Рмпрегнационные методы обработки содержимого непроходимой части корневого канала
Чтобы повысить эффективность и надежность импрегнационных методов, было предложено сочетать метод серебрения и резорцин-формалиновый метод. При этом сначала проводится метод серебрения...
Рридодиагностика
· метод иридодиагностики абсолютно безболезненный и безвредный, в отличие от многих широко применяемых методик обследования, не имеет никаких противопоказаний для применения (со стороны общего состояния)...
Рспользование диагностических методов стабилографии РІ процессе определения моторных функций Сѓ детей СЃ ФФН
2.1 Организация Рё методы экспериментального исследования РїРѕ диагностике моторных функции Сѓ детей СЃ ФФН Рсследовательская работа проводилась РЅР° базе РњРћРЈ РЎРћРЁ в„–67 Рі. Ростова-РЅР°-Дону...
Рсследование лекарственного растительного сырья методом бумажной хроматографии
Метод заключается в разделении на хроматографической бумаге смеси веществ в потоке растворителя, основанном на различной скорости перемещения компонентов смеси...
Методы ПЦРв диагностике онкологических заболеваний
Результатом открытия ПЦРстало почти немедленное практическое применение метода. Перспективы практического использования ПЦР-диагностики...
Молекулярно-генетические методы в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза
Высокая специфичность Высокая специфичность метода ПЦРобусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК...
Молекулярно-генетические методы в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза
Заболеваний органов дыхания существует огромное количество, но мы разберем лишь часть из них, как показательный пример роли метода ПЦРв их дифференциальной диагностике с туберкулезом легких...
Молекулярно-генетические методы исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза
молекулярный генетический туберкулез заболевание Заболеваний органов дыхания существует огромное количество, но мы разберем лишь часть из них, как показательный пример роли метода ПЦРв их дифференциальной диагностике с туберкулезом легких...
Молекулярно-генетические методы исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза
Заболеваний органов дыхания существует огромное количество, но мы разберем лишь часть из них, как показательный пример роли метода ПЦРв их дифференциальной диагностике с туберкулезом легких (см. табл. 1)...
Принципы и методы диагностики инфекционных заболеваний
При постановке диагноза инфекционной болезни, как и при диагностике любых других заболеваний, основываются на жалобах больного, анамнезе болезни, эпидемиологическом анамнезе, результатах осмотра...
Принципы ПЦР-диагностики
Полимеразная цепная реакция - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул...
Принципы ПЦР-диагностики
n Непосредственное определение возбудителей инфекционных заболеваний Метод ПЦРдает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического фрагмента ДНК возбудителя...
Принципы ПЦР-диагностики
В· Р’ С…РѕРґРµ реакции амплифицируется ДНК как живого, так Рё погибшего микроорганизма Рто налагает определенные требования РїСЂРё использовании ПЦРдля контроля эффективности лечения...
Принципы ПЦР-диагностики
полимеразный диагностика инфекционный заболевание ПЦРиспользуется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах: 1. криминалистика ПЦРиспользуют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев»...
ПЦР–диагностика
1.Амплифицируется ДНК как живого, так Рё погибшего микроорганизма. Рто налагает определенные требования РїСЂРё использовании ПЦРдля контроля эффективности лечения. Р’ общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени...
med.bobrodobro.ru
Станкевич Любовь Рвановна.
ПЦР– полимеразная цепная реакция. Рто – метод детекции различных микроорганизмов РїРѕ фрагментам РёС… генома (ДНК или Р РќРљ). Рзначально метод был изобретён для тестирования чистых культур РІ бактериологии. Затем стало СЏСЃРЅРѕ, что РѕРЅ может быть полезен для РїСЂСЏРјРѕР№ детекции инфекционных агентов РІ биологическом образце. РЎ этого момента начался Р±СѓРј Рё РјРѕРґР° РЅР° инфекционную диагностику заболеваний, передающихся половым путём методом ПЦР. Однако, РІРѕ всем РјРёСЂРµ сразу обратили внимание РЅР° недостатки Рё ограничения метода Рё стали относиться Рє нему дифференцированно для каждого конкретного РІРёРґР° возбудителя Рё клинического случая. Рљ сожалению, РІ Р РѕСЃСЃРёРё этим всем пренебрегли, Рё началась СЌРїРѕС…Р° дешевого, неточного, некачественного анализа методом ПЦРместного производства. Врачи гинекологи Рё урологи, РЅРµ раздумывая назначали анализ «на РІСЃРµ!!! инфекции» методом ПЦР, Р° получая сомнительного качества результаты также, РЅРµ задумываясь, назначали лечение. Результаты этой СЌРїРѕС…Рё – большое количество пациентов, которым проведена необоснованная терапия антибиотиками, полное неверие Рё разочарование пациентов РІ лабораторной диагностике вообще. Ведь РЅРµ секрет, что стало РІ РїРѕСЂСЏРґРєРµ вещей перепроверять диагнозы РІ нескольких клиниках Рё лабораториях. РРЅРѕРіРґР° это приводило Рє чередованию СЂСЏРґР° противоположных результатов Рё полной невозможности постановки диагноза Рё назначения лечения. Произошла полная подмена настоящего бактериологического анализа дешевым набором тестов некачественного ПЦР-анализа. Врач должен знать, что даже отрицательный результат РїРѕ «всем инфекциям» методом ПЦРне означает благополучия Сѓ пациента – воспаление РІРѕ влагалище или РІ уретре может быть вызвано бактериальной или РіСЂРёР±РєРѕРІРѕР№ флорой Рё только бактериологический посев даёт ключ Рє выявлению возбудителя Рё, самое главное, позволяет выбрать тот антибиотик для лечения, Рє которому данный возбудитель Сѓ конкретного пациента чувствителен. Только РІ этом случае лечение будет обоснованным, правильным Рё эффективным! Тем РЅРµ менее, для некоторых инфекций метод ПЦРостается самым лучшим средством диагностики, РЅРѕ проблема РІ условиях нашей страны состоит РІ том, что практически повсеместно используются диагностикумы, РЅРµ прошедшие международной сертификации. РўРµ же реагенты, которые разрешены Рє использованию РІ ведущих западных странах (фирмы В« Roche В», В« Digene В»), РґРѕСЂРѕРіРё (анализ РЅР° РѕРґРЅСѓ инфекцию стоит РѕС‚ 30 Евро) Рё, Рє сожалению, РЅРµ находят применения РІ Р РѕСЃСЃРёРё. Непонятно, почему РЅР° этапе диагностики (самом важном) практикующие врачи (Р° вместе СЃ РЅРёРјРё Рё РёС… пациенты) делают выбор РІ пользу дешевизны, Р° РЅРµ точности Рё качества исследования. Вероятно потому, что ставится задача заработать РЅР° лечении (РЅРµ важно чем Рё РѕС‚ чего). Ведь РЅРµ секрет, что фирменный сертифицированный ПЦРанализ отличается РѕС‚ дешевого тем, что РѕРЅ проводится РЅР° автоматическом оборудовании (Р° РЅРµ вручную) Рё РІ каждом тесте гарантируется выявление как ложноотрицательных, так Рё ложноположительных результатов. Гарантия РЅР° результат дается 99-100% (тогда как РІ отечественных наборах РІ лучшем случае 50-70%).
