Вайсера—Хьюппе

Необходимое оборудование и реактивы:

Раствор карболового фуксина

Для приготовления 1 г основного фуксина растворить в 2 мл глицерина и долить до

10. мл 5% раствором фенола.

Так же можно применить следующую пропись: в

5. мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до

50. мл.

2,5% раствор серной кислоты

96° раствор этилового спирта

Раствор метиленового синего

Вода

Термостат

3. °С

Ход работы:

Был приготовлен мазок препарата, как описано выше.

На мазок было нанесено несколько капель раствора карболового фуксина (можно использовать фуксин на анилиновой воде), окрашивание проводилось в термостате при

3. °С в закрытой посуде в течение нескольких часов.

Препарат обесцвечивали 2,5% раствором серной кислоты в течение 3 — 5 с и сполоснули 96% спиртом, до тех пор, пока в раствор не перестали переходить облачка красителя.

Препарат был докрашен метиленовым синим в течение 3 — 5 мин.

После докрашивания препарат ополоснули в проточной воде и высушили на воздухе. Микроскопию проводили при масляной иммерсии.

Возможна модификация процесса на стадии окрашивания фуксином, позволяющая ускорить процесс приготовления препарата. В этом случае окрашивание производится только карболовым фуксином. Мазок, покрытый красителем, следует подогревать на огне до появления паров в течение 5 — 8 мин. При использовании данного подхода обесцвечивание проводится 10 — 20 секунд в 2,5% серной кислоте.

Результат окрашивания:

Эндоспоры окрасились в красный цвет, бактерии — в синий.

2.2.2.Окрашивание эндоспор по методу Меллера

Необходимое оборудование и реактивы:

Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста

5% водный раствор хромовой кислоты

Раствор карболового фуксина

5% раствор серной кислоты

Раствор метиленового синего

Вода

Газовая горелка

Ход работы:

Зафиксированные мазки были помещены на 2 минуты в хлороформ.

Обработанные таким образом мазки были перенесены в 5% водный раствор хромовой кислоты на 2 —

1. минуты.

Препарат был промыт в проточной воде и окрасить карболовым фуксином. Для этого на стекло нанесли несколько капель красителя. Окрашивание проводили в течение 1 минуты (стекло при этом подогревали на горелке до появления паров).

Препарат был обесцвечен в 5% растворе серной кислоте в течение 5 с.

Препарат тщательно промыли в проточной воде и подкрасили водным раствором метиленового синего в течение 3 минут.

Препарат промыли в проточной воде ещё раз и высушли на воздухе

Микроскопию препарата проводили при масляной иммерсии.

Результат окрашивания:

Эндоспоры приобрели красный цвет, вегетативные клетки бактерий окрасились в синий.

2.2.3. Окрашивание эндоспор малахитовым зеленым по методу Шеффера-Фултона

Необходимое оборудование и реактивы:

Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста

1% водный раствор сафранина

5% раствор малахитового зелёного

Вода

Спиртовка

Ход работы:

Мазки культуры были зафиксированы над огнем.

Препарат был окрашен 5% водным раствором малахитового зеленого в течение 5—

1. мин.

Препарат промывали в проточной воде.

Было произведено докрашивание препарата 1% водным раствором сафранина в течение 30 с.

Стекло промыли водой, и высушили на воздухе

Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.

Результат окрашивания:

Эндоспоры окрасились в зелёный цвет, клетки бактерий — в красный (препарат окрашенный по этой методике представлен на рис 3).

Рисунок 3. Bacillus subtillus, окраска по Шефферу-Фултону

2.2.4.Окрашивание эндоспор по методу Ожешки (Ауески)

Необходимое оборудование и реактивы:

Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста

0,5% раствор соляной кислоты

Фильтровальная бумага

Раствор карболового фуксина

1% солянокислый спирт

Метиленовым синий Лефлера

Вода

Спиртовка

Ход работы:

Для работы был приготовлен мазок культуры. Для дальнейшей работы использовался нефиксированный мазок.

На мазок налили 0,5% раствор соляной кислоты и подогрели стекло над огнем 1 — 2 минуты. Затем слили с препарата кислоту и тщательно промыть проточной водой, высушить на воздухе.

После высыхания мазок был зафиксирован в пламени. Фиксированный препарат окрашивали по методу Циля — Нильсена, описанному ниже.

Этот метод применяется для окраски кислотоустойчивых бактерий, в том числе микобактерий туберкулёза.