Ртак, как же правильно проводить диагностику самых распространенных инфекций урогенитального тракта? Попробуем разобраться:
1) Хламидийная инфекция: только комплекс тестов ПЦРна Chlamydia trach . (мазок или моча) + определение антител по крови ( IgG и IgA к Chlamydia trach .) дает четкое, обоснованное заключение о наличии/отсутствии инфекции и характере её течения. Однако необходимо помнить, что для контроля лечения метод ПЦРне годится, так как он очень чувствителен и выявляет даже единичные копии генома, которые могут оставаться некоторое время после лечения даже при успешной эрадикации возбудителя.
2) Рнфекция Neisseria gonorrhoeae – возможны РґРІР° пути диагностики – Рё ПЦР-анализ Рё бакпосев (РїРѕ РјРёРєСЂРѕСЃРєРѕРїРёРё ставить диагноз врач РЅРµ имеет права!). ПЦРисследование гораздо более чувствительное, его хорошо применять для первичного СЃРєСЂРёРЅРёРЅРіР°, Р° бактериологическое исследование дает ключ Рє ответу Рѕ количестве возбудителя Рё его чувствительности Рє антибиотикам. Подбирать терапию Рё контролировать её эффективность лучше СЃ помощью культурального метода.
3) Рнфекция Mycoplasma / Ureaplasma – метод ПЦРне годится для диагностики. Высокая специфичность Рё чувствительность ПЦР-анализа РЅРµ вызывает сомнений, РЅРѕ использование этой реакции РЅРµ позволяет определиться врачам-клиницистам РїСЂРё решении следующих РІРѕРїСЂРѕСЃРѕРІ: следует ли рассматривать положительный результат ПЦРкак основание для назначения этиотропной терапии РїСЂРё данной форме патологии Рё каким лекарственным препаратам отдать предпочтение. РљСЂРѕРјРµ того, РІ настоящее время считается установленным фактом положение Рѕ том, что микоплазмы Рё уреаплазмы РјРѕРіСѓС‚ входить РІ состав флоры нормального микробиоценоза влагалища (Р’.Р•.Колупаев, Р’.Р•. Маликов Рё соавт.) Только культуральный метод (посев) позволяет правильно дифференцировать микроорганизмы Рё проводить количественный анализ РёС… содержания, что, безусловно, увеличивает его диагностическую эффективность РІ отношении условно-патогенной флоры. РљСЂРѕРјРµ этого, получение чистой культуры возбудителя дает возможность индивидуально подбирать адекватное лечение РЅР° основании тестирования антибиотикочувствительности выделенного штамма. Такой РїРѕРґС…РѕРґ значительно увеличивает эффективность антибактериальной терапии. Ртим же методом хорошо оценивать Рё результаты лечения.
4) Gardnerella vag . – также представитель условно патогенной флоры влагалища. Р’СЃС‘, что говорилось Рѕ ПЦРв плане диагностики микоплазм Рё уреаплазм, действительно Рё РІ случае гарднереллы. Особенно отмечу, что гарднереллы РЅРµ являются проблемой для мужчин (эпителий РІ уретре РЅРµ РїРѕРґС…РѕРґРёС‚ для роста Рё размножения этой бактерии). РЈ мужчин РѕРЅР° может присутствовать транзиторно, РЅРѕ РЅРµ являться причиной уретрита Рё быть РїРѕРІРѕРґРѕРј для назначения РєСѓСЂСЃР° антибиотиков. Рљ сожалению, РІ моей практике РјРЅРѕРіРѕ пациентов - мужчин, Сѓ которых ПЦРанализом выявлена гарднерелла, был назначен РєСѓСЂСЃ антибиотиков для её лечения Рё РѕРЅРё обращались Рє нам очень обеспокоенные тем, что Сѓ РЅРёС… проблема – гарднереллёз. Рначе, как обманом, такую ситуацию назвать нельзя. Что касается женщин, гарднереллы имеют диагностическое значение только РІ случае превышения РїРѕСЂРѕРіРѕРІРѕР№ концентрации. Поэтому, приемлемые варианты диагностики – это культуральный метод (посев СЃ определением количества Рё тестированием чувствительности Рє антибиотикам) или ДНК-анализ только РїСЂРё условии наличия РїРѕСЂРѕРіРѕРІРѕРіРѕ СѓСЂРѕРІРЅСЏ чувствительности. Например, ДНК-тесты фирмы В« Becton Dickinson В» разработаны СЃ пороговым уровнем чувствительности для Gardnerella vaginalis 2 С… 10 5 РљРћР•. Только высокий уровень G . vaginalis – 10 5 РљРћР• РЅР° 1 РјР» вагинальной жидкости - коррелирует СЃ бактериальным вагинозом. РџСЂРё отсутствии клинических СЃРёРЅРґСЂРѕРјРѕРІ обнаружение этой бактерии РЅРµ является диагностически достоверным. Также, как Рё РІ случае СЃ Neisseria gonorrhoeae отмечу, что РїРѕ РјРёРєСЂРѕСЃРєРѕРїРёРё ставить диагноз Рё назначать лечение врач РЅРµ имеет права! Результаты РјРёРєСЂРѕСЃРєРѕРїРёРё мазка РёР· влагалища необходимы для постановки заключения «бактериальный вагиноз». РќРѕ его причиной РјРѕРіСѓС‚ быть разные микроорганизмы, РЅРµ только гарднерелла. РќРµ зная причину вагиноза, нельзя правильно назначить лечение!
5) Candida (грибковые заболевания) – идеальным методом диагностики является посев СЃ определением РІРёРґР° Candida Рё РїРѕРґР±РѕСЂРѕРј противогрибковых препаратов, Рє которым чувствителен именно выделенный Сѓ пациента микроорганизм. Несмотря РЅР° то, что СЃРїРѕСЂС‹ Рё мицелий Candida хорошо выявляются Рё РїСЂРё РјРёРєСЂРѕСЃРєРѕРїРёРё мазка, это является только РїРѕРІРѕРґРѕРј для назначения посева. Лечение врач обязан назначать только РІ соответствии СЃ тестом РЅР° чувствительность Рє препаратам! Рменно пренебрежение этим стандартом РІ диагностике привело Рє тому, что сплошь Рё СЂСЏРґРѕРј кандидоз становится хронической Рё неизлечимой проблемой для пациента. Врач РїРѕ РєСЂСѓРіСѓ назначает противогрибковые препараты (РїРѕ принципу: «это РЅРµ помогло, попробуем РІРѕС‚ это…»), что РїСЂРёРІРѕРґРёС‚ только Рє формированию РІСЃРµ более резистентной Рє лечению культуры РіСЂРёР±РєР°. Бессимптомная колонизация небольшим количеством этих микроорганизмов влагалища является нормальным. Рменно поэтому использовать РґРѕСЂРѕР№ Рё сложный ПЦРметод для диагностики Candida нецелесообразно, Р° если использовать, то только СЃ РїРѕСЂРѕРіРѕРј чувствительности (например, ДНК-тесты фирмы В« Becton Dickinson В» разработаны СЃ пороговым уровнем чувствительности для Candida spp . 1 С… 10 4 клеток).
6) Trichomonas vaginalis – к сожалению, в нашей стране до сих практически нигде Вам ничего не предложат для диагностики этого микроорганизма, кроме микроскопии. Мировыми стандартами уже давно этот метод признан неудовлетворительным для выявления T . vaginalis (метод субъективный: легко пропустить возбудителя или спутать его с клетками, например; воспроизводимости и сходимости результатов нет вообще!). Культуральный метод чувствителен для обнаружения T . vaginalis , но зависит от различных типов сред и требует довольно продолжительного культивирования. Возможно применять и ДНК-анализ, ведь в случае данного возбудителя важно просто выяснить, есть он или нет, так как трихомонады – безусловный патоген.
7) Вирусные инфекции: в плане диагностики воспаления урогенитального тракта прежде всего значимы цитомегаловирусная и герпетическая инфекции. Для всех этих видов вируса правило одно: заражения без серологического ответа (т.е. выработки антител) не бывает, так как для этих вирусов слизистая половых путей – только входные ворота в Ваш организм. Затем они проникают в него и обитают в клетках организма (лимфоцитах, в нервной ткани и др.) Поэтому в первую очередь, необходимо проводить исследование крови на наличие антител обязательно классов и IgG и IgM . В случае герпеса необходимо помнить, что слизистую половых органов чаще всего поражает вирус герпеса 2 типа, (тестировать нужно антитела именно к HSV 2 типа). Многие лаборатории делают тест без разбора (просто на герпес и всё) и, как правило, получают положительный результат, который ничего не значит – тест положительный за счет антител к герпесу 1 типа, который к половым инфекциям не имеет никакого отношения! Метод ПЦРхорош только в первые 2-3 недели после заражения: антитела ещё не выработались, их в крови нет, а в слизистой можно выделить вирусный геном. Но, заражение чаще всего протекает бессимптомно, в этот момент пациенты не обращаются за помощью. Проблемы начинаются спустя некоторое время, анализ ПЦРможет давать отрицательные результаты (вирус уже ушел вглубь организма) и только появление антител в крови и оценка их динамики является ключом к диагностике и определению стадии заражения (острая, хроническая, перенесенная, реактивация хронической и т.п.)
8) Отдельно скажу о вирусе папилломы человека ( HPV ): эта разновидность вирусов обитает в клетках слизистой мочеполовых путей. Самый лучший способ выявить HPV – это ПЦРанализ (или его аналоги). В подавляющем случае присутствие вируса не приносит никакого вреда. Однако, заражение вирусом папилломы, относящимся к типу высокого риска, и его персистенция могут привести к раку шейки матки. Поэтому во время анализа важно выяснить, к какому типу (высокого или низкого риска) онкогенности относится выявленный вирус.
Теперь о самом главном: до 70% вагинитов, цервицитов, простатитов и уретритов обусловлено неспецифической бактериальной флорой (стафилококки, стрептококки, кишечная палочка и др.). То есть, в первую очередь, необходимо делать бактериологический посев для выявления причины воспаления. До 50% заболеваний протекает при наличии 2-х и более возбудителей. Поэтому, если ставится задача полной диагностики мочеполового тракта на предмет наличия/отсутствия инфекций, то стандартный набор диагностики должен включать в себя полный микробиологический скрининг, посев на микоплазмы/уреаплазмы, тесты на хламиди (ПЦР+ антитела в крови). У женщин обязательна микроскопия мазка из влагалища к указанному набору. Если при микроскопии выявлены признаки бактериального вагиноза, появляется подозрение на трихомоны, гарднереллы или нейссерии, то необходимо решать вопрос с врачом о дополнительной диагностике этих возбудителей.
В качестве резюме напомню главную заповедь врача, если он хочет вылечить больного: «Лечить необходимо причину болезни, а не её симптомы!!!»
А пациентам важно помнить, что во всем цивилизованном мире лечение большинства случаев неосложненных инфекций и заболеваний, передающихся половым путем всегда дешевле диагностики!!! (из статьи д-ра Живов А.В.)
bukvasha.ru
Северный Государственный Медицинский Университет
Кафедра семейной медициныРеферат на тему: «ПЦР– диагностика»Зав.каф.: профессор В.В. Попов
Зав.курсом клинической
лабораторной диагностики:
профессор Н.А. Воробьева
Выполнила: врач-интерн
МУЗ «Городская больница№1»
г. Северодвинска
Н.Ю. ШульгинаАрхангельск 2009 Содержание
Введение
Рзучение ДНК: строение, структура ДНК
РћСЃРЅРѕРІРЅРѕР№ принцип РџР¦Р
Осуществление рутинных методик РџР¦Р
Типовые ошибки РїСЂРё диагностике методом РџР¦Р
Преимущества метода ПЦРкак метода диагностики инфекционных заболеваний
Ограничения метода РџР¦Р
Основные принципы организации ПЦР- диагностических лабораторий и
требования к проведению ПЦР- анализа
Заключение
Список использованной литературы
Введение
ДНК-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека.
ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР(полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) .