Налили на фиксированный мазок карболового фуксина (окрашивание производилось через фильтровальную бумагу) и подогрели стекло над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживали в течение 1— 2 минут, не доводя до кипения.

Слили краску со стекла, удалили фильтровальную бумагу и тщательно промыли препарат в водопроводной воде.

Обесцветили препарат 1% солянокислым спиртом (раствором соляной кислоты в 70° спирте) до тех пор, пока мазок не принял бледно-розовый тон (примерно 30— 60 секунд).

Препарат промывали в воде 15−30 секунд.

Докрашивание препарата производили метиленовым синим Лефлера 15−30 секунд. Затем мазки ополоснули 70° спиртом.

Сполоснули препарат в воде и высушили фильтровальной бумагой.

Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.

Результат окрашивания:

Вегетативные клетки бактерий приобрели красную окраску, эндоспоры — синюю.

2.2.5. Окрашивание эндоспор по методу Битгера

Необходимое оборудование и реактивы:

1. Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста

2. 10% формалин

3. Аммиачный метиленовый синий

4. 0,5% раствор сафранина

5. Вода

6. Спиртовка

Ход работы:

Нефиксированный мазок обработали 10% формалином в течение

1. мин.

2. Мазок был промыт в проточной водой и высушен на воздухе.

Препарат был окрашен аммиачным метиленовым синим в течение 3 минут (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего + 3 мл 98% раствора аммиака +

8. мл дистиллированной воды), при этом стекло нагревали над огнем до закипания красителя.

Промыли мазок проточной водой.

Докрашивание проводили 0,5% раствором сафранина 3— 5 минут, затем промыли водой, высушили на воздухе

Препарат изучали под микроскопом при масляной иммерсии.

Результат окрашивания:

Вегетативные клетки бактерий приобрели красную окраску, эндоспоры — синюю.

2.3.Окраска экзоспор по Шеффер-Фултону

Необходимое оборудование и реактивы:

1. Мазок культуры актиномицетов в стационарной фазе роста

1% водный раствор сафранина

5% раствор малахитового зелёного

Вода

Спиртовка

Ход работы:

Мазки культуры были зафиксированы над огнем.

Препарат окрашивали 5% водным раствором малахитового зеленого в течение 5—

1. мин.

Промывали препарат в проточной воде.

Докрашивание препарата проводили 1% водным раствором сафранина в течение 30 с.

Промывали водой, и высушивали на воздухе

Препарат был изучен под микроскопом с использованием масляной иммерсии.

Результат окрашивания:

Экзоспоры окрасились в зелёный цвет, вегетативные клетки бактерий — в красный.

Выводы

Существует ряд методов, позволяющих подтвердить наличие спор в исследуемом материале путём окрашивания и последующей световой микроскопии.

Для окрашивания эндоспор применяются следующие методы: метод Вайсера — Хьюппе, метод Меллера, метод Шеффера — Фултона, метод Ожешки и метод Битгера.

Метод окраски по Шеффер-Фултону подходит как для выявления эндоспор, так и экзоспор.

Для визуализации спор могут быть использованы разные красители.

Основная проблема при окрашивании спор бактерий заключается в создании условий для связывания их со спорой, что обусловлено присущей ей высокой кислотоустойчивостью.

Процесс окрашивания спор бактерий является более сложным и многоэтапным процессом по сравнению с окраской вегетативных клеток.

Список литературы

Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. — 2001. — 736 с.

Верещагин Н.Н., Смирнова О.А., Плотникова О.А., Коваленко Е.В.// Мат-лы IX съезда Всероссийского научно-практич. общества эпиде-миологов, микробиологов и паразитологов. Москва. — 2007. — Т.3.- С. 93.

Ветеринарная и медицинская паразитология: Энциклопедический справочник. Ятусевич А.И., Рачковская И.В., Каплич В.М. М.: Колос. — 2001. — 538 с.

Ветеринарное законодательство. Т. 2, 3,

4. Под ред. А.Д. Третьякова. М.: Колос. — 1972

Гусев М.В., Микробиология: учебник/ Гусев М.В., Минеева Л.А. — 3-е издание. -М: Академия. — 2007. — 464 с.

Кадымов Р.А., Мамедов И.Б., Джульфаев С.А. Частная эпизоотология. Баку: Изд-во Бакин. гос. ун-та. — 1990. — 499 с.

Колычев Н.М., Ветеринарная микробиология и иммунология.: учебник для ВУЗов/ Колычев Н.М., Госманов Р.Г. — М.: Колосс.- 2006. — 432 с.