На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики. Ежегодно на рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека, животных и растений. Количество ПЦР-лабораторий неуклонно увеличивается, а ПЦР-анализ становится все более востребованным среди специалистов и пациентов.
Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦРстало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.
Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.
Также появлению ПЦРмного способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Рменно этот фермент катализирует Рё "контролирует" РІСЃРµ процессы РІРѕ время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента - РѕРЅ термостабилен, исключительно термостоек: РѕРЅ выдерживает нагревание РґРѕ температуры кипения без потери активности, Р° "любимый" его температурный режим РІРѕ время работы - 72°С. РњРЅРѕРіРёРµ реакции РїСЂРё проведении ПЦРидут почти исключительно РїСЂРё повышенной температуре.
Официальное становление метода ПЦРв России связано с выходом в 1995 г. двух методических рекомендаций:
-"Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции"(№95-106,утверждены МЗ РФ 08.08.95), в них ПЦРвпервые рекомендована к применению в практическом здравоохранении;
 -"Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабо- раториях, использующих метод полимеразной цепной реакции" (утверждены 22.06.95 Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ), связаны с организацией работы в ПЦР-лаборатории.
В 1995 г. была впервые подготовлена техническая документация (инструкции, технические условии и др.) и зарегистрирован в Минздраве России отечественной набор реагентов для ПЦР-диагностики Chlamydia trachomatis.
За прошедшие годы появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: мультипраймерная ПЦР, гнездовая ПЦР, ПЦРin situ, ПЦРв режиме реального времени и др. При использовании метода ПЦРдля идентификации РНК, а не ДНК применяется модифицированный ОТ-ПЦРметод. Одним из существенных преимуществ метода ПЦРявляется высокая чувствительность и специфичность. Чувствительность определяется сочетанием следующих трех факторов: эффективностью выделения ДНК возбудителя, чувствительностью собственно ПЦРи выбранного метода детекции.
Рзучение ДНК: строение, структура ДНК
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - универсальный носитель генетической информации Рё наследственных признаков Сѓ всех существующих РЅР° Земле организмов. Рсключение составляют только некоторые микроорганизмы, например, РІРёСЂСѓСЃС‹ - универсальным носителем генетической информации Сѓ РЅРёС… является Р РќРљ - одноцепочечная рибонуклеиновая кислота.
Строение ДНК-молекулы
Открытие ДНК молекулы произошло в 1953 году. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК, их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией.
ДНК представляет СЃРѕР±РѕР№ РґРІРѕР№РЅСѓСЋ нить, скрученную РІ спираль. Каждая нить состоит РёР· РёР· последовательно соединенных нуклеотидов. Каждый нуклеотид ДНК содержит РѕРґРЅРѕ РёР· четырёх азотистых оснований - гуанин (G), аденин (A) (РїСѓСЂРёРЅС‹), тимин (T) Рё цитозин (C) (РїРёСЂРёРјРёРґРёРЅС‹), связанное СЃ дезоксирибозой, Рє последней, РІ СЃРІРѕСЋ очередь, присоединена фосфатная РіСЂСѓРїРїР°. Между СЃРѕР±РѕР№ соседние нуклеотиды соединены РІ цепи фосфодиэфирной СЃРІСЏР·СЊСЋ, образованной 3'-гидроксильной (3'-РћРќ) Рё 5'-фосфатной группами (5'-Р Рћ3). Рто свойство обуславливает наличие полярности РІ ДНК, С‚.Рµ. противоположной направленности, Р° именно 5'- Рё 3'-концов: 5'-концу РѕРґРЅРѕР№ нити соответствует 3'-конец второй нити
Структура ДНК
Первичная структура ДНК - это линейная последовательность нуклеотидов ДНК в цепи. Последовательность нуклеотидов в цепи ДНК записывают в виде буквенной формулы ДНК: например - AGTCATGCCAG, запись ведется с 5'- на 3'-конец цепи ДНК.
Вторичная структура ДНК образуется за счет взаимодействий нуклеотидов (в большей степени азотистых оснований) между собой, водородных связей. Классический пример вторичной структуры ДНК - двойная спираль ДНК. Двойная спираль ДНК - самая распространенная в природе форма ДНК, состоящая из двух полинуклеотидных цепей ДНК. Построение каждой новой цепи ДНК осуществляется по принципу комплементарности, т.е. каждому азотистому основанию одной цепи ДНК соответствует строго определенное основание другой цепи: в комплементарной паре напротив A стоит T, а напротив G располагается C и т.д.
Синтез ДНК. Репликация
Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться (реплицироваться). В природе репликация ДНК происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов (гираз), которые служат катализатором (веществами, ускоряющими реакцию), в клетке происходит расплетение спирали в том ее участке, где должна происходить репликация (удвоение ДНК). Далее водородные связи, которые связывают нити, разрываются и нити расходятся.
Р’ построении РЅРѕРІРѕР№ цепи активным "строителем" выступает специальный фермент - ДНК-полимераза. Для удвоения ДНК необходим также стратовый блок или "фундамент", РІ качестве которого выступает небольшой двухцепочечный фрагмент ДНК. Ртот стартовый блок, Р° точнее - комплементарный участок цепи родительской ДНК - взаимодействует СЃ праймером - одноцепочечным фрагментом РёР· 20-30 нуклеотидов. РџСЂРѕРёСЃС…РѕРґРёС‚ репликация или клонирование ДНК одновременно РЅР° обеих нитях. РР· РѕРґРЅРѕР№ молекулы ДНК образуются РґРІРµ молекулы ДНК, РІ которых РѕРґРЅР° нить РѕС‚ материнской молекулы ДНК, Р° вторая, дочерняя, РІРЅРѕРІСЊ синтезированная.
Таким образом, процесс репликации ДНК (удваивания) включает в себя три основных этапа:
-Расплетение спирали ДНК и расхождение нитей
-Присоединение праймеров
-Образование новой цепи ДНК дочерней нити
Р’ РѕСЃРЅРѕРІРµ анализа методом ПЦРлежит принцип репликации ДНК - синтеза ДНК, который современным ученым удалось воссоздать искусственно: РІ лаборатории врачи вызывают удвоение ДНК, РЅРѕ только РЅРµ всей цепи ДНК, Р° ее небольшого фрагмента.РћСЃРЅРѕРІРЅРѕР№ принцип РџР¦Р
Любой метод ДНК-диагностики основан на специфической гибридизации двух нитей ДНК, комплементарных (структурно дополняющих) одна другой. Примерной (хотя и весьма приблизительной) аналогией может служить серологическая реакция, основанная на специфической реакции белка-антитела с соответствующим антигеном. Специфичность связывания нитей в спирали ДНК основана на связях А-Т и Г-Ц. Праймеры комплементарны искомым участкам ДНК, и поэтому они способны связываться с конкретными участками гена. Достройка нитей ДНК, начиная с добавленных праймеров, требует наличия в реакционной смеси пурин-и пиримидинтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ и ЦТФ), а также присутствия ДНК-полимеразы, которая соединяет их в цепочку согласно последовательности второй нити ДНК.
Осуществление рутинных методик РџР¦Р
Рсследуемым материалом для ПЦРмогут служить СЃРѕСЃРєРѕР±С‹ эпителиальных клеток, РєСЂРѕРІСЊ, плазма, сыворотка, плевральная Рё спинномозговая жидкости, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, СЃРѕРє простаты, слюна, моча, мокрота, слизь Рё РґСЂСѓРіРёРµ биологические выделения, биоптаты.
Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.
Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150 °С в течение 1 часа.
1. Выделение ДНК из клинического образца производится любым способом. Основное требование - достаточно стандартный выход продукта и интактность, сохранение двухнитевой структуры.
Проведению ПЦРпредшествует стадия выделения Рё преципитации ДНК РёР· исследуемого материала. Рто обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента РІ минимальном объеме жидкости, используемой РІ ПЦР. Р’ случаях, РєРѕРіРґР° РЅРµ требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, РїСЂРё идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна РёС… обработка, позволяющая лишь разрушить РјРёРєСЂРѕР±РЅСѓСЋ стенку: нагревание РІ лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.
При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦРбез всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.
В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки.
Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов.
2. Амплификация. Полимеразная цепная реакция ДНК проводится в специальном приборе (термоциклере или амплификаторе), который, согласно введенной программе, изменяет температуру в рабочих ячейках, держит ее в течение заданного времени и переходит к следующему этапу.
Каждый цикл ПЦРобычно состоит из трех температурных режимов.
а) Нагрев до 95 °С в течение 30-40 сек. При этом выделенные молекулы ДНК подвергаются денатурации, т. е. происходит разделение ДНК на две нити.
б) Охлаждение до оптимальной температуры (обычно 48-66 °С). При этом разделенные нити ДНК могут обратно воссоединиться по комплементарным участкам. Однако, при наличии в образце целевых участков ДНК, синтетические ДНК-зонды (праймеры, длиной 15-30 п.н.) специфически связываются (гибридизуются) с комплементарными участками ДНК, например хламидии или герпесвируса. Тем самым ограничиваются искомые участки генов, определяя точки начала и окончания предполагаемого продукта ПЦР. Время отжига 20-60 сек.
РІ) После завершения гибридизации праймеров СЃ искомыми участками ДНК, температуру смеси повышают РґРѕ 72 °С. Рта температура оптимальна для фермента РўР°q ДНК-полимеразы, которая начинает быстро достраивать РѕРґРЅСѓ Рё РґСЂСѓРіСѓСЋ цепочку ПЦР-продукта, начиная СЃ места фиксации, соответственно, РѕРґРЅРѕРіРѕ Рё второго ДНК-Р·РѕРЅРґР°. Ртот процесс называется элонгацией (С‚. Рµ. удлинением) ПЦР-продукта, сами же продукты ПЦРименуют ампликонами. Время протекания синтеза - 20-40 сек.
При первом цикле ПЦРполучается некоторое число ампликонов различной длины, которые служат субстратом во втором цикле реакции, где количество специфических продуктов удваивается еще раз. В каждом из последующих циклов (всего до 35-40) происходит двукратное возрастание числа целевых продуктов ПЦР-ампликонов.
Специфичность ПЦРи количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.
Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦРочень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения.
3. Детекция.
Способы учета результатов ПЦР:
Качественная оценка (электрофоретический метод)
Р’Рѕ РјРЅРѕРіРёС… случаях РїСЂРё ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "РґР°" или "нет", как, например, РїСЂРё первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов Рё РґСЂ. Обычным СЃРїРѕСЃРѕР±РѕРј разделения продуктов ПЦРи идентификации специфического гена является электрофорез РІ агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы Рё дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным РІ контроле без изучаемой ДНК Рё положительным - РІ РїСЂРѕР±Рµ СЃ ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять СЃРѕР±РѕР№ целевую ДНК или участок гена, клонированный РІ плазмиде или амплифицированный СЃ помощью РџР¦Р
Для учета результатов качественной ПЦРможет быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦРопределяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальных флуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.
Методы учета результатов ПЦРбез применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.
Р’ таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный РєСЂСѓРі наиболее востребованных микроорганизмов. РќР° СЂРѕСЃСЃРёР№СЃРєРѕРј рынке предлагается целый СЂСЏРґ flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, Рё СЂСЏРґР° вирусных инфекций. Ртот ассортимент патогенов вполне достаточен для РјРЅРѕРіРёС… больничных лабораторий, Рё РѕРЅРё РјРѕРіСѓС‚ СЃ начала своей деятельности сделать акцент РЅР° подобных методах анализа.
Количественная оценка результатов РџР¦Р
Р’ СЂСЏРґРµ клинических ситуаций возникает РІРѕРїСЂРѕСЃ Рѕ динамике патологического процесса Рё/или эффективности РїСЂРѕРІРѕРґРёРјРѕР№ терапии. Рти РІРѕРїСЂРѕСЃС‹ наиболее актуальны РїСЂРё обследовании пациентов СЃ хроническими инфекциями (гепатиты Р’ Рё РЎ, РІРёСЂСѓСЃ иммунодефицита человека Рё РґСЂ.). РџСЂРё диагностике РёСЃС…РѕРґСЏС‚ РёР· того, что накопление продуктов ПЦР(ампликонов) пропорционально содержанию РєРѕРїРёР№ РёСЃРєРѕРјРѕРіРѕ гена РІ исследуемой РїСЂРѕР±Рµ.
Естественно, учет результатов количественной ПЦРможно проводить и с помощью гель-электрофореза с анализом интенсивности специфических сигналов ПЦР. Обязательным условием правильной количественной оценки результатов ПЦРявляются надежные положительные контрольные пробы с известным содержанием копий искомого гена (например, 1000 копий гена гепатита С на одну ПЦР-реакцию). Ряд последовательных разведений количественного контроля дает возможность построить калибровочные кривые, по которым можно оценивать содержание генокопий в клинических образцах .