Кузьмин В.А., Святковский А.В., ред. Эпизоотология с микробиологией. М.: Академия. — 2005. — 429 с.

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004.- 691 с.

Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е.Н. Кондратьева, пер .с нем. Л.В. Алексеевой. — М: Мир. — 1987. — 566 с.

Определитель бактерий Берджи/ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кинга, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса, пер. с англ. под ред. Г. А. Заварзина. — М: Мир. — 1997 — в 2.т.

Справочник ветеринарного врача. Под ред. В.Г. Гавриша и И.И.Калюжного. — Ростов- на- Дону: Феникс. — 1999 — 608с.

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004.- с. 425

Гусев М.В., Микробиология: учебник/ Гусев М.В., Минеева Л.А. — 3-е издание. -М: Академия. — 2007. — с. 137

Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е.Н. Кондратьева, пер .с нем. Л.В. Алексеевой. — М: Мир. — 1987. — с. 204

Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. — 2001. — с. 422

Кузьмин В.А., Святковский А.В., ред. Эпизоотология с микробиологией. М.: Академия. — 2005. — с. 232

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004.- с. 424

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004.- с. 428

Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е.Н. Кондратьева, пер .с нем. Л.В. Алексеевой. — М: Мир. — 1987. — с. 312

Кадымов Р.А., Мамедов И.Б., Джульфаев С.А. Частная эпизоотология. Баку: Изд-во Бакин. гос. ун-та. — 1990. — с. 314

Определитель бактерий Берджи/ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кинга, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса, пер. с англ. под ред. Г. А. Заварзина. — М: Мир. — 1997 — т.1. — с. 267

Ветеринарная и медицинская паразитология: Энциклопедический справочник. Ятусевич А.И., Рачковская И.В., Каплич В.М. М.: Колос. — 2001. — с. 346

Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. — 2001. — с. 437

Колычев Н.М., Ветеринарная микробиология и иммунология.: учебник для ВУЗов/ Колычев Н.М., Госманов Р.Г. — М.: Колосс.- 2006. — с. 254

Ветеринарное законодательство. Под ред. А.Д. Третьякова. М.: Колос. — 1972. — т.2. — с. 412

Список источников информации

1.Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. — 2001. — 736 с.

2.Верещагин Н.Н., Смирнова О.А., Плотникова О.А., Коваленко Е.В.// Мат-лы IX съезда Всероссийского научно-практич. общества эпиде-миологов, микробиологов и паразитологов. Москва. — 2007. — Т.3.- С. 93.

3.Ветеринарная и медицинская паразитология: Энциклопедический справочник. Ятусевич А.И., Рачковская И.В., Каплич В.М. М.: Колос. — 2001. — 538 с.

4.Ветеринарное законодательство. Т. 2, 3,

4. Под ред. А.Д. Третьякова. М.: Колос. — 1972

5.Гусев М.В., Микробиология: учебник/ Гусев М.В., Минеева Л.А. — 3-е издание. -М: Академия. — 2007. — 464 с.

6.Кадымов Р.А., Мамедов И.Б., Джульфаев С.А. Частная эпизоотология. Баку: Изд-во Бакин. гос. ун-та. — 1990. — 499 с.

7.Колычев Н.М., Ветеринарная микробиология и иммунология.: учебник для ВУЗов/ Колычев Н.М., Госманов Р.Г. — М.: Колосс.- 2006. — 432 с.

8.Кузьмин В.А., Святковский А.В., ред. Эпизоотология с микробиологией. М.: Академия. — 2005. — 429 с.

9.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004.- 691 с.

10.Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е.Н. Кондратьева, пер .с нем. Л.В. Алексеевой. — М: Мир. — 1987. — 566 с.

11.Определитель бактерий Берджи/ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кинга, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса, пер. с англ. под ред. Г. А. Заварзина. — М: Мир. — 1997 — в 2.т.

12.Справочник ветеринарного врача. Под ред. В.Г. Гавриша и И.И.Калюжного. — Ростов- на- Дону: Феникс. — 1999 — 608с.

список литературы

referatbooks.ru

Смотрите также

..:::Новинки:::..

Windows Commander 5.11 Свежая версия.

Новая версия
IrfanView 3.75 (рус)

Обновление текстового редактора TextEd, уже 1.75a

System mechanic 3.7f
Новая версия

Обновление плагинов для WC, смотрим :-)

Весь Winamp
Посетите новый сайт.

WinRaR 3.00
Релиз уже здесь

PowerDesk 4.0 free
Просто - напросто сильный upgrade проводника.

..:::Счетчики:::..