Ключевым достижением в проведении количественной ПЦРстала разработка флуоресцентных ДНК-зондов, которые добавляются в реакционную смесь наряду с "обычными" праимерами и дают возможность отслеживания хода ПЦРво времени (так называемая геа1-timе-ПЦР), которая в 1993-1994 гг. была внедрена в.соответствующих приборах и диагностических системах (принцип ТаqМаn). Существует еще несколько методов конструирования ДНК-зондов для количественной ПЦР.
Методология ТаqМаn предусматривает синтез флуоресцентных ДНК-зондов, специфичных к средней части ампликона (между праймерами) и имеющих на концах две метки. Одна из них - флуоресцентная молекула, другая - молекула-гаситель этой флуоресценции. Таq-полимераза в ходе ПЦРне только достраивает нуклеотидную цепочку, но и разрушает связанный флуоресцентный зонд. При этом флуоресцирующая метка выходит в свободное состояние, освобождаясь от влияния гасителя. Поэтому интенсивность флуоресценции по мере амплификации продуктов ПЦРвозрастает пропорционально числу ампликонов и, соответственно, числу копий исходной ДНК. Специальный прибор, являющийся гибридом термоблока-амплификатора и флуориметра, осуществляет регулярные замеры флуоресценции в каждой пробирке (принцип геаl-timе-ПЦР). В результате после 20-40 циклов ПЦРдля каждого образца получают индивидуальные кривые. По калибровочным кривым с контрольными образцами возможно вычислить, сколько копий искомого гена содержится в изучаемом образце.
Важная особенность проведения ПЦРфлуоресцентным методом состоит в том, что пробирки с ПЦР-смесью не нужно открывать при учете результатов. Благодаря этому уменьшается вероятность загрязнения помещений продуктами амплификации и отпадает необходимость в выделении специальных рабочих зон для проведения электрофореза.
Типовые ошибки РїСЂРё диагностике методом РџР¦Р
Все большее развитие получает лабораторная диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) благодаря своей скорости и высокой чувствительности. Однако, несмотря на простоту и удобство метода, существует ряд условий, невыполнение которых может привести к получению недостоверного или ложного результата.
Простой на первый взгляд метод имеет ряд "подводных камней", с которыми так или иначе приходится сталкиваться практически каждому специалисту лаборатории. К различным ошибкам могут приводить как отсутствие опыта в использовании данной методики, так и стереотипы мышления персонала, ранее работавшего в биохимических или бактериологических лабораториях, где иные требования к работе. В результате таких ошибок могут быть получены ложноположительные, ложноотрицательные или недостоверные результаты анализов.
С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа, - прежде всего, связанные с нарушением правил взятия, хранения и транспортировки клинического материала. Однако при диагностике могут допускаться и другие ошибки, которые могут быть не замечены сотрудником КДЛ при анализе результатов.
Все ошибки, допускаемые в лабораторной практике, можно разделить на три класса:
ошибки преаналитического этапа;
ошибки аналитического этапа;
ошибки постаналитического этапа.
1.Ошибки преаналитического этапа ПЦР-диагностики
Операции преаналитического этапа ПЦР-диагностики выполняются вне ПЦР-лабораторий, однако ошибки, допускаемые на этом этапе, оказывают едва ли не самое существенное влияние на результат исследования. Большинство этих ошибок невозможно выявить в ходе исследования, и, следовательно, существенно возрастает риск получения ложного результата. В связи с этим необходима совместная работа с различными подразделениями ЛПУ по разработке алгоритма взятия биоматериала и контроль его выполнения.
Взятие биологического материала.В В В В В В В В
Первой Рё самой существенной ошибкой преаналитического этапа ПЦР-диагностики является неправильный выбор места взятия биологического материала для исследования. Поскольку метод ПЦРявляется прямым, С‚. Рµ. позволяет непосредственно выявить причину заболевания, Р° данном случае обнаружить патогенный микроорганизм, то биоматериал необходимо брать непосредственно РІ месте предполагаемой локализации инфекционного процесса. Рсследование некоего "универсального материала", как, например, РєСЂРѕРІРё, РЅРµ позволит определить наличие РІ организме патогена РІРѕ всех случаях, Р·Р° исключением тех, РїСЂРё которых возбудитель локализован именно РІ РєСЂРѕРІРё. Р’ первую очередь это относится Рє патогенам, которые РјРѕРіСѓС‚ поражать РјРЅРѕРіРёРµ органы Рё ткани, таким как, например, Chlamydia trachomatis или РњСѓСЃРѕbасterium tuberculosis.
Chlamydia trachomatis могут поражать эпителий слизистой оболочки урогенитального тракта, эпителий конъюнктивы глаза и синовиальной полости. Следовательно, при подозрении на урогенитальный хламидиоз материалом для исследования должен служить соскоб из урогенитального тракта, при поражении глаз у новорожденного - соскоб из конъюнктивы глаза, при хламидийном артрите - пунктат синовиальной жидкости.
Мусоbасterium tuberculosis могут поражать практически любой орган и ткань организма человека, т. е. материал для исследования не должен быть одним и тем же при разных формах патологического процесса.
Таким образом, если у ребенка хламидиоз глаз, а для исследования взят образец из урогенитального тракта, а при туберкулезе почек для исследования берется мокрота, отрицательный результат не будет исключать факта инфицирования пациента.
Вторая ошибка на преаналитическом этапе - неправильное взятие материала на исследование.
Общими требованиями к биологическому материалу являются максимальная концентрация микроорганизмов в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР.
Например, Chlamydia trachomatis - облигатные внутриклеточные паразиты, следовательно, исследуемый материал должен содержать большое количество клеток эпителия . То есть при взятии материала для выявления этих микроорганизмов необходимо делать соскоб, а не мазок, поскольку в мазке Chlamydia trachomatis не будут обнаружены, даже если находятся в организме в значительном количестве.
РџСЂРё взятии материала РёР· урогенитального тракта необходимо избегать ингибирующих примесей, таких как слизь, РєСЂРѕРІСЊ или РіРЅРѕР№. Для этого СЃРѕСЃРєРѕР±С‹ берут РЅРµ ранее, чем через РґРІР° часа после мочеиспускания, Сѓ женщин учитывают РґРЅРё цикла. Рзбыток слизи или РіРЅРѕСЏ необходимо удалить стерильным ватным тампоном непосредственно перед взятием биоматериала. Забирать материал желательно специальными пластиковыми зондами, что снижает вероятность появления РєСЂРѕРІРё РІ образце, Рє тому же РѕРЅРё, РІ отличие РѕС‚ ватных, РЅРµ СЃРѕСЂР±РёСЂСѓСЋС‚ транспортную среду Рё исследуемый материал.
Обработка биологического материала.
Правильное взятие урогенитального соскоба - процедура болезненная для лиц мужского пола и детей, поэтому для исследования можно использовать первую порцию утренней мочи, содержащую максимальное количество эпителия. В последующем для работы необходимо получить клеточный осадок мочи. Однако следует учитывать, что осадок содержит большое количество солей и мочевины, которые при использовании технологий флуоресцентной детекции денатурируют зонды, что может привести к ложноположительным результатам. Поэтому клеточный осадок мочи необходимо в обязательном порядке промывать физиологическим раствором.
Следующая ошибка преаналитического этапа - неправильная обработка взятой крови. Для предотвращения свертываемости крови в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Во многих лабораториях в качестве антикоагулянта используется гепарин. Однако гепарин достаточно сильно ингибирует ПЦР, и независимо от используемой тест-системы и способа пробоподготовки все результаты для образца, его содержащего, окажутся недостоверными в случае наличия внутреннего контроля ПЦРили отрицательными, независимо от реального положения вещей в случае, если внутреннего контроля нет .
Хранение биологического материала.
Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК возбудителя может разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8°С в течение нескольких часов, для более длительного хранения необходимо замораживание. Единственное исключение - кровь, поскольку цельную кровь замораживать нельзя! Необходимо получить плазму и уже ее замораживать. Заморозка должна быть однократной, в противном случае происходит разрушение нуклеиновых кислот.
2.Ошибки аналитического этапа ПЦР-диагностики
Ошибки в работе.
Ошибки аналитического этапа, как правило, связаны с невнимательным чтением инструкции, прилагаемой к набору для проведения ПЦР-анализа.
Одной из таких ошибок является неправильный выбор системы пробоподготовки. Менее опасно применение экспресс-методов дли сложных биоматериалов - таких как, например, плазма крови, потому что в этом случае наиболее вероятно получение недостоверных результатов из-за оставшихся в пробе ингибиторов ПЦР, что, в свою очередь, вынудит специалиста КДЛ повторить эксперимент и выяснить причину неудачи. Гораздо опаснее, если из-за неправильно выбранной тест-системы в процессе пробоподготовки теряется часть или вся ДНК или РНК возбудителя - в этом случае есть риск получения ложноотрицательного результата.
Вторая ошибка - неправильно приготовленные фоновые пробирки для тест-систем с флуоресцентной детекцией но конечной точке. Чаще всего это связано с тем, что сотрудник лаборатории забывает их менять при появлении новой серии реактивов или не делает этого из соображений экономии. Возможно, что одни и те же компоненты реакционной смеси едва ли будут иметь различный уровень флуоресценции, однако в разных сериях реактивов могут отличаться концентрации компонентов и поэтому высока вероятность различного уровня флуоресценции. Таким образом, ошибка, влияние которой в некоторых случаях можно не заметить, в других может обусловить большое количество недостоверных результатов.
Еще РѕРґРЅРѕР№ ошибкой, связанной СЃ неправильным приготовлением фоновых РїСЂРѕР±РёСЂРѕРє, является добавление РІ РЅРёС… полимеразы. Рто может произойти как случайно, так Рё вследствие того, что лаборант РЅРµ РґРѕ конца понимает, почему полимеразу добавлять РЅРµ нужно. Здесь РјРѕРіСѓС‚ быть РґРІР° варианта развития событий: если РІ тест-систему РЅРµ РІС…РѕРґРёС‚ внутренний контроль или РІ качестве отрицательного контрольного образца используется буфер, РЅРµ прошедший выделения, Рё если РІ тест-систему РІС…РѕРґРёС‚ внутренний контроль, который находится РїРѕРґ парафином, Рё/или отрицательный образец РїСЂРѕС…РѕРґРёС‚ стадию выделения. Р’ первом случае добавление полимеразы может существенно РЅРµ сказаться РЅР° результате, однако Рё РІ этом случае есть СЂРёСЃРє контаминации как положительным, так Рё внутренним контролем. Р’Рѕ втором случае РІСЃРµ отрицательные значения оказываются недостоверными. Обнаружить ошибку РЅРµ представляется проблемой, поскольку нормировочные значения оказываются очень высокими, близкими Рє 10', Р° значения флуоресценции РІ некоторых пробирках существенно ниже 1.
Контаминация.
Проблема контаминации возникает РїСЂРё неправильной организации работы лаборатории или РїСЂРё неаккуратном обращении СЃ положительными образцами. Так, РїСЂРё использовании гель-электрофореза РІ качестве метода детекции комната для его проведения обязательно должна иметь отдельный РІС…РѕРґ Рё систему вентиляции. Р’ противном случае вероятность того, что ампликоны РёР· открывающихся РїСЂРѕР±РёСЂРѕРє Р±СѓРґСѓС‚ попадать РІ РґСЂСѓРіРёРµ помещения, очень высока. Рто может привести Рє тому, что СЃРѕ временем РІСЃРµ больше исследуемых образцов РЅР° часто встречающиеся инфекции Р±СѓРґСѓС‚ оказываться положительными. РџСЂРё этом РЅР° первых этапах такого загрязнения отрицательный контроль может оставаться чистым, поскольку появление ложноположительных результатов РЅРѕСЃРёС‚ статистический характер.
В случае флуоресцентной детекции пробирка не открывается и теоретически вероятность контаминации близка к нулю, однако возможность ее открытия не исключена. Поэтому лучше, если амплификация и детекция будут проводиться в отдельной комнате, тогда в случае непредвиденной ситуации контаминированной окажется одна комната.
Еще РѕРґРЅР° ошибка, приводящая Рє контаминации образцов, связана СЃ неаккуратным обращением как СЃ клиническими пробами, так Рё СЃ положительными контрольными образцами Рё стандартами. Некоторые специалисты лаборатории СЃ целью СЌРєРѕРЅРѕРјРёРё РїСЂРё внесении РІ большое количество РїСЂРѕР±РёСЂРѕРє РѕРґРЅРѕРіРѕ Рё того же вещества используют РѕРґРёРЅ наконечник. Рто возможно, если РїСЂРѕР±РёСЂРєРё пустые или РёС… содержание одинаково (подготовка амплификационных РїСЂРѕР±РёСЂРѕРє). Однако, если РІ РїСЂРѕР±РёСЂРєРµ находится образец, как, например, РїСЂРё пробоподготовке, то РїСЂРё внесении даже РѕРґРЅРѕРіРѕ Рё того же раствора РІ разные РїСЂРѕР±РёСЂРєРё увеличивается СЂРёСЃРє переноса ДНК - так называемая РєСЂРѕСЃСЃ-контаминация. РЎ целью предотвращения РєСЂРѕСЃСЃ-контаминации также рекомендуется для внесения образцов, потенциально содержащих ДНК, использовать наконечники СЃ фильтрами.
Помимо этого при неаккуратной работе есть риск внести в пробу ингибиторы (например, тальк с перчаток).
Ошибки при интерпретации результата
Говоря об ошибках при интерпретации результатов, имеет смысл рассмотреть различные способы детекции.
При детекции с использованием гель-электрофореза есть риск принять неспецифические фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности четко и однозначно сравнить с положительным контролем и, в идеале, с маркером длин.
В случае нарушений правил работы существует риск контаминации уже на этапе детекции. Такого рода контаминация отслеживается в случае, если полоса наблюдается в заведомо отрицательной пробе, однако она неотличима от контаминации в лаборатории и требует повторной проверки всех образцов.
Одной из ошибок интерпретации, связанной с использованием метода флуоресцентной детекции по конечной точке, является невнимательное отношение к нормировочным значениям фоновых пробирок и к значениям флуоресценции в отрицательных пробах. Так, при неправильном хранении зонды в фоновых пробирках могут разрушаться, и нормировочные значения существенно увеличиваются (от нескольких часов до нескольких дней), при этом значения флуоресценции в образцах оказываются в большей или меньшей степени занижены. Главным критерием достоверности полученных результатов в данном случае могут служить отрицательные пробы. При отсутствии расхождений между фоновыми и амплификационными пробирками отрицательные образцы имеют значения флуоресценции близкие к единице или, в редких случаях, чуть выше. Если значения флуоресценции в одном или нескольких образцах или отрицательном контроле существенно ниже единицы, с большой долей вероятности можно утверждать, что фоновые пробирки не соответствуют данному исследованию, в этом случае необходимо их поменять.
Помимо вышеприведенного примера, может случиться так, что фоновая флуоресценция возрастает в амплификационных пробирках, в то время как в фоновых пробирках флуоресценция остается неизменной. Такая ситуация может возникнуть когда амплификационные пробирки хранятся при комнатной температуре. В этом случае будет увеличиваться содержание положительных результатов с низкими значениями флуоресценции. Результаты при этом получаются такие же, как при контаминации в лаборатории, однако в данном случае все низкие значения флуоресценции будут примерно одинаковы, что ц случае контаминации встречается достаточно редко, поскольку маловероятно, что во все отрицательные пробирки попадет равное количество постороннего материала. Подобного легко избежать, если менять фоновые пробирки раз в месяц-полтора, в этом случае, как правило, не успевает появиться достаточно большая разница между уже готовыми фоновыми и амплификационными пробирками.
Наиболее частая ошибка РїСЂРё исследовании методом ПЦРс детекцией результатов РІ режиме реального времени связана СЃ РїСЂРёР±РѕСЂРѕРј, который РїСЂРё больших колебаниях флуоресценции может зафиксировать ложноположительные результаты.В В В В В В В В
Р’ СЃРІСЏР·Рё СЃ этим необходимо проводить анализ индивидуальной РєСЂРёРІРѕР№. Пороговая линия должна пересекать индивидуальную РєСЂРёРІСѓСЋ Рё области начала экспоненциального роста, Рё это РЅРµ РѕРґРёРЅ РёР· множества РїРёРєРѕРІ колебания флуоресценции. Также РїСЂРёР±РѕСЂ может выдать ложноотрицателъный результат РІ случае, если РЅР° первых циклах ПЦРпо каким-то причинам произошло существенное уменьшение флуоресценции. Рту ошибку можно обнаружить РїСЂРё анализе исходных кривых флуоресценции. Если образец положительный, то РЅР° РёСЃС…РѕРґРЅРѕР№ РєСЂРёРІРѕР№ будет виден четкий экспоненциальный СЂРѕСЃС‚. Для большей достоверности можно сравнить такую сомнительную РєСЂРёРІСѓСЋ СЃ РєСЂРёРІРѕР№ заведомо положительной. Р’СЃРµ положительные кривые имеют сходный СѓРіРѕР» наклона, Рё уровень флуоресценции РїСЂРё выходе РЅР° плато заметь" РЅРѕ отличается РѕС‚ колебаний Рё отрицательных образцах.
3.Ошибки постаналитического этапа ПЦР-диагностики
Ошибки на завершающем, постаналитическом этапе связаны с неверной интерпретацией врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода.
Например, контрольное исследование на хламидиоз через 1 неделю после окончания курса антибиотиков даст положительный результат. Врач сделает вывод о неэффективности проведенной терапии. Однако окончательный вывод можно сделать не ранее чем через 4-6 недель, после того, как сменится эпителиальный слой, в котором паразитирует данный микроорганизм. Более ранняя диагностика может показать неверный результат, поскольку в клетках эпителия еще сохраняются погибшие микроорганизмы. Важно учитывать специфичность используемых тест-систем. Так, например, пациент с предполагаемым диагнозом "респираторный хламидиоз" направляется на исследование. При постановке ПЦРиспользуется видоспецифическая тест-система для выявления ДНК С. Trachomatis- результат исследования отрицательный. Однако врач не должен снимать предполагаемый диагноз, поскольку инфекция может быть вызвана другими видами хламидий, например С. рneumoniа, С. ресоrum, С. psitaci, которые не диагносцируются данной тест-системой. То есть при назначении ПЦР-исследования врач должен очень четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.
Вместе СЃ тем несовпадение результатов различных методов исследования РЅРµ РіРѕРІРѕСЂРёС‚ РѕР± ошибке. Зачастую ПЦР-исследование дает положительный результат, РІ то время как РФА - отрицательный. Несовпадение результатов исследований может объясняться, например, периодом "серологического РѕРєРЅР°".
В случае обратных результатов исследований возможен "иммунологический след" - остаточный уровень антител, который у некоторых людей может сохраняться многие месяцы и даже годы после выздоровления, либо при проведении ПЦРне учитывается видоспецифичность тест-систем.
Приведенные примеры показывают, что для получения качественных результатов исследований необходимо четкое выполнение правил работы на всех этапах клинической лабораторной диагностики и тесная взаимосвязь специалистов ПЦР-лаборатории с врачами-клиницистами.
www.coolreferat.com